專利名稱：人膽固醇酯合成酶－1b及其編碼序列的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及生物化學(xué)、分子生物學(xué)、基因工程和DNA重組技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及人膽固醇酯合成-1b(ACAT1b)及其編碼序列和它們的應(yīng)用。
背景技術(shù)：
人膽固醇酯合成酶即人酰基輔酶A膽固醇?；D(zhuǎn)移酶(ACAT，Acyl-coenzyme Acholesterol acyltransferase，EC2.3.1.26)，是人細(xì)胞內(nèi)唯一催化長鏈脂肪酸和游離膽固醇形成膽固醇酯的酶。ACAT在生物體內(nèi)發(fā)揮重要的生理功能，主要參與生物體膽固醇及其酯類吸收、運(yùn)輸和儲存等過程，是維持體內(nèi)膽固醇及其酯類代謝平衡的關(guān)鍵酶之一。國內(nèi)外大量研究表明，它在巨噬細(xì)胞中高活性地合成膽固醇酯，導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)膽固醇酯的過量堆積而形成泡沫細(xì)胞，引起動脈粥樣硬化(AS)早期病變；它的活性可影響神經(jīng)細(xì)胞膜內(nèi)的膽固醇量，而直接調(diào)節(jié)產(chǎn)生Aβ蛋白，與老年癡呆病變(AD)相關(guān)；它在肝、腸細(xì)胞中的活性變化，可直接影響合成膽固醇酯、膽固醇的吸收、脂蛋白的裝配，直至影響膽固醇的血液水平和血液轉(zhuǎn)運(yùn)，與高膽固醇酯癥直接相關(guān)；而長期飲食來源膽固醇的吸收缺乏，同樣引起嚴(yán)重疾病，如小孩、老年的癡呆癥等。因此，它是極重要的膽固醇代謝相關(guān)疾病藥物靶蛋白，國際上已把ACAT作為發(fā)展抗動脈粥樣硬化病變藥物的主攻靶蛋白。但是，ACAT又是含量極低的一種內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜膜蛋白，即使國際上許多實驗室或公司長期投入大量人力、物力等進(jìn)行研究，至今未能純化其天然型酶蛋白。所以，開展基因水平的工作，對深入研究ACAT的作用機(jī)制與結(jié)構(gòu)功能及其與相關(guān)疾病的關(guān)系，顯得極為重要，是目前唯一切實可行的途徑。
目前在哺乳動物中發(fā)現(xiàn)有編碼ACAT1和ACAT2的兩種不同ACAT基因。1993年，美國Dartmouth醫(yī)學(xué)院Chang TY實驗室，首次克隆了具有活性功能的人ACAT1 cDNA(4011bp)，其開放閱讀框編碼550個氨基酸序列(Chang TY et al.，1993，J.Biol.Chem.，26820747-20755)。1996年，美國加州大學(xué)舊金山分校的R.V.Farese實驗室成功進(jìn)行了小鼠ACAT1基因敲除實驗，并分析發(fā)現(xiàn)在肝臟和小腸中，仍有較強(qiáng)ACAT酶活性，由此推測存在另一種形式的ACAT。從計算機(jī)分析ACAT保守序列出發(fā)，1998年，三家實驗室分別克隆了非洲綠猴(Anderson RA et al.，1998，J.Biol.Chem.，27326747-26754)、小鼠(Cases S et al.，1998，J.Biol.Chem.，27326755-26764)和人(Oelkers P et al.，1998，J.Biol.Chem.，27326765-26771)的ACAT2 cDNA。人ACAT2 cDNA長約2040bp，其開放閱讀框編碼522個氨基酸。ACAT1幾乎在所有組織中都表達(dá)，而ACAT2只在肝臟和小腸中有高表達(dá)。
1999年，發(fā)明人實驗室和Chang TY實驗室合作發(fā)表了人ACAT1基因組DNA結(jié)構(gòu)組織，并且發(fā)現(xiàn)人ACAT1 4.3 knt mRNA序列來自于兩條不同的染色體(Li Bo-Liang et al.，J.Biol.Chem.，1999，27411060-11071)，通過一種跨染色體的反式剪接方式(interchromosomal trans-splicing)成熟。在此基礎(chǔ)上，發(fā)明人對這種反式剪接ACAT1mRNA在翻譯水平的調(diào)控進(jìn)行深入的研究。發(fā)明人發(fā)現(xiàn)，除了與國外同行發(fā)表的長約1650bp的ACAT1 ORF編碼的50kDa ACAT1蛋白相同外，這種反式剪接的ACAT1 mRNA還存在另一個上游的翻譯起始，其翻譯產(chǎn)生56kDa ACAT1大蛋白(系統(tǒng)命名為ACAT1b，相應(yīng)的50kDa ACAT1蛋白被命名為ACAT1s)。反式剪接mRNA可編碼產(chǎn)生活性蛋白在哺乳動物中十分罕見，因此多種ACAT1蛋白形式的存在，表明該基因功能的重要性和復(fù)雜性。
隨著中國人民生活水平的提高和飲食結(jié)構(gòu)的改變，心血管疾病和神經(jīng)蛻變性疾病越來越成為威脅人們生命健康的重要?dú)⑹?，大量流行病學(xué)和分子水平的研究已證明這些疾病與生物體內(nèi)膽固醇水平密切相關(guān)。由于ACAT在體內(nèi)膽固醇平衡、動脈粥樣硬化發(fā)病和神經(jīng)蛻變性疾病過程中起了關(guān)鍵作用，因此篩選ACAT的特異抑制劑成為一些制藥公司競相研究的熱點(diǎn)。由于天然形式的ACAT蛋白還沒有純化成功，因此尋找ACAT特異有效的抑制劑還很困難。國內(nèi)外越來越多的科學(xué)家和醫(yī)藥大公司參與到了該領(lǐng)域的研究。尤其是研究心腦血管疾病的科研專家們，特別希望能夠篩選發(fā)明針對抗動脈粥樣硬化和抗神經(jīng)蛻變性疾病ACAT的有效藥物。
發(fā)明人發(fā)現(xiàn)的ACAT1b，對于闡明ACAT的重要功能和揭示高膽固醇酯癥、動脈粥樣硬化和神經(jīng)蛻變性疾病等的分子機(jī)理具有重要意義，此項基礎(chǔ)性研究突破，將會很快引發(fā)它的應(yīng)用性研究，并迅速促進(jìn)膽固醇相關(guān)疾病藥物的發(fā)明。然而，目前，還沒有獲得人ACAT1b及其編碼序列。
因此，本領(lǐng)域迫切需要開發(fā)人ACAT1b及其編碼序列。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的就是提供一種新的人膽固醇酯合成酶1b及其編碼序列。
本發(fā)明的另一目的是提供生產(chǎn)這些人膽固醇酯合成酶及其編碼序列的方法以及它們的用途。
本發(fā)明的第一方面，提供了一種人膽固醇酯合成酶-1b，所述蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物。
(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有人膽固醇酯合成酶-1b的功能的由(a)衍生的蛋白。
在一優(yōu)選例中，所述人膽固醇酯合成酶-1b(ACAT1b)具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
本發(fā)明的第二方面，提供了一種分離的多核苷酸，所述多核苷酸包含一選自下組的核苷酸序列(a)編碼上述蛋白的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
優(yōu)選的，所述多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
較佳的，所述多核苷酸的序列包含選自下組的一種(a)SEQ ID NO1中32-1807位的序列；(b)SEQ ID NO1中1-1873位的序列。
更佳的，所述多核苷酸的序列具有選自下組的一種(a)SEQ ID NO1中32-1807位的序列；(b)SEQ ID NO1中1-1873位的序列。
本發(fā)明的第三方面，提供了一種載體，所述載體含有上述多核苷酸。較佳的，所述多核苷酸包含SEQ ID NO1中32-1807位序列。
本發(fā)明的第四方面，提供了一種宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞包含上述載體。優(yōu)選的，所述宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。更佳的，所述的宿主細(xì)胞是小鼠、大鼠、猴或人的細(xì)胞。
本發(fā)明的第五方面，提供了一種具有人膽固醇酯合成酶-1b活性的蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)人膽固醇酯合成酶-1b的條件下，培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人膽固醇酯合成酶-1b活性的蛋白。
本發(fā)明的第六方面，提供了一種能與上述人膽固醇酯合成酶-1b特異性結(jié)合的抗體。較佳的，所述抗體為單克隆抗體。
本發(fā)明的第七方面，提供了一種藥物組合物，所述藥物組合物含有安全有效量的上述人膽固醇酯合成酶-1b、或上述多核苷酸，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
本發(fā)明的第八方面，提供了所述人膽固醇酯合成酶-1b在篩選或制備治療膽固醇相關(guān)疾病或神經(jīng)蛻變相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。所述膽固醇相關(guān)疾病為動脈粥樣硬化癥或阿爾海默氏疾病。所述神經(jīng)蛻變相關(guān)疾病為早老性癡呆。
本發(fā)明的第九方面，提供了上述多核苷酸在篩選或制備治療膽固醇相關(guān)疾病或神經(jīng)蛻變相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。所述膽固醇相關(guān)疾病為動脈粥樣硬化癥或阿爾海默氏疾病。所述神經(jīng)蛻變相關(guān)疾病為早老性癡呆。
本發(fā)明的第十方面，提供了一種篩選治療膽固醇相關(guān)疾病或神經(jīng)蛻變相關(guān)疾病的藥物的方法，所述方法包括步驟(a)在適合生長的條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述宿主細(xì)胞含有上述表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有上述多核苷酸和與該多核苷酸可操作性相連的外源啟動子，其中在第一組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基或裂解物或制備蛋白中添加候選物質(zhì)，在第二組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基或裂解物或制備蛋白中不添加候選物質(zhì)；(b)測定第一組和第二組宿主細(xì)胞或裂解物或制備蛋白中膽固醇酯合成酶-1b活性，其中第一組宿主細(xì)胞或裂解物或制備蛋白的該酶活性高于和低于第二組就表示該候選物質(zhì)是治療膽固醇相關(guān)疾病或神經(jīng)蛻變相關(guān)疾病的藥物。
本發(fā)明的其它方面由于本文的技術(shù)的公開，對本領(lǐng)域的技術(shù)人員而言是顯而易見的。


下列附圖用于說明本發(fā)明的具體實施方案，而不用于限定由權(quán)利要求書所界定的本發(fā)明范圍。
圖1人ACAT1b cDNA序列即人膽固醇酯合成酶1b的多聚核苷酸編碼序列。
圖2人膽固醇酯合成酶1b的氨基酸序列。
圖3含人ACAT1b編碼序列的重組表達(dá)載體和蛋白印跡分析A.人ACAT1b編碼序列的重組表達(dá)載體的構(gòu)建示意圖；B.人膽固醇酯合成酶1b的蛋白印跡分析。
圖4人ACAT1b基因表達(dá)的人膽固醇酯合成酶的活性分析。
具體實施例方式
本發(fā)明人經(jīng)過廣泛而深入的研究，首次證明克隆得到的人ACAT1b cDNA存在上游非AUG翻譯起始位點(diǎn)，編碼產(chǎn)生的一種人膽固醇酯合成酶氨基酸序列，構(gòu)建含人ACAT1bcDNA的重組表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞表達(dá)，用以分析人ACAT1b的酶活性。在此基礎(chǔ)上完成了本發(fā)明。
如本文所用，術(shù)語“膽固醇酯合成酶-1b”、“ACAT1b”可互換使用，指具有ACAT1b氨基酸序列(圖2)的酶；術(shù)語“膽固醇酯合成酶-1b cDNA”和“ACAT1b cDNA”可互換使用，指具有編碼ACAT1b氨基酸序列的多聚核苷酸序列(圖1，SEQ ID NO1)。
在本發(fā)明中，“膽固醇酯合成酶-1b保守性變異多肽”指與SEQ ID NO2的氨基酸序列相比，有至多10個，較佳地至多8個，更佳地至多5個，最佳地至多3個氨基酸被性質(zhì)相似或相近的氨基酸所替換而形成多肽。
本發(fā)明的多核苷酸可以是DNA形式或RNA形式。DNA形式包括cDNA、基因組DNA或人工合成的DNA。DNA可以是單鏈的或是雙鏈的。DNA可以是編碼鏈或非編碼鏈。編碼成熟多肽的編碼區(qū)序列可以與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列相同或者是簡并的變異體。如本文所用，“簡并的變異體”在本發(fā)明中是指編碼具有SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，但與SEQ ID NO1所示的編碼區(qū)序列有差別的核酸序列。
編碼SEQ ID NO2的成熟多肽的多核苷酸包括只編碼成熟多肽的編碼序列；成熟多肽的編碼序列和各種附加編碼序列；成熟多肽的編碼序列(和任選的附加編碼序列)以及非編碼序列。
本發(fā)明還涉及上述cDNA的多核苷酸變異體。這些多核苷酸變異體可以是天然發(fā)生的等位變異體或非天然發(fā)生的變異體。這些核苷酸變異體包括取代變異體、缺失變異體和插入變異體。如本領(lǐng)域所知的，等位變異體是一個多核苷酸的替換形式，它可能是一個或多個核苷酸的取代、缺失或插入，但不會從實質(zhì)上改變該cDNA的功能。
本發(fā)明還涉及與上述的序列雜交的核酸片段。如本文所用，“核酸片段”的長度至少含10個核苷酸，較好是至少50個核苷酸，更好是至少100個核苷酸，最好是至少200個核苷酸以上至人膽固醇酯合成酶-1b cDNA的全長。核酸片段可用于核酸的擴(kuò)增技術(shù)(如PCR)以確定和/或克隆本發(fā)明的cDNA的核苷酸序列。
本發(fā)明的人ACAT1b cDNA的核苷酸全長序列或其片段通常可以用PCR擴(kuò)增法、重組法或人工合成的方法獲得。對于PCR擴(kuò)增法，可根據(jù)本發(fā)明所公開的有關(guān)核苷酸序列來設(shè)計引物，并用人細(xì)胞來源的cDNA文庫或含人染色體細(xì)胞的cDNA文庫作為模板，擴(kuò)增而得有關(guān)序列。
一旦獲得了有關(guān)的序列，就可以用重組法來大批量地獲得有關(guān)序列。這通常是將其克隆入載體，再轉(zhuǎn)入細(xì)胞，然后通過常規(guī)方法從增殖后的宿主細(xì)胞中分離得到有關(guān)序列。
此外，還可用人工合成的方法來合成有關(guān)序列，尤其是片段長度較短時。通常，通過先合成多個小片段，然后再進(jìn)行連接可獲得序列很長的片段。目前，已經(jīng)可以完全通過化學(xué)合成來得到本發(fā)明基因(或其片段，或其衍生物)的DNA序列。然后可將該DNA序列引入本領(lǐng)域中已知的各種現(xiàn)有的DNA分子(或如載體)和細(xì)胞中。
應(yīng)用PCR技術(shù)擴(kuò)增DNA/RNA的方法(Saiki RK et al.，Science，1985，2301350-1354)被優(yōu)選用于獲得本發(fā)明的cDNA。
本發(fā)明也涉及包含本發(fā)明基因的構(gòu)建物或載體，以及用所述構(gòu)建物或載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)導(dǎo)的宿主細(xì)胞，以及經(jīng)重組技術(shù)產(chǎn)生ACAT1b的方法。
適用于本發(fā)明的外源啟動子沒有特別限制，幾乎所有的外源啟動子都可用于本發(fā)明。代表性的外源啟動子的例子包括(但并不限于)各種重組克隆啟動子，如SV40啟動子、CMV啟動子等，和各種人工合成的啟動子等。應(yīng)注意，外源啟動子還包括來自宿主本身的啟動子。例如，對于某些遺傳病(例如因某啟動子的高活性或低活性所導(dǎo)致的疾病)，可以從病人本身分離得到有關(guān)啟動子，然后將其與本發(fā)明的膽固醇酯合成酶-1bcDNA序列相連，形成含外源啟動子的構(gòu)建物，然后將所述構(gòu)建物用于篩選治療膽固醇相關(guān)疾病的藥物或用于基因治療。
一種構(gòu)建物的例子就是與膽固醇酯合成酶-1b cDNA相連的外源啟動子。至于膽固醇酯合成酶-1b cDNA與外源啟動子的位置關(guān)系，所述cDNA序列應(yīng)位于外源啟動子的下游。
本發(fā)明中，含人膽固醇酯合成酶-1b cDNA的核苷酸序列可優(yōu)選地插入到載體，例如表達(dá)載體中。術(shù)語“載體”指本領(lǐng)域熟知的細(xì)菌質(zhì)粒、噬菌體、酵母質(zhì)粒、植物細(xì)胞病毒、哺乳動物細(xì)胞病毒如腺病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒或其他載體。在本發(fā)明中適用的載體包括但不限于表達(dá)載體、克隆載體，例如適用于原核(如大腸桿菌等細(xì)菌)、真核(如酵母)、昆蟲細(xì)胞、植物細(xì)胞、哺乳動物細(xì)胞中的載體?？傊?，只要能在宿主體內(nèi)復(fù)制和穩(wěn)定，任何質(zhì)粒和載體都可以用。在表達(dá)載體中，除了含有復(fù)制起點(diǎn)、膽固醇酯合成酶-1b cDNA之外，還可含有外源啟動子和其它轉(zhuǎn)錄、翻譯等控制元件。
本領(lǐng)域的技術(shù)人員熟知的方法能用于構(gòu)建含膽固醇酯合成酶-1b cDNA和合適的轉(zhuǎn)錄/翻譯控制信號的表達(dá)載體。這些方法包括體外重組DNA技術(shù)、DNA合成技術(shù)、體內(nèi)重組技術(shù)等(Sambroook，et al.Molecular Cloning，a Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory.New York，1989)。所述的DNA序列可有效地與待表達(dá)的外源啟動子相連接，以指導(dǎo)所述cDNA和對應(yīng)mRNA合成。
此外，表達(dá)載體優(yōu)選地包含一個或多個選擇性標(biāo)記基因，以提供用于選擇轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的表型性狀，如真核細(xì)胞培養(yǎng)用的二氫葉酸還原酶、新霉素抗性以及綠色熒光蛋白(GFP)，或用于大腸桿菌的四環(huán)素或氨芐青霉素抗性。
包含人膽固醇酯合成酶-1b cDNA的適當(dāng)序列以及適當(dāng)啟動子或者控制序列的載體，可以用于轉(zhuǎn)化適當(dāng)?shù)乃拗骷?xì)胞，以使其能夠表達(dá)人膽固醇酯合成酶-1b。
宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞，如細(xì)菌細(xì)胞；或是低等真核細(xì)胞，如酵母細(xì)胞；或是高等真核細(xì)胞，如哺乳動物細(xì)胞。代表性例子有大腸桿菌，鏈霉菌屬；鼠傷寒沙門氏菌的細(xì)菌細(xì)胞；真菌細(xì)胞如酵母；植物細(xì)胞；果蠅S2或Sf9的昆蟲細(xì)胞；CHO、COS、293細(xì)胞、或Bowes黑素瘤細(xì)胞的動物細(xì)胞等。優(yōu)選哺乳動物細(xì)胞，如小鼠，大鼠、猴和人的細(xì)胞。
用重組DNA轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞可用本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的常規(guī)技術(shù)進(jìn)行。所采用的轉(zhuǎn)化方法包括但并不限于磷酸鈣共沉淀法，常規(guī)機(jī)械方法如顯微注射、電穿孔、脂質(zhì)體包裝等。
獲得的轉(zhuǎn)化子可以用常規(guī)方法培養(yǎng)，以表達(dá)ACAT1b。根據(jù)所用的宿主細(xì)胞，培養(yǎng)中所用的培養(yǎng)基可選自各種常規(guī)培養(yǎng)基。在適于宿主細(xì)胞生長和表達(dá)的條件下進(jìn)行培養(yǎng)。上述重組多肽可在細(xì)胞內(nèi)、或在細(xì)胞膜上表達(dá)、或分泌到細(xì)胞外。
本發(fā)明還包括對ACAT1b DNA或是其片段編碼的多肽具有特異性的多克隆抗體和單克隆抗體，尤其是單克隆抗體。這里，“特異性”是指抗體能結(jié)合于ACAT1b基因產(chǎn)物或片段。
本發(fā)明還包括具有免疫活性的抗體片段，如Fab’或(Fab)2片段；抗體重鏈；抗體輕鏈；或嵌合抗體，如具有鼠抗體結(jié)合特異性但仍保留來自人的抗體部分的抗體。本發(fā)明的抗體可以通過本領(lǐng)域內(nèi)技術(shù)人員已知的各種技術(shù)進(jìn)行制備。
抗ACAT1b的抗體可用于免疫組織化學(xué)技術(shù)中，檢測活檢標(biāo)本中的ACAT1b。利用本發(fā)明蛋白，通過各種常規(guī)篩選方法，可篩選出與ACAT1b發(fā)生相互作用的物質(zhì)，如抑制劑、激動劑或拮抗劑等。
本發(fā)明還提供了一種藥物組合物，它含有安全有效量的本發(fā)明ACAT1b、其編碼核酸、抑制劑、激動劑、拮抗劑或反義核酸或它們的組合，以及藥學(xué)上可接受的載體或賦形劑。這類載體包括(但并不限于)鹽水、緩沖液、葡萄糖、水、甘油、乙醇、及其組合。藥物制劑應(yīng)與給藥方式相匹配。本發(fā)明的藥物組合物可以被制成針劑形式，例如用生理鹽水或含有葡萄糖和其他輔劑的水溶液通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。諸如片劑和膠囊之類的藥物組合物，可通過常規(guī)方法進(jìn)行制備。藥物組合物如針劑、溶液、片劑和膠囊宜在無菌條件下制造?；钚猿煞值慕o藥量是治療有效量，例如每天約0.01微克/千克體重-約5毫克/千克體重。此外，本發(fā)明的多肽還可與其他治療劑一起使用。
使用藥物組合物時，是將安全有效量的ACAT1b或其拮抗劑、激動劑施用于哺乳動物，其中該安全有效量通常至少約0.01微克/千克體重，而且在大多數(shù)情況下不超過約10毫克/千克體重，較佳地該劑量是約0.01微克/千克體重-約100微克/千克體重。當(dāng)然，具體劑量還應(yīng)考慮給藥途徑、病人健康狀況等因素，這些都是熟練醫(yī)師技能范圍之內(nèi)的。
本發(fā)明還涉及定量和定位檢測ACAT1b水平的診斷試驗方法。這些試驗是本領(lǐng)域所熟知的，且包括FISH測定和放射免疫測定。試驗中所檢測的ACAT1b水平，可以用作解釋ACAT1b在各種疾病中的重要性和用于診斷ACAT1b缺如或增加所引起的疾病。
一種檢測樣品中是否存在ACAT1b的方法是利用ACAT1b的特異性抗體進(jìn)行檢測，它包括將樣品與ACAT1b特異性抗體接觸；觀察是否形成抗體復(fù)合物，形成了抗體復(fù)合物就表示樣品中存在ACAT1b。
在本發(fā)明的一個實施例中，通過PCR擴(kuò)增和基因重組的方法得到了人ACAT1b cDNA序列，同時分析發(fā)現(xiàn)該cDNA序列5’-區(qū)域具有GGC翻譯起始密碼子、3’-區(qū)域具有TAG翻譯終止密碼子，說明這是一種非典型翻譯閱讀框的基因cDNA序列，其編碼591個氨基酸序列的一種人膽固醇酯合成酶即ACAT1b。
在另一實施例中，本發(fā)明將人ACAT1b cDNA的表達(dá)載體，轉(zhuǎn)染哺乳動物細(xì)胞表達(dá)，分析了人ACAT1b cDNA表達(dá)的膽固醇酯合成酶蛋白，同時利用Cell-free系統(tǒng)方法測定膽固醇酯合成酶活性，表明轉(zhuǎn)染細(xì)胞表達(dá)人ACAT1b具有膽固醇酯合成酶活性，但遠(yuǎn)低于陽性對照活性，顯示其對高膽固醇酯癥等膽固醇代謝相關(guān)疾病的診治、藥物研究，具有極其重要的價值。
本發(fā)明的膽固醇酯合成酶-1b cDNA具有廣闊的應(yīng)用前景。ACAT1b無論對基礎(chǔ)理論研究還是對膽固醇相關(guān)疾病(包括動脈粥樣硬化癥、阿爾海默氏疾病等)的診斷、治療及藥物篩選都具有重要意義。本發(fā)明使人們能在特定時期、特定組織里改變ACAT的表達(dá)活性，從而為治療膽固醇代謝相關(guān)疾病(如動脈粥樣硬化等)和神經(jīng)蛻變性疾病提供另一種途徑，并可利用本發(fā)明cDNA在哺乳動物細(xì)胞中表達(dá)ACAT1b。
下面結(jié)合具體實施例，進(jìn)一步闡述本發(fā)明。應(yīng)理解，這些實施例僅用于說明本發(fā)明而不用于限制本發(fā)明的范圍。下列實施例中未注明具體條件的實驗方法，通常按照常規(guī)條件，例如Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊(New YorkCold Spring HarborLaboratory Press，1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。
實施例1 人ACAT1b cDNA的克隆、鑒定為獲得含有人ACAT1b cDNA序列，設(shè)計合成引物，序列如下L1D2BF5’ACCGCTCGAGTAGTTAAATAG3’H1T7C15’AGGTCTAGAACAGCTGGCTCCAAAT3’使用L1D2BF和H1T7C1引物，利用PCR擴(kuò)增ACAT1 cDNA K1序列，將此PCR產(chǎn)物克隆入pcDNA3(購自Invitrogen)的XhoI和XbaI位點(diǎn)，序列測定正確。在此基礎(chǔ)上發(fā)現(xiàn)此cDNA序列具有編碼591個氨基酸的人膽固醇酯合成酶的功能，發(fā)明人命名為ACAT1b基因序列。
測得的人ACAT1b cDNA的核苷酸序列如圖1和SEQ ID NO1所示。
實施例2 人ACAT1b cDNA閱讀框及其編碼氨基酸序列分析根據(jù)測序得到的ACAT1b cDNA序列和一系列序列突變的研究，進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)該cDNA序列5’-區(qū)域具有非AUG(GGC)翻譯起始密碼子、3’-區(qū)域具有TAG翻譯終止密碼子，說明這是具有非典型翻譯閱讀框的基因cDNA序列，其編碼591個氨基酸序列的人膽固醇酯合成酶即ACAT1b(圖2)，比國外同行報道的人ACAT1s多了41個氨基酸殘基序列。
實施例3 人ACAT1b cDNA真核表達(dá)載體的構(gòu)建為確定人ACAT1b cDNA的蛋白表達(dá)和酶活性分析，以先報道的人ACAT cDNA K1序列的編碼區(qū)作為陽性(Positive)對照；然后，將獲得的陽性對照和樣品cDNA分別接入pcDNA3(購自Invitrogene公司)的XhoI和XbaI之間，位于CMV啟動子的下游，得到相應(yīng)的真核表達(dá)載體pcDNA3-A1s和pcDNA3-A1b(參見圖3A圖譜)。為與ACAT1s蛋白分開，在ACAT1b cDNA中的相應(yīng)密碼子引入突變，同樣接入pcDNA3的XhoI和XbaI之間，位于CMV啟動子的下游，得到相應(yīng)的真核表達(dá)載體pcDNA3-A1bm，使其只表達(dá)ACAT1b(參見圖3B表達(dá)圖譜)。
實施例4 細(xì)胞培養(yǎng)、DNA轉(zhuǎn)染和人ACAT1b cDNA表達(dá)的蛋白質(zhì)分析利用一株ACAT缺陷型的CHO細(xì)胞株AC29，在F12培養(yǎng)基(含10％FBS，100μg/mlstreptomycin，100μg/ml penicillin)中，于濕度95％、5％CO2、37℃下培養(yǎng)。人ACAT1bcDNA編碼蛋白的表達(dá)分析是通過轉(zhuǎn)染實驗確定的，選用的方法是磷酸鈣共沉淀法(Calcium-phosphate transfection，Liu J et al.1997)。分別將載體pcDNA3(Negative對照)、pcDNA3-A1s(Positive對照)、pcDNA3-A1b和pcDNA3-A1bm四種質(zhì)粒DNA，以磷酸鈣方法轉(zhuǎn)染ACAT缺陷型CHO細(xì)胞株AC29進(jìn)行表達(dá)研究。
具體實驗過程如下轉(zhuǎn)染前一天將細(xì)胞接種到60mm培養(yǎng)皿(dish)中，每dish細(xì)胞數(shù)為500,000個/5ml，轉(zhuǎn)染時細(xì)胞豐度達(dá)30-50％。轉(zhuǎn)染前3小時換新鮮培養(yǎng)基。制備磷酸鈣沉淀質(zhì)粒DNA，包括12μg樣品質(zhì)粒DNA(每個dish)，然后逐滴將DNA/磷酸鈣沉淀液加在培液中，37℃轉(zhuǎn)染AC29細(xì)胞。10小時后，PBS洗細(xì)胞2次，在新鮮培養(yǎng)基中恢復(fù)生長。48小時后收集轉(zhuǎn)染的細(xì)胞。
收集細(xì)胞測定蛋白表達(dá)方法如下培養(yǎng)的轉(zhuǎn)染細(xì)胞用冷PBS洗兩次，加100μl細(xì)胞裂解液(10％SDS，50mM Tris-HCl pH6.8，1mM EDTA，25mM DTT)溶解細(xì)胞蛋白質(zhì)。細(xì)胞裂解蛋白溶液用18號注射器針頭剪切數(shù)次，以斷裂粘稠的染色體DNA。蛋白含量測定按照Lowry法略作修改進(jìn)行。SDS-PAGE分析按照Laemmli方法進(jìn)行，膠濃度為12％。電泳完畢后，在電泳凝膠轉(zhuǎn)移儀上從下至上分別鋪4層電轉(zhuǎn)移液浸泡的濾紙-硝酸纖維素膜-電轉(zhuǎn)緩沖液漂洗過的聚丙烯酰胺凝膠-4層電轉(zhuǎn)液浸泡的濾紙，設(shè)定電流1mA/cm2轉(zhuǎn)移30分鐘。轉(zhuǎn)移完畢的硝酸纖維素膜用含5％脫脂奶粉的TBST緩沖液封閉30分鐘后，加入稀釋的DM54 ACAT2抗體覆蓋膜，4℃搖過夜或室溫2小時。TBST緩沖液洗膜3次。然后加入稀釋的辣根過氧化物酶標(biāo)記的羊抗兔IgG覆蓋膜，室溫1小時，TBST緩沖液洗膜3次，TBS緩沖液洗膜2次。按ECL蛋白印跡檢測試劑盒(Santa CruzBiotechnology Inc.公司)提供的方法進(jìn)行熒光顯影，結(jié)果參見圖3B。
實施例5 細(xì)胞培養(yǎng)、DNA轉(zhuǎn)染和人ACAT1b cDNA表達(dá)蛋白的酶活性分析細(xì)胞培養(yǎng)、DNA轉(zhuǎn)染實驗基本同上述實施例4，然后進(jìn)行Cell-free系統(tǒng)方法測定膽固醇酯合成酶活性。
Cell free系統(tǒng)測定膽固醇酯合成酶活性的分析參照文獻(xiàn)報道的方法(Chang CCYet al.，1995，J.Biol.Chem.27029532-29540)，裂解轉(zhuǎn)染細(xì)胞，加入膽固醇和3H標(biāo)記的油酰CoA底物，測定微粒體中ACAT的酶活性。具體做法是，冷PBS洗兩次后的轉(zhuǎn)染AC29細(xì)胞加入100μl含1mM EDTA的1mM Tris(pH7.8)，冰上放置5分鐘后收集細(xì)胞裂解物，取15μl 2M KCl，7.5μl 10％ CHAPS、15μl細(xì)胞裂解物和反應(yīng)底物37℃作用10分鐘，然后加4ml CHCl3∶MeOH(2∶1)混勻終止反應(yīng)，再加入10μl油酰膽固醇，混勻，加1ml水，離心，棄水相，吹干，加60μl乙酸乙脂，薄層層析，收集膽固醇脂，同位素計數(shù)，并以Western blot校正ACAT1b的表達(dá)量(標(biāo)準(zhǔn)ACAT活性，Normalized ACAT Activity)。該方法測得ACAT1b具有膽固醇酯合成酶活性，但遠(yuǎn)低于陽性對照(參見圖4)。
在本發(fā)明提及的所有文獻(xiàn)都在本申請中引用作為參考，就如同每一篇文獻(xiàn)被單獨(dú)引用作為參考那樣。此外應(yīng)理解，在閱讀了本發(fā)明的上述講授內(nèi)容之后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以對本發(fā)明作各種改動或修改，這些等價形式同樣落于本申請所附權(quán)利要求書所限定的范圍。
序列表<110>中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院<120>人膽固醇酯合成酶-1b及其編碼序列<130>03121b<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>1873<212>DNA<213>智人(Homo sapiens)<220>
<221>CDS<222>(32)…(1807)<223>
<400>11 tagttaaata gctatattta tatatatcca g31ggc acc ccg aat tcg gga gag ctt ccc gga gtc gac ctt cct gct76Gly Thr Pro Asn Ser Gly Glu Leu Pro Gly Val Asp Leu Pro Ala1 5 10 15ggc tgc tct gtg acc gct tcc cgg ctc tgc cct ctt ggc cga agt121Gly Cys Ser Val Thr Ala Ser Arg Leu Cys Pro Leu Gly Arg Ser20 25 30gcc cgc tgc cgg gcg cgg gcc tca gac aat aca atg gtg ggt gaa166Ala Arg Cys Arg Ala Arg Ala Ser Asp Asn Thr Met Val Gly Glu35 40 45gag aag atg tct cta aga aac cgg ctg tca aag tcc agg gaa aat211Glu Lys Met Ser Leu Arg Asn Arg Leu Ser Lys Ser Arg Glu Asn50 55 60cct gag gaa gat gaa gac cag aga aac cct gca aag gag tcc cta256Pro Glu Glu Asp Glu Asp Gln Arg Asn Pro Ala Lys Glu Ser Leu65 70 75gag aca cct agt aat ggt cga att gac ata aaa cag ttg ata gca301Glu Thr Pro Ser Asn Gly Arg Ile Asp Ile Lys Gln Leu Ile Ala80 85 90aag aag ata aag ttg aca gca gag gca gag gaa ttg aag cca ttt346
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ttc tcc aag aga ttc aaa tct gct gcc atg tta gct gtc ttt gct 1516Phe Ser Lys Arg Phe Lys Ser Ala Ala Met Leu Ala Val Phe Ala485 490 495gta tct gct gta gta cac gaa tat gcc ttg gct gtt tgc ttg agc 1561Val Ser Ala Val Val His Glu Tyr Ala Leu Ala Val Cys Leu Ser500 505 510ttt ttc tat ccc gtg ctc ttc gtg ctc ttc atg ttc ttt gga atg 1606Phe Phe Tyr Pro Val Leu Phe Val Leu Phe Met Phe Phe Gly Met515 520 525gct ttc aac ttc att gtc aat gat agt cgg aaa aag ccg att tgg 1651Ala Phe Asn Phe Ile Val Asn Asp Ser Arg Lys Lys Pro Ile Trp530 535 540aat gtt ctg atg tgg act tct ctt ttc ttg ggc aat gga gtc tta 1696Asn Val Leu Met Trp Thr Ser Leu Phe Leu Gly Asn Gly Val Leu545 550 555ctc tgc ttt tat tct caa gaa tgg tat gca cgt cgg cac tgt cct 1741Leu Cys Phe Tyr Ser Gln Glu Trp Tyr Ala Arg Arg His Cys Pro560 565 570ctg aaa aat ccc aca ttt ttg gat tat gtc cgg cca cgt tcc tgg 1786Leu Lys Asn Pro Thr Phe Leu Asp Tyr Val Arg Pro Arg Ser Trp575 580 585act tgt cgt tac gtg ttt tagaagcttg gactttgttt cctccttgtc act 1837Thr Cys Arg Tyr Val Phe *590gaagatt gggtagctcc ctgatttgga gccagctgt 1873<210>2<211>591<212>PRT<213>智人<400>2Gly Thr Pro Asn Ser Gly Glu Leu Pro Gly Val Asp Leu Pro Ala1 5 10 15Gly Cys Ser Val Thr Ala Ser Arg Leu Cys Pro Leu Gly Arg Ser20 25 30Ala Arg Cys Arg Ala Arg Ala Ser Asp Asn Thr Met Val Gly Glu35 40 45
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Leu Cys Phe Tyr Ser Gln Glu Trp Tyr Ala Arg Arg His Cys Pro560 565 570Leu Lys Asn Pro Thr Phe Leu Asp Tyr Val Arg Pro Arg Ser Trp575 580 585Thr Cys Arg Tyr Val Phe590<210>3<211>21<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(21)<223>引物L(fēng)1D2BF<400>3accgctcgag tagttaaata g 21<210>4<211>25<212>DNA<213>人工合成<220>
<221>misc_feature<222>(1)..(25)<223>引物H1T7C1<400>4aggtctagaa cagctggctc caaat 2權(quán)利要求
1.一種人膽固醇酯合成酶-1b，其特征在于，該蛋白選自下組(a)具有SEQ ID NO2氨基酸序列的蛋白、或其保守性變異蛋白、或其活性片段、或其活性衍生物。(b)將SEQ ID NO2氨基酸序列經(jīng)過一個或多個氨基酸殘基的取代、缺失或添加而形成的，且具有人膽固醇酯合成酶-1b的功能的由(a)衍生的蛋白。
2.如權(quán)利要求1所述的人膽固醇酯合成酶-1b，其特征在于，它具有SEQ ID NO2所示的氨基酸序列。
3.一種分離的多核苷酸，其特征在于，它包含一核苷酸序列，該核苷酸序列選自下組(a)編碼如權(quán)利要求1或2所述多肽的多核苷酸；(b)與多核苷酸(a)互補(bǔ)的多核苷酸。
4.如權(quán)利要求3所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸編碼具有SEQ ID NO2所示氨基酸序列的蛋白。
5.如權(quán)利要求4所述的多核苷酸，其特征在于，該多核苷酸的序列選自下組的一種(a)具有SEQ ID NO1中32-1807位的序列；(b)具有SEQ ID NO1中1-1873位的序列。
6.一種載體，其特征在于，它含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸。
7.一種宿主細(xì)胞，其特征在于，它含有權(quán)利要求6所述的載體。
8.如權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞。
9.如權(quán)利要求8所述的宿主細(xì)胞，其特征在于，所述的宿主細(xì)胞是小鼠、大鼠、猴或人的細(xì)胞。
10.一種具有人膽固醇酯合成酶-1b活性的蛋白的制備方法，其特征在于，該方法包含(a)在適合表達(dá)人膽固醇酯合成酶-1b的條件下，培養(yǎng)權(quán)利要求7所述的宿主細(xì)胞；(b)從培養(yǎng)物中分離出具有人膽固醇酯合成酶-1b活性的蛋白。
11.一種能與權(quán)利要求1所述的人膽固醇酯合成酶-1b特異性結(jié)合的抗體。
12.一種藥物組合物，其特征在于，它含有安全有效量的權(quán)利要求1所述的人膽固醇酯合成酶-1b、或權(quán)利要求3所述的多核苷酸，以及至少一種藥學(xué)上可接受的載體。
13.權(quán)利要求1所述人膽固醇酯合成酶-1b在篩選或制備治療膽固醇相關(guān)疾病或神經(jīng)蛻變相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
14.權(quán)利要求3所述的多核苷酸在篩選或制備治療膽固醇相關(guān)疾病或神經(jīng)蛻變相關(guān)疾病的藥物中的應(yīng)用。
15.一種篩選治療膽固醇相關(guān)疾病或神經(jīng)蛻變相關(guān)疾病的藥物的方法，其特征在于，包括步驟(a)在適合生長的條件下，培養(yǎng)宿主細(xì)胞，所述的宿主細(xì)胞含有權(quán)利要求6所述的表達(dá)載體，所述表達(dá)載體含有權(quán)利要求3所述的多核苷酸和與該多核苷酸可操作性相連的外源啟動子，其中在第一組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基或裂解物或制備蛋白中添加候選物質(zhì)，在第二組宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基或裂解物或制備蛋白中不添加候選物質(zhì)；(b)測定第一組和第二組宿主細(xì)胞或裂解物或制備蛋白的權(quán)利要求1所述的膽固醇酯合成酶-1b活性，其中第一組宿主細(xì)胞或裂解物或制備蛋白的該酶活性高于或低于第二組就表示該候選物質(zhì)是治療膽固醇相關(guān)疾病或神經(jīng)蛻變相關(guān)疾病的藥物。
全文摘要
本發(fā)明提供了人膽固醇酯合成酶－1b及其編碼序列，含所述序列的構(gòu)建物和載體，以及它們的用途。人ACAT1b cDNA的核苷酸序列長約1.9kb，編碼591個氨基酸序列。本發(fā)明的人ACAT1b cDNA及其編碼的人膽固醇酯合成酶可用于研究篩選治療或輔助治療高膽固醇酯癥、動脈粥樣硬化癥、早老性癡呆癥等的藥物。
文檔編號C12N15/85GK1626655SQ200310109368
公開日2005年6月15日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者李伯良, 張大元, 楊力, 何崇蕘, 楊新穎, 陳佳, 陳江 申請人:中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院