專利名稱：一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種櫛孔扇貝的α2巨球蛋白基因及其制備方法。
背景技術(shù)：
α2巨球蛋白(α2-macroglobulin，縮寫為α2M)是動(dòng)物血漿中的一種大分子糖蛋白，它的功能主要表現(xiàn)為清除組織中內(nèi)源或外源性的蛋白酶，并通過調(diào)節(jié)內(nèi)源或外源性蛋白酶的活性廣泛地參與多種生理功能。出現(xiàn)炎癥時(shí)，機(jī)體能誘導(dǎo)合成出豐富的α2巨球蛋白，它進(jìn)入組織，與組織釋放的過量的蛋白酶結(jié)合，并將后者清除，能防止組織被進(jìn)一步破壞。α2M還可以通過抑制侵入機(jī)體的寄生蟲和病原體釋放的多種蛋白酶與毒素，減少其對(duì)宿主的破壞，增強(qiáng)宿主的抗病力，是一種重要的非特異免疫因子。櫛孔扇貝(Chlamys farreri)屬于軟體動(dòng)物門，瓣鰓綱，珍珠貝目，扇貝科，主要分布于亞洲的中國(guó)、朝鮮、韓國(guó)和日本沿海，是我國(guó)北方海水養(yǎng)殖區(qū)最重要的養(yǎng)殖貝類。但隨著近年來養(yǎng)殖病害的不斷加劇，養(yǎng)成期櫛孔扇貝大規(guī)模死亡現(xiàn)象頻繁發(fā)生，造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失，嚴(yán)重威脅了這一產(chǎn)業(yè)的持續(xù)發(fā)展。因此，圍繞櫛孔扇貝大規(guī)模死亡問題的探討已引起養(yǎng)殖界各方的高度關(guān)注。利用傳統(tǒng)育種和分子生物學(xué)手段培育抗逆優(yōu)良品種是當(dāng)務(wù)之急。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因及其制備方法，它能滿足現(xiàn)有技術(shù)的上述需求。
一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因，其特征在于它編碼具有SEQ IDNo.2序列的櫛孔扇貝α2巨球蛋白多肽。
一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因的制備方法，其特征在于先分別以猜測(cè)體引物進(jìn)行和簡(jiǎn)并引物反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，再進(jìn)行3’末端快速克隆和5’末端快速克隆。
本發(fā)明的櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因能用于櫛孔扇貝的抗逆優(yōu)良品種的培育和開發(fā)。


附圖1為櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因的核苷酸序列SEQ ID No.1。
附圖2為根據(jù)櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因的核苷酸序列推導(dǎo)出的櫛孔扇貝α2巨球蛋白氨基酸序列SEQ ID No.2。
具體實(shí)施例方式
根據(jù)節(jié)肢動(dòng)物馬蹄蟹(Limulus polyphemus)α2M基因序列在α2M受體結(jié)合區(qū)選擇猜測(cè)體引物α2MUP(5’-GGT TGT GGT GAA CAA AACATG G-3’)和α2MDN(5’-GTA TCC ATC CAG AAA CCA TCT T-3’)。制備櫛孔扇貝血細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄為cDNA。取2μL上述cDNA作為模板進(jìn)行聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，條件為94℃，2min，1循環(huán)；94℃ 30sec，57.5℃ 30sec，72℃ 1min，30循環(huán)；72℃ 10min，1循環(huán)。得到相應(yīng)受體區(qū)片段1172bp。在α2M誘餌區(qū)設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物BAIT(5’-AAG CCC GTTGTA GAA/G ATI A/C G-3’)與受體結(jié)合區(qū)的巢式引物OUTR(5’-TTC TGTCTC AAT CTT GCT GG-3’)和INR(5’-TGT TGG TGA GAT ACT GAAGG-3’)組合進(jìn)行巢式反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)，條件為94℃1.5min，1循環(huán)；94℃ 30sec，50℃ 45sec，72℃ 1min，35循環(huán)；72℃10min，1循環(huán)。得到相應(yīng)誘餌區(qū)片段，長(zhǎng)度1218堿基對(duì)(base pairs，簡(jiǎn)寫為bp)。
3’末端快速克隆(3’RACE)法克隆α2M基因3’末端用反轉(zhuǎn)錄引物(5’-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC CTT TTT TTT TTT TTT-3’)進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。利用3’末端錨定引物(5’-CTG ATC TAG AGG TAC CGG ATC C-3’)與受體結(jié)合區(qū)巢式引物3OUT(5′-AGG GAG ATG GGA AAT GAC TG-3′)和3IN(5’-CAT CTG TGC ATC ATT TAC TGG-3’)組合進(jìn)行巢式RT-PCR，外側(cè)引物擴(kuò)增條件為94℃，1min，1循環(huán)；94℃ 30sec，55℃ 30sec，72℃ 2min，30循環(huán)；72℃ 10min，1循環(huán)。內(nèi)側(cè)引物擴(kuò)增條件為94℃，1min，1循環(huán)；94℃ 30sec，60℃ 30sec，72℃ 2min，30循環(huán)；72℃ 10min，1循環(huán)。得到相應(yīng)3’末端片段1914bp。
5’末端快速克隆(5’RACE)法克隆α2M基因5’末端利用血細(xì)胞總RNA制備雙鏈cDNA。利用DNA連接酶在雙鏈cDNA 5’末端加接頭(5’-CTA ATA CGA CTC ACT ATA GGG CAG CGT GGT CGC GGC CGAGGT-3’，3’-G CCG GCT CCA-5’)。利用接頭內(nèi)的巢式引物(OUTA5’-CTAATA CGA CTC ACT ATA GGG C-3’；INA5’-AG CGT GGT CGC GGCCGA GGT-3’)和誘餌區(qū)巢式引物(OUTB5’-GAA TTC TTC TTC TAC GATGAC AAG GTC-3’INB5’-GTA TAG CAT CCA CGG TGT TGG TGTC-3’)組合進(jìn)行RT-PCR，外側(cè)引物條件為94℃ 1.5min，1循環(huán)；94℃ 30sec，59℃ 35sec，72℃ 3min，30循環(huán)；72℃ 5min，1循環(huán)。內(nèi)側(cè)引物為94℃ 1min，1循環(huán)；94℃ 30sec，62℃ 35sec，72℃ 3min，30循環(huán)；72℃ 5min，1循環(huán)。得到相應(yīng)5’末端片段2239bp。將上述序列進(jìn)行拼接，獲得該基因及5’末端和3’末端非翻譯區(qū)，全長(zhǎng)6394bp，示于附圖1。其中開放讀碼框從第3位核苷酸到第5159位核苷酸共5157bp，編碼1719氨基酸，示于附圖2。
權(quán)利要求
1.一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因，其特征在于它編碼具有SEQ IDNo.2序列的櫛孔扇貝α2巨球蛋白多肽。
2.一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因的制備方法，其特征在于先以猜測(cè)體引物和簡(jiǎn)并引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，再進(jìn)行3’末端快速克隆和5’末端快速克隆。
全文摘要
一種櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因，其特征在于它編碼具有SEQ IDNo.2序列的櫛孔扇貝α2巨球蛋白多肽。于先以猜測(cè)體引物和簡(jiǎn)并引物進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)，再進(jìn)行3’末端快速克隆和5’末端快速克隆。本發(fā)明的櫛孔扇貝α2巨球蛋白基因能用于櫛孔扇貝的抗逆優(yōu)良品種的培育和開發(fā)。
文檔編號(hào)C12P19/34GK1542134SQ20031010548
公開日2004年11月3日 申請(qǐng)日期2003年11月4日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月4日
發(fā)明者馬洪明, 麥康森, 徐瑋, 劉付志國(guó), 張文兵, 譚北平, 國(guó) 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)