專利名稱：人源甲硫氨酰氨肽酶1的表達方法及它在尋找抗腫瘤藥物中應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)的表達方法、活性關(guān)鍵結(jié)構(gòu)要求、高通量篩選方法的建立和用途。該篩選方法可用于發(fā)現(xiàn)具有抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物。
背景技術(shù)：
在真核細胞的細胞質(zhì)內(nèi)，所有蛋白的翻譯都起始于N端的甲硫氨酸，然而在原核細胞、線粒體和葉綠體中蛋白的翻譯起始于N-甲?；琢虬彼幔柞；鶊F一般是在伴隨翻譯的過程中被去甲?；缸饔煤蟪ァ２徽撌窃谡婧思毎€是原核細胞中，甲硫氨酰氨肽酶(methionine aminopeptidases，MetAPs)有選擇性的切除新生蛋白或多肽鏈的N端甲硫氨酸。新生蛋白或多肽鏈N端甲硫氨酸的切除對于蛋白的翻譯后修飾以及在細胞的準確定位和功能的正常發(fā)揮起著關(guān)鍵的作用。實驗證明MetAPs在細胞信號傳導(dǎo)、蛋白之間相互作用、腫瘤細胞生長以及細菌和病毒感染等生理病理過程中發(fā)揮重要作用。
例如，一些蛋白的N端氨基酸肉豆蔻?；匦枋窃谠撔律鞍椎腘端甲硫氨酸去掉的前提下，否則將影響這些蛋白在細胞內(nèi)的正常功能，如蛋白激酶p60src，磷酸酯酶calcine3-urin B，以及蛋白分泌調(diào)節(jié)過程中的ADP核糖化因子等(Eur JBiochem.1984；139663-671，Proc Natl Acad Sci USA.1985；824625-4628，Proc Natl AcadSci USA.1988；854620-4624)。
對于原核細胞的生物，甲硫氨酰氨肽酶的存在對于細胞的生存是必需的。研究表明，敲除大腸桿菌、鼠傷寒沙門氏菌中的甲硫氨酰氨肽酶的基因，導(dǎo)致細菌生長停止，并且死亡(J Bacteriol.1989；1714071-4072)。
真核生物酵母細胞中發(fā)現(xiàn)存在兩種類型的甲硫氨酰氨肽酶，分別為ScMetAP1和ScMetAP2。基因敲除實驗表明，敲除兩者中任一基因可導(dǎo)致酵母細胞生長緩慢，但是不影響其生存；但兩基因同時敲除的結(jié)果是細胞不再具有生存的能力(Proc Natl Acad Sci USA.1995；9212357-12361)。
在果蠅實驗中，dMetAP2基因的突變會引起果蠅眼睛與翅膀發(fā)育過程中的缺陷。這表明dMetAP2基因在組織以及器官的發(fā)育過程中的蛋白起始翻譯或蛋白翻譯后加工中可能發(fā)揮重要的作用(Mech Dev.1999；8223-28)。
近年來的實驗證據(jù)確證人源II型甲硫氨酰氨肽酶是抗腫瘤血管生成藥物TNP-470在細胞內(nèi)的直接作用靶點，該藥物目前已經(jīng)進入II期臨床試驗。該類化合物通過共價修飾HsMetAP2催化區(qū)保守氨基酸殘基His231，從而抑制該蛋白酶的活性(Proc Natl Acad Sci USA.1998；9515183-15188)。
TNP-470機制的研究，有利于闡明HsMetAP2在血管內(nèi)皮細胞中的確切功能，為更好的開發(fā)抗腫瘤血管藥物奠定基礎(chǔ)；但是作為與HsMetAP2有著相同底物選擇性的同源性酶HsMetAP1，在細胞生長的過程中又發(fā)揮什么樣的作用？從實驗證據(jù)來看，HsMetAP2的活性抑制可以選擇性地終止內(nèi)皮細胞的增殖，HsMetAP1的酶活性并不能代償其中HsMetAP2失去的活性。假如找到一種HsMetAP1的有效抑制劑，可以更清楚的闡明這其中的奧秘，同時也可以觀察到HsMetAP1活性的抑制對于細胞生長的影響，進而為尋找具有抗腫瘤活性的先導(dǎo)化合物提供了一條新的途徑。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明目的是建立人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)在原核生物大腸桿菌的表達系統(tǒng)，并純化得到活性蛋白及它的缺失突變HsMetAP1Δ1-66和HsMetAP1Δ1-135并找出其活性關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的要求。
本發(fā)明的另一目的是建立HsMetAP1的高通量篩選模型，應(yīng)用該模型篩選得到活性化合物，這些活性化合物具有抑制腫瘤細胞生長的活性，從而找出人源I型甲硫氨酰氨肽酶與腫瘤之間的關(guān)系。
本發(fā)明通過下列步驟實施1.HsMetAP1活性蛋白的表達和純化1)根據(jù)GENEBANK數(shù)據(jù)庫公布的HsMetAP1基因序列(AccessionnumberKIA00094)設(shè)計引物正向引物5’ATTATAAGAATTCTAATGGCGGCCGTGGAGACGCGG3’反向引物5’ACGGTAGTCGACTTAAAATTGAGACATGAAGTG3’以上引物序列中斜體部分分別為限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I的序列，下劃線部分分別是目的基因HsMetAP1的編碼序列。
2)以人源膀胱細胞ECV304的總RNA為模板做RT-PCR得到該細胞的cDNA。采用1)中的引物和得到的cDNA用PCR方法(94℃變性5分鐘，94℃1分鐘、52℃1分鐘、72℃1分鐘30秒30次循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸10分鐘)得到HsMetAP1(385個氨基酸)的編碼序列(1155bp)。
3)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I分別酶切質(zhì)粒載體pGEX-KG(由美國密歇根大學(xué)管昆良教授惠贈)和上述2)中得HsMetAP1的PCR產(chǎn)物；低熔點瓊脂糖凝膠純化經(jīng)雙酶切的質(zhì)粒載體pGEX-KG和PCR產(chǎn)物。
4)T4連接酶連接純化的質(zhì)粒載體和PCR產(chǎn)物后轉(zhuǎn)化質(zhì)粒擴增型大腸桿菌TOP10F’(Invitrogen，Carlsbad，CA)，在含100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上過夜生長得到陽性克隆。挑取3-5個單克隆過夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒并用雙酶切和PCR的方法驗證，最后經(jīng)DNA測序證實，得到目的基因序列完全正確的pGEX-KG/HsMetAP1重組質(zhì)粒。
5)將pGEX-KG/HsMetAP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(Promega，Madison，WI)進行表達。經(jīng)Ultrospec 4000 UV/Visibale Spectrophotometer儀器(PharmaciaBiotech，Pisacatawatm，NJ)于600nm波長處監(jiān)測，當(dāng)大腸桿菌濃度達到0.4-0.6OD時，加入0.5mM的IPTG于30℃誘導(dǎo)表達數(shù)小時后收獲細胞。
6)配制磷酸緩沖液PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mMKH2PO4)，并加入1％的Triton X-100，混勻后，懸浮細胞進行超聲破細胞處理。
7)10,000g離心10分鐘后收集上清，將含有目的蛋白的上清溶液注射到預(yù)先用PBS平衡的GSH-Sepharose親和層析柱(Pharmacia Biotech，Pisacatawatm，NJ)，然后用PBS充分洗脫不結(jié)合的雜蛋白。
8)采用含有10mM還原型谷胱甘肽(reduced Glutathione)的50mM Tris pH8.0溶液洗脫融合蛋白GST-HsMetAP1，收集洗脫液。
9)配制緩沖液(50mM Tris pH8.0，150mM NaCl)，采用55mL HiPrepTM16/10脫鹽柱(Pharmacia Biotech，Pisacatawatm，NJ)除去蛋白洗脫液中的谷胱甘肽。
10)在上述9)得到蛋白溶液中加入1.5mM的CaCl2和2μg/mL的凝血酶(thrombin)于4℃酶切過夜。
11)采用GSH-Sepharose親和層析柱結(jié)合酶切后的GST，而不結(jié)合的即是目的活性蛋白HsMetAP1。
2.HsMetAP1缺失突變(HsMetAP1 Δ1-66和HsMetAP1 Δ1-135)活性蛋白的表達和純化設(shè)計HsMetAP1 Δ1-66正向引物5’TAGGGAATTCTATGGACTGTGGAAGGTGATATT3’和HsMetAP1 Δ1-135正向引物5’ATCAGAATTCTAATAGAAGGGATGCGACTTGTA3’(其中斜體部分為限制性內(nèi)切酶序列，下劃線部分為編碼序列)，結(jié)合HsMetAP1反向引物，以HsMetAP1的全長基因為模板，采用PCR的方法(94℃變性5分鐘，94℃1分鐘、52℃1分鐘、72℃1分鐘30次循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸10分鐘)得到缺失突變的基因序列。
兩種缺失突變型酶的重組質(zhì)粒構(gòu)建和目的蛋白純化方法同上全長蛋白酶的方法。
3.HsMetAP1活性測定方法的建立根據(jù)Pei等人的實驗結(jié)果，大腸桿菌和人源II型甲硫氨酰氨肽酶(EcMetAP1，HsMetAP2)可以水解合成底物Met-S-Gly-Phe的硫酯鍵，產(chǎn)物Met-SH迅速與過量的DTNB反應(yīng)，產(chǎn)生的3-羧基-4-硝基硫代苯酚鹽在412nm處有特征吸收(ε412＝13600M-1·cm-1)(AnalBiochem.2000，280159-65)。通過檢測單位時間內(nèi)412nm處的的光吸收變化來確定酶活性。
實驗結(jié)果表明HsMetAP1能夠有效切割該硫酯底物Met-S-Gly-Phe，要求的最佳pH值為6.5-7.0，且兩價金屬鈷離子和鋅離子都能夠激活酶達到較高的水解活性。確定HsMetAP1活性檢測體系為50mM MOPS，pH7.0，100μM Met-S-Gly-Phe，1mM DTNB，50μM CoCl2和750nM HsMetAP1，對該底物的酶動力學(xué)常數(shù)為Km(1.88mM)，kcat(6.5s-1)，kcat/Km(3.5×103M-1s-1)(表1)(Km，kcat確定方法見Anal Biochem.2000，280159-65)。
表1 HsMetAP1野生型酶和缺失突變型酶對底物Met-S-Gly-Phe的酶動力學(xué)分析HsMetAP1 variantsKm(mM)kcat(s-1)kcat/Km(M-1s-1)wild-type1.88+/-0.026.47+/-0.473,451HsMetAP1(Δ1-66) 1.28+/-0.0416.61+/-1.13 12,956HsMetAP1(Δ1-135)8.81+/-0.447.31+/-0.180,8294.HsMetAP1活性結(jié)構(gòu)關(guān)鍵要求對缺失突變型酶的性質(zhì)研究表明1-66序列氨基酸片斷較易從全長酶上降解，降解后的HsMetAP1 Δ1-66穩(wěn)定性增強；對底物Met-S-Gly-Phe的親和力和轉(zhuǎn)換速率增強，最終導(dǎo)致酶對底物的催化效率提高4倍之多Km(1.28mM)，kcat(16.6s-1)，kcat/Km(1.3×104M-1s-1)。更長片斷的缺失突變型酶是源自于HsMetAP1與EcMetAP1之間的同源序列比較，將前者N端與EcMetAP1非同源的1-135片斷全部缺失得缺失突變型酶HsMetAP1 Δ1-135；對該酶的動力學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，與前兩者全長酶和1-66序列缺失的突變型酶相比較對Met-S-Gly-Phe的切割活性大大減弱(表1)。
分析HsMetAP1的野生型酶和兩種缺失突變型酶對一類P1位氨基酸改變底物的水解活性表明HsMetAP1 Δ1-66與野生型酶相似僅具備水解甲硫氨酸起始的底物，但更長片斷的缺失突變型酶HsMetAP1 Δ1-135雖然對N末端是甲硫氨酸的正常底物催化效率明顯降低，但對N末端非甲硫氨酸替代的底物水解具有較高活性，其中包括Phe-S-Gly-Phe，Val-S-Gly-Phe，Ala-AMC等，可見N端135個氨基酸對HsMetAP1選擇性切割底物有著重要的作用。
表2 HsMetAP1野生型酶和缺失突變型酶對不同底物水解活性的比較enzyme activity(μM/min/μM)substrateHsMetAP1 HsMetAP1 Δ1-66 HsMetAP1 Δ1-135Met-S-Gly-Phe43+/-6 146+/-9 18+/-1Leu-S-Gly-Phe0+/-15+/-013+/-2Lys-S-Gly-Phe4+/-11+/-116+/-2Phe-S-Gly-Phe3+/-07+/-126+/-1Pro-S-Gly-Phe3+/-14+/-115+/-0Ser-S-Gly-Phe0+/-03+/-012+/-1Tyr-S-Gly-Phe2+/-14+/-115+/-0Val-S-Gly-Phe4+/-08+/-130+/-2Ala-AMCa2.8+/-0.17.0+/-0.587.3+/-8.2Met-AMCa13.1+/-0.9 21.6+/-0.9 16.9+/-0.7注酶活性分析體系100μL包含50mM MOPS pH7.0，50μM CoCl2，1mM DTNB，500μM各種不同的底物和300-400nM酶，酶活力單位表示為1μM蛋白在1分鐘時間內(nèi)作用于底物產(chǎn)生的μM產(chǎn)物量a熒光底物被酶水解后產(chǎn)生的AMC直接被檢測定量(λex＝360nm，λem＝460nm)，活力單位表示為1μM蛋白在1分鐘時間內(nèi)分解底物產(chǎn)生的nM產(chǎn)物量。
5.HsMetAP1高通量篩選模型的建立應(yīng)用上述活性檢測方法，確立高通量篩選條件100μL的反應(yīng)體系中包括50mMMOPS，pH7.0，50μM CoCl2，100μM Met-S-Gly-Phe，1mM DTNB，750nM HsMetAP1和2μL DMSO。
高通量篩選首先選擇20μg/mL的化合物濃度進行初篩，挑取初篩抑制率大于50％的化合物進行稀釋，確定其抑制該酶50％活性時所需化合物濃度即IC50。
6.HsMetAP1抑制劑的獲得應(yīng)用上述高通量篩選模型，對5260個純化合物樣品進行大規(guī)模篩選，發(fā)現(xiàn)13個活性化合物，13個化合物中的12個對HsMetAP1具有很好的抑制作用，且結(jié)構(gòu)是來源于同一結(jié)構(gòu)母核。
7.HsMetAP1抑制劑與抗腫瘤活性對大規(guī)模篩選所得到的HsMetAP1抑制劑和經(jīng)結(jié)構(gòu)改造后的HsMetAP1抑制劑對幾株腫瘤細胞的增殖影響和凋亡測試，發(fā)現(xiàn)它們具有明顯的抗腫瘤細胞生長作用。
Luo288 Luo276 Luo302-3 Liu342篩選并改造得到的幾個活性化合物的化學(xué)結(jié)構(gòu)表3四個化合物對HsMetAP1活性和三株腫瘤細胞增殖的抑制IC50IC50(μM)compoundMCF-7 MB-MDA-435 A549 HsMetAP1Luo302-3 9.4±0.27.7±1.37.8±0.2 4.6Luo27644.3±7.6 15.5±2.2 37.9±5.5 4.3Luo2887.0±0.210.9±4.4 8.1±0.4 2.5Liu3422.7±0.33.2±1.63.0±0.5 ～100表4四個化合物(40μM)對三株腫瘤細胞(MCF-7，MB-MDA-435和A549)不同時間凋亡率的比較Apoptosis rate of MCF-7(％)compound24h 48h 72hLuo302-3 16.2525.77 38.25Luo27612.6129.28 43.22Luo28812.7931.95 47.47Liu34221.5541.8 52.13Control(-)6.64 6.09 5.51
Apoptosis rate of MB-MDA-435(％)compound24h48h 72hLuo302-3 4.13.863.33Luo2763.73 4.864.26Luo2884.37 4.274.77Liu3425.87.5 11.67Control(-)2.82 3.582.24Apoptosis rate of A549(％)compound24h 48h 72hLuo302-3 N.D.N.D. N.D.
Luo276N.D.11.8121.42Luo288N.D.13.0215.1Liu342N.D.14.8521.74Control(-)N.D.5.74 5.37N.D.未經(jīng)測試


圖1是GENEBANK公布的HsMetAP1基因和蛋白質(zhì)序列(Accession numberKIA00094)。
圖2是重組質(zhì)粒pGEX-KG/HsMetAP1的構(gòu)建示意圖。
圖3是化合物樣品(空白圓圈)，100％酶活性對照(黑色圓圈)和陽性抑制劑對照(灰色圓圈)在96孔聚苯丙烯板上的分布。
本發(fā)明有益效果本發(fā)明的有益效果是在闡明人源I型甲硫氨酰氨肽酶性質(zhì)的基礎(chǔ)上，確定其為新型的腫瘤治療靶點，以此為基礎(chǔ)的篩選方法可用于發(fā)展新型的抗腫瘤藥物。
具體實施例方式
1.HsMetAP1活性蛋白的表達和純化1)據(jù)GENEBANK數(shù)據(jù)庫公布的HsMetAP1基因序列(Accession numberKIA00094)設(shè)計引物正向引物5’ATTATAAGAATTCTAATGGCGGCCGTGGAGACGCGG3’反向引物5’ACGGTAGTCGACTTAAAATTGAGACATGAAGTG3’
以上引物序列中斜體部分分別為限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I的序列，下劃線部分分別是目的基因HsMetAP1的編碼序列。
2)人源膀胱細胞ECV304的總RNA為模板做RT-PCR得到該細胞的cDNA。采用1)中的引物和得到的cDNA用PCR方法(94℃變性5分鐘，94℃1分鐘、52℃1分鐘、72℃1分鐘30秒30次循環(huán)，最后72℃繼續(xù)延伸10分鐘)得到HsMetAP1(385個氨基酸)的編碼序列(1155bp)。
3)限制性內(nèi)切酶EcoR I和Sal I分別酶切質(zhì)粒載體pGEX-KG(由美國密歇根大學(xué)管昆良教授惠贈)和上述2)中得HsMetAP1的PCR產(chǎn)物；低熔點瓊脂糖凝膠純化經(jīng)雙酶切的質(zhì)粒載體pGEX-KG和PCR產(chǎn)物。
4)T4連接酶連接純化的質(zhì)粒載體和PCR產(chǎn)物后轉(zhuǎn)化質(zhì)粒擴增型大腸桿菌TOP10F’(Invitrogen，Carlsbad，CA)，在含100μg/mL氨芐青霉素的LB平板上過夜生長得到陽性克隆。挑取3-5個單克隆過夜培養(yǎng)后抽提質(zhì)粒并用雙酶切和PCR的方法驗證，最后經(jīng)DNA測序證實，得到目的基因序列完全正確的pGEX-KG/HsMetAP1重組質(zhì)粒。
5)將pGEX-KG/HsMetAP1重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(Promega，Madison，WI)進行表達。經(jīng)Ultrospec 4000 UV/Visbale Spectrophotometer儀器(PharmaciaBiotech，Pisacatawatm，NJ)于600nm波長處監(jiān)測，當(dāng)大腸桿菌濃度達到0.4-0.6OD時，加入0.5mM的IPTG于30℃誘導(dǎo)表達5小時后收獲細胞。
6)配制磷酸緩沖液PBS(140mM NaCl，2.7mM KCl，10mM Na2HPO4，1.8mMKH2PO4)，并加入1％的Triton X-100，混勻后，懸浮細胞進行超聲破細胞處理。
7)10,000g離心10分鐘后收集上清，將含有目的蛋白的上清溶液注射到預(yù)先用PBS平衡的GSH-Sepharose親和層析柱(Pharmacia Biotech，Pisacatawatm，NJ)，然后用PBS充分洗脫不結(jié)合的雜蛋白。
8)采用含有10mM還原型谷胱甘肽(reduced Glutathione)的50mM Tris pH8.0溶液洗脫融合蛋白GST-HsMetAP1，收集洗脫液。
9)配制緩沖液(50mM Tris pH8.0，150mM NaCl)，采用55mL HiPrepTM16/10脫鹽柱(Pharmacia Biotech，Pisacatawatm，NJ)除去蛋白洗脫液中的谷胱甘肽。
10)在上述9)得到蛋白溶液中加入1.5mM的CaCl2和2μg/mL的凝血酶(thrombin)于4℃酶切過夜。
11)采用GSH-Sepharose親和層析柱結(jié)合酶切后的GST，而不結(jié)合的即是目的活性蛋白HsMetAP1。
2.HsMetAP1缺失突變(HsMetA1 Δ1-66和HsMetAP1 Δ1-135)活性蛋白的表達和純化設(shè)計HsMetAP1 Δ1-66正向引物5’TAGGGAATTCTATGGACTGTGGAAGGTGATATT3’和HsMetAP1 Δ1-135正向引物5’ATCAGAATTCTAATAGAAGGGATGCGACTTGTA3’(其中斜體部分為限制性內(nèi)切酶序列，下劃線部分為編碼序列)，結(jié)合HsMetAP1反向引物，以HsMetAP1的全長基因為模板，采用PCR的方法得到缺失突變的基因序列。
兩種缺失突變型酶的重組質(zhì)粒構(gòu)建和目的蛋白純化方法同上全長蛋白酶的方法。
3.HsMetAP1活性測定方法的具體操作在上述確立HsMetAP1的活性測定體系(50mM MOPS，pH7.0，100μM Met-S-Gly-Phe，1mM DTNB，50μM CoCl2和750nM HsMetAP1)的基礎(chǔ)上，活性測定的具體操作為如下將HsMetAP1和CoCl2混合成5×蛋白酶溶液即3.75μM HsMetAP1含有500μM CoCl2，取20μL置于透明的96孔聚苯丙烯板中；制備含有50mM MOPS，pH7.0，100μMMet-S-Gly-Phe，1mM DTNB的混合液，每100μL測活體系中加入80μL以上混合液，酶動力學(xué)反應(yīng)開始；迅速將上述96孔聚苯丙烯板轉(zhuǎn)移至SpectraMax430紫外分光光度計在波長412nm處連續(xù)檢測產(chǎn)物的產(chǎn)生1分鐘。
4.HsMetAP1高通量篩選模型的具體方法稱量1mg化合物樣品溶解于200μL Me2SO，取20μL加入到96孔聚丙烯板的A2-H11樣品孔中，然后加入80μL Me2SO，混合均勻后作為樣品母板(圖4)。用Biomek 2000自動加樣系統(tǒng)取2μL樣品轉(zhuǎn)移到96孔聚苯丙烯板中，作為樣品子板。6000個待篩選化合物分配在75個樣品子板上(樣品濃度為1mg/mL)。
在準備好樣品的96孔板上，A1-D1和E12-H12樣品孔中加入2μL Me2SO作為100％酶活性的樣品對照，而E1-H1和A12-D12樣品孔中分別加入溶解于Me2SO的不同濃度陽性對照抑制劑。采用Robbins加樣系統(tǒng)將80μL反應(yīng)混合物(含50mM MOPS，pH7.0，100μM Met-S-Gly-Phe，1mM DTNB)加入到待檢測的樣品板中，5×HsMetAP1蛋白酶溶液(3.75μM HsMetAP1含有500μM CoCl2)20μL的加入使催化反應(yīng)開始，60秒時間內(nèi)檢測并記錄酶動力學(xué)曲線的變化。
權(quán)利要求
1.一種人源I型甲硫氨酰肽酶(HsMetAP1)及它的缺失突變(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表達方法，包括如下步驟(1)設(shè)計不同的正、反向引物；(2)以人源膀胱細胞ECV304的總RNA為模板用RT-PCR方法得該細胞的cDNA，利用上述設(shè)計的引物和得到的cDNA用PCR方法得到HsMetAP1的編碼序列；(3)用內(nèi)切酶EcoR I和Sal I雙酶切質(zhì)粒載體pGEX-KG用T4連接酶連接、純化得重組質(zhì)粒pGEX-KG/HsMetAP1；(4)將上述重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入大腸桿菌表達，經(jīng)提取、純化得活性蛋白HsMetAP1或HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)、及它的缺失突變(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表達方法，其特征在于用于HsMetAP1設(shè)計的不同引物為正向引物5’ATTATAAGAATTCTAATGGCGGCCGTGGAGACGCGG3’反向引物5’ACGGTAGTCGACTTAAAATTGAGACATGAAGTG3’。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)、及它的缺失突變(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表達方法，其特征在于將雙酶切質(zhì)粒載體PGEX-KG用T4連接酶連接HsMetAP1或它的缺失突變的基因序列，純化得重組質(zhì)粒PGEX-KG/HsMetAP1或它的缺失突變。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)、及它的缺失突變(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表達方法，其特征在于T4連接酶連接純化的質(zhì)粒載體與PCR產(chǎn)物后轉(zhuǎn)化質(zhì)粒擴增型大腸桿菌在含氨芐青霉素LB平板上生長得陽性克隆，再挑出單克隆培養(yǎng)抽提質(zhì)粒用雙酶切及PCR方法驗證，DNA測序得純化的PGEX-KG/HsMetAP1或它的缺失突變的重組質(zhì)粒。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)、及它的缺失突變(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表達方法，其特征在于純化的重組質(zhì)粒PGEX-KG/HsMetAP1或它的缺失突變轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21(DE3)pLysS進行表達，收獲細胞、破細胞加入緩沖液混勻液，離心收集上清，提取純化得活性蛋白HsMetAP1或它的缺失突變。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的人源I型甲硫氨酰氨肽酶(HsMetAP1)、及它的缺失突變(HsMetAP1Δ1-66，HsMetAP1Δ1-135)的表達方法，其特征在于利用該方法進行抗腫瘤藥物的高通量的篩選。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人源I型甲硫氨酰氨肽酶HsMetAP1在原核生物大腸桿菌的表達系統(tǒng)，并純化得到活性蛋白并找到了其活性關(guān)鍵結(jié)構(gòu)的要求；本發(fā)明公開了建立HsMetAP1的高通量篩選模型，應(yīng)用該模型篩選得到活性化合物，找到了活性化合物具有抑制腫瘤細胞生長的活性，以及人源I型甲硫氨酰氨肽酶與腫瘤之間的關(guān)系。
文檔編號C12N9/48GK1609221SQ20031010802
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月20日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月20日
發(fā)明者李佳, 南發(fā)俊, 葉其壯, 李靜雅, 羅群力, 陳玲玲, 崔永梅 申請人:中國科學(xué)院上海藥物研究所