專利名稱：甘油氧化酶制劑的制備方法及其在測定血清甘油三酯中的應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及甘油氧化酶制劑的制備及其在測定血清甘油三酯中的應(yīng)用領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
甘油氧化酶(Glycerol Oxidase GO)是二十世紀七十年代后期才被發(fā)現(xiàn)的新酶，至今尚未被國際酶學(xué)委員會確定其標號。該酶主要存在于微生物體內(nèi)如曲霉菌屬和青霉菌屬中，所以可通過菌株發(fā)酵制備該酶。由于該酶發(fā)現(xiàn)較晚，國外只有關(guān)于該酶的實驗室研究工作，沒有工業(yè)化的生產(chǎn)，所以諸如Sigma公司、羅氏公司等大的生化制劑公司均無產(chǎn)品出售，更沒有使用該酶配制的檢測血清甘油三酯試劑盒在臨床推廣應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種甘油氧化酶制劑的制備方法及其在測定血清甘油三酯中的應(yīng)用。
本發(fā)明甘油氧化酶制劑的制備方法，是按照以下步驟實現(xiàn)的——菌種選育與培養(yǎng)取日本曲霉AS8586接孢子于土豆斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4天；——亞硝基胍誘變將培養(yǎng)的AS8586土豆斜面培養(yǎng)基用無菌水沖洗制備孢子懸液，并稀釋至107/ml孢子；按重量體積比1∶1的比例，稱取亞硝基胍于三角瓶中，接入上述孢子懸液并充分混勻后，搖床震蕩100分鐘時取出0.5ml菌液，用生理鹽水稀釋至102/ml孢子，取0.1ml涂布土豆斜面培養(yǎng)基上30℃溫箱培養(yǎng)，長出單菌落時，隨即挑取20個菌落劃斜面，溫箱培養(yǎng)24小時，將菌種斜面用無菌水沖洗制備孢子懸液按體積比1∶100的比例將孢子懸液接入盛有原始發(fā)酵液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃搖床培養(yǎng)48小時；——菌體收集以布氏漏斗真空抽濾菌體，蒸餾水充分洗滌去除殘留的發(fā)酵液體培養(yǎng)基至濾液無色透明為止，抽干后的菌體稱重；——液氮研磨將102/ml的菌體放入研缽，按菌體1ml加1克石英沙和1ml液氮的比例，加入石英沙和液氮，充分研磨，重復(fù)6次，溶于100ml的0.05mol/L硼酸緩沖液中使pH為9.5，充分混勻，于8000rpm離心30分鐘，收集上清液；——硫酸銨分級沉淀將盛有上清液的燒杯放在另一裝有冰水的大燒杯內(nèi)，磁力攪拌，邊攪拌邊徐徐加入硫酸銨至40％飽和度，4℃靜止1小時后20000g離心20分鐘，收集上清液繼續(xù)加入硫酸銨至80％飽和度，攪拌10分鐘，4℃靜止1小時后20000g離心20分鐘，收集沉淀；——蛋白脫鹽將分離得到的沉淀物，溶于0.05mol/L的硼酸緩沖液中，裝入透析帶，在體積比為1∶100的同種緩沖液中透析除鹽24小時，其中更換透析液3次；——凝膠過濾層析將透析后樣品上樣于預(yù)先經(jīng)0.05mol/L硼酸緩沖液充分平衡的1×100cm的Sephadex G-200柱進行層析分離，流速為0.2ml/min每管收集20min；洗脫液與平衡液相同，層析時監(jiān)測A280紫外吸收和酶的活性，確定GO所在的蛋白峰，合并收集液；——離子交換層析將上述合并收集的組分上樣于DEAE-SephadexA-25柱，進行離子層析分離、收集紫外吸收部分酶活在5u/ml以上組分；——冷凍干燥將上述得到的樣品放入培養(yǎng)皿，-20℃冷凍過夜，第二天放入冷凍干燥機凍干10小時，即可制得甘油氧化酶制劑成品。
一種甘油氧化酶制劑在測定血清甘油三酯中的應(yīng)用方法，該應(yīng)用方法按以下步驟完成；——試劑配制0.1mol/L TES緩沖液配制準確稱取5.72g TES，0.508g MgCl2溶于蒸餾水中，加水至250ml，使其pH為8；儲存液配制準確稱量48.8mg 4-AA，238.5mg的3，5二氯對羥基苯磺酸鈉，溶于上述TES緩沖液100ml；三酶合劑準確稱取比活力≥526U/mg的Lipase 10mg，比活力≥250U/mg的POD 4mg，比活力≥50U/mg的GO10mg溶于10ml TES緩沖液內(nèi)凍干；——測定方法貯存液與三酶合劑按體積比14∶1比例配制成工作液，取三個試管各加入3.0ml工作液，分別標注為空白管、標準管、樣品管，空白管注入0.05ml蒸餾水，標準管注入0.05ml甘油標準液，樣品管注入0.05ml待測樣品液，37℃水浴保溫20分鐘，500nm波長比色，按下列公式計算TG含量；C樣品＝A樣品/A標準×C標準其中C樣品＝被測樣品濃度 C標準＝甘油標準液濃度A樣品＝被測樣品吸光度A標準＝甘油標準液吸光度。
測定原理血清甘油三酯(TG)在脂肪酶(Lipase)作用下生成甘油(G)和脂肪酸(FFA)G在有氧條件下經(jīng)GO催化生成甘油醛和過氧化氫(H2O2)
H2O2在過氧化物酶(POD)催化下可與4-氨基安替比林(4-AA)及色源物質(zhì)作用，生成醌類化合物
在Lipase、GO、POD、4-AA及色源適量情況下，TG濃度與呈色反應(yīng)深淺成正比，因而可通過在500nm波長處分光光度比色對TG進行定量測定。
發(fā)明的優(yōu)點及效果1、在本發(fā)明GO制劑的制備方法中，為了提高菌種GO的產(chǎn)率采用了亞硝基胍誘變，這是制備中的關(guān)鍵步驟，為本發(fā)明的獨創(chuàng)之處，這一措施大大提高了GO的產(chǎn)率，為GO的制備提供了可靠的保證；由于GO是上世紀七十年代才被發(fā)現(xiàn)的新酶，至今尚未被國際酶學(xué)委員會確定其酶的標號，更沒有工業(yè)化產(chǎn)品上市，本發(fā)明GO的制備可為GO的理化性質(zhì)何酶促反應(yīng)的動力學(xué)研究提供必要的條件，因此本發(fā)明具有重要的科學(xué)價值。2、本發(fā)明GO制劑在測定血清甘油三酯中的應(yīng)用方法與已有的國內(nèi)外通用的磷酸甘油氧化酶法(GPO法)比較，本法用GO制劑取代了GPO法中的甘油激酶(GK)和磷酸甘油氧化酶(GPO)，本法目前國內(nèi)外均沒有上市使用，具有創(chuàng)新性，其次由于本法是以“1”代“2”，即以一種GO代替GK和GPO兩種酶，大大降低了原材料成本，因此具有較強的市場競爭能力，這種新技術(shù)在測定血清甘油三酯上推廣應(yīng)用可產(chǎn)生明顯的社會效益和經(jīng)濟效益。
具體實施例方式實施例1甘油氧化酶制劑的制備，該方法是按照以下步驟實現(xiàn)的
——菌種選育與培養(yǎng)取日本曲霉AS8586接孢子于土豆斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4天；——亞硝基胍誘變將培養(yǎng)的AS8586土豆斜面培養(yǎng)基用無菌水沖洗制備孢子懸液，并稀釋至107/ml孢子；按重量體積比1∶1的比例，稱取亞硝基胍(本例取10mg)于三角瓶中，接入上述孢子懸液(本例取10ml)并充分混勻后，搖床震蕩100分鐘時取出0.5ml菌液，用生理鹽水稀釋至102/ml孢子，取0.1ml涂布土豆斜面培養(yǎng)基上30℃溫箱培養(yǎng)，長出單菌落時，隨即挑取20個菌落劃斜面，溫箱培養(yǎng)24小時，將菌種斜面用無菌水沖洗制備孢子懸液，按體積比1∶100的比例將孢子懸液接入盛有原始發(fā)酵液體培養(yǎng)基的三角瓶中(本例取1ml孢子懸液，接入盛有100ml原始發(fā)酵液體培養(yǎng)基的三角瓶中)，30℃搖床培養(yǎng)48小時；——菌體收集以布氏漏斗真空抽濾菌體，蒸餾水充分洗滌去除殘留的發(fā)酵液體培養(yǎng)基至濾液無色透明為止，抽干后的菌體稱重；——液氮研磨將102/ml的菌體放入研缽，按菌體1ml加1克石英沙和1ml液氮的比例，加入石英沙和液氮，充分研磨，重復(fù)6次，溶于100ml的0.05mol/L硼酸緩沖液中使pH為9.5，充分混勻，于8000rpm離心30分鐘，收集上清液；——硫酸銨分級沉淀將盛有上清液的燒杯放在另一裝有冰水的大燒杯內(nèi)，磁力攪拌，邊攪拌邊徐徐加入硫酸銨至40％飽和度，4℃靜止1小時后20000g離心20分鐘，收集上清液繼續(xù)加入硫酸銨至80％飽和度，攪拌10分鐘，4℃靜止1小時后20000g離心20分鐘，收集沉淀；——蛋白脫鹽將分離得到的沉淀物，溶于0.05mol/L的硼酸緩沖液中，裝入透析帶，在體積比為1∶100的同種緩沖液中透析除鹽24小時，其中更換透析液3次；——凝膠過濾層析將透析后樣品上樣于預(yù)先經(jīng)0.05mol/L硼酸緩沖液充分平衡的1×100cm的Sephadex G-200柱進行層析分離，流速為0.2ml/min每管收集20min；洗脫液與平衡液相同，層析時監(jiān)測A280紫外吸收和酶的活性，確定GO所在的蛋白峰，合并收集液；——離子交換層析將上述合并收集的組分上樣于DEAE-SephadexA-25柱，進行離子層析分離、收集紫外吸收部分酶活在5u/ml以上組分；
——冷凍干燥將上述得到的樣品放入培養(yǎng)皿，-20℃冷凍過夜，第二天放入冷凍干燥機凍干10小時，即可制得甘油氧化酶制劑成品。
GO成品的分析與鑒定1、蛋白含量采用Bradford法測定樣品中蛋白含量；2、酶活力測定將凍干粉GO定量稱取后用4-氨基安替比林-苯酚法測定GO活力為100U/mg。
甘油氧化酶制劑在測定血清甘油三酯中的應(yīng)用，該應(yīng)用方法按以下步驟完成；——試劑配制0.1mol/L TES緩沖液配制準確稱取5.72g TES，0.508g MgCl2溶于蒸餾水中，加水至250ml，使其pH為8；儲存液配制準確稱量48.8mg 4-AA，238.5mg的3，5二氯對羥基苯磺酸鈉，溶于上述TES緩沖液100ml；三酶合劑準確稱取比活力≥526U/mg的Lipase 10mg，比活力≥250U/mg的POD 4mg，比活力≥50U/mg的GO10mg溶于10ml TES緩沖液內(nèi)凍干；——測定方法貯存液與三酶合劑按體積比14∶1比例配制成工作液，取三個試管各加入3.0ml工作液，分別標注為空白管、標準管、樣品管，空白管注入0.05ml蒸餾水，標準管注入0.05ml甘油標準液，樣品管注入0.05ml待測樣品液，37℃水浴保溫20分鐘，500nm波長比色，按下列公式計算TG含量C樣品＝A樣品/A標準×C標準在全自動生化分析儀或半自動生化分析儀上用本試劑加入被測樣品——血清進行甘油三酯含量測定。
如應(yīng)用本法對100例患者血清TG進行測定，同時用GPO法測定，結(jié)果見下表

上述結(jié)果經(jīng)統(tǒng)計學(xué)處理，兩種測定方法P＞0.05，說明GO法與GPO法沒有顯著性差別，GO法可替代GPO法在臨床推廣使用。
權(quán)利要求
1.一種甘油氧化酶制劑的制備方法，其特征為該方法是按照以下步驟實現(xiàn)的——菌種選育與培養(yǎng)取日本曲霉AS8586接孢子于土豆斜面培養(yǎng)基上，30℃培養(yǎng)4天；——亞硝基胍誘變將培養(yǎng)的AS8586土豆斜面培養(yǎng)基用無菌水沖洗制備孢子懸液，并稀釋至107/ml孢子；按重量體積比1∶1的比例，稱取亞硝基胍于三角瓶中，接入上述孢子懸液并充分混勻后，搖床震蕩100分鐘時取出0.5ml菌液，用生理鹽水稀釋至102/ml孢子，取0.1ml涂布土豆斜面培養(yǎng)基上30℃溫箱培養(yǎng)，長出單菌落時，隨即挑取20個菌落劃斜面，溫箱培養(yǎng)24小時，將菌種斜面用無菌水沖洗制備孢子懸液按體積比1∶100的比例將孢子懸液接入盛有原始發(fā)酵液體培養(yǎng)基的三角瓶中，30℃搖床培養(yǎng)48小時；——菌體收集以布氏漏斗真空抽濾菌體，蒸餾水充分洗滌去除殘留的發(fā)酵液體培養(yǎng)基至濾液無色透明為止，抽干后的菌體稱重；——液氮研磨將102/ml的菌體放入研缽，按菌體1ml加1克石英沙和1ml液氮的比例，加入石英沙和液氮，充分研磨，重復(fù)6次，溶于100ml的0.05mol/L硼酸緩沖液中使pH為9.5，充分混勻，于8000rpm離心30分鐘，收集上清液；——硫酸銨分級沉淀將盛有上清液的燒杯放在另一裝有冰水的大燒杯內(nèi)，磁力攪拌，邊攪拌邊徐徐加入硫酸銨至40％飽和度，4℃靜止1小時后20000g離心20分鐘，收集上清液繼續(xù)加入硫酸銨至80％飽和度，攪拌10分鐘，4℃靜止1小時后20000g離心20分鐘，收集沉淀；——蛋白脫鹽將分離得到的沉淀物，溶于0.05mol/L的硼酸緩沖液中，裝入透析帶，在體積比為1∶100的同種緩沖液中透析除鹽24小時，其中更換透析液3次；——凝膠過濾層析將透析后樣品上樣于預(yù)先經(jīng)0.05mol/L硼酸緩沖液充分平衡的1×100cm的Sephadex G-200柱進行層析分離，流速為0.2ml/min每管收集20min；洗脫液與平衡液相同，層析時監(jiān)測A280紫外吸收和酶的活性，確定GO所在的蛋白峰，合并收集液；——離子交換層析將上述合并收集的組分上樣于DEAE-SephadexA-25柱，進行離子層析分離、收集紫外吸收部分酶活在5u/ml以上組分；——冷凍干燥將上述得到的樣品放入培養(yǎng)皿，-20℃冷凍過夜，第二天放入冷凍干燥機凍干10小時，即可制得甘油氧化酶制劑成品。
2.一種權(quán)利要求1所述的甘油氧化酶制劑在測定血清甘油三酯中的應(yīng)用方法，其特征是該應(yīng)用方法按以下步驟完成；——試劑配制0.1mol/L TES緩沖液配制準確稱取5.72g TES，0.508g MgCl2溶于蒸餾水中，加水至250ml，使其pH為8；儲存液配制準確稱量48.8mg 4-AA，238.5mg的3，5二氯對羥基苯磺酸鈉，溶于上述TES緩沖液100ml；三酶合劑準確稱取比活力≥526U/mg的Lipase 10mg，比活力≥250U/mg的POD4mg，比活力≥50U/mg的GO10mg溶于10ml TES緩沖液內(nèi)凍干；——測定方法貯存液與三酶合劑按體積比14∶1比例配制成工作液，取三個試管各加入3.0ml工作液，分別標注為空白管、標準管、樣品管，空白管注入0.05ml蒸餾水，標準管注入0.05ml甘油標準液，樣品管注入0.05ml待測樣品液，37℃水浴保溫20分鐘，500nm波長比色，按下列公式計算TG含量；C樣品＝A樣品/A標準×C標準其中C樣品＝被測樣品濃度C標準＝甘油標準液濃度A樣品＝被測樣品吸光度A標準＝甘油標準液吸光度。
全文摘要
甘油氧化酶(GO)制劑的制備方法及其在測定血清甘油三酯中的應(yīng)用。制備方法由菌種選育與培養(yǎng)，亞硝基胍誘變，菌體收集，液氮研磨，硫酸銨分級沉淀，蛋白脫鹽，凝膠過濾層析，離子交換層析，冷凍干燥等步驟完成。GO的應(yīng)用方法包括試劑配制即0.1mol/L TES緩沖液配制、儲存液配制、三酶合劑配制；貯存液與三酶合劑按體積比14∶1比例配制成工作液，空白管、標準管、樣品管各注入3.0ml工作液，并分別注入0.05ml蒸餾水、0.05ml甘油標準液、0.05ml待測樣品液，37℃水浴保溫20分鐘，500nm波長比色，計算TG含量。本發(fā)明解決了GO的批量化生產(chǎn)問題，其應(yīng)用代替了磷酸甘油氧化酶法(GPO法)中的GK和GPO兩種酶，大大降低了原材料成本，其推廣應(yīng)用可產(chǎn)生明顯的社會效益和經(jīng)濟效益。
文檔編號C12Q1/61GK1611610SQ200310106719
公開日2005年5月4日 申請日期2003年10月27日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月27日
發(fā)明者李明潤, 邢來君, 關(guān)俊玲, 李明春, 高向耘, 李志新, 李明, 王英, 米沙 申請人:天津市醫(yī)藥科學(xué)研究所