專利名稱：一種添加金屬離子提高必特螺旋霉素產(chǎn)量的發(fā)酵工藝的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一類新藥必特螺旋霉素的發(fā)酵工藝優(yōu)化方法。具體說是通過添加金屬離子提高必特螺旋霉素產(chǎn)量的一種發(fā)酵工藝。
背景技術(shù)：
醫(yī)藥生物技術(shù)研究所王以光教授等人運(yùn)用同源重組技術(shù)將4″位異戊酰基轉(zhuǎn)移酶基因整合至螺旋霉素產(chǎn)生菌streptomyces spiramyceticusF21染色體上，得到了穩(wěn)定的必特螺旋霉素基因工程菌WSJ-1.的必特螺旋霉素為混合型抗生素，其主組分4″-?；菪顾亍Ｓ捎谄湓趪鴥?nèi)外均為首創(chuàng)，于2000年10月獲得中國發(fā)明專利(專利號(hào)ZL97104440.6)并在大量臨床前試驗(yàn)研究基礎(chǔ)上，于2001年7月獲得國家藥品監(jiān)督管理局頒發(fā)的“新藥臨床研究批件”。必特螺旋霉素已經(jīng)通過藥品監(jiān)督管理局的批準(zhǔn)，按一類新藥要求進(jìn)行了臨床試驗(yàn)，現(xiàn)在已經(jīng)通過I期臨床研究?，F(xiàn)有的必特螺旋霉素的發(fā)酵生產(chǎn)只是一些較常規(guī)的發(fā)酵生產(chǎn)方式，所存在的突出問題是發(fā)酵單位較低，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力，往往達(dá)不到生產(chǎn)化的要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種簡便的生產(chǎn)工藝，在發(fā)酵過程中通過添加金屬離子達(dá)到提高效價(jià)的目的。本發(fā)明是通過以下方式來實(shí)現(xiàn)一種添加金屬離子提高必特螺旋霉素產(chǎn)量的發(fā)酵工藝，發(fā)酵工藝為將斜面接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48h，按10％接種量接種二級(jí)種子培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h；按4％接種量接種于發(fā)酵搖瓶中，220r/min，28℃旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)96h；或按4％接種量接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，28℃培養(yǎng)96h；，本發(fā)明在發(fā)酵初始時(shí)，將錳離子的水溶液添加到發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，使得發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中錳離子濃度為3～10mM，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到18～30小時(shí)時(shí)，再將錳離子的水溶液添加到發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中，使得發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中的錳離子濃度為2～8mM。
另一種方法是在發(fā)酵過程中添加鎂離子的水溶液，當(dāng)上述的發(fā)酵進(jìn)行到18～30小時(shí)時(shí)，將鎂離子的水溶液添加到發(fā)酵搖瓶，使得發(fā)酵搖瓶中的鎂離子濃度為5～35mM。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有如下特點(diǎn)(1)發(fā)酵水平高，已明顯超過原工藝的水平。
(2)對(duì)組分沒有影響。
(3)操作簡單。
(4)成本低，便于大規(guī)模生產(chǎn)。
可以看出這種方法有效地克服了現(xiàn)有發(fā)酵方法的不足，為其實(shí)現(xiàn)工業(yè)產(chǎn)業(yè)化作好準(zhǔn)備。
具體實(shí)施例方式
本發(fā)明內(nèi)容通過以下的實(shí)施例作進(jìn)一步闡述，但并不限制本發(fā)明的范圍。
實(shí)施例1斜面接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48h，按10％接種量接種二級(jí)種子培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h。按4％接種量接種于發(fā)酵搖瓶中，220r/min，28℃旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)96h。按常規(guī)方法配置發(fā)酵培養(yǎng)基后(發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉、葡萄糖、魚粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸銨、酵母粉)，將一定量的錳鹽溶于定量的水中后添加到初始料中進(jìn)行發(fā)酵，投入到搖瓶中后的錳離子濃度為3mM，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到24小時(shí)時(shí)再一次性投入含一定量錳離子的水溶液于發(fā)酵液中，此時(shí)投入到搖瓶中后的錳離子濃度為8mM。
實(shí)施例2如實(shí)施例1的方法，將一定量的錳鹽溶于定量的水中后添加到初始料中進(jìn)行發(fā)酵，投入到搖瓶中后的錳離子濃度為7mM，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到18小時(shí)時(shí)，再一次性投入含一定量錳離子的水溶液于發(fā)酵液中，此時(shí)投入到搖瓶中后的錳離子濃度為2mM。
實(shí)施例3
如實(shí)施例1的方法，將一定量的錳鹽溶于定量的水中后添加到初始料中進(jìn)行發(fā)酵，投入到搖瓶中后的錳離子濃度為10mM，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到30小時(shí)時(shí)，再一次性投入含一定量錳離子的水溶液于發(fā)酵液中，此時(shí)投入到搖瓶中后的錳離子濃度為5mM。
表1.錳離子添加工藝在搖瓶上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果沒有添加過Mn2+Mn2+搖瓶對(duì)照Mn2+添加濃度(mM)搖瓶對(duì)照效價(jià)組分效價(jià)(u/ml) 組分 添加時(shí)間(h)(u/ml) (iso/sp) (iso/sp) 0mM/h實(shí)施例1 2000 3/1 4070 2/138(24h)實(shí)施例2 2440 3/1 3890 3/172(18h)實(shí)施例3 1600 1/1 3140 2/110 5(30h)實(shí)施例4如實(shí)施例1的方法，將發(fā)酵搖瓶改為發(fā)酵罐。
實(shí)施例5如實(shí)施例2的方法，將發(fā)酵搖瓶改為發(fā)酵罐。
實(shí)施例6如實(shí)施例3的方法，將發(fā)酵搖瓶改為發(fā)酵罐。
表2.錳離子添加工藝在30L發(fā)酵罐上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果批 發(fā)酵罐對(duì)照 Mn2+發(fā)酵罐 Mn2+添加濃度(mM)號(hào)效價(jià) 組分 效價(jià) 組分添加時(shí)間(h)(u/ml) (iso/sp) (u/ml) (iso/sp) 0 /實(shí)施例4 2120 3/1 3320 2/1 3 8(24h)實(shí)施例5 2115 3/1 3232 2/1 7 2(18h)實(shí)施例6 1468 1/1 2380 1/1 10 5(30h)實(shí)施例7
基本發(fā)酵工藝流程為斜面接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48h，按10％接種量接種二級(jí)種子培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h。按4％接種量接種于發(fā)酵搖瓶中，220r/min，28℃旋轉(zhuǎn)式搖床培養(yǎng)96h。按常規(guī)方法配置發(fā)酵培養(yǎng)基后(發(fā)酵培養(yǎng)基淀粉、葡萄糖、魚粉、磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈉、硝酸銨、酵母粉)，按常規(guī)方法配置發(fā)酵培養(yǎng)基后，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到18小時(shí)時(shí)將一定量的鎂鹽溶于定量的水中，一次性投入到發(fā)酵液中，此時(shí)投入到搖瓶中后的鎂離子濃度為25mM。
實(shí)施例8按照實(shí)施例7的方法，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到25小時(shí)時(shí)，將一定量的鎂鹽溶于定量的水中，一次性投入到發(fā)酵液中，此時(shí)投入到搖瓶中后的鎂離子濃度為6mM。
實(shí)施例9按照實(shí)施例7的方法，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到30小時(shí)時(shí)，將一定量的鎂鹽溶于定量的水中，一次性投入到發(fā)酵液中，此時(shí)投入到搖瓶中后的鎂離子濃度為35mM。
表3.鎂離子添加工藝在搖瓶上的實(shí)驗(yàn)結(jié)果批沒加Mg2+搖瓶對(duì)照 Mg2+搖瓶對(duì)照 Mg2+添加濃度號(hào)(mM)效價(jià) 組分 效價(jià) 組分 添加時(shí)間(h)(u/ml)(iso/sp) (u/ml) (iso/sp)實(shí)施例722263/1 3040 2/125(18h)實(shí)施例824403/1 3420 1.5/1 6(25h)實(shí)施例917004/1 2566 2/135(30h)
權(quán)利要求
1.一種添加金屬離子提高必特螺旋霉素產(chǎn)量的發(fā)酵工藝，發(fā)酵工藝為將斜面接種于一級(jí)種子培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)48h，按10％接種量接種二級(jí)種子培養(yǎng)基，28℃培養(yǎng)24h；按4％接種量接種于發(fā)酵搖瓶中，220r/min，28℃旋轉(zhuǎn)式搖床進(jìn)行發(fā)酵，培養(yǎng)96h；或按4％接種量接種于發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵，28℃培養(yǎng)96h；其特征在于，在發(fā)酵的過程中，添加錳離子或鎂離子的水溶液，使得發(fā)酵罐或發(fā)酵搖瓶中錳離子或鎂離子的濃度為2-35mM。
2.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征在于，發(fā)酵初始時(shí)，將錳離子的水溶液添加到發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中后，使得發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中錳離子濃度為3～10mM；當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到18～30小時(shí)時(shí)，添加錳離子的水溶液，使得發(fā)酵搖瓶或發(fā)酵罐中的錳離子濃度為2～8mM。
3.如權(quán)利要求1所述的發(fā)酵工藝，其特征在于，當(dāng)發(fā)酵進(jìn)行到18～30小時(shí)時(shí)，添加鎂離子的水溶液，使得發(fā)酵搖瓶中的鎂離子濃度為5～35mM。
全文摘要
一種添加金屬離子提高必特螺旋霉素產(chǎn)量的發(fā)酵工藝。本發(fā)明是在按常規(guī)方法配置發(fā)酵培養(yǎng)基后，添加一定量的錳離子溶液或鎂離子溶液，用本發(fā)明所建立的發(fā)酵工藝進(jìn)行必特螺旋霉素的發(fā)酵水平已明顯超過原工藝的水平，不僅效價(jià)高，而且操作簡單成本低，便于大規(guī)模生產(chǎn)，有效地克服了現(xiàn)有發(fā)酵方法的不足，并為下一階段的工業(yè)產(chǎn)業(yè)化的實(shí)現(xiàn)奠定了良好基礎(chǔ)。
文檔編號(hào)C12P19/62GK1546681SQ20031010932
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者莊英萍, 康源, 王永紅, 儲(chǔ)炬, 張嗣良 申請(qǐng)人:華東理工大學(xué)