專利名稱：雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種與胞內(nèi)寄生細(xì)菌匹配的DNA疫苗雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pCMVnir，又稱為pCN及其制備方法，屬于生命科學(xué)和醫(yī)學(xué)中DNA疫苗技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
DNA疫苗是一種以DNA重組技術(shù)構(gòu)建的攜帶抗原基因的真核表達(dá)質(zhì)粒，是具有廣泛應(yīng)用前景的第三代疫苗，大量的文獻(xiàn)多角度多方位證實(shí)了DNA疫苗的可行性及其免疫學(xué)機(jī)制，已經(jīng)有7種核酸疫苗經(jīng)FDA批準(zhǔn)進(jìn)入臨床實(shí)驗(yàn)。但作為一種新技術(shù)，DNA疫苗還面臨著一些需要解決的問題，其中一個(gè)重要問題是誘導(dǎo)的免疫應(yīng)答不如預(yù)期的強(qiáng)，增加DNA疫苗的免疫能力是目前急需研究的課題之一。首先是對(duì)疫苗表達(dá)載體進(jìn)行改進(jìn)，選用合適的強(qiáng)的啟動(dòng)子，增強(qiáng)抗原的表達(dá)水平；其次改進(jìn)DNA疫苗的接種途徑，其中以減毒胞內(nèi)寄生細(xì)菌攜帶DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒，通過口服和粘膜免疫接種方式，取得了較好的效果，這是因?yàn)闇p毒沙門氏細(xì)菌是一種良好的粘膜免疫佐劑和DNA疫苗的載體，它們可以攜帶質(zhì)粒進(jìn)入人體抗原遞呈細(xì)胞，包括巨嗜細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞，并在細(xì)胞生活一定的時(shí)間并持續(xù)表達(dá)抗原，誘導(dǎo)強(qiáng)而持久的免疫應(yīng)答，參見Darji A.等人“減毒沙門氏細(xì)菌攜帶的DNA疫苗的口服免疫”《細(xì)胞》，1997；91(6)765-775(Darji et al.Oralsomatic transgene vaccination using attenuated S.typhimurium，cell，1997；71(6)765-775)。但現(xiàn)在以胞內(nèi)寄生菌為免疫途徑的DNA疫苗表達(dá)質(zhì)粒還存在著一定的缺陷，即目前常用的DNA疫苗載體皆為真核表達(dá)質(zhì)粒，不能在原核細(xì)胞中表達(dá)抗原。沙門氏細(xì)菌攜帶DNA疫苗在進(jìn)入腸道細(xì)胞之前相當(dāng)長(zhǎng)時(shí)間不表達(dá)抗原，無疑影響了抗原的表達(dá)量及誘導(dǎo)免疫反應(yīng)的能力。為解決這些問題，需要構(gòu)建一種與胞內(nèi)寄生菌匹配的新型雙啟動(dòng)子DNA疫苗載體，使抗原基因在細(xì)菌和宿主細(xì)胞內(nèi)都可表達(dá)，并不影響它們的穩(wěn)定性，而常用的原核細(xì)胞啟動(dòng)子T7、T5、Lac、Tac等化學(xué)誘導(dǎo)和溫度誘導(dǎo)啟動(dòng)子不合適體內(nèi)使用，因?yàn)榘麅?nèi)寄生細(xì)菌不含大腸桿菌操縱子的調(diào)控系統(tǒng)，以上啟動(dòng)子進(jìn)入后會(huì)失控的持續(xù)高表達(dá)，嚴(yán)重影響細(xì)菌生命，而使細(xì)菌及其攜帶的質(zhì)粒很壞丟失，in vivo-inducible啟動(dòng)子可以解決以上問題，根據(jù)目前重組細(xì)菌多價(jià)菌苗的研究成果，細(xì)菌厭氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子nirB在細(xì)菌內(nèi)厭氧環(huán)境即可啟動(dòng)抗原基因表達(dá)，細(xì)菌厭氧環(huán)境誘導(dǎo)啟動(dòng)子nirB是從大腸桿菌中分離出來的，在細(xì)菌內(nèi)指導(dǎo)合成硝酸鹽還原酶基因NirB(nitrite reductase)，它的誘導(dǎo)表達(dá)方式是通過在培養(yǎng)基中添加氮或改變培養(yǎng)體系中的氧飽和度，在人工合成的NirB啟動(dòng)子中，由于人為缺失掉了氮元素的調(diào)控元件，所有NirB啟動(dòng)子不再受培養(yǎng)基中的氮元素濃度的影響，nirB是一種細(xì)菌內(nèi)環(huán)境激活的啟動(dòng)子，即in vivo-inducible啟動(dòng)子，參見Oxer MD等，厭氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子nirB在大腸桿菌中的高效表達(dá)外源基因，核酸研究，1991；19(11)2889-2892(Oxer MD，et al.High level heterologous expression in E.coli using the anaerobically-activatednirB promoter.Nucleic Acid Research，1991；19(11)2889-2892)。

發(fā)明內(nèi)容本發(fā)明針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，提供一種與胞內(nèi)寄生細(xì)菌匹配的DNA疫苗雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pCMVnir及其制備方法。
本發(fā)明的雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir為雙股閉環(huán)DNA分子，是一種基因克隆的載體，長(zhǎng)度為5.1Kb，用于表達(dá)制備基因工程產(chǎn)品和生產(chǎn)DNA疫苗，含有兩種啟動(dòng)子，一種是真核細(xì)胞啟動(dòng)子HCMV IE啟動(dòng)子，另一種為大腸桿菌硝酸鹽還原酶基因啟動(dòng)子nirB，分別在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中被激活表達(dá)相應(yīng)的蛋白。含有多克隆酶切位點(diǎn)，用以插入外源基因。
本發(fā)明的雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir的DNA序列如下(1)SEQ ID NO 1的信息(a)序列特征*長(zhǎng)度5144堿基對(duì)*類型核酸，1323A，1185C，1165G，1471T.
*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)行(b)分子類型載體DNA(c)假設(shè)否(d)反義否tcctgcatct tttaatcaaa tcccaagatg tgtataaacg cgccggtatg tacaggaaga 60ggtttatact aaactgttac attgcaaacg tggtttcgtg tgccaagtgt gaaaaccgat120gtttaatcaa ggctctgacg catttctaca accacgactc caagtgtgtg ggtgaagtca180tgcatctttt aatcaaatcc caagatgtgt ataaaccacc aaactgccaa aaaatgaaaa240ctgtcgacaa gctctgtccg tttgctggca actgcaaggg tctcaatcct atttgtaatt300attgaataat aaaacaatta taaatgtcaa atttgttttt tattaacgat acaaaccaaa360cgcaacaaga acatttgtag tattatctat aattgaaaac gcgtagttat aatcgctgag420gtaatattta aaatcatttt caaatgattc acagttaatt tgcgacaata taattttatt480ttcacataaa ctagacgcct tgtcgtcttc ttcttcgtat tccttctctt tttcattttt540ctcttcataa aaattaacat agttattatc gtatccatat atgtatctat cgtatagagt600aaattttttg ttgtcataaa tatatatgtc ttttttaatg gggtgtatag taccgctgcg660catagttttt ctgtaattta caacagtgct attttctggt agttcttcgg agtgtgttgc720tttaattatt aaatttatat aatcaatgaa tttgggatcg tcggttttgt acaatatgtt780gccggcatag tacgcagctt cttctagttc aattacacca ttttttagca gcaccggatt840aacataactt tccaaaatgt tgtacgaacc gttaaacaaa aacagttcac ctcccttttc900tatactattg tctgcgagca gttgtttgtt gttaaaaata acagccattg taatgagacg960cacaaactaa tatcacaaac tggaaatgtc tatcaatata tagttgctga tggccggcct 1020attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta 1080cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 1140caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg 1200tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagtc 1260cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga 1320ccttacggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgc 1380tgatgcggtt ttggcagtac accaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 1440caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 1500
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2.為研究啟動(dòng)子的活性，構(gòu)建pCN-EGFP和pCN-DsRed兩種報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)胞Salmonella SL3261和大腸桿菌DH5α，證實(shí)pCMVnir中Nir的激活是兼性厭氧依賴性的；將兩種報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和前列腺細(xì)胞，可見有強(qiáng)的熒光表達(dá)。
本發(fā)明的DNA疫苗雙啟動(dòng)子表達(dá)載體pCMVnir的具體制備方法如下(1)質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒載體pET16L1E7CTA2B，為一種人乳頭瘤病毒L1E7融合基因與粘膜免疫佐劑融合表達(dá)質(zhì)粒。利用下列基因和試劑按常規(guī)分子生物學(xué)制備含有綠色熒光蛋白EGFP-N1和紅色熒光蛋白Ds-Red基因的質(zhì)粒pEGFP-N1和pDsRed2-N1(可從美國(guó)Clontech公司購(gòu)到)，減毒沙門氏細(xì)菌S.SL3261為一種色氨酸代謝途徑基 因突變的減毒株(aroA)(為常見的細(xì)菌株，可從美國(guó)ATCC公司購(gòu)到)，Qiagen小量質(zhì)粒提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Fugene為Promega公司產(chǎn)品，T4 DNA連接酶、BamHI、NotI核酸內(nèi)切酶為TAKARA公司試劑，其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口試劑。所用的基因質(zhì)粒、減毒株均可從市場(chǎng)購(gòu)得。
(2)設(shè)計(jì)合成細(xì)菌厭氧啟動(dòng)子Nir分別設(shè)計(jì)兩條單鏈，兩鏈長(zhǎng)度分別為99和98bp，預(yù)留酶切位點(diǎn)粘性末端，含有細(xì)菌厭氧誘導(dǎo)FNR順式元件，細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)及真核基因Kozak元件，以促進(jìn)真核基因的表達(dá)，5’CGGACCGAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCGGTAGGGCCCAGATCTTAATCATCCACAGGAGATATACCATGG 3’。
各取等摩爾數(shù)的上述單鏈DNA混合，94℃變性30sec，然后65℃復(fù)性15min，然后緩慢冷卻至室溫，使兩條鏈緩慢退火。非變性聚丙烯酰氨(PAGE)電泳，確定DNA雙鏈形成，以備與相應(yīng)核酸內(nèi)切酶消化的載體連接。
(3)構(gòu)建pCMVnir雙啟動(dòng)子載體pTriEx-4載體以相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶NcoI和xhoI切割，以Qiagen凝膠試劑盒切膠回收，去掉約300bp的小片段，回收pTriEx-4片段，紫外分光光度計(jì)定量。
pET16L1E7CTA2B質(zhì)粒經(jīng)NcoI與xhoI雙酶切，回收HPV16L1E7片段。將pTriEx-4與HPV16L1E7片段混合，經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，鑒定純化重組質(zhì)粒pTriEx16L1E7。
pTriEx16L1E7經(jīng)RsrII和NcoI酶切，切膠回收，并與細(xì)菌厭氧啟動(dòng)子NirB混合，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，鑒定純化重組質(zhì)粒pCMVnir16L1E7。并將酶切鑒定正確的pCMVnir16L1E7進(jìn)行DNA序列分析。pCMVnir16L1E7經(jīng)Ncol與xhol雙酶切后1％瓊脂糖電泳，然后用QIAquick Gel抽提試劑盒回收NirB片段；pTriEx-4經(jīng)Ncol與xhol雙酶切后1.5％瓊脂糖電泳，去掉T7和P10區(qū)域，用QIAquick凝膠抽提試劑盒回收pTriEx-4剩余片段，兩者經(jīng)T4DNA連接酶連接，得pCMVnir轉(zhuǎn)化DH5α，涂于含氨芐青霉素的LB平板上，質(zhì)粒提取酶切、測(cè)序鑒定。
下面是為研究啟動(dòng)子的活性而構(gòu)建pCN-EGFP和pCN-DsRed兩種報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)胞Salmonella SL3261和大腸桿菌DH5α，證實(shí)pCMVnir中Nir的激活是兼性厭氧依賴性的；將兩種報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和前列腺細(xì)胞，可見有強(qiáng)的熒光表達(dá)。
(1)構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pCN-EGFP和pCN-DsRedpCMVnir經(jīng)BamHI與NotI雙酶切后1％瓊脂糖電泳，用QIAquick凝膠抽提試劑盒回收大片段；pEGFP-N1和pDsRed2-N1分別經(jīng)BamHI與NotI雙酶切后回收EGFP-N1與DsRed2-N1片段，然后分別與pCMVnir(pCN)連接得pCMVnir-EGFP-N1(pCN-EGFP)和pCN-DsRed，轉(zhuǎn)化DH5α，涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，質(zhì)粒提取酶切鑒定，在肉眼觀察及熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)狀況。
(2)將pCN-EGFP和pCN-DsRed分別轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌S.SL3261和大腸桿菌DH5α，含表達(dá)質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落在37℃震蕩培養(yǎng)過夜后，以1∶100的比例接入新的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)2hr，再在菌液上面覆蓋液體石蠟，靜置過夜，在熒光顯微鏡下觀察和流失細(xì)胞儀熒光蛋白的表達(dá)狀況。HeLa細(xì)胞在37％、5％CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10％小牛血清的RDMI1640采用promega公司的Fugene轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作按說明書，并設(shè)轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空白對(duì)照組，分別于轉(zhuǎn)染后24、48hr在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表達(dá)熒光的情況。轉(zhuǎn)然后24、48hr收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，70％乙醇固定懸浮細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照組，用流式技術(shù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
(3)重組減毒沙門氏細(xì)菌SL3261/pCMVnir16L1E7和pCMVnir16L1E7質(zhì)粒DNA在體內(nèi)的變化動(dòng)態(tài)及穩(wěn)定性研究pCMVnir16L1E7轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)菌，厭氧誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)口腔、鼻腔和皮膚粘膜接種BALB/c小鼠，經(jīng)口腔接種前半小時(shí)，給小鼠灌胃小蘇打水，接種細(xì)菌量為109PFU/ml，然后分別在3、4、5和6周取小鼠脾臟、頜下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、PP結(jié)等，勻漿，培養(yǎng)沙門氏細(xì)菌，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)的細(xì)菌中提取質(zhì)粒。
本發(fā)明的新型DNA疫苗載體pCMVnir的實(shí)驗(yàn)情況如下[1]根據(jù)NirB啟動(dòng)子的研究狀況，設(shè)計(jì)合成一種人工合成的NirB啟動(dòng)子，這種啟動(dòng)子含有一般啟動(dòng)子的基本抗體，如-35區(qū)、-10區(qū)、TATA盒上的特異轉(zhuǎn)錄調(diào)控元件FNR結(jié)合位點(diǎn)，和增強(qiáng)真核基因表達(dá)的Kozak序列，此啟動(dòng)子與大腸桿菌的野生NirB啟動(dòng)子相比，可更高效啟動(dòng)異原基因轉(zhuǎn)錄和翻譯。圖1.示相關(guān)載體的構(gòu)建過程及酶切鑒定結(jié)果。pCMVnir，經(jīng)DNA序列分析表明，pCMVnir中的序列與設(shè)計(jì)合成的序列相符，圖2示pCMVnir質(zhì)粒圖譜結(jié)構(gòu)及序列分析結(jié)果。其中可在MCS的末端有His肽純化標(biāo)簽蛋白序列，若希望表達(dá)后純化異原蛋白，可將外源基因與His-肽在碳端融合，若不需要，可在引物設(shè)計(jì)時(shí)將外源基因翻譯終止密碼子置于His-肽序列之前。報(bào)告質(zhì)粒pCN-EGFP和pCN-DsRed，轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)菌SL3261和大腸桿菌DH5a，經(jīng)厭氧培養(yǎng)，靜止于4℃放置24～48hr后，細(xì)菌可發(fā)出肉眼可見的綠色和紅色熒光，熒光隨菌體沉淀于細(xì)菌培養(yǎng)管的管底，如圖3，上層液體則較澄清，沒有明顯可見的熒光，表明這兩種熒光蛋白表達(dá)不是分泌性的，而是沉淀于管底。涂菌于含有100ug/ml氨芐青霉素的LB平板上，可見菌落可分別呈現(xiàn)綠色和粉紅色熒光，這種色素局限于菌落而非擴(kuò)散于培養(yǎng)基中。純化兩種表達(dá)質(zhì)粒，經(jīng)Fugene脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和前列腺細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后48～72小時(shí)，熒光顯微鏡下觀察表達(dá)情況，鏡下可見有強(qiáng)的熒光產(chǎn)生，表明CMVie啟動(dòng)子可以在真核細(xì)胞中有效翻譯和轉(zhuǎn)錄異原蛋白。流失細(xì)胞儀檢測(cè)熒光報(bào)告基因表達(dá)的強(qiáng)度，經(jīng)FACS表明，NirB可啟動(dòng)EGFP和DsRed在大腸桿菌和減毒沙門氏細(xì)菌中高效表達(dá)，見圖4。兩種報(bào)告質(zhì)粒pCN-EGFP和pCN-DsRed轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α和減毒沙門氏細(xì)菌SL3261，經(jīng)過厭氧誘導(dǎo)表達(dá)后，在用堿法和Qiagen質(zhì)粒提取試劑盒，可以從細(xì)菌中提取出轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒，質(zhì)粒的量與對(duì)照質(zhì)粒相似，其中宿主細(xì)菌的生長(zhǎng)情況與其他對(duì)照菌相比沒有明顯受到抑制的現(xiàn)象。pCMVnir16L1E7轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)菌，厭氧誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)口腔、鼻腔和皮膚粘膜接種BALB/c小鼠，分別在3、4、5和6周取小鼠脾臟、頜下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、PP結(jié)等，勻漿，培養(yǎng)沙門氏細(xì)菌，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)的細(xì)菌中提取質(zhì)粒，發(fā)現(xiàn)重組沙門氏細(xì)菌在小鼠體內(nèi)可以進(jìn)行有限的復(fù)制，如在第三周培養(yǎng)的細(xì)菌較少，而在2、3周細(xì)菌得到復(fù)制達(dá)到最高，然后細(xì)菌量逐漸下降，見圖5，因?yàn)闋I(yíng)養(yǎng)原因，減毒沙門氏細(xì)菌不能無限的復(fù)制。從培養(yǎng)的細(xì)菌中可以提取出轉(zhuǎn)化的質(zhì)粒DNA，表明質(zhì)粒DNA在小鼠和細(xì)菌體內(nèi)是穩(wěn)定的，與用報(bào)告質(zhì)粒的研究結(jié)果一致。圖6示，本發(fā)明所構(gòu)建載體與目前國(guó)內(nèi)外同類研究的對(duì)比，表明以pCMVnir為載體構(gòu)建的DNA疫苗，與減毒胞內(nèi)寄生細(xì)菌聯(lián)合應(yīng)用可大量增加細(xì)胞抗原的表達(dá)量，對(duì)解決目前DNA疫苗所面臨的免疫原性弱的缺點(diǎn)有重要作用。
上述實(shí)驗(yàn)證明pCMVnir是一個(gè)理想的DNA疫苗載體，這種載體與減毒胞內(nèi)寄生菌匹配應(yīng)用，將提高DNA疫苗誘導(dǎo)的免疫反，并可用于體外表達(dá)其他的基因工程產(chǎn)品。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)良效果如下
1.pCMVnir載體及減毒沙門氏細(xì)菌進(jìn)入腸道后，可在腸道等相對(duì)厭氧的環(huán)境中啟動(dòng)nirB啟動(dòng)子表達(dá)所攜帶的抗原，當(dāng)胞內(nèi)寄生菌攜帶質(zhì)粒進(jìn)入真核細(xì)胞后，在真核細(xì)胞內(nèi)可行成兩個(gè)外原抗原表達(dá)灶，一個(gè)是nirB啟動(dòng)子以沙門氏菌為場(chǎng)所，另一個(gè)是質(zhì)粒從細(xì)菌漏出到細(xì)胞漿后CMV啟動(dòng)子以細(xì)胞漿為場(chǎng)所表達(dá)抗原，無疑在細(xì)胞內(nèi)會(huì)形成更多的抗原蛋白用于遞呈到細(xì)胞表面，而其他DNA疫苗載體由于只含有CMV啟動(dòng)子，只能在胞漿表達(dá)抗原。再則在寄生于真核細(xì)胞內(nèi)的沙門氏細(xì)菌中的抗原表達(dá)載體進(jìn)入細(xì)胞核，即在真核細(xì)胞內(nèi)形成一個(gè)質(zhì)粒復(fù)制的廠房。
2.在構(gòu)建多價(jià)細(xì)菌菌苗時(shí)，曾嘗試以常規(guī)啟動(dòng)子為研究對(duì)象，但由于沙門氏菌中不具有大腸桿菌中的操縱子調(diào)控機(jī)制，外源基因無限制的高效表達(dá)即抑制了細(xì)菌的繁殖又導(dǎo)致質(zhì)粒DNA的過早丟失，當(dāng)口服后兩周之內(nèi)從各種組織器官中只能測(cè)出極少的一部沙門氏菌，更為嚴(yán)重的是這些沙門氏細(xì)菌中幾乎不含有抗原表達(dá)質(zhì)粒，即一般攜帶常規(guī)原核表達(dá)啟動(dòng)子的質(zhì)粒是不合適于以胞內(nèi)寄生菌為載體的疫苗研究的，而nirB的活性是由細(xì)菌內(nèi)環(huán)境有機(jī)調(diào)控的。結(jié)果表明本發(fā)明構(gòu)建pCMVnir的nirB啟動(dòng)子既可以高效表達(dá)外源基因，況且不會(huì)影響重組細(xì)菌和質(zhì)粒在體內(nèi)的穩(wěn)定性，是一種理想的與胞內(nèi)寄生細(xì)菌匹配的DNA新型表達(dá)載體，由于本載體所用的啟動(dòng)子為一種細(xì)菌內(nèi)環(huán)境誘導(dǎo)的強(qiáng)啟動(dòng)子，因此可用于高效表達(dá)外源基因，而不需要在培養(yǎng)體系中加入誘導(dǎo)劑。
本研究將CMV與nir啟動(dòng)子聯(lián)合應(yīng)用，構(gòu)建了一種新型雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir(pCN)，并研究了兩種啟動(dòng)子的活性和重組減毒胞內(nèi)寄生細(xì)菌及所攜帶的質(zhì)粒的穩(wěn)定性。本發(fā)明構(gòu)建的新型雙啟動(dòng)子DNA疫苗載體攜帶真核細(xì)胞CMVie和原核細(xì)胞NirB厭氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子，NirB啟動(dòng)子在菌體內(nèi)被激活高效表達(dá)異原蛋白，這種高效表達(dá)并不對(duì)細(xì)胞的生長(zhǎng)和宿主菌中質(zhì)粒的穩(wěn)定性有明顯的影響，由于細(xì)菌中微環(huán)境隨著細(xì)菌生長(zhǎng)和增殖對(duì)其的不同而變化并有機(jī)調(diào)節(jié)了NirB啟動(dòng)子的活性。
目前國(guó)外的常規(guī)DNA疫苗載體攜帶的耐藥基因多為氨芐青霉素和卡那霉素耐藥基因。本發(fā)明的DNA疫苗載體攜帶氨芐青霉素耐藥基因，在應(yīng)用時(shí)可能會(huì)使機(jī)體內(nèi)的細(xì)菌捕獲耐藥基因，可以在本發(fā)明的基礎(chǔ)上用卡那霉素耐藥基因替代氨芐青霉素耐藥基因。


圖1是新型雙啟動(dòng)子DNA疫苗pCMVnir質(zhì)粒圖譜，質(zhì)粒大小為5.1Kbp，攜帶氨芐青霉素抗性基因(bla)，大腸桿菌高拷貝質(zhì)粒復(fù)制子(ori)，真核細(xì)胞啟動(dòng)子為HCMV前早期啟動(dòng)子，修飾了的大腸桿菌厭氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子nirB，多克隆酶切位點(diǎn)含有多個(gè)單一的位點(diǎn)，供外援基因插入表達(dá)，MCS含有His-肽純化標(biāo)記，可融合表達(dá)外源蛋白，作為純化標(biāo)簽，及原核細(xì)胞和真核細(xì)胞轉(zhuǎn)錄終止序列，poly(A)加尾信號(hào)。B為nirB啟動(dòng)子的DNA序列測(cè)序結(jié)果，表明nirB含有厭氧誘導(dǎo)調(diào)控元件FNR，啟動(dòng)子核心TATA盒，核糖體結(jié)合序列RBS和真核細(xì)胞KOZAK序列和第一個(gè)ATG密碼子。
圖2是pCMVnir載體的構(gòu)建過程的酶切鑒定結(jié)果1，pCMVnir16L1E7的NcoI+Xhol酶切片段，含有約1500bp的L1E7 DNA片段2，pTriEx16L1E7為CpoI單酶切；3.4為pTriEx16L1E7的NcoI+Xhol雙酶切條帶，含有1500bp的L1E7片段；5.6，pCMVnir的NcoI+RsrII酶切片段，含有分子量較小的Nir啟動(dòng)子序列；7，為pET16L1E7CTA2B的NcoI+Xhol酶切片段，含1500bp的L1E7片段；8，Markerλ-EcoT14I.
圖3是將報(bào)告基因Ds-Red插入pCMVnir構(gòu)建的報(bào)告質(zhì)粒pCN-DsRed轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)菌SL3261和大腸桿菌DH5a，厭氧誘導(dǎo)表達(dá)后出現(xiàn)肉眼可見的熒光蛋白表達(dá)，表明啟動(dòng)子nirB可在相對(duì)厭氧的環(huán)境中高效表達(dá)外源蛋白，這種蛋白是非分泌性的的，局限于細(xì)菌的沉淀內(nèi)，而培養(yǎng)基較澄清。A，B為SL3261和DH5a的空白對(duì)照。C，F(xiàn)為pCN-Red轉(zhuǎn)化的SL3261，D，E為pCN-Red轉(zhuǎn)化的大腸桿菌DH5a，C，D，E，F(xiàn)都出現(xiàn)了肉眼可見的紅色熒光蛋白，而對(duì)照組沒有可見的熒光蛋白。
圖4是pCMVnir16L1E7轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)菌，厭氧誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)口腔(IG)、鼻腔(IN)和皮膚粘膜(TEI)接種BALB/c小鼠，為從Peyer’s Patch(腸系膜集合淋巴濾泡)中的分離培養(yǎng)情況，發(fā)現(xiàn)重組沙門氏細(xì)菌在小鼠體內(nèi)可以進(jìn)行有限的復(fù)制，在第三周培養(yǎng)的細(xì)菌菌落較少，而在4、5周細(xì)菌得到復(fù)制達(dá)到最高，然后細(xì)菌量逐漸下降，所以細(xì)菌在體內(nèi)被最終清除，不會(huì)對(duì)人體造成潛在的危害。
圖5是報(bào)告質(zhì)粒pCN-EGFP轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)菌與大腸桿菌DH5a，經(jīng)厭氧誘導(dǎo)表達(dá)以后形成的紅色熒光沉淀，收集細(xì)菌用流式細(xì)胞儀檢測(cè)應(yīng)綠色熒光蛋白EGFP的表達(dá)量，同時(shí)做三組試驗(yàn)，并設(shè)置相應(yīng)對(duì)照，取均值，用Graphpad公司軟件分析，pCN-EGFP轉(zhuǎn)化的細(xì)菌表達(dá)的熒光量明顯高于對(duì)照組。
圖6是本研究構(gòu)建的雙啟動(dòng)子DNA疫苗載體和目前常用的單啟動(dòng)子DNA疫苗的對(duì)照，上圖為減毒沙門氏細(xì)菌為載體的雙啟動(dòng)子DNA疫苗所攜帶的抗原表達(dá)情況，抗原自細(xì)菌進(jìn)入人體內(nèi)腸道等處即開始表達(dá)抗原蛋白，被腸道細(xì)胞攝取遞呈，誘導(dǎo)免疫反應(yīng)，并被腸道的上皮內(nèi)的APC細(xì)胞遞呈，當(dāng)細(xì)菌進(jìn)入APC后，可在細(xì)胞內(nèi)形成兩個(gè)抗原表達(dá)場(chǎng)所，一部分繼續(xù)在胞內(nèi)細(xì)菌內(nèi)由nirB啟動(dòng)子表達(dá)，另一部分當(dāng)質(zhì)粒漏入APC后CMV啟動(dòng)抗原蛋白表達(dá)。而其他另外途經(jīng)，抗原蛋白只能當(dāng)質(zhì)粒進(jìn)入APC并由細(xì)菌內(nèi)漏出后才能表達(dá)抗原蛋白。充分發(fā)揮了減毒胞內(nèi)寄生細(xì)菌的抗原表達(dá)場(chǎng)所，粘膜免疫佐劑和攜帶DNA疫苗的作用。
具體實(shí)施方式
下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步說明。
實(shí)施例1需要常規(guī)的分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)設(shè)備和技術(shù)，主要包括超凈工作臺(tái)、無菌設(shè)備、低溫離心機(jī)、細(xì)菌培養(yǎng)設(shè)備、核酸分離純化、電泳、紫外線分光光度計(jì)等。
(1)質(zhì)粒載體的構(gòu)建含有綠色熒光蛋白EGFP-N1和紅色熒光蛋白Ds-Red基因的質(zhì)粒pEGFP-N1和pDsRed2-N1(從美國(guó)Clontech公司購(gòu)到)，減毒沙門氏細(xì)菌S.SL3261為一種色氨酸代謝途徑基因突變的減毒株(aroA)(從美國(guó)ATCC公司購(gòu)到)，Qiagen小量質(zhì)粒提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Fugene為Promega公司產(chǎn)品，T4 DNA連接酶、BamHI、NotI核酸內(nèi)切酶為TAKARA公司試劑，其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)或進(jìn)口試劑。所用的基因質(zhì)粒、減毒株均可從市場(chǎng)購(gòu)得。
(2)合成細(xì)菌厭氧啟動(dòng)子Nir分別設(shè)計(jì)兩條單鏈，兩鏈長(zhǎng)度分別為99和98bp，預(yù)留酶切位點(diǎn)粘性末端，含有細(xì)菌厭氧誘導(dǎo)FNR順式元件，細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)及真核基因Kozak元件，以促進(jìn)真核基因的表達(dá)，
5’CGGACCGAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCGGTAGGGCCCAGATCTTAATCATCCACAGGAGATATACCATGG 3’。
各取等摩爾數(shù)的上述單鏈DNA混合，94℃變性30sec，然后65℃復(fù)性15min，然后緩慢冷卻至室溫，使兩條鏈緩慢退火。非變性聚丙烯酰氨(PAGE)電泳，確定DNA雙鏈形成，以備與相應(yīng)核酸內(nèi)切酶消化的載體連接。
(3)構(gòu)建pCMVnir雙啟動(dòng)子載體pTriEx-4(20μg)載體以相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶NcoI(5unit)和xhoI(5unit)切割，以Qiagen凝膠試劑盒切膠回收，去掉約300bp的小片段，回收pTriEx-4片段，紫外分光光度計(jì)定量。
pET16L1E7CTA2B質(zhì)粒(20μg)經(jīng)NcoI(5unit)與xhoI(5unit)雙酶切，回收HPV16L1E7片段。將pTriEx-4與HPV16L1E7片段混合(摩爾比為1∶3，DNA分子質(zhì)量總量為0.1-1μg)，經(jīng)T4DNA連接酶連接(10μL體系，1unit連接酶)于14度連接過夜，取5μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，涂于含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)板上，鑒定純化重組質(zhì)粒pTriEx16L1E7。
TriEx16L1E7質(zhì)粒(20μg)經(jīng)RsrII(5unit)和NcoI(5unit)酶切，切膠回收，并與細(xì)菌厭氧啟動(dòng)子NirB混合(摩爾比為1∶10，總量為0.1-1μg)，用T4DNA連接酶連接(10μL體系，1unit連接酶)于14度連接過夜，取5μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，鑒定純化重組質(zhì)粒pCMVnir16L1E7。并將酶切鑒定正確的pCMVnir16L1E7進(jìn)行DNA序列分析。
pCMVnir16L1E7質(zhì)粒(20μg)經(jīng)Ncol(5unit)與xhol(5unit)雙酶切后1％瓊脂糖電泳，然后用QIAquick Gel抽提試劑盒回收Nir B片段；pTriEx-4經(jīng)Ncol與xhol雙酶切后1.5％瓊脂糖電泳，去掉T7和P10區(qū)域，用QIAquick凝膠抽提試劑盒回收pTriEx-4剩余片段，回收的Nir B片段和pTriEx-4兩片段，經(jīng)T4 DNA連接酶連接(摩爾比為1∶3，DNA分子質(zhì)量總量為0.1-1μg)，取5μL連接產(chǎn)物pCMVnir轉(zhuǎn)化DH5α，涂于含氨芐青霉素的LB平板上，質(zhì)粒提取酶切、測(cè)序鑒定。
在采用以上途經(jīng)構(gòu)建pCMVnir的同時(shí)，還采用另一種直接方法構(gòu)建，即將等量的nirB啟動(dòng)子的兩條鏈，在95度變性5分鐘，然后置于工作臺(tái)上自然冷卻到室溫，經(jīng)PAGE膠電泳確定雙鏈退火情況，并將pTriEx-4質(zhì)?！?0μg)經(jīng)RsrII(5unit)和NcoI(5unit)酶切電泳，切膠回收，并與細(xì)菌厭氧啟動(dòng)子NirB混合(摩爾比為1∶10，總量為0.1-1μg)，用T4DNA連接酶連接(10μL體系，1unit連接酶)于14度連接過夜，取5μL轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，鑒定純化重組質(zhì)粒pCMVnir。采用兩種方法獲得的pCMVnir具有完全相同的結(jié)構(gòu)特征。
為研究啟動(dòng)子的活性而構(gòu)建pCN-EGFP和pCN-DsRed兩種報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)胞Salmonella SL3261和大腸桿菌DH5α，證實(shí)pCMVnir中Nir的激活是兼性厭氧依賴性的；將兩種報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和前列腺細(xì)胞，可見有強(qiáng)的熒光表達(dá)。
(1)構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pCN-EGFP和pCN-DsRedpCMVnir質(zhì)?！?0μg〕經(jīng)BamHI(5unit)與NotI(5unit)雙酶切后1％瓊脂糖電泳，用QIAquick凝膠抽提試劑盒回收大片段；pEGFP-N1〔20μg〕和pDsRed2-N1〔20μg〕分別經(jīng)BamHI(5unit)與NotI(5unit)雙酶切后回收EGFP-N1與DsRed2-N1片段，然后分別與pCMVnir(pCN)連接(摩爾比為1∶10，總量為0.1-1μg)，用T4DNA連接酶連接(10μL體系，1unit連接酶)于14度連接過夜，取5μL轉(zhuǎn)化DH5α，得pCMVnir-EGFP-N1(pCN-EGFP)和pCN-DsRed，，涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，質(zhì)粒提取酶切鑒定，在肉眼觀察及熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)狀況。
(2)將pCN-EGFP〔0.01μg〕和pCN-DsRed〔0.01μg〕分別轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌S.SL3261和大腸桿菌DH5α，含表達(dá)質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落在37℃震蕩培養(yǎng)過夜后，以1∶100的比例接入新的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)2hr，再在菌液上面覆蓋液體石蠟，靜置過夜，在熒光顯微鏡下觀察和流失細(xì)胞儀熒光蛋白的表達(dá)狀況。HeLa細(xì)胞在37％、5％CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10％小牛血清的RDMI1640采用promega公司的Fugene轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，具體操作按說明書，并設(shè)轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空白對(duì)照組，分別于轉(zhuǎn)染后24、48hr在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表達(dá)熒光的情況。轉(zhuǎn)然后24、48hr收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，70％乙醇固定懸浮細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照組，用流式技術(shù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度。
(3)重組減毒沙門氏細(xì)菌SL3261/pCMVnir16L1E7和pCMVnir16L1E7質(zhì)粒DNA在體內(nèi)的變化動(dòng)態(tài)及穩(wěn)定性研究a.每組5-6只年齡為6周的雌性BALB/C小鼠，鼻飼小鼠，小鼠先通過吸入本巴比妥鈉麻醉，然后用微量移液器每個(gè)鼻孔滴入30μL細(xì)菌懸液，細(xì)菌濃度為109/ml。
b.通過口腔接種方法為在細(xì)菌接種以前30分鐘，先給小鼠灌胃5％碳酸氫鈉60μL，以中和小鼠胃酸，然后再用22-gauge feeding tubes飼養(yǎng)管，給小鼠接種細(xì)菌0.25mL。
c.經(jīng)皮膚粘膜接種(transcutaneous inoculation，TCI)方法為有研究表明皮膚粘膜的細(xì)胞可以攝取涂在皮膚上的抗原，并產(chǎn)生可靠的免疫反應(yīng)，本研究為探索通過皮膚粘膜接種減毒沙門氏細(xì)菌疫苗做了嘗試小鼠在細(xì)菌接種前，先通過巴比妥那麻醉，然后用醫(yī)用脫毛劑在小鼠腹部1cm2的面積脫去毛發(fā)，并用肥皂水清晰脫毛區(qū)域，晾干，然后將500μL的細(xì)菌懸液涂于脫毛處，靜置直到小鼠蘇醒為止，由于小鼠的麻醉、脫毛和洗滌，小鼠比較虛弱，為了防治小鼠的死亡，注意小鼠的保溫。
d.分別在小鼠接種細(xì)菌以后的3、4、5、6周，研究重組細(xì)菌在小鼠體內(nèi)的變化，小鼠經(jīng)脫頸處死，解剖臺(tái)上分別取小鼠的頜下淋巴結(jié)、脾臟、腸系膜淋巴結(jié)、Peyer’s patch、腹股溝淋巴結(jié)，用研磨器將以上組織器官研磨，PP結(jié)和腸系膜淋巴結(jié)為每一只小鼠分別取2個(gè)淋巴結(jié)；脾臟為每只小鼠取一個(gè)完整的脾臟；肝臟為每一只小鼠取1/3部分，頜下淋巴結(jié)為每只小鼠取3個(gè)，在2mlPBS勻漿，分別取200μL涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，培養(yǎng)過夜，計(jì)數(shù)菌落的數(shù)目。調(diào)取單菌落接種于同樣的液體培養(yǎng)基中，振蕩培養(yǎng)過夜，用Qiagen小量質(zhì)粒提取試劑盒提取質(zhì)粒，電泳以觀察質(zhì)粒的穩(wěn)定性。
序列表<110>山東大學(xué)<120>雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir及其制備方法<140>
<141>
<160>1<170>Patent In3.1<210>1<211>5144<212>DNA<400>1tcctgcatct tttaatcaaa tcccaagatg tgtataaacg cgccggtatg tacaggaaga 60ggtttatact aaactgttac attgcaaacg tggtttcgtg tgccaagtgt gaaaaccgat120gtttaatcaa ggctctgacg catttctaca accacgactc caagtgtgtg ggtgaagtca180tgcatctttt aatcaaatcc caagatgtgt ataaaccacc aaactgccaa aaaatgaaaa240ctgtcgacaa gctctgtccg tttgctggca actgcaaggg tctcaatcct atttgtaatt300attgaataat aaaacaatta taaatgtcaa atttgttttt tattaacgat acaaaccaaa360cgcaacaaga acatttgtag tattatctat aattgaaaac gcgtagttat aatcgctgag420gtaatattta aaatcatttt caaatgattc acagttaatt tgcgacaata taattttatt480ttcacataaa ctagacgcct tgtcgtcttc ttcttcgtat tccttctctt tttcattttt540ctcttcataa aaattaacat agttattatc gtatccatat atgtatctat cgtatagagt600aaattttttg ttgtcataaa tatatatgtc ttttttaatg gggtgtatag taccgctgcg660catagttttt ctgtaattta caacagtgct attttctggt agttcttcgg agtgtgttgc720tttaattatt aaatttatat aatcaatgaa tttgggatcg tcggttttgt acaatatgtt780gccggcatag tacgcagctt cttctagttc aattacacca ttttttagca gcaccggatt840aacataactt tccaaaatgt tgtacgaacc gttaaacaaa aacagttcac ctcccttttc900tatactattg tctgcgagca gttgtttgtt gttaaaaata acagccattg taatgagacg960cacaaactaa tatcacaaac tggaaatgtc tatcaatata tagttgctga tggccggcct 1020attaatagta atcaattacg gggtcattag ttcatagccc atatatggag ttccgcgtta 1080cataacttac ggtaaatggc ccgcctggct gaccgcccaa cgacccccgc ccattgacgt 1140caataatgac gtatgttccc atagtaacgc caatagggac tttccattga cgtcaatggg 1200tggagtattt acggtaaact gcccacttgg cagtacatca agtgtatcat atgccaagtc 1260cgccccctat tgacgtcaat gacggtaaat ggcccgcctg gcattatgcc cagtacatga 1320ccttacggga ctttcctact tggcagtaca tctacgtatt agtcatcgct attaccatgc 1380tgatgcggtt ttggcagtac accaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc 1440caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact 1500ttccaaaatg tcgtaataac cccgccccgt tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt 1560gggaggtcta tataagcaga cgtcgtttag tgaaccgtca gatcactaga tgctttattg 1620cggtagttta tcacagttaa attgctaacg ccagtctcga acttaacgtg cagaagttgg 1680tcgtgaggca ctgggcaggt aagtatcggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcggggct 1740gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc 1800gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac 1860
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1.雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir，其特征在于為雙股閉環(huán)DNA分子，是一種基因克隆的載體，長(zhǎng)度為5.1Kb，用于表達(dá)制備基因工程產(chǎn)品和生產(chǎn)DNA疫苗，含有兩種啟動(dòng)子，一種是真核細(xì)胞啟動(dòng)子HCMV IE啟動(dòng)子，另一種為大腸桿菌硝酸鹽還原酶基因啟動(dòng)子nirB，分別在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中被激活表達(dá)相應(yīng)的蛋白，含有多克隆酶切位點(diǎn)，用以插入外源基因，該載體具有SEQ ID NO 1所示的序列(a)序列特征*長(zhǎng)度5144堿基對(duì)*類型核酸，1323 A，1185 C，1165 G，1471 T.*鏈型雙鏈*拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)環(huán)行(b)分子類型載體DNA(c)假設(shè)否(d)反義否tcctgcatct tttaatcaaa tcccaagatg tgtataaacg cgccggtatg tacaggaaga60ggtttatact aaactgttac attgcaaacg tggtttcgtg tgccaagtgt gaaaaccgat120gtttaatcaa ggctctgacg catttctaca accacgactc caagtgtgtg ggtgaagtca180tgcatctttt aatcaaatcc caagatgtgt ataaaccacc aaactgccaa aaaatgaaaa240ctgtcgacaa gctctgtccg tttgctggca actgcaaggg tctcaatcct atttgtaatt300attgaataat aaaacaatta taaatgtcaa atttgttttt tattaacgat acaaaccaaa360cgcaacaaga acatttgtag tattatctat aattgaaaac gcgtagttat aatcgctgag420gtaatattta aaatcatttt caaatgattc acagttaatt tgcgacaata taattttatt480ttcacataaa ctagacgcct tgtcgtcttc ttcttcgtat 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ttggcagtac accaatgggc gtggatagcg gtttgactca cggggatttc1440caagtctcca ccccattgac gtcaatggga gtttgttttg gcaccaaaat caacgggact1500ttccaaaatg tcgtaataac cccgccccgt tgacgcaaat gggcggtagg cgtgtacggt1560gggaggtcta tataagcaga cgtcgtttag tgaaccgtca gatcactaga tgctttattg1620cggtagttta tcacagttaa attgctaacg ccagtctcga acttaacgtg cagaagttgg1680tcgtgaggca ctgggcaggt aagtatcggg ccctttgtgc ggggggagcg gctcggggct1740gtccgcgggg ggacggctgc cttcgggggg gacggggcag ggcggggttc ggcttctggc1800gtgtgaccgg cggctctaga gcctctgcta accatgttca tgccttcttc tttttcctac1860agctcctggg caacgtgctg gttattgtgc tgtctcatca ttttggcaaa gaattggatc1920ggaccgaggt aaatttgatg tacatcaaat ggtacccctt gctgaatcgt taaggtaggc1980ggtagggccc agatcttaat catccacagg agatatacca tggcacacca tcaccaccat2040cactcttctg gtaaagaaac cgctgctgcg aaatttgaac gccagcacat ggactcgcca2100ccgccttctg gtctggtccc ccggggcagc gcaggttctg gtacgattga tgacgacgac2160aagagtccgg gcttctcctc aacgatatct gagctcgtgg atccgaattc tcagatctcg2220gcgcgcctgc aggtcgacgg taccggttcg aagcttgcgg 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cgggataata ccgcgccaca4860tagcagaact ttaaaagtgc tcatcattgg aaaacgttct tcggggcgaa aactctcaag4920gatcttaccg ctgttgagat ccagttcgat gtaacccact cgtgcaccca actgatcttc4980agcatctttt actttcacca gcgtttctgg gtgagcaaaa acaggaaggc aaaatgccgc5040aaaaaaggga ataagggcga cacggaaatg ttgaatactc atactcttcc tttttcaata5100ttattgaagc atttatcagg gttattgtct catgtccgcg cgtt 5144。
2.權(quán)利要求1所述的雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir，其特征在于，是按如下方法獲得的(1)設(shè)計(jì)合成細(xì)菌厭氧誘導(dǎo)啟動(dòng)子nirB，構(gòu)建攜帶CMVie和NirB兩種不同種類啟動(dòng)子的載體pCMVnir；(2)構(gòu)建pCN-EGFP和pCN-DsRed兩種報(bào)告質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)胞SalmonellaSL3261和大腸桿菌DH5α，證實(shí)pCMVnir中Nir的激活是兼性厭氧依賴性的；將兩種報(bào)告質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染Hela細(xì)胞和前列腺細(xì)胞，可見有強(qiáng)的熒光表達(dá)。
3.一種權(quán)利要求1所述的雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir制備方法，包括如下步驟(1)質(zhì)粒載體的構(gòu)建質(zhì)粒載體pET16L1E7CTA2B，為一種人乳頭瘤病毒L1E7融合基因與粘膜免疫佐劑融合表達(dá)質(zhì)粒，利用下列基因和試劑按常規(guī)分子生物學(xué)制備含有綠色熒光蛋白EGFP-N1和紅色熒光蛋白Ds-Red基因的質(zhì)粒pEGFP-N1和pDsRed2-N1，減毒沙門氏細(xì)菌S.SL3261為一種色氨酸代謝途徑基因突變的減毒株(aroA)，Qiagen小量質(zhì)粒提取試劑盒為Qiagen公司產(chǎn)品，細(xì)胞轉(zhuǎn)染試劑Fugene為Promega公司產(chǎn)品，T4 DNA連接酶、BamHI、NotI核酸內(nèi)切酶為TAKARA公司試劑，其他常規(guī)分子生物學(xué)試劑均為市售試劑，所用的基因質(zhì)粒、減毒株均為市售產(chǎn)品；(2)設(shè)計(jì)合成細(xì)菌厭氧啟動(dòng)子Nir分別設(shè)計(jì)兩條單鏈，兩鏈長(zhǎng)度分別為99和98bp，預(yù)留酶切位點(diǎn)粘性末端，含有細(xì)菌厭氧誘導(dǎo)FNR順式元件，細(xì)菌核糖體結(jié)合位點(diǎn)(RBS)及真核基因Kozak元件，以促進(jìn)真核基因的表達(dá)，5’CGGACCGAGGTAAATTTGATGTACATCAAATGGTACCCCTTGCTGAATCGTTAAGGTAGGCGGTAGGGCCCAGATCTTAATCATCCACAGGAGATATACCATGG 3’；各取等摩爾數(shù)的上述單鏈DNA混合，94℃變性30sec，然后65℃復(fù)性15min，然后緩慢冷卻至室溫，使兩條鏈緩慢退火，非變性聚丙烯酰氨電泳，確定DNA雙鏈形成，以備與相應(yīng)核酸內(nèi)切酶消化的載體連接；(3)構(gòu)建pCMVnir雙啟動(dòng)子載體pTriEx-4載體以相應(yīng)的限制性內(nèi)切酶NcoI和xho I切割，以Qiagen凝膠試劑盒切膠回收，去掉約300bp的小片段，回收pTriEx-4片段，紫外分光光度計(jì)定量；pET16L1E7CTA2B質(zhì)粒經(jīng)NcoI與xhoI雙酶切，回收HPV16L1E7片段，將pTriEx-4與HPV16L1E7片段混合，經(jīng)T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，鑒定純化重組質(zhì)粒pTriEx16L1E7；pTriEx16L1E7經(jīng)RsrII和NcoI酶切，切膠回收，并與細(xì)菌厭氧啟動(dòng)子NirB混合，用T4DNA連接酶連接，轉(zhuǎn)化感受態(tài)DH5α，鑒定純化重組質(zhì)粒pCMVnir16L1E7，并將酶切鑒定正確的pCMVnir16L1E7進(jìn)行DNA序列分析，pCMVnir16L1E7經(jīng)Ncol與xhol雙酶切后1％瓊脂糖電泳，然后用QIAquick Gel抽提試劑盒回收Nir B片段；pTriEx-4經(jīng)Ncol與xhol雙酶切后1.5％瓊脂糖電泳，去掉T7和P10區(qū)域，用QIAquick凝膠抽提試劑盒回收pTriEx-4剩余片段，兩者經(jīng)T4 DNA連接酶連接，得pCMVnir轉(zhuǎn)化DH5α，涂于含氨芐青霉素的LB平板上，質(zhì)粒提取酶切、測(cè)序鑒定。
4.一種權(quán)利要求2所述的雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir的制備方法，其特征在于，(1)構(gòu)建報(bào)告質(zhì)粒pCN-EGFP和pCN-DsRedpCMVnir經(jīng)BamHI與NotI雙酶切后1％瓊脂糖電泳，用QIAquick凝膠抽提試劑盒回收大片段；pEGFP-N1和pDsRed2-N1分別經(jīng)BamHI與NotI雙酶切后回收EGFP-N1與DsRed2-N1片段，然后分別與pCMVnir連接得pCMVnir-EGFP-N1和pCN-DsRed，轉(zhuǎn)化DH5α，涂于含有氨芐青霉素的LB平板上，質(zhì)粒提取酶切鑒定，在肉眼觀察及熒光顯微鏡下觀察熒光蛋白的表達(dá)狀況；(2)pCN-EGFP和pCN-DsRed分別轉(zhuǎn)化減毒沙門氏菌S.SL3261和大腸桿菌DH5α，含表達(dá)質(zhì)粒的陽(yáng)性菌落在37℃震蕩培養(yǎng)過夜后，以1∶100的比例接入新的培養(yǎng)液中生長(zhǎng)2hr，再在菌液上面覆蓋液體石蠟，靜置過夜，在熒光顯微鏡下觀察和流失細(xì)胞儀熒光蛋白的表達(dá)狀況；HeLa細(xì)胞在37％、5％CO2飽和濕度的細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，培養(yǎng)基為含有10％小牛血清的RDMI1640采用promega公司的Fugene轉(zhuǎn)染試劑盒進(jìn)行轉(zhuǎn)染，并設(shè)轉(zhuǎn)染對(duì)照組和空白對(duì)照組，分別于轉(zhuǎn)染后24、48hr在熒光顯微鏡下觀察細(xì)胞表達(dá)熒光的情況；轉(zhuǎn)染后24、48hr收集細(xì)胞，PBS洗滌3次，70％乙醇固定懸浮細(xì)胞，以未轉(zhuǎn)染細(xì)胞作為空白對(duì)照組，用流式技術(shù)檢測(cè)熒光強(qiáng)度；(3)重組減毒沙門氏細(xì)菌SL3261/pCMVnir16L1E7和pCMVnir16L1E7質(zhì)粒DNA在體內(nèi)的變化動(dòng)態(tài)及穩(wěn)定性pCMVnir16L1E7轉(zhuǎn)化減毒沙門氏細(xì)菌，厭氧誘導(dǎo)表達(dá)，經(jīng)口腔、鼻腔和皮膚粘膜接種BALB/c小鼠，經(jīng)口腔接種前半小時(shí)，給小鼠灌胃小蘇打水，接種細(xì)菌量為109PFU/ml，然后分別在3、4、5和6周取小鼠脾臟、頜下淋巴結(jié)、腸系膜淋巴結(jié)、PP結(jié)等，勻漿，培養(yǎng)沙門氏細(xì)菌，然后再?gòu)呐囵B(yǎng)的細(xì)菌中提取質(zhì)粒。
全文摘要
雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir及其制備方法，屬于DNA疫苗技術(shù)領(lǐng)域。雙啟動(dòng)子DNA疫苗表達(dá)載體pCMVnir為雙股閉環(huán)DNA分子，是一種基因克隆的載體，長(zhǎng)度為5.1Kb，用于表達(dá)制備基因工程產(chǎn)品和生產(chǎn)DNA疫苗，含有兩種啟動(dòng)子，一種是真核細(xì)胞啟動(dòng)子HCMV IE啟動(dòng)子，另一種為大腸桿菌硝酸鹽還原酶基因啟動(dòng)子nirB，分別在真核細(xì)胞和原核細(xì)胞中被激活表達(dá)相應(yīng)的蛋白，含有多克隆酶切位點(diǎn)，用以插入外源基因，該載體具有SEQ ID NO 1所示的序列。本發(fā)明的疫苗載體可用于高效表達(dá)外源基因，而不需要在培養(yǎng)體系中加入誘導(dǎo)劑。
文檔編號(hào)C12N15/63GK1544624SQ20031010551
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月14日
發(fā)明者于修平, 卞繼峰, 趙蔚明, 耿昭, 周亞濱, 賈繼輝, 欒怡, 齊眉 申請(qǐng)人:山東大學(xué)