專利名稱：用于多步反應的pcr擴增管的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種可用于完成多步反應的PCR擴增器，用于基因擴增及其相關基因檢測。
背景技術：
本發(fā)明涉及一種用于基因擴增和直接檢測的PCR擴增管(PCR是本領域技術人員熟知的技術名詞)，尤其是指一種可直接檢測擴增產物的免沖洗PCR擴增器。
目前，在分子生物學研究和醫(yī)學臨床診斷過程中，聚合酶鏈式反應(PCR)技術是不可缺少的。PCR通常是在一個封閉的管腔內進行，它可以將被檢測的靶基因放大數(shù)萬至數(shù)百萬倍。但是，基因擴增之后，一般需要用電泳等方法對擴增產物進行檢測。由于PCR方法靈敏度極高，其擴增產物在檢測過程中不可避免的會進入空氣中。當進行下一次試驗時，這些飄浮在空中的產物將可能又被擴增出來，這就是PCR檢測容易獲得所謂“假陽性”的原因。為此，國際上一些生物技術公司發(fā)展了封閉式的基因擴增和檢測技術。如熒光定量PCR技術。但是，該技術需要有十分復雜的動態(tài)光學檢測裝置，檢測儀器十分復雜，在我國很難推廣。同時，該技術每次試驗只能檢測一個基因的信息，不能滿足生物信息時代人們需要對大量基因信息的檢測的要求。
基因芯片技術為人們同時檢測大量基因信息提供了有力的工具。基因芯片把許多不同的核酸探針(單鏈寡核苷酸)固定于玻片上，把樣品中基因的擴增產物標記熒光，并與芯片上的核酸探針進行雜交，通過熒光掃描儀進行檢測。雖然基因芯片獲得的信息量大，但是目前大部分基因芯片主要用于細胞的mRNA表達檢測等實驗室研究應用。在重要病原微生物檢測方面，至今很少有成熟的應用實例和過硬的產品問世。就其原因主要在于樣品的處理、擴增標記、雜交、檢測等操作過程都是分開來單獨進行的，從而使整個檢測過程操作繁瑣、復雜，并因此而增加了污染的機會，降低了所得結果的可靠性。盡管目前已將基因擴增技術與芯片檢測方法合為一體，但其特點是整個基因擴增過程在一個微反應池中進行，因而，需要對器件的同一部位反復地升溫降溫，這將無法對結果進行動態(tài)跟蹤和實時定量分析。為此，國內外一些研究者提出把基因芯片與微流體技術相結合，來實現(xiàn)所有操作過程的一體化。申請人對此也進行了研究，并已提出了基因擴增微陣列探針循環(huán)檢測型生物芯片等。然而，由于這種芯片制備困難，并需要研制專門的反應器與之配套，故其成本很高。同時，基因芯片要求靶基因的擴增產物標記熒光，通過熒光信號來檢測核酸探針的雜交狀態(tài)。這就要求在樣品處理過程中要摻入熒光，這不僅提高了樣品處理的成本，增加了難度和不確定因素。而且，在這個過程中因標記效率問題，影響檢測的可靠性。同時，由于整個操作過程的復雜性提高，如樣品處理過程的條件控制和雜交后非特異探針的反復清洗等，不利于集成化檢測。因此，發(fā)展可以對被檢測的基因序列進行非標記檢測的低成本的生物芯片技術是實現(xiàn)生物芯片在醫(yī)學和生命科學等領域中大量實際應用的關鍵之一。
三、技術內容技術問題本發(fā)明提供一種用于多步反應的PCR擴增管，可使多步反應在封閉狀態(tài)下在同一PCR擴增管中完成。
技術方案本發(fā)明是一種用于多步反應的PCR擴增器，包括擴增管組件，擴增管組件由管蓋和擴增管組成，在擴增管組件上設有開口向上的溶液池和溶液流道，溶液池位于擴增管內。
技術效果①由于本發(fā)明將貯液池設置于反應管內，反應管自身能夠構成一個相對封閉的空間，使基因擴增及擴增后操作在上述相對封閉的空間內完成A)將制備好的待擴增基因提取物、擴增液(包括相應的引物和酶等)加入反應管本體中，再在貯液池中加入基因擴增后反應體系，密封PCR反應管；B)把封閉好的反應管放置于相應的基因擴增儀中進行擴增；基因擴增儀可以使用各種流行的儀器，也可以是通過改進的專用的擴增雜交和檢測一體化儀器；C)將管內擴增后的溶液流倒后，使兩種液體混合，再將混合后液體用力甩到PCR反應管底部；D)在溶液混合后，再進行下一步的基因擴增反應。因此，本發(fā)明可以使基因擴增或相關基因檢測等多步反應能在封閉狀態(tài)下在同一PCR擴增管中完成。
②由于本發(fā)明能使二步法的RT-PCR(反轉錄基因擴增)在單PCR管中實現(xiàn)。在PCR管中的反應試劑進行反轉錄過程，以使溶液中產生DNA片斷，再如前所述的方法進行反轉錄體系與貯液池中的溶液進行混合，再進行PCR反應。在封閉體系中進行二步法的RT-PCR，有著反應產率高、不易產生污染、靈敏度高等優(yōu)點。
③本發(fā)明采用封閉體系中貯存兩種反應體系，可在不受外界干擾的狀態(tài)下進行兩步基因擴增反應，如在巢式PCR反應中可大大減少實驗的操作步驟，提高實驗的重復性和精密性。
④本發(fā)明采用封閉體系中貯存兩種反應體系，其中一種為基因擴增混合體系，而在貯液池中貯存雜交緩沖液，可在PCR反應結束后，與雜交緩沖液進行混合，最后與固定在PCR管內壁上的核酸探針進行雜交。以檢測基因被擴增結果，如果有明確的雜交信號，可確認為在基因擴增前存在被檢測的基因。
四

圖1是本發(fā)明實施例1的結構示意圖。
圖2是本發(fā)明實施例2的結構示意圖。
圖3是本發(fā)明實施例3的結構示意圖。
圖4是本發(fā)明實施例4的結構示意圖。
其中1管蓋，2普通PCR管，3液體通道，4溶液池五、具體實施方案實施例1一種可用于完成多步反應的PCR擴增器，使用方法為1、芯片的制備根據(jù)所要檢測的每一靶基因序列，設計一條能與之負鏈(即與正鏈相同)有效雜交的20-50個堿基的寡核苷酸探針，其一端標記一個氨基，通過點樣法將這些探針按照一定的陣列固定到處理過的管蓋內面，制備管蓋芯片。
2、因擴增的引物設計根據(jù)所要檢測的每一靶基因序列，在兩端設計一對20個堿基左右的擴增引物，在其中一條與正鏈互補的引物5’端標記一個熒光分子(如FAM、CY3、CY5等)。
3、因擴增事先在普通的PCR擴增管內加入混合好的PCR或RT-PCR反應體系、引物及處理好的DNA或RNA模板。然后塞入溶液池，在溶液池加入30ul的雜交緩沖液。最后蓋上制備好的管蓋。在PCR擴增儀上按照一定程序進行擴增反應。
4、雜交檢測PCR擴增結束后，將擴增管倒置并用力使PCR反應液和雜交液混合并甩至管蓋端，置于37℃雜交1小時。
5、芯片檢測將管蓋芯片置于熒光掃描顯微鏡下進行雜交結果檢測。
實施例2一種用于多步反應的PCR擴增管，包括反應管且該反應管由PCR管和管中的貯存液體的貯液池組成。分別用于檢測非典型性肺炎相關的冠狀病毒的特定引物(—參見WHO公開引物)，在PCR管中加入反轉錄體系，同時在貯液池中加入基因擴增體系，并加入適量的SYBGREEN。使用WHO推薦的基因擴增條件，在PCR儀上設置后，進行反轉錄后，將PCR管倒置使得兩種溶液相混合，再進行PCR擴增。擴增前后，可在紫外燈下直接觀察，如果出現(xiàn)熒光，則基因被擴增，被測體系中含有被檢測的非典型性肺炎相關的冠狀病毒。
實施例3一種可用于完成多步反應的PCR擴增器，使用方法為1、芯片的制備根據(jù)所要檢測的每一靶基因序列，設計一條能與之負鏈(即與正鏈相同)有效雜交的20-50個堿基的寡核苷酸探針，用Beacon designer2.1軟件將該探針設計成分子信標，然后通過點樣法將這些探針按照一定的陣列固定到處理過的管蓋內面，制備管蓋芯片。
2、因擴增的引物設計根據(jù)所要檢測的每一靶基因序列，在兩端設計一對20個堿基左右的擴增引物。
3、PCR的擴增、雜交及檢測PCR的擴增、雜交及檢測同方案1實施例4一種用于多步反應的PCR擴增器，包括擴增管組件，擴增管組件由管蓋1和擴增管2組成，在擴增管組件上設有開口向上的溶液池4和溶液流道3，溶液池位于擴增管2內，溶液池吊設在管蓋1上，溶液池的外底面為傾斜底面。
實施例5一種用于多步反應的PCR擴增器，包括擴增管組件，擴增管組件由管蓋1和擴增管2組成，在擴增管組件上設有開口向上的溶液池和溶液流道3，溶液池位于擴增管2內，溶液池為環(huán)形溶液4，溶液流道3位于環(huán)形溶液池41的內周壁內，溶液池設在擴增管2內，溶液池的外壁與擴增管內壁相吻合。
實施例6
溶液池為圓缺形溶液池42，其橫截面為圓缺形，溶液流道3為圓缺形溶液池42與擴增管2內壁之間的間隙，圓缺形溶液池42的橫截面為中心角大于180°的圓缺形，并設在擴增管2內，圓缺形溶液池42的外壁與擴增管2的內壁相吻合，圓缺形溶液池42的頂面為傾斜面。
實施例7一種用于多步反應的PCR擴增器，包括擴增管組件，擴增管組件由管蓋1和擴增管2組成，在擴增管組件上設有開口向上的溶液池和溶液流道3，溶液池位于擴增管2內，溶液池由支架5固定于擴增管2內。
權利要求
1.一種用于多步反應的PCR擴增器，包括擴增管組件，擴增管組件由管蓋(1)和擴增管(2)組成，其特征在于在擴增管組件上設有開口向上的溶液池(4)和溶液流道(3)，溶液池位于擴增管(2)內。
2.根據(jù)權利要求1所述的用于多步反應的PCR擴增器，其特征在于溶液池吊設在管蓋(1)上。
3.根據(jù)權利要求1或2所述的用于多步反應的PCR擴增器，其特征在于溶液池的外底面為傾斜底面。
4.根據(jù)權利要求1所述的用于多步反應的PCR擴增器，其特征在于溶液池為環(huán)形溶液池(41)，溶液流道(3)位于環(huán)形溶液池(41)的內周壁內。
5.根據(jù)權利要求4所述的用于多步反應的PCR擴增器，其特征在于溶液池設在擴增管(2)內，溶液池的外壁與擴增管內壁相吻合。
6.根據(jù)權利要求1所述的用于多步反應的PCR擴增器，其特征在于溶液池為圓缺形溶液池(42)，其橫截面為圓缺形，溶液流道(3)為圓缺形溶液池(42)與擴增管(2)內壁之間的間隙。
7.根據(jù)權利要求6所述的用于多步反應的PCR擴增器，其特征在于圓缺形溶液池(42)的橫截面為中心角大于180°的圓缺形，并設在擴增管(2)內，圓缺形溶液池(42)的外壁與擴增管(2)的內壁相吻合。
8.根據(jù)權利要求7所述的用于多步反應的用于多步反應的PCR擴增器，其特征在于圓缺形溶液池(42)的頂面為傾斜面。
9.根據(jù)權利要求1所述的用于多步反應的PCR擴增器，其特征在于溶液池由支架(5)固定于擴增管(2)內。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種用于多步反應的PCR擴增器，包括擴增管組件，擴增管組件由管蓋和擴增管組成，在擴增管組件上設有開口向上的溶液池和溶液流道，溶液池位于擴增管內。由于本發(fā)明將貯液池設置于反應管內，反應管自身能夠構成一個相對封閉的空間，使基因擴增及擴增后操作可在上述相對封閉的空間內完成。故使基因擴增或相關基因檢測等多步反應能在封閉狀態(tài)下在同一PCR擴增管中完成。
文檔編號C12P19/34GK1539954SQ20031010617
公開日2004年10月27日 申請日期2003年11月3日 優(yōu)先權日2003年11月3日
發(fā)明者劉全俊, 白云飛, 葛芹玉, 溫恬, 陸祖宏 申請人:東南大學