專利名稱：甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽轉(zhuǎn)錄因子BnHB6蛋白編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及的是一種蛋白編碼序列，特別是一種甘藍(lán)型甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽轉(zhuǎn)錄因子BnHB6蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
近代地球氣候環(huán)境的變化和人類的活動(dòng)引起的地表沙漠和半沙漠化，以及大面積干旱半干旱地區(qū)和鹽堿灘涂地的存在，要求有適宜于這些地區(qū)種植的農(nóng)作物品種能夠不斷地得到推廣。當(dāng)前一個(gè)重要的手段就是將表現(xiàn)出耐鹽抗旱的基因?qū)r(nóng)作物進(jìn)行基因工程改造，以獲得抗鹽耐旱的農(nóng)作物新品種。植物轉(zhuǎn)錄因子能夠啟動(dòng)相關(guān)的耐鹽抗旱基因及其蛋白的表達(dá)來提高植物的耐鹽抗旱。包含同源盒區(qū)-亮氨酸拉鏈(Homeodomain leucine-zipper)(HD-Zip)區(qū)域的轉(zhuǎn)錄因子是植物中發(fā)現(xiàn)的一個(gè)蛋白質(zhì)家族。該基因含有一個(gè)同源盒區(qū)域和6個(gè)亮氨酸組成的拉鏈結(jié)構(gòu)，能夠結(jié)合在DNA上啟動(dòng)下游基因的表達(dá)，是一類同源盒(Homeobox)區(qū)域結(jié)合(Binding)的蛋白，故取第一個(gè)字母命名該基因?yàn)镠B。此類轉(zhuǎn)錄因子在植物的生長(zhǎng)、發(fā)育和抗逆反應(yīng)中發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)錄因子HB6基因在植物不同的逆境環(huán)境下均有明顯的增強(qiáng)表達(dá)，并啟動(dòng)下游相關(guān)的耐鹽抗旱基因的表達(dá)，是植物ABA信號(hào)傳導(dǎo)中重要的調(diào)節(jié)基因。
在現(xiàn)有技術(shù)文獻(xiàn)的檢索中發(fā)現(xiàn)雜志《Plant Molecular Biology(植物分子生物學(xué))》在1999，401073-1083發(fā)表了文章“The HD-Zip gene ATHB6 in Arabidopsisis expressed in developing leaves，roots and carpels and up-regulated by waterdeficit conditions”(擬南芥HD-Zip基因ATHB6是在發(fā)育的葉、根和心皮中表達(dá)并受水分缺乏正調(diào)控)”，該文獻(xiàn)雖然對(duì)基因ATHB6在干旱脅迫處理下的表達(dá)已經(jīng)做了充分肯定，是脫落酸ABA誘導(dǎo)表達(dá)的正相關(guān)的基因，但到目前的報(bào)道顯示該基因的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的耐鹽、抗旱和抗病蟲方面的效果沒有明顯提高，此外至今尚未發(fā)現(xiàn)與本發(fā)明主題有密切聯(lián)系文獻(xiàn)的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)中的不足，提供一種甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽轉(zhuǎn)錄因子BnHB6蛋白編碼序列，使其在抗旱耐鹽具有明顯的作用，能夠明顯降低在干旱和鹽堿半鹽堿土地上種植的各種農(nóng)作物在生物產(chǎn)量上的損失。
本發(fā)明是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供了一種分離出的DNA分子，該分子包括編碼具有甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第207-1142位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ IDNO.3中從核苷酸第207-1142位的核苷酸序列雜交。較佳地，所述的編碼序列具有SEQID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。更佳地，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第207-1142位的核苷酸序列。
本發(fā)明分離出的甘藍(lán)型油菜HD-ZIP類相關(guān)蛋白質(zhì)多肽BnHB6，它包括具有SEQID NO.3氨基酸序列的多肽，較佳地，該多肽是具有SEQ ID NO.3序列的多肽，該多肽能夠在鹽、旱、淹水、創(chuàng)傷、活性氧以及水楊酸處理下均能發(fā)揮作用，而水楊酸是植物抗病蟲的信號(hào)分子。
本發(fā)明提供的載體，它包含上述的DNA分子。一種核酸分子，它包含所述的DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
本發(fā)明用上述DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。在實(shí)例中該宿主細(xì)胞是擬南芥。
在本發(fā)明中，“分離的”、“純化的”DNA是指，該DNA或片段已從天然狀態(tài)下位于其兩側(cè)的序列中分離出來，還指該DNA或片段已經(jīng)與天然狀態(tài)下伴隨核酸的組分分開，而且已經(jīng)與在細(xì)胞中伴隨其蛋白質(zhì)分開。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽蛋白(或多肽)編碼序列”指編碼具有甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白活性的多肽的核苷酸序列，如SEQ ID NO.3中第207-1142位核苷酸序列及其簡(jiǎn)并序列。該簡(jiǎn)并序列是指，位于SEQ ID NO.3序列的編碼框第207-1142位核苷酸中，有一個(gè)或多個(gè)密碼子被編碼相同氨基酸的簡(jiǎn)并密碼子所取代后而產(chǎn)生的序列。由于密碼子的簡(jiǎn)并性，所以與SEQ ID NO.3中第207-1142位核苷酸序列同源性低至約70％的簡(jiǎn)并序列也能編碼出SEQ ID NO.3所述的序列。該術(shù)語(yǔ)還包括能在中度嚴(yán)緊條件下(70％-85％一致性)，更佳的在高度嚴(yán)緊條件下(85％以上一致性)與SEQ ID NO.3中從核苷酸第207-1142位的核苷酸序列雜交的核苷酸序列。該術(shù)語(yǔ)還包括與SEQ ID NO.3中從核苷酸第207-1142位的核苷酸序列的同源性至少70％，較佳地至少80％，更佳地至少90％，最佳地至少95％的核苷酸序列。
該術(shù)語(yǔ)還包括能編碼具有與天然的甘藍(lán)型油菜BnHB6相同功能的蛋白的SEQ IDNO.3中開放閱讀框序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-90個(gè)，較佳地1-60個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))核苷酸的缺失、插入和/或取代，以及在5’和/或3’端添加數(shù)個(gè)(通常為60個(gè)以內(nèi)，較佳地為30個(gè)以內(nèi)，更佳地為10個(gè)以內(nèi)，最佳地為5個(gè)以內(nèi))核苷酸。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽蛋白或多肽”指具有甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白活性的SEQ ID NO.3序列的多肽。該術(shù)語(yǔ)還包括具有與天然甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)相同功能的、SEQ ID NO.4序列的變異形式。這些變異形式包括(但并不限于)若干個(gè)(通常為1-50個(gè)，較佳地1-30個(gè)，更佳地1-20個(gè)，最佳地1-10個(gè))氨基酸的缺失、插入和/或取代，以及在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)(通常為20個(gè)以內(nèi)，較佳地為10個(gè)以內(nèi)，更佳地為5個(gè)以內(nèi))氨基酸。例如，在本領(lǐng)域中，用性能相近或相似的氨基酸進(jìn)行取代時(shí)，通常不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。又比如，在C末端和/或N末端添加一個(gè)或數(shù)個(gè)氨基酸通常也不會(huì)改變蛋白質(zhì)的功能。該術(shù)語(yǔ)還包括甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白的活性片段和活性衍生物。
本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜BnHB6多肽的變異形式包括同源序列、保守性變異體、等位變異體、天然突變體、誘導(dǎo)突變體、在高或低的嚴(yán)謹(jǐn)條件下能與甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)DNA雜交的DNA所編碼的蛋白、以及利用甘藍(lán)型油菜BnHB6多肽的抗血清獲得的多肽或蛋白。
在本發(fā)明中，“甘藍(lán)型油菜BnHB6保守性變異多肽”指與SEQ ID NO.3的氨基酸序列相比，有至多10個(gè)，較佳地至多8個(gè)，更佳地至多5個(gè)氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。這些保守性變異多肽最好根據(jù)表1進(jìn)行替換而產(chǎn)生。
表1


表285％ identity in 204-1142nt overlapQuery204 TTGATGATGAAGAGATTAAGCAGTTCAGATTCAGTGGGTGGTCTCATCTCTTTATGTCCC 263|||||||||||||||||||| ||||||||||||||||||||||||||||||||||||||Sbjct216 TTGATGATGAAGAGATTAAGTAGTTCAGATTCAGTGGGTGGTCTCATCTCTTTATGTCCT 275Query264 ACTACTTCCACAGATCAGCCGAGTCCAAGAAGATACGG---GAGAGAATTTCAGTCGATG 320|| |||||||||||| ||| |||||| || |||||||| |||||| ||||||||||||Sbjct276 ACAACTTCCACAGATGAGCAGAGTCCGAGGAGATACGGTGGGAGAGAGTTTCAGTCGATG 335Query321 CTTGAAGGTTACGAGGAGGAAGAAGAAGAAGCCATAACCGAGGAAAGAGGACAAACCGGT 380||||||||||||||||| |||||||||||| ||| || |||||||||||||Sbjct336 CTTGAAGGATACGAGGA---AGAAGAAGAAGCTATAGTAGAAGAAAGAGGACACGTGGGC 392Query381 TTAGCCGAGAAGAAGAGACGGTTAAGCATTAACCAAGTTAAAGCCTTGGAGAAAAATTTC 440
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Query1092 TGAACAGCCACCGTCTCTGCACTGGTATTCCACCGTTGATCAGTGGAA 1139|||||| || |||||||| |||||||| |||||||||||||| |||||Sbjct1103 TGAACAACCGCCGTCTCTACACTGGTACTCCACCGTTGATCATTGGAA 1150Query1321 TTTCGTTCAGTTCTTGTAATTAAGGATCAT 1350|||||| || ||||||||||||||||||||Sbjct1346 TTTCGTGCACTTCTTGTAATTAAGGATCAT 1375Query甘藍(lán)型油菜BnHB6的核酸序列Sbjct擬南芥AtHB6的核酸序列(AY063819)表2為本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白與擬南芥AtHB6蛋白的核苷酸序列的同源比較(GAP)表。
表386％ identity in 311aa overlap，90％ similarity in 311aa overlapQuery1 MMKRLSSSDSVGGLISLCPTTSTDQPSPRRY-GREFQSMLEGYEEEEEEAITEERGQTGL 59MMKRLSSSDSVGGLISLCPTTSTD+ SPRRY GREFQSMLEGY EEEEEAI EERG GLSbjct1 MMKRLSSSDSVGGLISLCPTTSTDEQSPRRYGGREFQSMLEGY-EEEEEAIVEERGHVGL 59Query60 AEKKRRLSINQVKALEKNFELENKLEPERKVKLAQELGLQPRQVAVWFQNRRARWKTKQL 119+EKKRRLSINQVKALEKNFELENKLEPERKVKLAQELGLQPRQVAVWFQNRRARWKTKQLSbjct60 SEKKRRLSINQVKALEKNFELENKLEPERKVKLAQELGLQPRQVAVWFQNRRARWKTKQL 119Query120 EKDYGVLKTQYDSLRHNFDSLRRDNESLLQEIGKLKAKLNGEEEVEEDDEDEENNAVTME 179EKDYGVLKTQYDSLRHNFDSLRRDNESLLQEI KLK KLNGEE++E+AVT ESbjct120 EKDYGVLKTQYDSLRHNFDSLRRDNESLLQEISKLKTKLNGGGGEEEEEENNA--AVTTE 177Query180 SDVSVKEEEVSLPEELTDPPSSPPQLLEHSDSFNYRSFTDLRDLLPLK-AAASSVAAAGS 238SD+SVKEEEVSLPE++T+ PSSPPQ LEHSD NYRSFTDLRDLLPLK AA+S AAAGSSbjct178 SDISVKEEEVSLPEKITEAPSSPPQFLEHSDGLNYRSFTDLRDLLPLKAAASSFAAAAGS 237Query239 SDSSDSSAVLNEESSSNVT-AAPATVPRGSFLQFVKMEQTEDHDDFLSGEEACGFFSDEQ 297SDSSDSSA+LNEESSSNVT AAP TVP G+F QFVKMEQTEDH+DFLSGEEAC FFSDEQSbjct238 SDSSDSSALLNEESSSNVTVAAPVTVPGGNFFQFVKMEQTEDHEDFLSGEEACEFFSDEQ 297Query298 PPSLHWYSTVDQWN 311PPSLHWYSTVD WNSbjct298 PPSLHWYSTVDHWN 311Query甘藍(lán)型油菜BnHB6的氨基酸序列Sbjct擬南芥AtHB6的氨基酸序列(S47136)表3為本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白與擬南芥AtHB6的氨基酸序列的同源比較(FASTA)表。其中，相同的氨基酸在兩個(gè)序列之間用氨基酸單字符標(biāo)出。
發(fā)明甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白或多肽的類似物。這些類似物與天然甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)多肽的差別可以是氨基酸序列上的差異，也可以是不影響序列的修飾形式上的差異，或者兼而有之。這些多肽包括天然或誘導(dǎo)的遺傳變異體。誘導(dǎo)變異體可以通過各種技術(shù)得到，如通過輻射或暴露于誘變劑而產(chǎn)生隨機(jī)誘變，還可通過定點(diǎn)誘變法或其他已知分子生物學(xué)的技術(shù)。類似物還包括具有不同于天然L-氨基酸的殘基(如D-氨基酸)的類似物，以及具有非天然存在的或合成的氨基酸(如β、γ-氨基酸)的類似物。應(yīng)理解，本發(fā)明的多肽并不限于上述例舉的代表性的多肽。
修飾(通常不改變一級(jí)結(jié)構(gòu))形式包括體內(nèi)或體外的多肽的化學(xué)衍生形式如乙?；螋然?。修飾還包括糖基化，如那些在多肽的合成和加工中或進(jìn)一步加工步驟中進(jìn)行糖基化修飾而產(chǎn)生的多肽。這種修飾可以通過將多肽暴露于進(jìn)行糖基化的酶(如哺乳動(dòng)物的糖基化酶或去糖基化酶)而完成。修飾形式還包括具有磷酸化氨基酸殘基(如磷酸酪氨酸，磷酸絲氨酸，磷酸蘇氨酸)的序列。還包括被修飾從而提高了其抗蛋白水解性能或優(yōu)化了溶解性能的多肽。
在本發(fā)明中，可選用本領(lǐng)域已知的各種載體，如市售的載體，包括質(zhì)粒，粘粒等。在生產(chǎn)本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜BnHB6多肽時(shí)，可以將甘藍(lán)型油菜BnHB6編碼序列可操作地連于表達(dá)調(diào)控序列，從而形成甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白表達(dá)載體。
如本發(fā)明所用，“可操作地連于”指這樣一種狀況，即線性DNA序列的某些部分能夠影響同一線性DNA序列其他部分的活性。例如，如果信號(hào)肽DNA作為前體表達(dá)并參與多肽的分泌，那么信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)序列)DNA就是可操作地連于多肽DNA；如果啟動(dòng)子控制序列的轉(zhuǎn)錄，那么它是可操作地連于編碼序列；如果核糖體結(jié)合位點(diǎn)被置于能使其翻譯的位置時(shí)，那么它是可操作地連于編碼序列。一般，“可操作地連于”意味著相鄰，而對(duì)于分泌前導(dǎo)序列則意味著在閱讀框中相鄰。
在本發(fā)明中，術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”為真核細(xì)胞。常用的真核宿主細(xì)胞包括酵母細(xì)胞、煙草細(xì)胞和其它植物細(xì)胞。
還可用Northern印跡法技術(shù)分析甘藍(lán)型油菜BnHB6基因產(chǎn)物的表達(dá)，即分析甘藍(lán)型油菜BnHB6的RNA轉(zhuǎn)錄物在細(xì)胞中的存在與否和數(shù)量。
此外，本發(fā)明提供的可用作探針的核酸分子，該分子通常具有甘藍(lán)型油菜BnHB6核苷酸編碼序列的8-100個(gè)連續(xù)核苷酸，較佳地具有15-50個(gè)連續(xù)核苷酸。該探針可用于檢測(cè)樣品中是否存在編碼甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)的核酸分子。
本發(fā)明的檢測(cè)樣品中是否存在甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)核苷酸序列的方法，它包括用上述的探針與樣品進(jìn)行雜交，然后檢測(cè)探針是否發(fā)生了結(jié)合。較佳地，該樣品是PCR擴(kuò)增后的產(chǎn)物，其中PCR擴(kuò)增引物對(duì)應(yīng)于甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)核苷酸編碼序列，并可位于該編碼序列的兩側(cè)或中間。引物長(zhǎng)度一般為15-50個(gè)核苷酸。
此外，根據(jù)本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜BnHB6核苷酸序列和氨基酸序列，可以在核酸同源性或表達(dá)蛋白質(zhì)的同源性基礎(chǔ)上，篩選甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)同源基因或同源蛋白。
為了得到與甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)基因相關(guān)的甘藍(lán)型油菜cDNAs的點(diǎn)陣，可以用DNA探針篩選甘藍(lán)型油菜cDNA文庫(kù)，這些探針是在低嚴(yán)謹(jǐn)條件下，用32P對(duì)甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)的全部或部分做放射活性標(biāo)記而得的。最適合于篩選的cDNA文庫(kù)是來自甘藍(lán)型油菜的文庫(kù)。構(gòu)建來自感興趣的細(xì)胞或者組織的cDNA文庫(kù)的方法是分子生物學(xué)領(lǐng)域眾所周知的。另外，許多這樣的cDNA文庫(kù)也可以購(gòu)買到，例如購(gòu)自Clontech，Stratagene，Palo Alto，Cal.。這種篩選方法可以識(shí)別與甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)相關(guān)的基因家族的核苷酸序列。
本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)核苷酸全長(zhǎng)序列或其片段通?？梢杂肞CR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對(duì)于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列，尤其是開放閱讀框序列來設(shè)計(jì)引物，并用市售的cDNA庫(kù)或按本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的常規(guī)方法所制備的cDNA庫(kù)作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。當(dāng)序列較長(zhǎng)時(shí)，常常需要進(jìn)行兩次或多次PCR擴(kuò)增，然后再將各次擴(kuò)增出的片段按正確次序拼接在一起。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可通過化學(xué)合成將突變引入本發(fā)明蛋白序列中。
除了用重組法產(chǎn)生之外，本發(fā)明蛋白的片段還可用固相技術(shù)，通過直接合成肽而加以生產(chǎn)(Stewart等人，(1969)Solid-Phase Peptide Synthesis，WH FreemanCo.，San Francisco；Merrifield J.(1963)J.Am Chem.Soc 852149-2154)。在體外合成蛋白質(zhì)可以用手工或自動(dòng)進(jìn)行。例如，可以用Applied Biosystems的431A型肽合成儀(Foster City，CA)來自動(dòng)合成肽。可以分別化學(xué)合成本發(fā)明蛋白的各片段，然后用化學(xué)方法加以連接以產(chǎn)生全長(zhǎng)的分子。
利用本發(fā)明的甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與甘藍(lán)型油菜BnHB6相關(guān)發(fā)生相互作用的物質(zhì)，或者受體、抑制劑或拮抗劑等。
本發(fā)明具有實(shí)質(zhì)性特點(diǎn)和顯著進(jìn)步，本發(fā)明在抗旱耐鹽具有明顯的作用，能夠明顯降低在干旱和鹽堿半鹽堿土地上種植的各種農(nóng)作物在生物產(chǎn)量上的損失。地球上存在大面積的干旱半干旱、鹽堿半鹽堿地區(qū)，因此，本發(fā)明具有很大的應(yīng)用價(jià)值。
具體實(shí)施例方式
下面結(jié)合實(shí)驗(yàn)室試驗(yàn)具體數(shù)據(jù)，以具體實(shí)施例來進(jìn)一步闡述本發(fā)明下列實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等分子克隆實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(New YorkCold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。這些實(shí)施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1甘藍(lán)型油菜BnHB6基因的克隆1.組織分離(isolation)甘藍(lán)型油菜(品種為“滬油15”)從市場(chǎng)上購(gòu)得，將甘藍(lán)型油菜置于28℃發(fā)芽24小時(shí)，然后播種于溫室中，待甘藍(lán)型油菜葉片為3-5片時(shí)，準(zhǔn)備抽取DNA或RNA。
2.RNA的分離(RNA isolation)取部分組織，用研缽研碎，加入盛有裂解液的1.5mL EP管，充分振蕩后，再移入玻璃勻漿器內(nèi)。勻漿后移至1.5mL EP管中，抽提總RNA(TRIzol Reagents，GIBCOBRL，USA)。用甲醛變性膠電泳鑒定總RNA質(zhì)量，然后在分光光度計(jì)上測(cè)定RNA含量。
3.基因的全長(zhǎng)克隆(Cloning of Full-length cDNA)根據(jù)擬南芥AtHB6基因的氨基酸保守序列，利用同源性基因克隆原理，采用RACE方法(GibcoBRL試劑盒)進(jìn)行cDNA全長(zhǎng)克隆，分三個(gè)階段進(jìn)行(1)RT-PCRPCR[HB001(SEQ ID NO.1)+HB002(SEQ ID NO.2)]得到2003BP(761bp)，回收，連接到pGEMT-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtHB6基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)HD-ZIP基因。
(2)3’-RACEPCR[AP+HB301(5’-CGCCGCTGGATCGTCGGACA-3’)]得到HB3’(474bp)，回收，連接到T-Easy載體上，用SP6或T7作為通用引物，采用終止物熒光標(biāo)記(Big-Dye，Perkin-Elmer，USA)的方法，在ABI 377測(cè)序儀(Perkin-Elmer，USA)上進(jìn)行測(cè)序。測(cè)序結(jié)果用GCG軟件包(Wisconsin group，USA)中的BLAST和FASTA軟件搜索已有的數(shù)據(jù)庫(kù)(Genebank+EMBL)，知其核酸序列及編碼蛋白與已知十字花科植物如擬南芥(Arabidopsis thaliana)AtHB6基因的同源性很高，故初步認(rèn)為它是一個(gè)與HD-ZIP相關(guān)基因。
(3).5’-RACE第一輪PCR[AAP+RD501(5’-GTGATCCTCCGTCTGCTCCA-3’)]第二輪PCR[(AUAP+RD502(5’-TCCGGCAACGAA(A/T)CTTCTTC-3’))得到HB5’(約233bp)(過程同(1))將測(cè)序結(jié)果的重疊區(qū)拼接，發(fā)現(xiàn)過程(1)得到的片段既是該基因的完整編碼區(qū)。
BLAST的結(jié)果證明從甘藍(lán)型油菜中新得到的基因確為一個(gè)與擬南芥AtHB6相關(guān)的基因。
通過組合使用上述3種方法，獲得了候選的甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白的全長(zhǎng)編碼序列(SEQ ID NO.3)。
實(shí)施例2甘藍(lán)型油菜BnHB6基因的序列信息與同源性分析本發(fā)明新的甘藍(lán)型油菜BnHB6全長(zhǎng)cDNA的長(zhǎng)度為1572bp，詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3，其中開放讀框位于207-1142位核苷酸(935個(gè)核苷酸)。根據(jù)全長(zhǎng)cDNA推導(dǎo)出甘藍(lán)型油菜BnHB6的氨基酸序列，共311個(gè)氨基酸殘基，分子量為35176.49道爾頓，等電點(diǎn)(pI)為4.57。詳細(xì)序列見SEQ ID NO.3。
將甘藍(lán)型油菜BnHB6的全長(zhǎng)cDNA序列及其編碼蛋白質(zhì)用BLAST程序在Non-redundant GenBank+EMBL+DDBJ+PDB和Non-redundant GenBank CDStranslations+PDB+SwissProt+Superdate+PIR數(shù)據(jù)庫(kù)中進(jìn)行核苷酸和蛋白質(zhì)同源性檢索，結(jié)果發(fā)現(xiàn)它與擬南芥基因AtHB6在核苷酸水平上具有85％的相同性，(附表2)；在氨基酸水平上，它與擬南芥基因AtHB6(S47136)也有86％的相同性(附表3)。由此可見，甘藍(lán)型油菜基因BnHB6與擬南芥基因AtHB6無論從核酸還是蛋白水平上都存在較高的同源性。擬南芥基因AtHB6(S47136)已經(jīng)被證明在干旱條件下明顯增強(qiáng)表達(dá)，并發(fā)揮著重要的作用，可以認(rèn)為甘藍(lán)型油菜基因BnHB6在抗旱耐鹽方面也具有相似的作用。
實(shí)施例3甘藍(lán)型油菜基因BnHB6蛋白或多肽在擬南芥中進(jìn)行真核細(xì)胞表達(dá)及轉(zhuǎn)基因植株的抗旱耐鹽性鑒定含目的基因(甘藍(lán)型油菜基因BnHB6)的表達(dá)載體的構(gòu)建根據(jù)甘藍(lán)型油菜基因BnHB6的全長(zhǎng)序列(SEQ ID NO.3)，設(shè)計(jì)擴(kuò)增出完整編碼閱讀框的引物，并在上游和下游引物上分別引入限制性內(nèi)切酶位點(diǎn)(這可視選用的載體而定)，以便構(gòu)建表達(dá)載體。以實(shí)施例1中獲得的擴(kuò)增產(chǎn)物為模板，經(jīng)PCR擴(kuò)增后，將甘藍(lán)型油菜基因BnBDCl基因cDNA克隆至中間載體(如pBluescript)，進(jìn)一步克隆到雙元表達(dá)載體(如pBI121和改進(jìn)的pCAMBIA2300)，在保證閱讀框架正確的前提下鑒定好的表達(dá)載體，再將其轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌中，利用葉盤法技術(shù)轉(zhuǎn)化模式植物擬南芥。
1.發(fā)苗種子用無菌水漂洗15-20分鐘，再用70％的乙醇消毒1分鐘，然后用0.1％升汞消毒10-12分鐘。最后再用無菌水沖洗5遍。將洗好的種子用吸水紙吸干，放入MS培養(yǎng)基。光照培養(yǎng)5天，待苗長(zhǎng)到4-5厘米便可以剪苗。
2.剪苗剪取0.5-1厘米的下胚軸小片段放入預(yù)培養(yǎng)基，培養(yǎng)2天。
預(yù)培養(yǎng)基MS+6BA(0.2mg/l)+2.4D(1.2mg/l)3.轉(zhuǎn)化共培養(yǎng)將預(yù)培養(yǎng)2天的下胚軸放入事先培養(yǎng)好的菌液中(OD值0.4-0.6)侵染3-5分鐘。接著取出放入預(yù)培養(yǎng)基暗培養(yǎng)2天。
4.篩選培養(yǎng)共培養(yǎng)結(jié)束后，將外植體放入篩選培養(yǎng)基。2周繼代一次。2-4周有愈傷組織形成和芽的分化。待綠芽長(zhǎng)到2厘米后，切下生根。
篩選培養(yǎng)基MS+6BA(4.5mg/l)+NAA(0.1mg/l)+AgNO3(6mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(20mg/l)
生根培養(yǎng)基MS+NAA(0.5mg/l)+cb(250mg/l)+Kan(5mg/l)5.轉(zhuǎn)化植株培養(yǎng)；待根系發(fā)達(dá)后，將植株取出，用無菌水洗凈附著的固體培養(yǎng)基，移入土壤中，剛開始用玻璃罩罩幾天，待植株健壯后再取下玻璃罩，溫室中培養(yǎng)。
含甘藍(lán)型油菜基因BnHB6的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株的抗旱耐鹽性鑒定鑒于編碼BnHB6，如擬南芥的AtHB6基因已被證明在抗旱耐鹽條件下發(fā)揮作用，而甘藍(lán)型油菜基因BnHB6轉(zhuǎn)錄水平與擬南芥的AtHB6具有較高的同源性，可進(jìn)一步對(duì)含甘藍(lán)型油菜基因BnHB6的轉(zhuǎn)基因擬南芥植株進(jìn)行抗旱耐鹽鑒定。用300mM氯化鈉和300mM甘露醇處理處理轉(zhuǎn)基因植株和轉(zhuǎn)基因植株的種子(2天、7天、14天、21天、28天)后研究BnHB6基因在轉(zhuǎn)基因植株中的表達(dá)情況以及各種處理對(duì)植株的生長(zhǎng)情況。Northern blot分析結(jié)果證明，轉(zhuǎn)基因植株BnHB6轉(zhuǎn)錄水平在鹽和甘露醇處理后其表達(dá)量顯著增強(qiáng)，而對(duì)照非轉(zhuǎn)基因植株雖表達(dá)量提高，但明顯低于轉(zhuǎn)基因植株。此外非轉(zhuǎn)基因植株生長(zhǎng)緩慢，最后在鹽和甘露醇處理下枯萎而死，轉(zhuǎn)基因植物依然能正常生長(zhǎng)，只是比未經(jīng)處理的植株生長(zhǎng)稍慢。在抗厭氧、抗氧化和抗病試驗(yàn)中，轉(zhuǎn)基因植株也明顯表現(xiàn)出比對(duì)照(未轉(zhuǎn)基因植株)生長(zhǎng)正常。這證明甘藍(lán)型油菜基因BnHB6基因比擬南芥基因AtHB6具有更有效的和更廣泛的抗逆境的功能，將可用于利用轉(zhuǎn)基因技術(shù)改良植物抗旱耐鹽的研究和產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)中。
實(shí)施例4甘藍(lán)型油菜基因BnHB6在甘藍(lán)型油菜中的拷貝數(shù)分析采用常規(guī)方法從甘藍(lán)型油菜葉片中提取DNA(參考《分子克隆》，Sambrook等，1989)，分別用HindIII Xba I BamH和EcoRI酶切DNA[13μg(微克)/樣品]后，將DNA轉(zhuǎn)至雜交膜(尼龍膜)上后。使用Amersham Pharmacia公司Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabelling module(PRN3540)，我們將BnBDC1基因編碼區(qū)標(biāo)記為探針，然后進(jìn)行雜交(于60℃雜交16小時(shí))。取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于60℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于60℃漂洗3次，每次同樣15分鐘。用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。結(jié)果(Southern blot)發(fā)現(xiàn)在雜交膜上出現(xiàn)多條雜交條帶，說明甘藍(lán)型油菜基因BnHB6在甘藍(lán)型油菜中拷貝數(shù)不低于2。
實(shí)施例5甘藍(lán)型油菜基因BnHB6在不同處理的甘藍(lán)型油菜中的表達(dá)譜分析
1.RNA的提取將生長(zhǎng)了3-5片葉的甘藍(lán)型油菜幼苗先后經(jīng)200mM甘露醇0.5小時(shí)、100mMNaCl3小時(shí)、4℃48小時(shí)、1500μJ/m2紫外線照射0.5小時(shí)，淹水處理兩天，剪刀創(chuàng)傷后0.5小時(shí)，200uM H2023小時(shí)，100μM脫落酸4小時(shí)和500uM水楊酸12小時(shí)處理，然后用TRIzol試劑盒(GIBCO BRL，USA)提取并參考《分子克隆》有關(guān)RNA的制備章節(jié)(Sambrook等，1989)。
2.RNA的定量參考《分子克隆》(Sambrook等，1989)，分光光度計(jì)測(cè)OD260；RNA含量計(jì)算1 OD260＝40μg/ml。
3總RNA瓊脂糖凝膠電泳分離1)取6ml 25*(倍)電泳緩沖液，加入117ml無菌水，混勻。2)稱取1.5g瓊脂糖，加入到上述溶液中，于微波爐里加熱融化，轉(zhuǎn)入55℃水浴中。3)于通風(fēng)櫥中取26.8ml甲醛，加入到55℃的凝膠溶液中，混勻。4)迅速倒入制膠板中，室溫水平放置30分鐘，待膠凝固。5)將提取的RNA(20μg)溶解于RNA變性溶液中，在65℃下加熱10分鐘，然后立即放在冰上。6)在樣品中加入2ul 10*上樣緩沖液，混勻。7)在電泳液未蓋過膠的條件下點(diǎn)樣，5V/cm電壓電泳5小時(shí)左右。
4.RNA尼龍膜上轉(zhuǎn)移1)轉(zhuǎn)移之前，將尼龍膜用10*SSC浸泡。2)將濕潤(rùn)的膜準(zhǔn)確地蓋在膜上，將兩張與膜大小相同的濾紙置2*SSC溶液中濕潤(rùn)，蓋在膜上，排除氣泡。3)濾紙上放一疊與膜大小相同的吸水紙，在吸水紙上放一玻璃板和一重物，水平放置，轉(zhuǎn)移12-20小時(shí)。4)轉(zhuǎn)移后，將膜于80℃烘烤2小時(shí)。
5.膜上雜交信號(hào)的檢出1)將膜浸在5×Dendart’s，0.1％SDS，0.1mg/ml鮭魚精DNA]，65℃下預(yù)雜交2小時(shí)。2)將用Gene ImagesTMContents CDP-StarTMlabellingmodule標(biāo)記的探針在沸水中變性5分鐘，直接加入1)的雜交液中，于65℃雜交16-24小時(shí)。3)取出膜，置于洗膜液I(1*SSC，1％SDS)中，于65℃漂洗3次，每次15分鐘。轉(zhuǎn)入洗膜液II(0.1*SSC，1％SDS)中于65℃漂洗3次，每次15分鐘。4)用X光片壓片60-90分鐘，然后顯影、定影(方法參照Roche DIG labeled試劑盒說明書)。Northern雜交表明除了冷處理外，不同的化學(xué)物質(zhì)、環(huán)境和激素處理，都不同程度的提高了甘藍(lán)型油菜BnHB6轉(zhuǎn)錄水平。說明甘藍(lán)型油菜BnHB6轉(zhuǎn)錄水平在干旱、鹽、創(chuàng)傷和活性氧脅迫下，均能發(fā)揮作用。水楊酸處理也明顯提高該基因的表達(dá)水平，說明該基因在病蟲害脅迫下也會(huì)發(fā)揮作用。
甘藍(lán)型油菜BnHB6基因在甘露醇和脫落酸的不同時(shí)間處理的表達(dá)譜分析
1.RNA的提取將生長(zhǎng)了3-5片葉的甘藍(lán)型油菜幼苗經(jīng)200mM甘露醇處理2分鐘、5分鐘、20分鐘、1小時(shí)、3小時(shí)、6小時(shí)和12小時(shí)，然后按照上面提到的方法抽提RNA，并進(jìn)行定量；同時(shí)將生長(zhǎng)了3-5片葉的甘藍(lán)型油菜幼苗經(jīng)100mM脫落酸處理，處理時(shí)間和抽提方法同上。
2.Northern雜交方法同實(shí)施例5。試驗(yàn)結(jié)果證明，隨著甘露醇和脫落酸處理時(shí)間的延長(zhǎng)，BnHB6的表達(dá)逐步增強(qiáng)，說明BnHB6是干旱和逆境信號(hào)激素脫落酸誘導(dǎo)表達(dá)的，在油菜抗逆性中扮演重要的角色。
本發(fā)明涉及的序列及記號(hào)分列如下(1)SEQ ID NO.1的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度21bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.1GC ATA ACT T(A/T/C/G)G ATT CCC TCC(2)SEQ ID NO.2的信息(i)序列特征(A)長(zhǎng)度20bp(B)類型核苷酸(C)鏈性單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii).分子類型寡核苷酸(iii).序列描述SEQ ID NO.2(A/T)TT CCC GCC CA(A/G)A(A/T/C/G)T TAA CC(2)SEQ ID NO.3的信息
<110>上海交通大學(xué)<120>甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽轉(zhuǎn)錄因子BnHB6蛋白編碼序列<140>
<160>2<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1572<212>DNA<213>甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)<400>1ttcatatgga aaacaaagaa ctctgtctct ctctctcctc tcttactgaa tagaatctcc 60ccattgttct aatttatctc ttccttcaaa gtattgatca tcaagtacta gatgcatttt 120aaactgagag ttaaaacaaa caaaaaaatc attattttga agtaactaaa aggtttttga 180gaagaccctt tttgtagtgc tgtttgatga tgaagagatt aagcagttca gattcagtgg 240gtggtctcat ctctttatgt cccactactt ccacagatca gccgagtcca agaagatacg 300ggagagaatt tcagtcgatg cttgaaggtt acgaggagga agaagaagaa gccataaccg 360aggaaagagg acaaaccggt ttagccgaga agaagagacg gttaagcatt aaccaagtta 420aagccttgga gaaaaatttc gagttagaga acaagcttga gcccgagagg aaagtgaagc 480tagctcaaga acttggtctc caacctcgtc aagtagctgt ttggtttcag aaccgccgtg 540cgcggtggaa gacaaaacag ctcgagaaag attacggtgt tctcaaaacg cagtacgatt 600ctctccgcca taacttcgat tccctccgcc gtgacaatga atctcttctt caagagatcg 660gtaaactaaa agctaagcta aacggagaag aagaagttga agaagatgat gaagatgaag 720agaacaacgc ggtcacgatg gagagtgatg tttccgtcaa ggaagaagaa gtttcgttgc 780cggaggagct tacagatccg ccgtcttctc ctccgcagct tctagagcat tccgacagtt 840tcaattaccg gagtttcacc gacctccgcg accttcttcc gttaaaggcc gcggcttcct 900ccgtcgccgc cgctggatcg tcggacagta gcgattcgag cgccgtgttg aacgaggaaa 960gtagctctaa cgttacggcg gctccggcga cggttccccg gggcagtttc ttgcagtttg 1020tgaaaatgga gcagacggag gatcacgacg actttctgag tggagaagaa gcgtgcgggt 1080ttttctccga tgaacagcca ccgtctctgc actggtattc caccgttgat cagtggaact 1140gaggcttttg atcaccggga gagggttttt gaattggatt aaaatgttct gttatgattc 1200gccggagaag attgaaaaag cggagggcgg aatgggaata atggtgaaat tgcaagggtt 1260cattctgggc gggaatataa ttaattaggg tgatttttgt aattatgcgc tctcttgcgt 1320ttcgttcagt tcttgtaatt aaggatcatg cgaatttgag aaaggggtgg aaaattctaa 1380agggcgaaaa ctagaaatgg aatctttgcg ggattgaatt caagaatttg aaagaattca 1440cgtgtaataa attttgcagt attttaaatg attttataag attttaatgc aattgtataa 1500tttttatgtt tatcttttgc catagaattt aagtgaatgt aaattaattt gatggaaaaa 1560
aaaaaaaaaa aa 1572<210>2<211>311<212>PRT<213>甘藍(lán)型油菜(Brassica napus)<400>2MMKRLSSSDS VGGLISLCPT TSTDQPSPRR YGREFQSMLE GYEEEEEEAI TEERGQTGLA 60EKKRRLSINQ VKALEKNFEL ENKLEPERKV KLAQELGLQP RQVAVWFQNR RARWKTKQLE 120KDYGVLKTQY DSLRHNFDSL RRDNESLLQE IGKLKAKLNG EEEVEEDDED EENNAVTMES 180DVSVKEEEVS LPEELTDPPS SPPQLLEHSD SFNYRSFTDL RDLLPLKAAA SSVAAAGSSD 240SSDSSAVLNE ESSSNVTAAP ATVPRGSFLQ FVKMEQTEDH DDFLSGEEAC GFFSDEQPPS 300LHWYSTVDQW N 31權(quán)利要求
1.一種甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽轉(zhuǎn)錄因子BnHB6蛋白編碼序列，其特征在于，包括編碼具有甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第207-1142位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第207-1142位的核苷酸序列雜交。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽轉(zhuǎn)錄因子BnHB6蛋白編碼序列，其特征是，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3所示的氨基酸序列的多肽，或其保守性變異多肽、或其活性片段，或其活性衍生物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽轉(zhuǎn)錄因子BnHB6蛋白編碼序列，其特征是，所述的編碼序列具有SEQ ID NO.3中從核苷酸第207-1142位的核苷酸序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽轉(zhuǎn)錄因子BnHB6蛋白編碼序列，其特征是，包含DNA分子中8-100個(gè)連續(xù)核苷酸。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽轉(zhuǎn)錄因子BnHB6蛋白編碼序列，其特征是，DNA分子轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞，它是真核細(xì)胞。
全文摘要
一種甘藍(lán)型油菜抗旱耐鹽轉(zhuǎn)錄因子BnHB6蛋白編碼序列，屬于基因工程領(lǐng)域。包括編碼具有甘藍(lán)型油菜BnHB6蛋白質(zhì)活性的多肽的核苷酸序列，而且所述的核苷酸序列與SEQ ID NO.3中從核苷酸第207－1142位的核苷酸序列有至少70％的同源性；或者所述的核苷酸序列能與SEQ ID NO.3中從核苷酸第207－1142位的核苷酸序列雜交。本發(fā)明在植物抗旱耐鹽方面具有明顯的作用，具有很大的應(yīng)用價(jià)值，能夠明顯減少農(nóng)作物在干旱半干旱、鹽堿半鹽堿條件下生物產(chǎn)量的損失。
文檔編號(hào)C12N15/79GK1528895SQ20031010796
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年10月16日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月16日
發(fā)明者余舜武, 張利達(dá), 左開井, 唐東芹, 唐克軒 申請(qǐng)人:上海交通大學(xué)