專利名稱：纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法及其設(shè)備的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種纖維素酶固體發(fā)酵方法。
背景技術(shù)：
纖維素酶是水解植物纖維的酶類，由C-1酶、C-x酶和β-葡萄糖苷酶組成，它可以將植物細(xì)胞壁的纖維素逐步降解，直至最后分解生成葡萄糖。因此，纖維素酶廣泛用于很多加工制造行業(yè)，如食品、飲料、飼料、制酒、發(fā)酵、造紙、紡織物后處理，中草藥有效成分提取，石油開采，污水處理等領(lǐng)域，用后無不優(yōu)質(zhì)高產(chǎn)。在植物生物技術(shù)的研究工作中，也經(jīng)常應(yīng)用纖維素酶來水解細(xì)胞壁以便進(jìn)行基因工程和細(xì)胞工程等操作。所以纖維素酶被譽為打開植物寶庫的金鑰匙。纖維素酶在我國目前只有幾家小作坊式的生產(chǎn)廠，遠(yuǎn)不夠市場需求，國內(nèi)需要依賴進(jìn)口，價格昂貴，大大增加了國內(nèi)各行業(yè)的制造成本。所以十分需要大規(guī)模生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)價廉的纖維素酶技術(shù)出現(xiàn)。
目前，國內(nèi)外生產(chǎn)纖維素酶的菌種主要是綠色木霉(一種真菌)的各種變異菌株(經(jīng)誘變或基因工程操作獲得)，木霉的生物學(xué)特性適宜在有氧溫暖和潮濕的靜止環(huán)境下生長，這規(guī)定了它的發(fā)酵條件，因此木霉不適合液體發(fā)酵，需要進(jìn)行固體發(fā)酵。國內(nèi)外的諸多研究證明，固體比液體發(fā)酵產(chǎn)酶量多70％以上，酶活高，酶的質(zhì)量好。但固體發(fā)酵容易污染，這是限制不易大量生產(chǎn)質(zhì)優(yōu)價廉纖維素酶的主要技術(shù)原因。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)技術(shù)，解決固體發(fā)酵容易污染的技術(shù)難題，可實現(xiàn)產(chǎn)量高、質(zhì)優(yōu)價廉。
本發(fā)明的目的是通過如下技術(shù)方案實現(xiàn)的生產(chǎn)步驟如下1、液體制種選擇菌種為綠色木霉AS3.3030工程菌株，發(fā)酵活力為1000單位/克稻草以上；經(jīng)菌種斜面試管、搖瓶擴大培養(yǎng)，發(fā)酵罐再擴大直至所需液體種子量；2、固體發(fā)酵將稻草粉碎至長度4-8mm，取重量比例為85-95∶5-15的稻草粉和麩皮在混料機中拌勻后移入蒸球中，再加入2.5-3倍的營養(yǎng)液，關(guān)閉蒸球，在旋轉(zhuǎn)中滅菌1小時。
將蒸球內(nèi)的滅菌料通過無菌通道送至無菌接種室，然后鋪設(shè)在料盤中，待料溫降至35℃±5℃時接種液體培養(yǎng)基，接種量為料的12-15％(w/w)，將料盤送至發(fā)酵室，在28-30℃的無菌空氣和80-90％的相對濕度條件下培養(yǎng)72小時。
3，制取原酶將發(fā)酵完畢后的物料在50℃-60℃的熱氣流中烘干至物料不再減重為止。干后的物料粉碎過篩80-100目，取篩下物料檢測每克酶活在1000單位以上為合格品。
4、制取液體酶將發(fā)酵后的物料在浸提罐中以5-7倍水在30℃以下浸提，緩慢攪拌，經(jīng)實驗室的壓榨機取樣，榨干物中的殘余酶活小于每克150單位即可；將浸提后的物料經(jīng)車間壓榨機榨干，榨出液經(jīng)超濾機濃縮至每毫升酶活不小于1000單位即可。加1-3‰的苯甲酸鈉保存、包裝。
5、制取粉狀工業(yè)酶將液體酶的榨出液超濾濃縮至每毫升200-250單位酶活，加入重量比例8-10％的白色硫酸銨，在緩慢攪拌下輸入噴霧干燥機，成品酶活在每克2000單位以上即合格。
上述菌種斜面采用馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方比例為每升培養(yǎng)液中含有馬鈴薯160-240克、葡萄糖8-13克、瓊脂14-22克、磷酸二氫鉀2-4克、7水硫酸鎂1.3-1.8克、濾紙粉8-12克，其余為水；上述液體種子培養(yǎng)基配方比例為每升培養(yǎng)液中含有米糠8-12克、麩皮4-6克、硫酸銨1.5-2.5克、磷酸二氫鉀0.8-1.2克、無水氯化鈣0.8-1.2克、葡萄糖3-5克、微量元素溶液9-11毫升。其中微量元素溶液每升中含7水硫酸亞鐵0.4-0.6克、4水二氯化錳0.17-0.21克、7水硫酸鋅0.34-0.38克、6水二氯化鈷0.35-0.39克，自然PH值為5.4。
上述固體發(fā)酵培養(yǎng)液配方比例為每升培養(yǎng)液中含有硫酸銨8-12克、磷酸二氫鉀1-3克、7水硫酸鎂0.4-0.6克、2水氯化鈣0.4-0.6克，溶液PH值為5.4。
生產(chǎn)的主要設(shè)備1，實驗室設(shè)備包括分光光度計、超凈工作臺、滅菌柜、控溫振蕩水浴、控溫培養(yǎng)箱、離心機等。
2，車間設(shè)備蒸球(蒸汽滅菌用)、板筐壓濾機、超濾機、噴霧干燥機、氣流干燥床、粉碎機、振蕩篩、液體種子發(fā)酵罐、包裝機等。
3，固體發(fā)酵設(shè)備及條件(1)，設(shè)置固體發(fā)酵室，內(nèi)涂防霉仿瓷涂料，室內(nèi)設(shè)置裝有發(fā)酵料塑料盤的多層金屬架；發(fā)酵室內(nèi)設(shè)置保溫暖氣和保濕設(shè)備，發(fā)酵時濕度即可達(dá)80-90％，室外設(shè)置溫、濕度指示器；多個發(fā)酵室并聯(lián)，有無菌風(fēng)管道相通，每個發(fā)酵室與輸送無菌風(fēng)的總管相連；發(fā)酵室頂部設(shè)有帶逆止閥的發(fā)酵廢氣排出口，只許廢氣排出，不許進(jìn)入；(2)，固體發(fā)酵接種室接種室設(shè)置在液體種子罐的隔壁，經(jīng)不銹鋼管道將液體培養(yǎng)基送入接種室，接種室經(jīng)嚴(yán)格滅菌并通入無菌風(fēng)，接種室有兩個相對的無菌通道，一個通道輸入裝盤的無菌料，另一通道輸出接種的發(fā)酵料，無菌通道內(nèi)設(shè)有連接蒸球的晾料室與發(fā)酵室的傳送帶。
(3)，從蒸球滅菌出料開始，經(jīng)裝盤晾料、接種，至發(fā)酵完畢，都要在無菌狀態(tài)下進(jìn)行，各工序之間用無菌通道和傳送帶連接，輸入的空氣用高壓鼓風(fēng)機經(jīng)無菌過濾以管道送至各室，以舒適風(fēng)的強度充滿室內(nèi)即可。
本發(fā)明的優(yōu)點實現(xiàn)固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶無污染，生產(chǎn)產(chǎn)量高、質(zhì)優(yōu)價廉。
具體實施例方式
生產(chǎn)步驟如下1、選擇菌種及傳代培養(yǎng)產(chǎn)纖維素酶工程菌，系綠色木霉(Trichoderma sp.)，取自北京中科院微生物所，編號As3.3030。
發(fā)酵活力為1000單位/克稻草以上；經(jīng)常規(guī)的菌種斜面試管、搖瓶擴大、發(fā)酵罐再擴大直至所需液體種子量；
培養(yǎng)基配方菌種斜面采用馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方比例為每升培養(yǎng)液中含有馬鈴薯克200克、葡萄糖10克、瓊脂18克、磷酸二氫鉀3克、7水硫酸鎂1.5克、濾紙粉10克，加水至1000毫升；2、培養(yǎng)條件a，搖瓶，接種時用接種環(huán)將菌絲體刮入搖瓶，在恒溫振蕩水浴上于28-30℃培養(yǎng)48小時，PH值下降到3.0-2.8為止，振蕩速度為110轉(zhuǎn)/分；b，液體種子罐121℃滅菌60分鐘，接種菌絲體，接種量8.9％，培養(yǎng)溫度29-30℃，攪拌速度110轉(zhuǎn)/分，培養(yǎng)時間約48小時，PH值下降到3.0-2.8為止。
液體種子培養(yǎng)基比例為米糠10克、麩皮5克、硫酸銨2克、磷酸二氫鉀1克、無水氯化鈣1克、葡萄糖4克、微量元素溶液10毫升。微量元素溶液每升中含7水硫酸亞鐵0.5克、4水二氯化錳0.19克、7水硫酸鋅0.36克、6水二氯化鈷0.37克，自然PH值為5.4。
3、固體發(fā)酵(1)，培養(yǎng)液每升培養(yǎng)液中含有下列化學(xué)物質(zhì)硫酸銨10克、磷酸二氫鉀2克、7水硫酸鎂0.5克、2水氯化鈣0.5克，此時溶液PH值為5.4。
(2)，取95千克粉碎至5mm的稻草粉，與5千克麩皮在混料機中拌勻后移入蒸球中，再加入3倍的培養(yǎng)液，即300千克，關(guān)閉蒸球，在1.5千克/平方厘米的壓力下滅菌1小時，蒸球同時以每分鐘1轉(zhuǎn)的速度旋轉(zhuǎn)。
(3)，將蒸球內(nèi)的滅菌料通過無菌通道送至無菌接種室，以8-10厘米的厚度鋪在塑料盤中，待料溫降 35℃時接種液體培養(yǎng)基，接種量為料的12-15％(w/w)，將盤送至發(fā)酵室，在28-30℃的無菌空氣和90％的相對濕度條件下培養(yǎng)72小時。
4、制取原酶將發(fā)酵完畢后的原酶在氣流烘干機中以60℃-121℃的熱氣流中烘干，至物料不再減重(在千分之三誤差以內(nèi))為止。干后的物料粉碎80-100目過篩，取篩下物料檢測每克酶活在1000單位以上為合格品。篩上物料可做牛羊飼料。
5、制取液體酶將發(fā)酵后的物料在浸提罐中以7倍水在30℃以下浸提，緩慢攪拌(約每分鐘1轉(zhuǎn))，取樣在實驗室的壓榨機中榨干，榨干物中的殘余酶活小于每克150單位即可(約需1小時)，榨干后的渣每克保持在酶活150單位，還可做飼料添加劑，也避免反復(fù)提取水分太多，超濾費電費時，本工藝綜合經(jīng)濟效益高。浸提后從浸提罐用泵將物料打入車間壓榨機榨干。榨出液經(jīng)超濾機濃縮至每毫升酶活不小于1000單位即可。加1-3‰的苯甲酸鈉保存。包裝。
6、制取粉狀工業(yè)酶將步驟5的榨出液超濾濃縮至每毫升200-250單位酶活，加入8-10％(重量)的白色硫酸銨，在緩慢攪拌下輸入噴霧干燥機，成品酶活在每克2000單位以上即合格。
主要設(shè)備及設(shè)施1、實驗室設(shè)備分光光度計、超凈工作臺、滅菌柜、控溫振蕩水浴、控溫培養(yǎng)箱、離心機等。
2、車間設(shè)備蒸球(蒸汽滅菌用)、板筐壓濾機、超濾機、噴霧干燥機、氣流干燥床、粉碎機、振蕩篩、液體種子發(fā)酵罐、包裝機等。
3、固體發(fā)酵室及發(fā)酵盤固體發(fā)酵室為圓形，水泥結(jié)構(gòu)，內(nèi)涂防霉仿瓷涂料，高2-2.5米，直徑4.5-5米(約15-20平方米)。墻上裝有可折疊鋁合金架，架上能放裝有發(fā)酵料的塑料盤，架共三層。發(fā)酵室用暖氣保溫，發(fā)酵時濕度即可達(dá)80-90％(相對)，室外要設(shè)置溫、濕度指示器。多個發(fā)酵室成并聯(lián)設(shè)置，有無菌風(fēng)管道相通，每發(fā)酵室底部有無菌風(fēng)支管進(jìn)入口，支管另端與輸送無菌風(fēng)的總管相連。發(fā)酵室頂部有發(fā)酵廢氣排出口，排出口設(shè)有不銹鋼網(wǎng)與逆止伐，只許廢氣排出，不許進(jìn)入。發(fā)酵室內(nèi)不必設(shè)加水及排水設(shè)施，發(fā)酵濕度可以滿足需要。發(fā)酵室壁設(shè)有玻璃窗可觀察真菌生長情況。發(fā)酵盤材質(zhì)為硬質(zhì)無毒塑料，長寬高為100×40×15厘米。
4，固體發(fā)酵接種室接種室設(shè)置在液體種子罐的隔壁，經(jīng)不銹鋼管由管的出料口排入接種室的容器中，接種室經(jīng)嚴(yán)格滅菌并通入無菌風(fēng)，接種室有兩個相對的無菌通道，一個通道輸入裝了盤的無菌料，另一通道輸出接了種的發(fā)酵料，無菌通道設(shè)有傳送帶，一頭與蒸球的晾料室相連，一頭與發(fā)酵室相連。
5、滅菌接種和固體發(fā)酵工藝路線此一工藝路線從滅菌出料開始，至發(fā)酵完畢，都要在無菌狀態(tài)下進(jìn)行。工序之間用無菌通道和傳送帶連接，輸入的空氣用高壓鼓風(fēng)機經(jīng)無菌過濾以管道送至各室，以舒適風(fēng)的強度充滿室內(nèi)即可，以箭頭示之如下蒸球滅菌出料→裝盤晾料至35℃→接種→輸入發(fā)酵室發(fā)酵—→產(chǎn)品分析檢測方法為品了檢測一般只需分析總酶活即可。酶的其他組分分析不是為了研究不常用。纖維素酶的分析方法在一般書中都能查到，下面只提一下方法名稱。
總酶活以濾紙做底物，用3、5-二硝基水楊酸比色法，又稱濾紙酶活。測定酶的總活力。
C1酶活以脫脂棉做底物，仍用上述二硝基水楊酸法，測定酶對長纖維的斷裂能力。
Cx酶活以羧甲基纖維素鈉(CMC)為底物，仍用二硝基水楊酸法，測定將長纖維素鏈水解成纖維寡糖的能力。
β-葡萄糖苷酶活以水楊苷為底物，仍用上述比色法，測定將纖維寡糖水解成單糖的能力。
還有許多輔助酶如果膠酶、半纖維素酶、淀粉酶、蛋白酶、木聚糖酶等在纖維素酶應(yīng)用上均有作用。沒有特殊目的一般不作測定。
權(quán)利要求
1.一種纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征是生產(chǎn)步驟如下(1)、液體制種選擇菌種為綠色木霉AS3.3030工程菌株，發(fā)酵活力為1000單位/克稻草；經(jīng)菌種斜面試管、搖瓶擴大培養(yǎng)，發(fā)酵罐再擴大直至所需液體種子量；(2)、固體發(fā)酵將稻草粉粉碎至1.5mm，取重量比例為85-95∶5-15的稻草粉和麩皮在混料機中拌勻后移入蒸球中，再加入2.5-3倍的培養(yǎng)液，關(guān)閉蒸球，在旋轉(zhuǎn)中滅菌1小時。將蒸球內(nèi)的滅菌料通過無菌通道送至無菌接種室，然后鋪設(shè)在特制的塑料盤中，待料溫降至40℃-35℃時接種種子液，接種量為料的12-15％(w/w)，將盤送至發(fā)酵室，在28-30℃的無菌空氣和*-90％的相對濕度條件下培養(yǎng)三天。(3)，制取原酶將發(fā)酵完畢后的物料在60℃-121℃的熱氣流中烘干至物料不再減重為止。干后的物料粉碎過篩80-100目，取篩下物料檢測每克酶活在1000單位以上為合格品。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征是將發(fā)酵后的物料在浸提罐中以7倍水在30℃以下浸提，緩慢攪拌，取樣在實驗室的壓榨機中榨干，榨干物中的殘余酶活小于每克150單位即可，榨干后的渣每克保持在酶活150單位，浸提后從浸提罐用泵將物料打入壓榨機榨干，榨出液經(jīng)超濾機濃縮至每毫升酶活不小于1000單位即可，加1-3‰的苯甲酸鈉保存、包裝，即制成液體酶。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征是將液體酶的榨出液超濾濃縮至每毫升200-250單位酶活，加入重量比例8-10％的白色硫酸銨，在緩慢攪拌下輸入噴霧干燥機，成品酶活在每克2000單位以上即合格，制取粉狀工業(yè)酶。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征是菌種斜面采用馬鈴薯培養(yǎng)基，培養(yǎng)基配方比例為每升培養(yǎng)液中含有馬鈴薯160-240克、葡萄糖8-13克、瓊脂14-22克、磷酸二氫鉀2-4克、7水硫酸鎂1.3-1.8克、濾紙粉8-12克，其余為水；
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征是液體種子培養(yǎng)基配方比例為每升培養(yǎng)液中含有米糠8-12克、麩皮4-6克、硫酸銨1.5-2.5克、磷酸二氫鉀0.8-1.2克、無水氯化鈣0.8-1.2克、葡萄糖3-5克、微量元素溶液9-11毫升。其中微量元素溶液每升中含7水硫酸亞鐵0.4-0.6克、4水二氯化錳0.17-0.21克、7水硫酸鋅0.34-0.38克、6水二氯化鈷0.35-0.39克，自然PH值為5.4。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法，其特征是固體發(fā)酵培養(yǎng)液配方比例為每升培養(yǎng)液中含有硫酸銨8-12克、磷酸二氫鉀1-3克、7水硫酸鎂0.4-0.6克、2水氯化鈣0.4-0.6克，溶液PH值為5.4。
7.一種纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法的設(shè)備，包括控制培養(yǎng)箱、離心機等實驗室設(shè)備和蒸球、壓濾機、超濾機、干燥機、液體種子發(fā)酵罐等車間設(shè)備，其特征是并設(shè)置固體發(fā)酵室，內(nèi)涂防霉仿瓷涂料，室內(nèi)設(shè)置裝有發(fā)酵料塑料盤的多層金屬架；發(fā)酵室內(nèi)設(shè)置保溫暖氣和保濕設(shè)備，室外設(shè)置溫、濕度指示器；數(shù)個發(fā)酵室排串聯(lián)，有無菌風(fēng)管道相通，每個發(fā)酵室底部有與輸送無菌風(fēng)的總管相連的無菌風(fēng)支管進(jìn)入口；發(fā)酵室頂部設(shè)有帶逆止閥的發(fā)酵廢氣排出口；固體發(fā)酵接種室設(shè)置在液體種子罐的隔壁，經(jīng)不銹鋼管由管的出料口排入接種室的容器中，接種室有兩個相對的無菌通道，一個通道輸入裝盤的無菌料，另一通道輸出接種的發(fā)酵料，無菌通道內(nèi)設(shè)有連接蒸球的晾料室與發(fā)酵室的傳送帶。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法使用的設(shè)備，其特征是固體發(fā)酵室為圓形水泥結(jié)構(gòu)，內(nèi)涂防霉仿瓷涂料，高2-2.5米，直徑4.5-5米。
9.根據(jù)權(quán)利要求7所述的纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法使用的設(shè)備，其特征是發(fā)酵盤材質(zhì)采用無毒塑料，長寬高分別為100厘米、40厘米和15厘米。
全文摘要
一種纖維素酶固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)方法，選擇綠色木霉工程菌株，經(jīng)菌種斜面試管、搖瓶擴大培養(yǎng)，發(fā)酵罐再擴大直至所需液體種子量，固體發(fā)酵，通過無菌通道送至無菌接種室，然后鋪設(shè)在塑料盤中接種培養(yǎng)基，培養(yǎng)72小時，制取原酶，發(fā)酵后的物料浸提，浸提后榨干，榨出液濃縮，加苯甲酸鈉制成液體酶，將液體酶的榨出液超濾濃縮，加入白色硫酸銨，干燥制成粉狀工業(yè)酶。本發(fā)明的優(yōu)點是實現(xiàn)固體發(fā)酵大規(guī)模生產(chǎn)纖維素酶無污染，生產(chǎn)產(chǎn)量高、質(zhì)優(yōu)價廉。
文檔編號C12N9/24GK1528890SQ20031010481
公開日2004年9月15日 申請日期2003年10月10日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月10日
發(fā)明者陳欣, 陳紅漫, 陳祖潔, 曹淡君, 王元志, 陳 欣 申請人:陳欣, 陳 欣