專利名稱：一種開放式蛋白消減雜交方法
技術領域：
本發(fā)明涉及蛋白表達差異的分析方法，特別是直接在蛋白質水平上分析蛋白表達差異的方法。
背景技術：
研究正常細胞與病理細胞之間蛋白質表達的差異是目前進行疾病的發(fā)生發(fā)展機理研究的重要手段。現有技術中進行蛋白表達差異分析的方法有兩大類。一種是在RNA水平上的差異分析；另一種是在蛋白質水平上的差異分析。
RNA水平的差異分析方法主要有差異顯示PCR技術(differentialdisplay PCR，DD-PCR)和消減雜交技術(subtractive hybridization)和抑制性消減雜交技術(suppression subtractive hybridization，SSH)。
DD-PCR技術由Liang等[1]于1992年首先建立。該技術的主要流程為首先提取組織標本的mRNA，然后以3’端的12對錨定引物進行逆轉錄反應；以錨定引物和5’端的20種隨機引物進行PCR擴增，并在反應體系中加入同位素標記的d-ATP探針；PCR擴增產物電泳分析后回收差異條帶，再以之為模板進行第二輪擴增；對第二輪擴增產物進行雜交鑒定、測序，獲得差異顯示表達序列標簽(expression sequence tag，EST)。DD-PCR技術可快速地對多個樣本進行比較，同其他差異顯示技術方法相比，非常適合用于對處于疾病不同發(fā)展階段或處于不同發(fā)育階段的生物樣本進行比較研究。該技術存在的主要問題是假陽性率高，且對高拷貝數的mRNA傾向性較強[2]；另一方面，用該技術獲得的片段多為非翻譯區(qū)的序列，而這部分序列往往不包括在基因庫已知序列里面，由此出發(fā)尋找全基因序列往往效果不佳。改進的方法主要包括簡化錨定引物、調整PCR反應條件以及設立適當的對照[3，4]。消減雜交技術(subtractive hybridization)和抑制性消減雜交技術(suppression subtractive hybridization，SSH)最早用于尋找由于缺失而導致遺傳性疾病的相關基因。其后Liang等[5]將其應用于兩個不同的cDNA文庫，將兩者變性后復性再進行雜交；然后，采用親和素-生物素結合或羥基磷灰石層析技術分離未雜交的部分，由此獲得呈差異表達的基因片段。該技術的主要缺陷在于無法對低豐度表達的基因進行克隆，一些改良后的消減雜交技術如代表性差異分析法(representiationaldifference analysis，RDA)、酶降解消減技術(enzymatic degradingsubtraction，EDS)等依然存在上述問題。抑制性消減雜交技術則是一種簡便有效、以抑制PCR和消減雜交為基礎的分離差異表達基因的新技術。該技術的操作流程包括兩輪雜交和兩輪PCR擴增，可以有效擴增目的cDNA片段。抑制性雜交技術克服了消減雜交技術無法克隆低豐度表達基因的缺陷，并且降低了假陽性率，相對于其它差異顯示技術具有很大的優(yōu)越性[6]。
至于在蛋白水平上的差異顯示的研究，由于蛋白操作的困難，現在多半是用抗體芯片的方法，只能尋找已知蛋白的表達差異變化，無法尋找到新的蛋白，而且目前抗體芯片成本極高，其使用要求精密儀器，普通科研院所買不起，并且抗體芯片所含抗體數量有限，遠遠不如基因芯片的數量，并不能真正達到高通量篩選的目的另一方面，現有技術中也提供了蛋白水平上開放式的差異顯示分析方法，如二維電泳加上質譜分析的大型儀器，但價格高昂，不適宜中小實驗室。在蛋白水平上直接進行一種簡易開放式的消減雜交已越來越迫切。而本方法恰好解決了這些問題，從而即使是中小型實驗室也可以普及蛋白水平上的差異顯示方法。
Aptamer，按全國生命科學技術名詞審定委員會發(fā)布的試用新詞，翻譯為適體。曾譯作“契合寡聚物”。其特性是能與核酸，多肽，蛋白質，小分子專一、高效結合的RNA或DNA片段。適體可按要求設計和合成，目前，全世界對適體的研究方興未艾，已有超過300篇研究文獻報道，和成百上千的適體。適體譽為新一代的基因治療及藥物設計的工具。[7]發(fā)明內容本發(fā)明通過構建DNA或RNA隨機序列庫〔aptamer庫〕，使之進入細胞體內結合相應特異性抗原蛋白分子。如果某蛋白分子有表達數量差異，那么其結合的特異性DNA、RNA序列或aptamer也會表現出相應的數量變化來，從而把在蛋白水平上的消減雜交轉移到對DNA序列的消減雜交上來。也就是直接用DNA、RNA(APTAMER)的消減雜交來反映蛋白水平的變化。
本發(fā)明的技術方案是1、構建適體DNA或RNA隨機序列庫，與經過處理固定了的對照細胞和病理細胞〔活體〕在一致條件下孵化，然后洗去未結合或非特異結合細胞蛋白的DNA或RNA隨機序列庫。
2、抽提上述細胞的蛋白質，用苯酚氯仿分離沉淀蛋白質，取上清〔含DNA或RNA序列〕，用真空干燥機濃縮DNA或RNA或酒精沉淀DNA或RNA從而得到可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫。
3、對上步中得到的靶細胞和對照細胞的隨機DNA或RNA序列庫進行消減雜交后；PCR克隆消減序列以得到差異顯示文庫并測序，選取幾個到幾十個克隆，用標記引物擴增制備相應類型的DNA或RNAaptamer。篩選確定具有表達差異和功能差異的特異性蛋白。
本發(fā)明的另一技術方案是1)預雜交準備好對照細胞和病理細胞〔細胞數量和其他處理條件一致〕，加以固定處理。用化學合成方法構建適體DNA或RNA隨機序列庫，與經過處理固定了的對照細胞在一定條件下孵化，然后洗出并收集預雜交后未結合或非特異結合細胞蛋白的DNA或RNA隨機序列；2)雜交所收集的洗下的DNA或RNA隨機序列庫與病理細胞孵育，在一定條件下洗去未結合或非特異結合的DNA或RNA隨機序列；3)獲取差異顯示的aptamer苯酚氯仿裂解第二步中的細胞，并抽提蛋白質，取含DNA或RNA序列的上清液，用真空干燥機濃縮DNA或酒精沉淀DNA或RNA從而得到可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫；4)重復以上三步驟PCR擴增Aptamer庫，膠純化擴增后的特異結合細胞分子的DNA或RNA隨機序列，以此DNA或RNA隨機序列同上繼續(xù)篩選5-15輪；5)獲取差異顯示的蛋白隨后克隆并測序，找到幾個到十幾個DNA或RNA Aptamers后，利用該DNA或RNA aptamer篩選確定具有表達差異和功能差異的特異性蛋白并進行分析。
上述步驟中，進行循環(huán)擴增后，如果為單鏈DNA或RNA，則需再做一個單引物PCR〔94C 15s，55C 15s，72C 15s〕或體外轉錄。
在第2種方法中，用正常細胞與適體DNA或RNA隨機序列庫做預雜交后，再用所收集的洗下的DNA或RNA隨機序列庫與病理細胞孵育雜交，這一步驟可以改為，用病理細胞預雜交，再用所收集的洗下的DNA或RNA隨機序列庫與正常細胞孵育雜交。
篩選具有表達差異和功能差異的特異性蛋白的方法有1、靶蛋白是膜蛋白，先用紫外照射交聯DNA或RNA分子和抗原分子，較嚴格條件裂解細胞從而分離膜蛋白，跑PAGE膠分離純化已標記DNA-蛋白復合物，切下條帶，純化測序?；虿⒂孟鄳囊?cellulose進行親和層析來分離純化DNA或RNA-蛋白復合物，送測序獲得蛋白序列或質普分析；如用biotin標記的aptamer，可用親和素層析柱來分離純化。
2、靶蛋白非膜蛋白，而且紫外照射形成交聯復合物的效率低下，可溫和裂解，并用相應的引物-cellulose進行親和層析來分離純化DNA或RNA-蛋白復合物，亦可跑膠分離純化，送測序獲得蛋白序列或質普分析；如用biotin標記的aptamer，可用親和素層析柱來分離純化。
3、也可用aptamer篩選相關細胞的cDNA表達文庫從而直接獲得差異顯示蛋白的基因信息。
綜上所述，本方法把在蛋白水平上的表達差異，通過aptamer轉移至DNA或RNA水平上的差異顯示，從而達到了簡捷快速地高通量篩選表達差異蛋白的目的，為蛋白相互關系的系統(tǒng)研究和基因功能的系統(tǒng)探索提供了一條捷徑，而且該技術普遍適用于各大中小科研院所及公司。
除了在蛋白質和基因功能研究方面的顯著優(yōu)勢外，本方法還可用于aptamer靶藥物的高效篩選，有可能為生物制藥帶來一片全新的空間。
具體的實施方法如下第1種方法1、用化學合成方法構建適體隨機序列庫，與經過處理固定了的對照細胞和病理細胞〔活體〕〔細胞數量以及其他條件一致〕孵化，在一定條件下該適體隨機序列庫將進入細胞并特異性結合其對應分子，然后在一定條件下洗去未結合或非特異結合細胞蛋白的DNA或RNA隨機序列庫。
2、用化學裂解法等裂解細胞并苯酚氯仿抽提蛋白質，取上清〔含適體的DNA或RNA序列〕，用真空干燥機濃縮適體DNA或RNA或酒精沉淀適體DNA或RNA從而得到可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫。
3、對靶細胞和對照細胞的隨機DNA或RNA序列庫進行消減雜交〔用試劑盒〕后，注意在消減之前加一已標記內對照序列以檢測消減雜交效果；PCR克隆消減序列以得到差異顯示文庫并測序，選取幾個到幾十個克隆，用標記引物擴增制備相應類型的DNA或RNA aptamer。
如下篩選具有表達差異和功能差異的特異性蛋白。
4、如靶蛋白是膜蛋白，先用紫外照射交聯DNA或RNA分子和抗原分子，較嚴格條件裂解細胞從而分離膜蛋白，跑PAGE膠分離純化已標記DNA-蛋白復合物，切下條帶，純化測序?；虿⒂孟鄳囊?cellulose進行親和層析來分離純化DNA或RNA-蛋白復合物，送測序獲得蛋白序列或質普分析；如用biotin標記的aptamer，可用親和素層析柱來分離純化。
5、如靶蛋白非膜蛋白，而且紫外照射形成交聯復合物的效率低下，可溫和裂解，并用相應的引物-cellulose進行親和層析來分離純化DNA或RNA-蛋白復合物，亦可跑膠分離純化，送測序獲得蛋白序列或質普分析；如用biotin標記的aptamer，可用親和素層析柱來分離純化。
6、也可用aptamer篩選相關細胞的cDNA表達文庫從而直接獲得差異顯示蛋白的基因信息。
第2種方法1)預雜交準備好對照細胞和病理細胞〔細胞數量和其他處理條件一致〕，加以固定處理。用化學合成方法構建適體DNA或RNA隨機序列庫，與經過處理固定了的對照細胞在一定條件下孵化，然后洗出并收集預雜交后未結合或非特異結合細胞蛋白的DNA或RNA隨機序列；2)雜交所收集的洗下的DNA或RNA隨機序列庫與病理細胞孵育，在一定條件下洗去未結合或非特異結合的DNA或RNA隨機序列；3)獲取差異顯示的aptamer苯酚氯仿裂解第二步中的細胞，并抽提蛋白質，取含DNA或RNA序列的上清液，用真空干燥機濃縮DNA或酒精沉淀DNA或RNA從而得到可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫；4)重復以上三步驟PCR擴增Aptamer庫，膠純化擴增后的特異結合細胞分子的DNA或RNA隨機序列，以此DNA或RNA隨機序列同上繼續(xù)篩選5-15輪；5)取差異顯示的蛋白隨后克隆并測序，找到幾個到十幾個DNA或RNA Aptamers后，利用該DNA或RNA aptamer篩選確定具有表達差異和功能差異的特異性蛋白并進行分析。
如下篩選具有表達差異和功能差異的特異性蛋白。
6)如靶蛋白是膜蛋白，先用紫外照射交聯DNA或RNA分子和抗原分子，較嚴格條件裂解細胞從而分離膜蛋白，跑PAGE膠分離純化已標記DNA-蛋白復合物，切下條帶，純化測序?；虿⒂孟鄳囊?cellulose進行親和層析來分離純化DNA或RNA-蛋白復合物，送測序獲得蛋白序列或質普分析；如用biotin標記的aptamer，可用親和素層析柱來分離純化。
7)如靶蛋白非膜蛋白，而且紫外照射形成交聯復合物的效率低下，可溫和裂解，并用相應的引物-cellulose進行親和層析來分離純化DNA或RNA-蛋白復合物，亦可跑膠分離純化，送測序獲得蛋白序列或質普分析；如用biotin標記的aptamer，可用親和素層析柱來分離純化。
8)也可用aptamer篩選相關細胞的cDNA表達文庫從而直接獲得差異顯示蛋白的基因信息。
參考文獻1、Liang P，Pardee AB.Differential display of eukaryotic messenger RNA by meansof the polymerase chain reaction.Science，1992，257(5072)967-971.
2、Bertioli DJ，Schlichter UH，Adams MJ，et al.An analysis of differentialdisplay shows a strong bias towards high copy number mRNAs.Nucleic Acids Res，1995，23(21)4520-4523.
3、Sun Y，Hegamyer G，Kim H，et al.Molecular cloning of mouse tissue inhibitorof metalloproteinases-3 and its promoter.Specific lack of expression inneoplastic JB6 cells may reflect altered gene methylation.J Biol Chem，1995，270(33)19312-19319。
4、Ledakis P，Tanimura H，Fojo T.Limitations of differential display.BiochemBiophys Res Commun，1998，251(2)653-656.
5、Liang P，Zhu W，Zhang X，et al.Differential display using one-base anchoredoligo-dT primers.Nucleic Acids Res，1994，22(25)5763-5764.
6、Diatchenko L，Lau YF，Campbell AP，et al.Suppression subtractivehybridizationa method for generating differentially regulated ortissue-specific cDNA probes and libraries.Proc Natl Acad Sci USA，1996，93(12)6025-6030.
7、Dr.Charles Wilson，Technology，Archemix Corp Pre-Conference Tutorial RNAi Interference，Beyondgenome June 16-17，2003，San Diego.
權利要求
1.一種開放式蛋白消減雜交方法，包括如下步驟1)構建適體DNA或RNA隨機序列庫，與經過處理固定了的對照細胞和病理細胞在一致條件下孵化，然后洗去未結合或非特異結合細胞蛋白的DNA或RNA隨機序列庫；2)抽提上述細胞的蛋白質，用苯酚氯仿分離沉淀蛋白質，取含有DNA或RNA的上清液，用真空干燥機濃縮DNA或RNA或酒精沉淀DNA或RNA從而得到可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫；3)對上步中得到的靶細胞和對照細胞的隨機DNA或RNA序列庫進行消減雜交后；PCR克隆消減序列以得到差異顯示文庫并測序，選取幾個到幾十個克隆，用標記引物擴增制備相應類型的DNA或RNA aptamer。利用該DNA或RNA aptamer篩選確定具有表達差異和功能差異的特異性蛋白。
2.一種開放式蛋白消減雜交方法，包括如下步驟1)預雜交準備好對照細胞和病理細胞〔細胞數量和其他處理條件一致〕，加以固定處理。用化學合成方法構建適體DNA或RNA隨機序列庫，與經過處理固定了的對照細胞在一定條件下孵化，然后洗出并收集預雜交后未結合或非特異結合細胞蛋白的DNA或RNA隨機序列；2)雜交所收集的洗下的DNA或RNA隨機序列庫與病理細胞孵育，在一定條件下洗去未結合或非特異結合的DNA或RNA隨機序列；3)獲取差異顯示的aptamer苯酚氯仿裂解第二步中的細胞，并抽提蛋白質，取含DNA或RNA序列的上清液，用真空干燥機濃縮DNA或酒精沉淀DNA或RNA從而得到可反應蛋白水平變化的DNA或RNA隨機序列庫；4)重復以上三步驟PCR擴增Aptamer庫，膠純化擴增后的特異結合細胞分子的DNA或RNA隨機序列，以此DNA或RNA隨機序列同上繼續(xù)篩選5-15輪；5)獲取差異顯示的蛋白隨后克隆并測序，找到幾個到十幾個DNA或RNA Aptamers后，利用該DNA或RNA aptamer篩選確定具有表達差異和功能差異的特異性蛋白并進行分析。
3.根據權利要求2所述的開放式蛋白消減雜交方法，其特征在于進行循環(huán)擴增后，如果為單鏈DNA或RNA，則需再做一個單引物PCR〔94C 15s，55C 15s，72C 15s〕或體外轉錄。
全文摘要
本發(fā)明涉及蛋白表達差異的分析方法，特別是直接在蛋白質水平上分析蛋白表達差異的方法。本發(fā)明通過構建DNA或RNA隨機序列庫(aptamer庫)，使之進入細胞體內結合相應特異性抗原蛋白分子。如果某蛋白分子有表達數量差異，那么其結合的特異性DNA、RNA序列或aptamer也會表現出相應的數量變化來，從而把在蛋白水平上的消減雜交轉移到對DNA序列的消減雜交上來。從而達到了簡捷快速的高通量篩選表達差異蛋白的目的。
文檔編號C12Q1/68GK1609232SQ20031011045
公開日2005年4月27日 申請日期2003年10月24日 優(yōu)先權日2003年10月24日
發(fā)明者文劍 申請人:文劍, 戴輝