專利名稱：防治棉花黃萎病的菌株及其菌劑的制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種防治棉花黃萎病的菌株及其菌劑的制備方法，屬于利用微生物防治土傳植物病害的技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
棉花黃萎病是由大麗輪枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)引起的棉花上最為重要的世界性難治病害，目前仍沒有有效的防治措施。統(tǒng)計(jì)表明，我國每年棉花黃萎病發(fā)病面積約占播種面積的50％，年損失近200萬擔(dān)，折合人民幣10億元，嚴(yán)重影響了棉花生產(chǎn)和紡織業(yè)的發(fā)展。因此，控制棉花黃萎病的危害已成為生產(chǎn)上急需解決的問題。
棉花黃萎菌是典型的土壤習(xí)居菌，其防治極其困難。該菌之所以如此猖獗為害且難以防治，其主要原因是它能夠在作物病殘?bào)w上，甚至直接在土壤中長期存活達(dá)十幾年之久，且菌量可以常年積累，目前的防治方法，包括應(yīng)用抗病品種、化學(xué)藥劑和農(nóng)業(yè)措施，都不能達(dá)到理想的防病效果。因?yàn)槿狈乖N材料，棉花抗黃萎病品種選育受到限制；化學(xué)藥劑防治一則防效欠佳，二則污染環(huán)境，破壞農(nóng)田生態(tài)平衡；農(nóng)業(yè)措施中較為有效的是多年輪作，但在中國特定的農(nóng)業(yè)環(huán)境下，人多地少且作物種類單一，難以推廣應(yīng)用。
利用微生物防治植物病害特別是土傳植物病害是最有效的防治措施之一，目前，經(jīng)檢索，尚未發(fā)現(xiàn)利用枯草芽孢桿菌(B.subtilis)防治棉花黃萎病的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題是提供一種防治棉花黃萎病的菌株及其菌劑的制備方法。
本發(fā)明解決其技術(shù)問題所采用的技術(shù)方案一、防治棉花黃萎病的菌株NCD-2菌株經(jīng)API系統(tǒng)鑒定為芽孢桿菌屬(Bacillus)枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。
保藏日期2003年10月15日，保藏單位名稱及簡稱中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)，保藏號(hào)1019。
二、防治棉花黃萎病的菌劑的制備方法該方法包括從原種開始，經(jīng)三角瓶、種子罐、發(fā)酵罐的三級(jí)發(fā)酵工藝，其特征在于(1)用于接種的菌株為枯草芽孢桿菌NCD-2；(2)發(fā)酵溫度、PH值及放罐條件A.液體發(fā)酵的溫度控制在28-37℃，優(yōu)選30-32℃；初始PH值控制在7.0-8.0，優(yōu)選7.2-7.6；B.放罐條件鏡檢觀察到發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)生率90％以上，菌體濃度達(dá)到1010以上；發(fā)酵時(shí)間一般與培養(yǎng)基的組成、發(fā)酵溫度、發(fā)酵罐的體積、通氣條件等有關(guān)。通常搖瓶和種子罐的培養(yǎng)時(shí)間為1.5-2天，發(fā)酵罐的發(fā)酵時(shí)間為2-4天，總發(fā)酵時(shí)間約為一周。
(3)將上述發(fā)酵液制成液體制劑或者固體制劑A.液體制劑的制備將發(fā)酵液與下列添加劑按配比要求復(fù)合制成液體制劑幾丁質(zhì) 0.3％-0.5％ Kg/L(發(fā)酵液體積)膠原蛋白 0.2％-0.5％ Kg/L(發(fā)酵液體積)甲基纖維素 0.5％-1％Kg/L(發(fā)酵液體積)B.固體制劑的制備將發(fā)酵液濃縮獲得芽孢，再與固體填充物按照重量份數(shù)比1∶1000的比例混合，然后經(jīng)烘干和粉碎制成固體制劑。
所述的固體填充物由膨潤土和葡萄糖按下述重量百分比混合而成膨潤土99.7％、葡萄糖0.3％。
種子罐培養(yǎng)基各組分的重量百分比為玉米粉 2.0％豆餅粉 2.0％麥麩 2.0％Na2HPO40.2％NaH2PO40.02％MgSO40.03％ZnSO40.05％α-淀粉酶3-5u/kg配料泡敵 0.02％發(fā)酵罐培養(yǎng)基各組份的重量百分比為
玉米粉 2.0％豆餅粉 2.0％麥麩2.0％Na2HPO40.2％NaH2PO40.02％MgSO40.03％ZnSO40.05％CaCO3 0.3％α-淀粉酶 3-5u/kg配料泡敵0.02％枯草芽桿菌NCD-2菌種的篩選分離方法與過程在棉花黃萎病缺乏防治措施的背景下，本發(fā)明人在國際上首先提出“微菌核際”概念，并開展微菌核際微生物分離及拮抗微生物篩選和應(yīng)用。本發(fā)明人于1997年應(yīng)用一般土壤細(xì)菌分離方式，對(duì)河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所的連作20年棉田土壤中細(xì)菌進(jìn)行了分離，分離到2000余個(gè)細(xì)菌菌株，應(yīng)用對(duì)峙培養(yǎng)方法初步測定其對(duì)大麗輪枝菌(V.dahliae)菌絲生長的作用后發(fā)現(xiàn)，NCD-2菌株及其他18個(gè)細(xì)菌菌株對(duì)大麗輪枝菌的微菌核和菌絲生長具有較強(qiáng)的抑制作用。隨后應(yīng)用對(duì)峙培養(yǎng)方法對(duì)NCD-2菌株的抑菌作用進(jìn)行了詳細(xì)研究，證明NCD-2菌株抑菌率為57.4％，同時(shí)產(chǎn)生明顯的抑菌帶達(dá)7.0毫米。室內(nèi)通過盆栽實(shí)驗(yàn)證明，用NCD-2菌株懸浮液(108菌體/ml)對(duì)棉花種子浸種處理能夠極顯著地降低棉花黃萎病的病情指數(shù)，防病效果達(dá)到77.0％。說明NCD-2菌株是一個(gè)非常有開發(fā)潛力的菌株，1999年設(shè)置田間小區(qū)試驗(yàn)，試驗(yàn)方法如下將NCD-2菌株懸浮液(cfu為1010細(xì)菌/ml)，按照2∶1比例(菌液包衣劑體積)與包衣劑A充分混合制成包衣劑。以種子量10％(體積/重量)的包衣劑對(duì)棉花種子進(jìn)行包衣。將包衣的棉花種子播入營養(yǎng)缽中，每缽播3粒種子，蓋土并輕輕壓實(shí)。播種期比當(dāng)?shù)孛藁ㄕ２シN期提前10天，播種后的營養(yǎng)缽放在塑料拱棚中，出苗一周后，每缽中留一棵壯苗。在棉苗有2片真葉時(shí)，移栽到大田，移栽時(shí)，每穴中灌入20ml拮抗細(xì)菌懸浮液(拮抗細(xì)菌活體濃度107細(xì)菌/ml)。以清水包衣種子，穴中灌入清水為對(duì)照。每小區(qū)15m2，重復(fù)3次，隨機(jī)排列。小區(qū)試驗(yàn)結(jié)果表明NCD-2菌株處理能夠防治棉花黃萎病，防病效果達(dá)78.1％，從而確立了NCD-2菌株作為專門防治棉花黃萎病的生防菌株。隨后，2000-2002年，分別在河北省、山東省和新疆進(jìn)行了多點(diǎn)小區(qū)試驗(yàn)，主要應(yīng)用NCD-2菌株固體制劑，使用方法為按種子量的10％進(jìn)行均勻拌種后進(jìn)行正常播種，防病效果達(dá)到56.3％-92.6％。
本發(fā)明的菌株液體制劑使用方法如下按種子量(脫絨種子)的20％進(jìn)行拌種、育苗，在移栽時(shí)應(yīng)用該制劑的130倍水液蘸根。
本發(fā)明的菌株固體制劑使用方法如下按種子量的10％進(jìn)行均勻拌種后再進(jìn)行正常播種。
本發(fā)明提供的枯草芽孢桿菌NCD-2菌株經(jīng)生物測定不僅對(duì)黃萎菌及其微菌核具有強(qiáng)烈的抑制作用，而且對(duì)棉刺盤孢菌(棉花炭疽病菌)、尖孢鐮刀菌萎蔫?；?棉花枯萎病菌)、玉米大斑凸臍蠕孢菌(玉米大斑病菌)、玉蜀黍平臍蠕孢菌(玉米小斑病菌)、新月彎孢霉(玉米彎孢霉葉斑病菌)、串珠鐮刀菌(玉米莖基腐菌)、禾谷絲核菌(小麥紋枯病菌)、禾谷鐮刀菌(小麥赤霉病菌)、禾生炭疽菌(高梁炭疽病菌)、輪紋大莖點(diǎn)菌(蘋果輪紋病菌)、鏈格孢蘋果?；?蘋果斑點(diǎn)落葉病菌)、白腐盾殼霉(葡萄白腐病菌)、茄鏈格孢(番茄早疫病菌)和蔥鏈格孢(蔥紫斑病菌)等14種主要農(nóng)作物病原菌具有抑菌作用，說明拮抗細(xì)菌NCD-2具有廣譜性抑菌譜。生物安全性測定結(jié)果表明NCD-2對(duì)目前國內(nèi)主要種植作物(小麥、玉米、棉花、馬鈴薯、黃瓜、茄子和大豆)是非致病的。另外，如果將本發(fā)明的枯草芽孢桿菌NCD-2采用液體發(fā)酵的三級(jí)發(fā)酵工藝，并加入添加劑生產(chǎn)該菌株的制劑，則更方便于大面積推廣應(yīng)用。
本發(fā)明的有益效果將本發(fā)明的菌劑用于防治棉花黃萎病，防治效果顯著，防治效果達(dá)56.3％-92.6％，并且無污染、無公害、低成本、便于大面積推廣應(yīng)用。
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)NCD-2菌株保藏日期2003年10月15日保藏單位名稱及簡稱中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心(CGMCC)保藏號(hào)1019保藏單位地址中國北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條街13號(hào)中國科學(xué)院微生物研究所
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例枯草芽孢桿菌NCD-2菌株制劑的制備方法嚴(yán)格按照上述發(fā)明內(nèi)容部分中關(guān)于防治棉花黃萎病菌劑制備方法中的工藝步驟操作，即可制取該菌株的液體或固體制劑。
權(quán)利要求
1.一種防治棉花黃萎病的菌株，其特征在于該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)NCD-2菌株CGMCC1019。
2.一種防治棉花黃萎病的菌劑的制備方法，它包括有從原種開始，經(jīng)三角瓶、種子罐、發(fā)酵罐的三級(jí)發(fā)酵工藝，其特征在于(1)用于接種的菌株為枯草芽孢桿菌NCD-2；(2)發(fā)酵溫度、PH值及放罐條件A.液體發(fā)酵的溫度控制在28-37℃，初始PH值控制在7.0-8.0；B.放罐條件鏡檢觀察到發(fā)酵液中芽孢產(chǎn)生率90％以上，菌體濃度達(dá)到1010以上；(3)將上述發(fā)酵液制成液體制劑或者固體制劑A.液體制劑的制備將發(fā)酵液與下列添加劑按配比要求復(fù)合制成液體制劑幾丁質(zhì) 0.3％-0.5％ Kg/L(發(fā)酵液體積)膠原蛋白0.2％-0.5％ Kg/L(發(fā)酵液體積)甲基纖維素 0.5％-1％Kg/L(發(fā)酵液體積)B.固體制劑的制備將發(fā)酵液濃縮獲得芽孢，再與固體填充物按照重量份數(shù)比1∶1000的比例混合，然后經(jīng)烘干和粉碎制成固體制劑。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的防治棉花黃萎病的菌劑的制備方法，其特征在于所述的固體填充物由膨潤土和葡萄糖按下述重量百分比混合而成膨潤土99.7％、葡萄糖0.3％。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的防治棉花黃萎病的菌劑的制備方法，其特征在于種子罐培養(yǎng)基各組分的重量百分比為玉米粉 2.0％豆餅粉 2.0％麥麩 2.0％Na2HPO40.2％NaH2PO40.02％MgSO40.03％ZnSO40.05％α-淀粉酶 3-5u/kg配料泡敵 0.02％。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的防治棉花黃萎病的菌劑的制備方法，其特征在于發(fā)酵罐培養(yǎng)基各組份的重量百分比為玉米粉 2.0％豆餅粉 2.0％麥麩 2.0％Na2HPO40.2％NaH2PO40.02％MgSO40.03％ZnSO40.05％HCaCO30.3％α-淀粉酶3-5u/kg配料泡敵 0.02％。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種防治棉花黃萎病的菌株及其菌劑的制備方法，該菌種為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)NCD－2菌株CGMCC1019。該菌株的菌劑的制備方法為采用三級(jí)發(fā)酵工藝，其接種的菌株為枯草芽孢桿菌NCD－2；液體發(fā)酵的溫度控制在28－37℃，初始pH值控制在7.0－8.0。在菌體液體發(fā)酵的基礎(chǔ)上，復(fù)合多種添加劑制成液體制劑，或者將發(fā)酵液經(jīng)濃縮獲得芽孢，再與固體填充物按1∶1000的比例混合，然后經(jīng)烘干和粉碎制成固體制劑。本發(fā)明的有益效果是將本發(fā)明的菌劑用于防治棉花黃萎病，防治效果顯著，防治效果達(dá)56.3％－92.6％，并且無污染、無公害、低成本、便于大面積推廣應(yīng)用。
文檔編號(hào)C12N1/20GK1528885SQ200310109619
公開日2004年9月15日 申請(qǐng)日期2003年10月17日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月17日
發(fā)明者馬平, 李社增, 陳新華, 鹿秀云, 何月秋, 高勝國, 馬 平 申請(qǐng)人:河北省農(nóng)林科學(xué)院植物保護(hù)研究所