專利名稱：一種弧菌及用它生產(chǎn)甘露糖醛酸裂合酶的方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種弧菌及用它生產(chǎn)β-1，4-D-甘露糖醛酸裂合酶的方法。
背景技術(shù)：
褐藻膠是由甘露糖醛酸與古羅糖醛酸組成的線性高分子化合物，由β-1，4-D-甘露糖醛酸和α-1，4-L-甘露糖醛酸兩種單體組成的嵌段聚合物。作為一種性能優(yōu)良的線性高分子，褐藻膠及其寡糖在食品、農(nóng)業(yè)、日用化工、醫(yī)藥等領(lǐng)域得到了廣泛利用。近年來，褐藻膠寡糖及其衍生物的許多生物學(xué)功能和生理活性逐漸被人們所認(rèn)識(shí)，在抗菌、抗病毒、抗腫瘤、抗凝血和降血脂、治療心腦血管疾病和老年癡呆等方面都顯示出良好的應(yīng)用前景。如一中國(guó)專利(CN1408360)公開了一種褐藻膠酸水解寡糖產(chǎn)物具有抗衰老和抗癡呆中的作用，一篇日本專利(JP05304974)披露了一種酶法得到的褐藻膠寡糖酸鈣具有降低血壓作用，還有人將甘露糖醛酸作為種子根促長(zhǎng)劑等。文獻(xiàn)檢索表明，生產(chǎn)褐藻膠酶的微生物有很多，如黃桿菌(Flavobacterium multivolum)、固氮菌(Azotobacter vinelandii)、克里伯克菌(Klebsiella aerogenes)、假單胞菌(Pseudomonas alginovora)、弧菌(Vibro sp.AL-9、Vibro sp.AL-128、Vibro alginolyticus AACC17749)、腸桿菌(Enterobacter cloacae M-1)、別單胞菌(Alteromonas sp.)以及芽孢桿菌(Bacillus circulans)等，但用這些菌生產(chǎn)出來的酶難以純化，酶活力也不高，專利CN1445365A和CN1333336A中都公開了用弧菌制備褐藻膠裂合酶的方法，但所產(chǎn)生的褐藻膠裂合酶缺乏單一性，即它能同時(shí)降解褐藻膠中甘露糖醛酸和古羅糖醛酸，不能單一降解褐藻膠中甘露糖醛酸，這種缺陷與所用的菌種有關(guān)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種弧菌Vibro sp.YWA，它能克服現(xiàn)有技術(shù)的上述不足。
一種弧菌，其特征是該弧菌為Vibro.spYWA，該弧菌的保藏單位是中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏號(hào)為M203074。
弧菌Vibro sp.YWA用于生產(chǎn)β-1，4-D-甘露糖醛酸裂合酶。
一種用弧菌Vibro sp.YWA生產(chǎn)β-1，4-D-甘露糖醛酸裂合酶的方法，其特征是將該弧菌接種于含有褐藻膠的液體培養(yǎng)基中，在25-30℃和150-200rpm轉(zhuǎn)速下，恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)12-48小時(shí)后，離心去除菌體，然后向上清液加入硫酸銨使其飽和度為55-65％得到沉淀，沉淀物用水溶解后用DEAE-A50或DEAE-Sephacel離子交換柱進(jìn)行色譜分離，將所得活性組分透析脫鹽后冷凍干燥。
本發(fā)明的菌種性能穩(wěn)定，發(fā)酵時(shí)間短，所產(chǎn)酶得率高種類單一，活力高，可以專一水解褐藻膠中甘露糖醛酸之間的β-1，4糖苷鍵，能產(chǎn)生單一甘露糖醛酸裂合酶。該酶可作為褐藻膠糖鏈分析的工具酶。


及
具體實(shí)施例方式
附圖1為本發(fā)明的弧菌株的形態(tài)特征圖片。
附圖2為其16s rDNA基因序列分析結(jié)果。
本發(fā)明的產(chǎn)酶菌種是從腐爛海帶中分離篩選的一種能生產(chǎn)甘露糖醛酸裂合酶的弧菌，該菌為弧形，端生單鞭毛，鞭毛的長(zhǎng)度為菌體長(zhǎng)度的3倍，經(jīng)生化特征分析以及16s rRNA基因序列分析，確認(rèn)該菌為弧菌屬的新種。該弧菌種保藏單位是中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，簡(jiǎn)稱CCTCC，保藏號(hào)為M203074。生產(chǎn)甘露糖醛酸裂合酶時(shí)，將該弧菌于發(fā)酵培養(yǎng)基中培養(yǎng)，該培養(yǎng)基的組成為褐藻膠0.2％-1.0％、氯化鈉1-3％、酵母提取物0.1-0.3％、蛋白胨0.5-1.5％、其余為水的PH7-8磷酸鹽緩沖液，在20-30℃，150-200轉(zhuǎn)/分的轉(zhuǎn)速下恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)12-48小時(shí)，培養(yǎng)后的發(fā)酵液離心除去菌體，得到發(fā)酵液。向離心所得的上清液中加入硫酸銨使飽和度達(dá)到55-65％，離心后收集沉淀得到粗酶。將該粗酶用pH7.4的磷酸緩沖溶液洗滌，透析，壓濾濃縮。將所得酶液用DEAE-Sephacel(XK1.6×20cm)柱分離，用含有NaCl 0.1～0.8mol/L的10mmol/L磷酸緩沖溶液(pH7.4)進(jìn)行線性梯度洗脫，流速為0.5ml/min，紫外(波長(zhǎng)280nm)分析儀在線監(jiān)測(cè)，收集具有酶活性組分，酶液經(jīng)透析、濃縮得到甘露糖醛裂合酶純品，純度99％以上。該酶最佳溫度25℃，最佳pH7.4，分子量62.5KD。
將褐藻膠、多聚古羅糖醛酸和多聚甘露糖醛酸用水配成0.1％濃度，加入上述制得的甘露糖醛酸裂合酶0.1ml，在50mmol/L磷酸鹽緩沖液(pH7.4)，25℃下恒溫酶解，隨著酶解時(shí)間延長(zhǎng)，褐藻膠和多聚甘露糖醛酸溶液在235nm波長(zhǎng)下吸收值逐漸升高，而多聚古羅糖醛酸溶液在該波長(zhǎng)下的吸收基本不變，表明該酶具有專一降解古羅糖醛酸能力。
權(quán)利要求
1 一種弧菌，其特征是該弧菌為Vibro sp.YWA，保藏單位是CCTCC，保藏號(hào)為M203074。
2 弧菌Vibro sp.YWA用于生產(chǎn)β-1，4-D-甘露糖醛酸裂合酶。
3 一種用弧菌Vibro sp.YWA生產(chǎn)β-1，4-D-甘露糖醛酸裂合酶的方法，其特征是將該弧菌接種于含有褐藻膠的液體培養(yǎng)基中，在25-30℃和150-200rpm轉(zhuǎn)速下，恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)12-48小時(shí)后，離心去除菌體，然后向上清液加入硫酸銨使其飽和度為55-65％得到沉淀，沉淀物用水溶解后用DEAE-A50或DEAE-Sephacel離子交換柱進(jìn)行色譜分離，將所得活性組分透析脫鹽后冷凍干燥。
4 如權(quán)利要求3所述的方法，其特征是所述的液體培養(yǎng)基的組成為褐藻膠0.2％-1.0％、氯化鈉1-3％、所述的酵母提取物0.1-0.3％、蛋白胨0.5-1.5％、PH7-8的磷酸鹽緩沖水溶液，其余為水。
全文摘要
一種用弧菌Vibro sp.YWA生產(chǎn)β－1，4－D－甘露糖醛酸裂合酶的方法，其特征是將該弧菌接種于含有褐藻膠的液體培養(yǎng)基中，在25－30℃和150－200rpm轉(zhuǎn)速下，恒溫?fù)u瓶培養(yǎng)12－48小時(shí)后，離心去除菌體，然后向上清液加入硫酸銨使其飽和度為55－65％得到沉淀，沉淀物用水溶解后用DEAE－A50或DEAE－Sephacel離子交換柱進(jìn)行色譜分離，將所得活性組分透析脫鹽后冷凍干燥。本發(fā)明的菌種性能穩(wěn)定，發(fā)酵時(shí)間短，所產(chǎn)酶得率高種類單一，活力高，可以專一水解褐藻膠中甘露糖醛酸之間的β－1，4糖苷鍵，能產(chǎn)生單一甘露糖醛酸裂合酶。該酶可作為褐藻膠糖鏈分析的工具酶。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1544616SQ200310105728
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者王遠(yuǎn)紅, 于廣利, 趙峽, 呂志華 申請(qǐng)人:中國(guó)海洋大學(xué)