專利名稱：一種枯草芽孢桿菌及應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種枯草芽孢桿菌及其在石油餾分油深度脫硫中應(yīng)用。
背景技術(shù)：
化石燃料中所含的硫化物燃燒時排放出大量的二氧化硫等毒性氣體，由此轉(zhuǎn)化成的大面積酸雨嚴重污染大氣和水源，破壞生態(tài)平衡，危害人類生存?；剂现械挠袡C硫化合物成分復(fù)雜，大部分是雜環(huán)化合物，其中的C-S化學(xué)共價鍵十分牢固，用常規(guī)的物理和化學(xué)方法難以有效地除去雜環(huán)中的有機硫，成本也較高。
近年來，國際上迅速發(fā)展的生物脫硫(Biodesulfurization，簡稱BDS)技術(shù)將成為降低石油產(chǎn)品硫含量的有效途徑。BDS可廣泛用于處理汽油、餾分油、催化裂解原料油和渣油。BDS可以與已有的化學(xué)法加氫脫硫技術(shù)(Hydrodesulfurization，簡稱HDS)裝置有機結(jié)合，最大限度地減少氫氣的生產(chǎn)費用，并改善HDS裝置的操作。另外，由于BDS過程中的副產(chǎn)物有機硫產(chǎn)品的價值較高，預(yù)計BDS比HDS在經(jīng)濟上有更強的競爭力。BDS在常溫常壓下操作，能耗比HDS低70-80％，采用BDS技術(shù)的投資額約為HDS的50％，操作費用比HDS低10-25％。
由于二苯并噻吩(Dibenzothiophene，簡稱DBT)是化石燃料中含量高、難降解的有機硫化物的典型代表，所以一直被作為模式化合物來研究。人們對微生物降解DBT的途徑提出各種解釋，可以概括為兩種路線。一種是由Kodama等提出的C-C鍵斷裂氧化途徑[Kodama K K，et al.，Agric.Biol.Chem.，1973，3745]，也稱破壞性路線，即DBT的C-C鍵斷裂后形成水溶性含硫化合物從油中脫出。這樣脫去的不僅是硫本身，而是整個含硫雜環(huán)，這就會降低液體收率，同時也會降低有價值烴的燃燒值；另一種是C-S鍵斷裂氧化的非破壞性路線，即DBT依次被氧化為亞砜(Sulfoxide)、砜(Sulfone)、亞磺酸鹽(Sulfinate)和硫酸鹽(Sulphate)，因此稱為“4S”代謝途徑[Kilbane JJ，Trends Biotechnol，1989，797]。由于后來該途徑在R.rhodochrous IGTS8菌株進一步證實，所以又稱IGTS8途徑[Denome S A，et al.，Appl.Environ.Microbiol.，1993，59(9)2837]。其特點是DBT中的硫被氧化為硫酸鹽轉(zhuǎn)入到水相，而其骨架結(jié)構(gòu)則氧化成羥基聯(lián)苯留在油相，沒有碳的損失。因此，C-S鍵斷裂氧化途徑更具有應(yīng)用價值。1999年，L.Setti等對R.rhodochrous IGTS8降解DBT的“4S”途徑途徑作了進一步分析[L Setti，et al，Appl Mierobiol Biotechnol，1999，52111～117]指出IGTS8菌株的“4S”途徑有兩條不同路線第一條路線DBT被轉(zhuǎn)化成DBT亞砜和DBT砜。砜在亞硫酸水解酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?-(2’-羥基苯)苯亞磺酸[2-(2’-hydroxyphenyl)benzene sulfinate]，進一步形成2-羥基聯(lián)苯(2-HBP)和亞硫酸。第二條路線中砜進一步氧化成2-(2’-羥基苯)苯磺酸[2-(2’-hydroxyphenyl)benzene sulfone]，后者在磺酸水解酶的作用下轉(zhuǎn)變?yōu)?，2-二羥基聯(lián)苯(DHBP)和硫酸。
美國天然氣研究所(簡稱IGT)分離的紅平紅球菌Rhodococcusrhodochrous IGTS8(J.J.Kilbane & B.A.Bielaga.Chemtech，1990)，可有效地脫除二苯噻吩結(jié)構(gòu)中的有機硫，且不損失該有機物的熱值，是一株有商業(yè)價值的菌株。日本也分離到幾株紅平紅球菌(Izumi Y，et al.Appl.Environ.Microbiol，1994)。南韓國立重點科技研究所1998年分離到一株與紅平紅球菌很類似的諾卡氏菌Norcardia sp.，可用于油品脫有機硫，很有應(yīng)用前景(J.H.Chang et al.Biotechnol，1998)。紅平紅球菌專一性的脫硫途徑已從酶學(xué)和分子遺傳學(xué)上所證實(Piddington C S et al.Appl.Environ.Microbiol，1995；Gray K A，et al Nature Biotechnol，1996)。
盡管人們分離到各種脫硫微生物，但它們的脫硫能力有限，還要經(jīng)過誘變篩選或進行分子水平改良，或提供新類型的脫硫微生物。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提供一種新型脫硫微生物，能夠?qū)Ｒ谎趸瘮嗔袰-S鍵，提高脫硫能力，用于石油餾分中有機硫的脫除過程。
本發(fā)明新型脫硫微生物菌株及變異體為枯草芽孢桿菌Bacillussubtilis Fds-1，CGMCC No.0644。(下面簡稱B.Subtilis Fds-1)該B.SubtilisFds-1菌株的形態(tài)特征為革蘭氏陽性，桿狀；有亞端生芽孢，芽孢圓形，孢束膨大，細胞直徑小于1μm。
該B.Subtilis Fds-1菌株的生理生化特征見表1。
表1 B.Subtilis Fds-1菌株的生理生化特征

本發(fā)明的脫硫菌株與其它生物脫硫的專利菌種不同，與紅球菌Rhodococcus rhodochrous ATCC 53968、諾卡氏菌Nocardia sp、節(jié)桿菌Arthrobacter sp等相比，親緣關(guān)系較遠，不是同一屬的微生物；與專利US4,632,906中提出的Bacillus Sulfacportare ATCC 39909菌株相比，雖然是同屬，但不是同種。而且本發(fā)明的B.Subtilis Fds-1菌株是經(jīng)過紫外線處理的突變菌株，它與普通的枯草芽孢桿菌的區(qū)別是可以耐受較高的溫度。
本發(fā)明的菌株可以用于石油或石油餾分的脫硫過程，如汽油、煤油、柴油、減壓餾分油、渣油、各種原油等的脫硫過程。脫硫過程可以采用生長細胞和休止細胞兩種方法脫硫，具體過程與其它菌株脫硫方法相同。
本發(fā)明提供的菌株是一種新型枯草芽孢桿菌，具有專一氧化斷裂有機硫化物中的C-S鍵。因此，B.Subtilis Fds-1菌株可作為生物催化劑，專一性斷裂含硫有機化合物中的C-S鍵，脫除硫原子，特別適合于石油餾分油的深度脫硫。該菌株通過4S途徑脫除石油或石油餾分油中的有機硫，而不破壞其C-C骨架，因而不向其它微生物脫硫那樣降低烴的燃燒值。并且脫硫功能強，具有工業(yè)應(yīng)用價值。
本發(fā)明提供的B.SubtilisFds-1菌株，己于2001年10月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，其簡稱為CGMCC，保藏編號為CBMCC No.0644。
具體實施例方式
下面具體說明本發(fā)明微生物菌株的誘變篩選過程，以及應(yīng)用效果。
本發(fā)明的B.subtilisFds-1菌株是從高硫油井附近的土壤中分離并經(jīng)過紫外線誘變篩選得到的。篩選方法如下在中國勝利石油管理局孤島油田的高硫油井附近，選幾十個代表地點。先除去表層土，再從10-20cm深處取土樣30-50g，裝入無菌紙袋。將1g土樣加入100ml基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中(成分，重量百分比KH2PO4，0.4％；Na2HPO4，0.4％；NH4Cl，0.2％；MgCl2·6H2O，0.02％；CaCl2·2H2O，0.0001％；FeCl3·6H2O，0.0001％；無硫碳源，0.1～0.3％)。30℃培養(yǎng)2～3天，靜置后取上層液體1ml，加入富集培養(yǎng)基中(其成分為上述基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中加0.01％～0.05％DBT)。
在富集培養(yǎng)基中30℃培養(yǎng)2～3天后在含有DBT的瓊脂平板上劃線分離單菌落。得到的單菌落做進一步的代謝途徑分析，鑒別是否以4S途徑降解DBT。其鑒別方法如下將在富集培養(yǎng)基培養(yǎng)2～3天的菌液離心除菌體，取上清液并將其pH調(diào)至8.0，加少量Gibb’s試劑，呈現(xiàn)藍色是二羥基聯(lián)苯的專一反應(yīng)，說明培養(yǎng)液中有DBT的降解產(chǎn)物存在。
對篩選到的脫硫菌株進行了紫外線誘變處理，方法如下將篩選到的枯草芽孢桿菌接入基礎(chǔ)鹽加DBT的富集培養(yǎng)基中，28-30℃振蕩培養(yǎng)2天。取上述培養(yǎng)液離心，收集細胞，再用生理鹽水洗滌后制成菌懸液。分裝10mL菌懸液在培養(yǎng)皿中，置30w紫外燈下，距20cm照射1～6min，每隔30秒取樣。不同紫外線(U.V)處理時間的菌液梯度稀釋后涂布在培養(yǎng)皿上，與沒經(jīng)照射的對照細胞涂布培養(yǎng)皿一起培養(yǎng)2天。通過這些培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)可以計算不同照射時間的致死率。選致死率在70％左右的存活細胞進行單菌落擴大培養(yǎng)后，接入搖瓶作脫硫能力對比。從對比實驗中選出脫硫能力強的突變株即為本發(fā)明的脫硫菌株B.Subtilis Fds-1。
本發(fā)明菌株用于石油餾分脫硫可以采用如下過程。用生長細胞脫硫過程為菌種培養(yǎng)→加入待處理油品→常溫處理→分離油相。用休止細胞脫硫過程為菌種培養(yǎng)→收集細胞→懸浮于磷酸鹽緩沖液中→加入待處理油品→常溫處理→分離油相。具體過程如下。
本發(fā)明采用生長細胞和休止細胞兩種工藝對模型化合物(如DBT)或柴油脫硫。生長細胞脫硫利用加入適量有機硫(如DBT)的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基作為培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基；接種量為5％，培養(yǎng)溫度30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)48小時。然后加入10％待處理柴油，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24小時，分離柴油。休止細胞脫硫利用加入適量有機硫(如DBT)的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基作為培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基；接種量為5％，培養(yǎng)溫度30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)48小時。離心收集菌體，用pH7.2的磷酸鹽緩沖液重懸細胞，按油水比1∶5加入柴油，200rpm振蕩培養(yǎng)8小時，分離柴油，測定硫含量。上述條件可以根據(jù)具體情況進行調(diào)整。
下面通過實施具體說明。
實施例1枯草芽孢桿菌B.Subtilis的篩選方法。
(1).取基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基10ml，加2mM DBT，接入土樣5g。振蕩1分鐘，沉淀30分鐘。用吸管取出上清液接入肉湯培養(yǎng)基，28-30℃培養(yǎng)24-48小時。
(2).將上述培養(yǎng)菌種分別接種到以DBT為唯一硫源的選擇培養(yǎng)基中，30℃培養(yǎng)48小時。再進一步富集培養(yǎng)2～3天，取培養(yǎng)液離心，上清液作Gibb’s分析，呈現(xiàn)蘭色說明培養(yǎng)物中含有可以專一性將DBT轉(zhuǎn)化為2-HBP的菌株，或用氣相色譜/質(zhì)譜分析檢測2-羥基聯(lián)苯，判斷專一性脫硫菌種存在。
(3).對上步檢測呈現(xiàn)陽性的脫硫微生物劃線分離，并對單菌落進行純培養(yǎng)。
(4).對純培養(yǎng)的菌株再做進一步的脫硫驗證試驗，然后對有脫硫能力的菌株進行分類學(xué)鑒定。本發(fā)明通過上述步驟分離、篩選出的脫硫微生物定名為枯草芽孢桿菌B.Subtilis。
實施例2對篩選到的B.Subtilis菌株進行紫外線誘變篩選。
以實施例1分離到的B.Subtilis菌株為出發(fā)菌株，經(jīng)紫外線(U.V)誘變，篩選脫硫能力強的突變株B.Subtilis Fds-1，方法如下(1).測定紫外線照射致死率將分離到的具有脫硫能力的枯草芽孢桿菌接入基礎(chǔ)鹽加DBT的富集培養(yǎng)基中，28-30℃振蕩培養(yǎng)2天。取上述培養(yǎng)液離心，收集細胞。再用生理鹽水洗滌后制成菌懸液。取10ml菌懸液于帶磁轉(zhuǎn)子的培養(yǎng)皿中，置20w的紫外燈下，垂直距離30cm照射6分鐘。每隔30秒取樣。不同照射時間的菌液分別用生理鹽水稀釋，與沒經(jīng)照射的對照細胞同時涂布于基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基培養(yǎng)皿，30℃培養(yǎng)2-3天。通過這些培養(yǎng)皿上生長的菌落數(shù)，可以計算不同U.V照射時間的致死率。U.V照射3分鐘的致死率在70％左右，此劑量下的存活細胞更容易積累有利變異。
(2).紫外線誘變按前述方法，分裝10mL菌懸液在培養(yǎng)皿中，紫外線照射3分鐘。將存活細胞進行單菌落擴大培養(yǎng)后，接入搖瓶作脫硫能力對比。
(3).突變株B.Subtilis Fds-1的篩選如果所選的菌株將以4S途徑降解DBT，產(chǎn)生二羥基聯(lián)苯(2-HBP)，可以用Gibbs反應(yīng)檢測出來。2-HBP在堿性條件下與Gibbs試劑(2，6-二氯醌亞胺)反應(yīng)生成藍色靛酚衍生物。其濃度與顏色成正比。Gibbs反應(yīng)方法如下用10％的Na2CO3溶液將菌液pH調(diào)至8.0，然后離心除菌體，取上清5mL，加入Gibbs試劑50μL，30℃反應(yīng)30分鐘后，溶液呈亮藍色，即為陽性反應(yīng)。測量其610nm處吸光度。測定發(fā)酵液中2-HBP的含量。
脫硫活力的測定以單位時間一定量的菌體降解DBT產(chǎn)生2-HBP的量來比較脫硫活力將培養(yǎng)液離心后用pH7.0緩沖液洗滌，加DBT溶液，于30℃恒溫振蕩反應(yīng)1h。測定2-HBP的生成量。從200個具有脫硫能力的突變株中，選定一個脫硫能力較強的菌株，菌株編號為B.subtilis Fds-1。
實施例3B.Subtilis Fds-1菌株的生長細胞脫硫。
(1)將B.Subtilis Fds-1菌株按10％接種量接入到含有0.5～1.0mM DBT的50ml基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基中(組分為每升蒸餾水中含有10.0g葡萄糖，4.0g NH4Cl，6.3g KH2PO4，8.0g K2HPO4，0.2g MgCl2·6H2O，1.0ml金屬鹽溶液和1.0ml維生素混合液。其中，金屬鹽溶液為2.0g CaCl2，1.0g NaCl，0.5g FeCl2·4H2O，0.5g ZnCl2，0.5g MnCl2·4H2O，0.1g Na2MoO4·2H2O，0.05g CuCl2，0.05g Na2WO4·2H2O和10ml 10M HCl溶于1升蒸餾水的溶液；維生素混合液是400mg泛酸鈣，200mg肌醇，400mg煙酸，400mg鹽酸吡哆辛，200mg對氨基苯甲酸和0.5mg維生素B12溶于1升蒸餾水的溶液)。在30℃，200rpm搖床培養(yǎng)48小時，測培養(yǎng)物中菌體濃度與產(chǎn)物2-HBP的含量。
(2)菌濃測定利用細胞干重與細胞懸液在660nm的光密度(OD660)之間的線性關(guān)系，通過測定培養(yǎng)物的OD值得出。
(3)B.Subtilis Fds-1菌株如上所述經(jīng)過48h生長，菌體濃度可達到1.4～1.5g/L。平均比脫硫活性0.0907～0.1076mM/g干細胞/h；DBT脫除率可達98.8％。
實施例4B.SubtilisFds-1菌株的休止細胞和生長細胞進行柴油脫硫?qū)嶒灐?br> 本發(fā)明菌株用于石油餾分脫硫可以采用如下具體過程。生長細胞脫硫利用加入適量有機硫(實驗中采用DBT)的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(同實施例3)作為培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基；接種量為5％，培養(yǎng)溫度30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)48小時。然后加入10％待處理柴油，30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)24小時，分離柴油。休止細胞脫硫利用加入適量有機硫(實驗中采用DBT)的基礎(chǔ)鹽培養(yǎng)基(同實施例3)作為培養(yǎng)細胞的培養(yǎng)基；接種量為5％，培養(yǎng)溫度30℃，200rpm振蕩培養(yǎng)48小時。離心收集菌體，用pH7.2的磷酸鹽(實驗中采用磷酸氫鈉)緩沖液重懸細胞，按油水比1∶5加入柴油，200rpm振蕩培養(yǎng)8小時，分離柴油，測定硫含量。
按上述方法，用B.Subtilis Fds-1分別對不同規(guī)格柴油進行生物脫硫。
表2數(shù)據(jù)表明，用B.Subtilis Fds-1菌株對4#柴油(含硫量200μg/g)進行生長細胞脫硫，48h內(nèi)可使硫含量降至40.1μg/g，脫除率達到79.9％。比未誘變的生長細胞脫硫率提高25.3％。
表2 B.subtiiis菌株誘變前后的脫硫性能比較

表3結(jié)果表明B.Subtilis Fds-1菌株休止細胞的平均脫硫率比生長細胞高10％。最高脫硫率可以達到90％以上，說明該菌的休止細胞脫除有機硫能力更強。
表3 B.Subtillis Fds-1菌株的生長細胞和休止細胞脫硫?qū)Ρ?

權(quán)利要求
1.一種枯草芽孢桿菌株Bacillus subtilis Fds-1，CGMCC No.0644。
2.按照權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于菌株的形態(tài)特征為革蘭氏陽性，桿狀；有亞端生芽孢，芽孢圓形，孢束膨大，細胞直徑小于1μm。
3.按照權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于菌株的生理生化特征如下表
4.按照權(quán)利要求1所述的菌株，其特征在于所述的菌株從高硫油井附近的土壤中分離并經(jīng)過紫外線誘變篩選得到的。
5.權(quán)利要求1所述菌株在石油或石油餾分脫硫中的應(yīng)用。
6.按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于所述的石油或石油餾分為汽油、煤油、柴油、減壓餾分油、渣油或原油。
7.按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于脫硫采用生長細胞脫硫。
8.按照權(quán)利要求5所述的應(yīng)用，其特征在于脫硫采用休止細胞脫硫。
9.按照權(quán)利要求7所述的應(yīng)用，其特征在于采用生長細胞脫硫過程為菌種培養(yǎng)→加入待處理油品→常溫處理→分離油相。
10.按照權(quán)利要求8所述的應(yīng)用，其特征在于采用休止細胞脫硫過程為菌種培養(yǎng)→收集細胞→懸浮于磷酸鹽緩沖液中→加入待處理油品→常溫處理→分離油相。
全文摘要
本發(fā)明涉及的枯草芽孢桿菌Bacillus subtilis Fds－1，2001年10月16日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為CGMCC NO.0644。本發(fā)明菌株從高硫油井附近的土壤中分離并經(jīng)過紫外線誘變篩選得到的。該菌株的生長細胞或休止細胞均可以通過氧化斷裂C－S鍵脫除有機化合物中的有機硫，特別適合于脫除石油餾分油中的有機硫，脫硫率高。
文檔編號C12N1/20GK1609189SQ200310104908
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月24日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月24日
發(fā)明者佟明友, 方向晨, 張全, 李淑蘭 申請人:中國石油化工股份有限公司, 中國石油化工股份有限公司撫順石油化工研究院