專利名稱：松材線蟲檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明松材線蟲(Bursaphelenchus xylophilus)檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域。專用于海關(guān)進(jìn)出境木材和木質(zhì)包裝所帶松材線蟲的高靈敏度快速檢測(cè)。同時(shí)可用于林間松材線蟲病的檢測(cè)和診斷。
背景技術(shù)：
松材線蟲病又稱作松樹萎蔫病，是林業(yè)上的一種毀滅性病害，被稱為森林癌癥。感病松樹被其侵染，當(dāng)環(huán)境條件適宜時(shí)，僅僅一個(gè)月左右即全株枯死。該病最早于1905年在日本九州長(zhǎng)崎被發(fā)現(xiàn)，而后在美國、加拿大、墨西哥、韓國、葡萄牙等地均有報(bào)道。該病的病原線蟲是松材線蟲[Bursaphelenchus xylophilus(Steiner and Buhrer)Nickel]，分類上屬滑刃目、滑刃總科、傘滑刃屬。該病自1982年在南京中山陵首次報(bào)道以來，現(xiàn)已查明在我國江蘇、安徽、浙江、廣東、山東、香港、臺(tái)灣等地均有分布，且各地有呈擴(kuò)散蔓延之趨勢(shì)。至1998年底，該病在江蘇、安徽、浙江、廣東、山東五省的37個(gè)縣市發(fā)病面積超過100余萬畝，累計(jì)枯死松樹1600余萬株，直接經(jīng)濟(jì)損失1.28億元，對(duì)我國林業(yè)資源、自然景觀和生態(tài)環(huán)境造成了嚴(yán)重破壞。目前，對(duì)于松材線蟲病尚無很好的防治辦法，只有通過檢疫的手段防止其繼續(xù)蔓延傳播，控制傳播媒體的入境渠道，加強(qiáng)該病的檢疫。而檢疫工作的有效實(shí)施，需要一套快速、準(zhǔn)確的病原線蟲檢測(cè)鑒定技術(shù)。而且，在枯死松樹中，往往除了松材線蟲外，還有其它線蟲，特別是與松材線蟲同屬的其它傘滑刃線蟲，包括擬松材線蟲(Bursaphelenchusmucronatus Mamiya & Enda，1979)、假傘滑刃線蟲(B.fraudulentus)等。這些線蟲與松材線蟲形態(tài)相似、較難辨認(rèn)。目前，在口岸中，松材線蟲的主要檢疫技術(shù)是形態(tài)學(xué)觀察，但形態(tài)學(xué)觀察存在以下缺點(diǎn)第一，在口岸截獲的松材線蟲，一般存在于貨物的木質(zhì)包裝板或墊板中，這些材料一般較為干燥，其中的線蟲數(shù)量較少，而且大多都是幼蟲，常處于休眠階段，其口針和食道都已經(jīng)退化，要準(zhǔn)確鑒定有一定的困難。而要獲得成蟲做鑒定需要做進(jìn)一步的培養(yǎng)，這一過程至少需要7-10天，滿足不了口岸快速檢疫的要求。第二，一些形態(tài)學(xué)鑒別特征如雌蟲尾尖突長(zhǎng)度、尾形、雄蟲交合傘形狀與擬松材線蟲存在一定的重疊現(xiàn)象，給形態(tài)鑒定帶來了一定困難，容易造成錯(cuò)檢、漏檢現(xiàn)象。針對(duì)這些情況，檢疫上急需一套快速、準(zhǔn)確的病原線蟲的檢測(cè)、鑒定技術(shù)。
近年來，隨著生化及分子生物學(xué)技術(shù)的發(fā)展，國內(nèi)外的一些學(xué)者先后采用同工酶電泳和PCR-ITS-RFLP技術(shù)對(duì)松材線蟲進(jìn)行檢測(cè)鑒定，但是這些技術(shù)受到線蟲群體的數(shù)量、線蟲群體是否單一等方面的影響，必須將港口截獲的線蟲進(jìn)行純化培養(yǎng)，耗時(shí)費(fèi)力，難以滿足快速檢測(cè)的要求。
隨著我國進(jìn)口木材和木質(zhì)包裝貨物的增多，松材線蟲從疫區(qū)進(jìn)入我國的機(jī)會(huì)亦增多，但我國口岸缺乏必要的對(duì)該病原物進(jìn)行快速檢測(cè)的方法。故本發(fā)明的目的就是形成一整套松材線蟲分子鑒定的試劑盒，以滿足港口檢疫部門快速檢測(cè)的需要。

發(fā)明內(nèi)容技術(shù)問題 由于現(xiàn)有技術(shù)的限制，要對(duì)松材線蟲進(jìn)行準(zhǔn)確檢測(cè)所需周期較長(zhǎng)，同時(shí)由于松材線蟲與擬松材線蟲在形態(tài)發(fā)育、生理生化等方面的相似性，要準(zhǔn)確地對(duì)兩者(尤其是幼蟲)進(jìn)行鑒定有一定的難度。因此本發(fā)明的目的就是提供松材線蟲與擬松材線蟲檢測(cè)方法及其檢測(cè)試劑盒，對(duì)松材線蟲和擬松線蟲進(jìn)行快速準(zhǔn)確的鑒定。
技術(shù)方案松材線蟲檢測(cè)試劑盒，包括以下成分1)松材線蟲與擬松材線蟲特異性引物序列上游引物P15′-GATGATGCGATTGGTGACT-3′上游引物P25′-TGTTTGAGGAGTGCGTGCAC-3′下游引物P35′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG 3′其中P1/P3構(gòu)成松材線蟲特異性引物對(duì)，P2/P3構(gòu)成擬松材線蟲特異性引物對(duì)；2)1.25ml溶液I，內(nèi)含1mlWLB和0.25ml1ug/ul蛋白酶K，其中1mlWLB(Worm Lysis Buffer)含有500mM KCl，100mM Tris-Cl pH8.0，15mM MgCl2，10mM DTT，4.5％(質(zhì)量比，下文同)Tween 20，0.1％明膠和水；3)1ml溶液II，內(nèi)含
2×PCR reaction Buffer，4.0mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.8μM P1，0.8μMP2，0.8μM P3，100U taq酶，松材線蟲和擬松材線蟲對(duì)照DNA各50ul和水。
上述松材線蟲檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)松材線蟲的方法，包括1)線蟲DNA的提取將線蟲挑入雙蒸水中，用解剖刀將線蟲切成3段以上；用取液器吸取帶有線蟲片段的線蟲液5μl加入到已裝有5μl權(quán)利要求1所述溶液I的0.2ml薄壁管中；將0.2ml薄壁管置于-20℃～-80℃冷凍3h～10min；冷凍后再將薄壁管在65℃下溫育至少2h，最后94℃下保溫10min；12000g離心4min即得到單條線蟲DNA；2)松材線蟲雙倍PCR檢測(cè)吸取所得的單條線蟲的DNA 5μl作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；按下列組成在PCR反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液，15μl反應(yīng)體積包括溶液II7.5μlddH2O2.4μlTaq酶 0.1μlDNA 5μl3)在進(jìn)行單條線蟲擴(kuò)增的同時(shí)還應(yīng)進(jìn)行松材線蟲和擬松材線蟲對(duì)照DNA的擴(kuò)增反應(yīng)，此時(shí)加入的模板體積為1μl，而ddH2O體積為6.4μl；4)雙倍PCR反應(yīng)程序94℃變性10分鐘；進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘；5)反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液5-10μl在1.5％的瓊脂糖中電泳，與對(duì)照DNA的擴(kuò)增片段比較，松材線蟲擴(kuò)增片段約為850bp，擬松材線蟲擴(kuò)增片段約為350bp(見附電泳圖譜)，故當(dāng)發(fā)現(xiàn)樣本的擴(kuò)增片段為850bp時(shí)則樣本為松材線蟲，如樣本的擴(kuò)增片段為350bp時(shí)則為擬松材線蟲。
有益效果 本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，其優(yōu)點(diǎn)和積極效果表現(xiàn)在(1)實(shí)用性好從木材或木質(zhì)包裝中分離出的線蟲可以直接用于檢測(cè)，無需純化培養(yǎng)，有重要的實(shí)際應(yīng)用價(jià)值。松材線蟲隨貿(mào)易往來最可能的傳播途徑是木材或木質(zhì)包裝傳播，在貿(mào)易口岸中，檢疫部門主要是通過對(duì)線蟲的分離、鑒定來判別是否攜帶松材線蟲。但是目前的檢測(cè)方法需要對(duì)該病原線蟲進(jìn)行分離純化培養(yǎng)，需要5-7天的時(shí)間，無法滿足進(jìn)出境檢疫部門快速檢疫的需要。為了使我們的檢疫方法具有實(shí)際的應(yīng)用價(jià)值，我們將分離得到的線蟲(無論成蟲還是幼蟲)提取DNA后直接進(jìn)行PCR擴(kuò)增，可在8小時(shí)內(nèi)完成對(duì)松材線蟲的檢測(cè)。因此本方法大大提高了檢測(cè)的效率。
(2)準(zhǔn)確性高由于傳統(tǒng)松材線蟲的檢測(cè)技術(shù)只是根據(jù)形態(tài)特征來確定建議對(duì)象，容易受到蟲齡的限制，同時(shí)無法排除人為因素的干擾，很難區(qū)分形態(tài)相似種，尤其是松材線蟲和擬松材線蟲的區(qū)分，從而導(dǎo)致準(zhǔn)確性不高；而本發(fā)明根據(jù)松材線蟲和擬松材線蟲的核糖體基因轉(zhuǎn)錄間隔區(qū)(Internal TranscribedSpacer，英文縮寫為ITS)序列，利用Bioedit軟件對(duì)該序列與其它相似種ITS序列進(jìn)行比較，選擇松材線蟲和擬松材線蟲特有序列做特異引物，進(jìn)行PCR擴(kuò)增，為病原線蟲的鑒定和檢測(cè)提供準(zhǔn)確的靶標(biāo)位點(diǎn)。
(3)靈敏度高試劑盒研制中我們觀察到，按照本試劑盒提供的說明方法，可以對(duì)單條線蟲提取DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，效果良好。
(四)說明書附1松材線蟲與擬松材線蟲粗提DNA為模板進(jìn)行雙倍PCR擴(kuò)增M為分子量標(biāo)記，1-4為松材線蟲，5-8為擬松材線蟲圖2單條松材線蟲與擬松材線蟲DNA為模板進(jìn)行雙倍PCR擴(kuò)增M為分子量標(biāo)記，1-4為松材線蟲，5-8為擬松材線蟲以設(shè)計(jì)的松材線蟲和擬松材線蟲特異引物對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲進(jìn)行雙倍PCR檢測(cè)，松材線蟲可以擴(kuò)增出850bp的條帶，擬松材線蟲可以擴(kuò)增出350bp的條帶。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1松材線蟲與擬松材線蟲特異性引物P1/P2/P3的雙倍PCR擴(kuò)增。
松材線蟲檢測(cè)試劑盒，包括以下成分松材線蟲與擬松材線蟲特異性引物序列上游引物P15′-GATGATGCGATTGGTGACT-3′上游引物P25′-TGTTTGAGGAGTGCGTGCAC-3′下游引物P35′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′試劑盒反應(yīng)體系松材線蟲檢測(cè)試劑盒，包括以下成分1.25ml溶液I，內(nèi)含1mlWLB(WormLysis Buffer，500mM KCl，100mM Tris-Cl pH8.0，15mM MgCl2，10mM DTT，4.5％Tween 20，0.1％gelatin，)和0.25ml 1ug/ul蛋白酶K，1ml溶液II(2×PCR反應(yīng)Buffer，4.0mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.8μM P1、P2、P3)，100U taq酶，松材線蟲和擬松材線蟲對(duì)照DNA各50ul。該試劑盒存放于-20℃，保質(zhì)期1年。
對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲樣本進(jìn)行分子檢測(cè)上述松材線蟲和擬松材線蟲檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)的方法，包括1)單條線蟲DNA提取★在洗液浸泡過的凹玻片的凹孔中加入雙蒸水6μl；★將一條線蟲挑入雙蒸水中，用解剖刀(11號(hào)刀片)將線蟲切成3段以上；★用取液器迅速吸取帶有盡量多線蟲片段的線蟲液5μl加入到已裝有5μl溶液I的0.2ml薄壁管中；★將0.2ml薄壁管置于-20℃至少冷凍3h或-80℃至少10min；★冷凍后再將薄壁管在65℃下溫育至少2h，最后94℃下保溫10min；★12000g離心4min即得到單條線蟲的DNA；2)雙倍PCR擴(kuò)增取5ul單條線蟲DNA溶液，加入7.5ul溶液II，2.4ul雙蒸水，0.1ultaq酶，總體積15ul，同時(shí)進(jìn)行松材線蟲和擬松材線蟲對(duì)照DNA的擴(kuò)增反應(yīng)，此時(shí)加入模板體積為1ul，而雙蒸水的體積為6.4ul。
PCR擴(kuò)增程序?yàn)?4℃變性10分鐘；進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘。
3)擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳檢測(cè)取5-10μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，在1.5％的瓊脂糖凝膠上進(jìn)行電泳，電壓為50-100V，30分鐘后在紫外光下檢測(cè)結(jié)果；其中分子量約為850bp的特異性條帶證明所檢測(cè)的病原線蟲為松材線蟲，分子量約為350bp的DNA條帶證明所檢測(cè)病原為擬松材線蟲(

圖1，圖2)，上述方法可在8小時(shí)內(nèi)完成對(duì)松材線蟲和擬松材線蟲的檢測(cè)，準(zhǔn)確、靈敏。
權(quán)利要求
1.松材線蟲檢測(cè)試劑盒，包括以下成分1)松材線蟲與擬松材線蟲特異性引物序列上游引物P15′-GATGATGCGATTGGTGACT-3′上游引物P25′-TGTTTGAGGAGTGCGTGCAC-3′下游引物P35′-TTTCACTCGCCGTTACTAAGG-3′其中P1/P3構(gòu)成松材線蟲特異性引物對(duì)，P2/P3構(gòu)成擬松材線蟲特異性引物對(duì)；2)1.25ml溶液I，內(nèi)含1mlWLB和0.25ml1ug/ul蛋白酶K，其中1mlWLB(Worm Lysis Buffer)含有500mM KCl，100mM Tris-Cl pH 8.0，15mM MgCl2，10mM DTT，4.5％(質(zhì)量比，下文同)Tween 20，0.1％明膠和水；3)1ml溶液II，內(nèi)含2×PCR reaction Buffer，4.0mM MgCl2，0.2mM dNTP，0.8μM P1，0.8μMP2，0.8μM P3，100U taq酶，松材線蟲和擬松材線蟲對(duì)照DNA各50ul和水。
2.權(quán)利要求1所述松材線蟲檢測(cè)試劑盒用于檢測(cè)松材線蟲的方法，包括1)線蟲DNA的提取將線蟲挑入雙蒸水中，用解剖刀將線蟲切成3段以上；用取液器吸取帶有線蟲片段的線蟲液5μl加入到已裝有5μl權(quán)利要求1所述溶液I的0.2ml薄壁管中；將0.2ml薄壁管置于-20℃～-80℃冷凍3h～10min；冷凍后再將薄壁管在65℃下溫育至少2h，最后94℃下保溫10min；12000g離心4min即得到單條線蟲DNA；2)松材線蟲PCR檢測(cè)吸取所得的單條線蟲的DNA 5μl作為PCR反應(yīng)的模板進(jìn)行PCR反應(yīng)；按下列組成在PCR反應(yīng)管中調(diào)制反應(yīng)液，15μl反應(yīng)體積包括溶液II 7.5μlddH2O 2.4μlTaq酶 0.1μlDNA 5μl3)在進(jìn)行單條線蟲擴(kuò)增的同時(shí)還應(yīng)進(jìn)行松材線蟲和擬松材線蟲對(duì)照DNA的擴(kuò)增反應(yīng)，此時(shí)加入的模板體積為1μl，而ddH2O體積為6.4μl；4)PCR反應(yīng)程序94℃變性10分鐘；進(jìn)入循環(huán)，94℃變性45秒，52℃退火45秒，72℃延伸1分鐘，40個(gè)循環(huán)；最后72℃延伸10分鐘；5)反應(yīng)結(jié)束后，取反應(yīng)液5-10μl在1.5％的瓊脂糖中電泳，與對(duì)照DNA的擴(kuò)增片段比較，松材線蟲擴(kuò)增片段約為850bp，擬松材線蟲擴(kuò)增片段約為350bp，故當(dāng)發(fā)現(xiàn)樣本的擴(kuò)增片段為850bp時(shí)則樣本為松材線蟲，如樣本的擴(kuò)增片段為350bp時(shí)則為擬松材線蟲。
全文摘要
本發(fā)明松材線蟲檢測(cè)試劑盒及其檢測(cè)方法屬于農(nóng)林作物防病治病及植物檢疫范疇。設(shè)計(jì)了兩個(gè)引物對(duì)，P1/P3為松材線蟲特異性引物對(duì)，P2/P3為擬松材線蟲特異性引物對(duì)。試劑盒1.25ml溶液I，(Worm Lysis Buffer，500mM KCl，100mM Tris－Cl pH8.0，15mM MgCl
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1529164SQ200310106109
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年10月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月21日
發(fā)明者林茂松, 余本淵, 王金成 申請(qǐng)人:南京農(nóng)業(yè)大學(xué)