專利名稱：鐮孢霉菌的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種其發(fā)酵物具有藥用功能的微生物。
背景技術：
神經酰胺(Ceramide)類化合物，是一類具有藥用、保健功能的化合物，其中部分化合物具有抑制人骨髓白血病細胞、人白血病淋巴細胞、人肝癌細胞、肺癌細胞等腫瘤細胞生長活性作用。此類化合物用微生物發(fā)酵方式獲得尚未見報道。

發(fā)明內容
本發(fā)明的目的是提供一種其發(fā)酵物具有藥用功能的微生物—鐮孢霉菌。
本發(fā)明所述的鐮孢霉菌命名為Fusarium sp.Ym 37846，保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC NOM203065。
本發(fā)明所述的鐮孢霉菌系從夾竹桃科植物長春花(Catharanthus roseus(L.)G.Don)植物活體中分離得到的?，F保藏在國家知識產權局專利局保藏單位保藏，保藏單位名稱中國典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏日期為2003年8月6日，保藏編號為M203065。
本發(fā)明所述的YM37846菌株的顯微形態(tài)特征1、無性世代 菌絲白色有隔，分生孢子未觀察到。
2、有性世代 未發(fā)現。
本發(fā)明所述的鐮孢霉菌的固體培養(yǎng)特征1、PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑42mm，7天52mm，11天蔓延整個培養(yǎng)皿。菌絲白色，中部淺黃色微突，平長茸狀，生長緊密，邊緣整齊，背面淡黃色，后為褐色。
2、麥芽汁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑35mm，7天69mm，11天蔓延整個培養(yǎng)皿。菌絲淺紅色，邊緣白色，菌落平絮茸狀，生長緊密，邊緣整齊，背面淺褐色。
3、察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑19mm，7天34mm，11天40mm。菌絲白色，中部緊密，扁平，凹陷，有的凸凹不平，短茸狀，邊緣彌散，不整齊，背面中部褐色，外緣黃色，邊緣白色。
本發(fā)明所述的鐮孢霉菌YM35852菌株液體發(fā)酵培養(yǎng)1、培養(yǎng)基PDA。搖瓶培養(yǎng)時間5-7天。培養(yǎng)溫度30℃±2℃。
2、發(fā)酵培養(yǎng)特征培養(yǎng)第1天，菌種有零星的白色菌絲點；培養(yǎng)第2天，長滿白色菌絲；培養(yǎng)第3天，發(fā)酵液菌絲體密集，菌絲體呈淡褐色；培養(yǎng)第4天，長滿淺褐色菌絲球，發(fā)酵液清亮，培養(yǎng)第5-7天，發(fā)酵液清亮褐色，菌絲體球狀，淺褐色菌絲體。
3、YM37846菌株液體發(fā)酵5-7天后，對發(fā)酵液和菌體進行化學提取、分離，可得到四個抗腫瘤活性化合物，其中3個屬神經酰胺類化合物，1個為生物堿類化合物。所得化合物目前結構尚不明確。
本發(fā)明所述的YM37846菌株液體發(fā)酵提取工藝為菌種→試管斜面→種子培養(yǎng)→發(fā)酵培養(yǎng)→發(fā)酵物提取→分離化合物→有效成分。
上述步驟中，發(fā)酵原料為馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)。本工藝適合于半知菌類叢梗孢科絲狀真菌類微生物。
上述的YM37846液態(tài)發(fā)酵工藝中，發(fā)酵條件參數如下(1)發(fā)酵方式液態(tài)發(fā)酵。
(2)菌種斜面試管斜面菌種培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖固體培養(yǎng)基(固體PDA)。
(3)種子培養(yǎng)種子培養(yǎng)為馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(液體PDA)。馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基(PDA)制備取新鮮馬鈴薯200克，去皮切成小塊，加水1升煮沸30分鐘，過濾棄馬鈴薯，濾液加水補足至1升，加入葡萄糖20克，PH自然。
上述馬鈴薯葡萄糖培養(yǎng)基中加入瓊脂15克，即為固體PDA培養(yǎng)基。
(4)發(fā)酵培養(yǎng)發(fā)酵的培養(yǎng)基馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(液體PDA)，PH自然。
(5)培養(yǎng)時間試管斜面菌種活化培養(yǎng)48-72小時，種子搖床培養(yǎng)時間72-96小時，發(fā)酵培養(yǎng)時間5-7天。
(6)培養(yǎng)溫度試管斜面菌種培養(yǎng)溫度28℃±2℃，種子搖床培養(yǎng)溫度30℃±2℃，發(fā)酵培養(yǎng)溫度為30℃±2℃。
(7)發(fā)酵物提取發(fā)酵完畢，過濾，收集菌體和發(fā)酵液。按常規(guī)化學提取方法，采用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，菌體用乙酸乙酯浸泡過夜，提取三次。
(8)分離化合物采用硅膠(Silica G)柱層析方法分離純化獲得神經酰胺類及生物堿類化合物。
本發(fā)明所述的YM37846是從長春花植物體中分離篩選得到的，能夠人工發(fā)酵產生與寄主植物相同或類似化合物的一株絲狀真菌。長春花主要藥用成份為長春堿，具有降血壓、鎮(zhèn)靜安神、抗單核細胞性白血病、以及抗腫瘤(淋巴瘤或絨毛膜上皮癌)。本發(fā)明是通過長春花內生真菌的純培養(yǎng)，以馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)為原料，采用現代微生物發(fā)酵技術，結合組合化學手段，尋找具有治療人類腫瘤疾病藥用成分另一類生物資源提供一種新途徑。
本發(fā)明經“體外抗腫瘤試驗”結果對人骨髓白血病細胞K562的抑制生長率為74.86％，人白血病淋巴細胞MT-4的抑制率67.78％；對人肝癌細胞CA的抑制率77.73％；對人肺癌細胞HAS-84的抑制率62.5％。同時還發(fā)現有保濕和抑制黑色素形成，防止皮膚粗糙的作用。


圖1為YM37846菌絲體形態(tài)圖。
具體實施例方式
本發(fā)明實施例取編號YM37846菌種，在無菌條件下(無菌室或超凈工作臺)，用接種針挑取少許菌種，轉接于已滅菌的固體PDA培養(yǎng)基試管(18×180mm)中，置培養(yǎng)箱內28℃±2℃活化培養(yǎng)48-72小時。
取出活化48-72小時的菌種，在無菌條件下，以同樣方式接入活化好的菌種到已滅菌的種子液體PDA培養(yǎng)基中，在30℃±2℃下搖床培養(yǎng)72-96小時，即為YM37846種子。
發(fā)酵采用500毫升玻璃三角瓶，裝入配制好的液體PDA培養(yǎng)基100毫升，15磅滅菌30分鐘后，取出待冷卻至30℃。在無菌條件下，取YM37846種子，接種于裝有100毫升液體PDA培養(yǎng)基的500毫升玻璃三角瓶中，種子接種量為5-10％(v/w)，置30℃±2℃通氣培養(yǎng)5-7天。在發(fā)酵期間，注意發(fā)酵室溫度變化，檢查有無染菌現象。
發(fā)酵完畢，過濾，收集菌體和發(fā)酵液。按常規(guī)化學提取方法，采用乙酸乙酯萃取發(fā)酵液，菌體用乙酸乙酯浸泡過夜，提取三次。采用硅膠(Silica G)柱層析方法分離純化獲得抑制上述4種腫瘤細胞生長的神經酰胺類及長春堿類化合物。
本發(fā)明所述的YM37846菌株18SRNA堿基組成系列NGNNNTGCTANTTTNNGTNAAANTNANNNACNTNNTCTNCNCTACNNNGNNAANNNCAATNNTGGATTTAATNNNGTNGCNGANNGNNAGAANNTNCCNGTNTCGCNANTGATTGNNNNAANTNNNCTNTTTNTCCNGNACTGGCNGAATNAACCAGGGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTTCGGNGNTGACTGGTGATTCATGATANCTCCTCTAATCGNATGGNCTTGNGCCGGCGATGGNTCATTNAAATTTNTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTCATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGTGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCAGGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGCCAGCGAGTACTTCCTTGTCCGAAAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACTCCGTCGTGCTGG
GGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCGTCCGGACTGGCCCAGAGAGGTGGGCANCTACCACTCAGGGCCGGAAAGCTCNCCTGGT.
權利要求
1.一種鐮孢霉菌，其特征在于命名為Fusarium sp.Ym 37846，保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC NOM203065。
2.根據權利要求1所述的一種鐮孢霉菌，其特征在于所述的YM37846菌株18SRNA堿基組成系列NGNNNTGCTANTTTNNGTNAAANTNANNNACNTNNTCTNCNCTACNNNGNNAANNNCAATNNTGGATTTAATNNNGTNGCNGANNGNNAGAANNTNCCNGTNTCGCNANTGATTGNNNNAANTNNNCTNTTTNTCCNGNACTGGCNGAATNAACCAGGGTATTTATTAGATTAAAAACCAATGCCCTTCGGNGNTGACTGGTGATTCATGATANCTCCTCTAATCGNATGGNCTTGNGCCGGCGATGGNTCATTNAAATTTNTTCCCTATCAACTTTCGATGTTTGGGTATTGGCCAAACATGGTTGCAACGGGTAACGGAGGGTTAGGGCTCGACCCCGGAGAAGGAGCCTGAGAAACGGCTACTACATCCAAGGAAGGCAGCAGGCGCGCAAATTACCCAATCCCGACACGGGGAGGTAGTGACAATAAATACTGATACAGGGCTCTTTTGGGTCTTGTCATTGGAATGAGTACAATTTAAATCCCTTAACGAGGAACAATTGGAGGGCAAGTCTGGTGCCAGCAGCCGCGGTAATTCCAGCTCCAATAGCGTATATTAAAGTTGTTGTGGTTAAAAAGCTCGTAGTTGAACCTTGGGCCTGGCTGGCCGGTCCGCCTCACCGCGTGTACTGGTCCGGCCGGGCCTTTCCCTCTGTGGAACCCCATGCCCTTCACTGGGTGTGGTGGGGAAACAGGACTTTTACTGTGAAAAAATTAGAGTGCTCCAGGCAGGCCTATGCTCGAATACATTAGCATGGAATAATAGAATAGGACGTGTGGTTCTATTTTGTTGGTTTCTAGGACCGCCGTAATGATTAATAGGGACAGTCGGGGGCATCAGTATTCAATTGTCAGAGGTGAAATTCTTGGATTTATTGAAGACTAACTACTGCGAAAGCATTTGCCAAGGATGTTTTCATTAATCAGGAACGAAAGTTAGGGGATCGAAGACGATCAGATACCGTCGTAGTCTTAACCATAAACTATGCCGACTAGGGATCGGACGGTGTTATTTTTTGACCCGTTCGGCACCTTACGAGAAATCAAAGTGCTTGGGCTCCACGGGGAGTATGGTCGCAAGGCTGAAACTTAAAGAAATTGACGGAAGGGCACCACCAGGGGTGGAGCCTGCGGCTTAATTTGACTCAACACGGGGAAACTCACCAGGTCCAGACACAATGAGGATTGACAGATTGAGAGCTCTTTCTTGATTTTGTGGGTGGTGGTGCATGGCCGTTCTTAGTTGGTGGAGTGATTTGTCTGCTTAATTGCGATAACGAACGAGACCTTAACCTGCTAAATAGCCCGTATTGCTTTGGCAGTACGCTGGCTTCTTAGAGGGACTATCGGCTCAAGCCGATGGAAGTTTGAGGCAATAACAGGTCTGTGATGCCCTTAGATGTTCTGGGCCGCACGCGCGCTACACTGACGGAGCCAGCGAGTACTTCCTTGTCCGAAAGGTCCGGGTAATCTTGTTAAACTCCGTCGTGCTGGGGATAGAGCATTGCAATTATTGCTCTTCAACGAGGAATCCCTAGTAAGCGCAAGTCATCAGCTTGCGTTGATTACGTCCCTGCCCTTTGTACACACCGCCCGTCGCTACTACCGATTGAATGGCTCAGTGAGGCGTCCGGACTGGCCCAGAGAGGTGGGCANCTACCACTCAGGGCCGGAAAGCTCNCCTGGT
3.根據權利要求1所述的鐮孢霉菌，其特征在于所述的鐮孢霉菌的固體培養(yǎng)特征1、PDA培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑42mm，7天52mm，11天蔓延整個培養(yǎng)皿。菌絲白色，中部淺黃色微突，平長茸狀，生長緊密，邊緣整齊，背面淡黃色，后為褐色。2、麥芽汁培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑35mm，7天69mm，11天蔓延整個培養(yǎng)皿。菌絲淺紅色，邊緣白色，菌落平絮茸狀，生長緊密，邊緣整齊，背面淺褐色。3、察貝克培養(yǎng)基28℃培養(yǎng)4天，菌落直徑19mm，7天34mm，11天40mm。菌絲白色，中部緊密，扁平，凹陷，有的凸凹不平，短茸狀，邊緣彌散，不整齊，背面中部褐色，外緣黃色，邊緣白色。
全文摘要
本發(fā)明涉及微生物技術領域，特別是涉及一種其發(fā)酵物具有藥用功能的微生物。本發(fā)明所述的鐮孢霉菌命名為Fusarium sp.Ym 37846，保藏在國家知識產權局指定的保藏單位，保藏編號為CCTCC NOM203065。本發(fā)明所述的YM37846是從長春花植物體中分離篩選得到的，能夠人工發(fā)酵產生與寄主植物相同或類似化合物的一株絲狀真菌。本發(fā)明是通過長春花內生真菌的純培養(yǎng)，以馬鈴薯培養(yǎng)基(PDA)為原料，采用現代微生物發(fā)酵技術，結合組合化學手段，尋找具有治療人類腫瘤疾病藥用成分另一類生物資源提供一種新途徑。
文檔編號C12N1/14GK1609186SQ200310101180
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月21日 優(yōu)先權日2003年10月21日
發(fā)明者李紹蘭, 陳有為, 夏國興, 李邦良, 楊麗源, 周斌, 李治瀅, 張琦 申請人:杭州夏洋生物工程有限公司