專利名稱：一種結(jié)核分枝桿菌Ag85B抗原與人IL-2重組融合蛋白及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種基因工程重組蛋白Ag85B/IL-2融合蛋白，及其在制備用于腫瘤免疫治療，尤其是膀胱腫瘤治療和預(yù)防其復(fù)發(fā)的藥物或蛋白疫苗的用途。
背景技術(shù)：
膀胱腫瘤是泌尿系統(tǒng)最常見的腫瘤，具有發(fā)病率高、易浸潤轉(zhuǎn)移和易復(fù)發(fā)等臨床特點(diǎn)。
卡介苗(BCG)作為一種活的減毒牛型結(jié)核分枝桿菌，是一種有效的生物免疫修飾劑。自1976年Merales等首先報(bào)道應(yīng)用BCG治療膀胱癌后(Morales A，et al.Intracavitary BacillusCalmette-Guerin in the treatment of superficial bladder tumors.J Urol 1976Aug；116(2)180-183)，多年來的實(shí)踐證實(shí)膀胱腔內(nèi)灌注BCG免疫預(yù)防與治療淺表性膀胱腫瘤是一種成功的免疫治療法，在預(yù)防腫瘤復(fù)發(fā)，治療殘留的腫瘤與原位癌方面和腔內(nèi)化療相比，已顯示出明顯的優(yōu)勢，成為預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)，治療原位癌的一線藥物和首選方法(Meyer JP，et al.Use of baci lle Calmette-Guerin in superficial bladder cancer.Postgrad.MedJ.2002 Aug；78(922)449-54)。
細(xì)胞因子白介素-2(IL-2)由激活的T淋巴細(xì)胞產(chǎn)生，它不僅能促進(jìn)T、B細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)T細(xì)胞活性，還能活化NK細(xì)胞、誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子和LAK細(xì)胞、以及TIL細(xì)胞的產(chǎn)生。Den Otter等(Den Otter W，et al.Intravesical interleukin-2 in T1 papillary bladdercarcinimaregression of marker lesion in 8 of 10 patients.J Urol 1998Apr；159(4)1183-1186)應(yīng)用IL-2對10個(gè)術(shù)后有明顯殘留的病人行膀胱灌注，連續(xù)治療5天為一療程，治療2個(gè)月后進(jìn)行膀胱鏡檢及殘留部位的重復(fù)活檢以觀察療效，結(jié)果10個(gè)病人有8個(gè)殘留部位愈合且反復(fù)活檢未見腫瘤。作者認(rèn)為TUR后行IL-2灌注治療是一種有效的方法，可產(chǎn)生較強(qiáng)的抗腫瘤效應(yīng)。盡管單獨(dú)使用IL-2治療膀胱腫瘤取得了一定的效果，但通過實(shí)驗(yàn)人們也發(fā)現(xiàn)單獨(dú)應(yīng)用IL-2由于與劑量成正比的關(guān)系，存在著使用劑量越大，副作用越大的問題(Velotti F，et al.Local activation of immune response in bladder cancer patientstreated with intraarterial infusion of recombinant interleukin-2.Cancer Res 1991Mayl，51(9)2456-2462)。
已有多項(xiàng)研究證實(shí)BCG與IL-2聯(lián)合膀胱灌注在預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)優(yōu)于單用BCG或IL-2灌注。BCG聯(lián)合IL-2灌注膀胱在預(yù)防膀胱癌復(fù)發(fā)和治療表淺型膀胱癌方面能發(fā)揮相互協(xié)同作用。BCG能夠激活機(jī)體NK細(xì)胞、T細(xì)胞和巨噬細(xì)胞，IL-2有助于NK細(xì)胞和細(xì)胞毒性T細(xì)胞(CTL)的成熟。
無論是BCG還是IL-2在臨床治療膀胱癌均存在著劑量大、療程長、毒副作用大等缺點(diǎn)。BCG作為一種活的減毒牛型結(jié)核分枝桿菌，其生物活性仍具有很強(qiáng)的抗原性、致敏性和殘余毒性。臨床應(yīng)用時(shí)常引起膀胱炎、發(fā)熱反應(yīng)、膀胱孿縮，嚴(yán)重時(shí)出現(xiàn)全身性BCG感染與敗血癥進(jìn)而危及生命。大劑量IL-2應(yīng)用時(shí)常可引起血管通透性增高，低血壓，腎功能損害，骨髓造血抑制等。
Ag85B又稱為α-Ag或MPB59，是BCG、結(jié)核桿菌及其它分枝桿菌最主要的分泌蛋白，約占分枝桿菌外分泌蛋白總量的1/4(Harth G，Lee BY，Wang J，et al.Novel insights into thegenetics，biochemistry，and immunocytochemistry of the 30-kilodalton majorextracellular protein of mycobacterium tuberculosis.Infect Immun，1999，64(8)3038-3047)。在不同的分枝桿菌中，Ag85B在氨基酸和DNA水平，均具有高度的同源性。Ag85B基因長858bp，編碼285個(gè)氨基酸殘基，分子量約30KD。Ag85B是BCG在體外和體內(nèi)發(fā)揮生物學(xué)作用的主要成分，也是廣泛分布于結(jié)核分枝桿菌以及其它非典型分枝桿菌中具有交叉反應(yīng)性的蛋白，能夠誘導(dǎo)機(jī)體強(qiáng)烈的Th1型免疫反應(yīng)。利用分枝桿菌Ag85B的免疫原性，在膀胱癌及其它腫瘤治療中的應(yīng)用研究近年來受到重視。Ag85B蛋白能夠誘導(dǎo)膀胱癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的增殖反應(yīng)，并能誘導(dǎo)Th1細(xì)胞分泌細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12等細(xì)胞因子(Zlotta AR，Drowart A，Vooren JV，et al.Superficial bladder tumors and increased reactivity againstmycobacterial antigens before bacillus calmette-guerin therapy.J Urol，1998，159，1885-1891)；(Kuromatsu I，Matsuo K，Takamuta S，et al.Induction of effective antitumorimmune responses in a mouse bladder tumor model by using DNA of α antigen frommycobacteria.Cancer Gene Therapy，2001，8(7)483-490)利用轉(zhuǎn)染Ag85B基因的膀胱腫瘤細(xì)胞疫苗免疫動(dòng)物后，抗原遞呈細(xì)胞(APC)分別通過MHC I類和II類分子，既能遞呈CTL表位肽，又能遞呈Th表位肽，從而比其它的基因修飾的腫瘤細(xì)胞疫苗具有更大的抗腫瘤優(yōu)勢。
鑒于BCG和IL-2在治療膀胱腫瘤和預(yù)防其復(fù)發(fā)時(shí)的不足，我們設(shè)想利用基因工程手段，將分枝桿菌中的主要分泌抗原基因Ag85B與人IL-2基因融合，構(gòu)建Ag85B/IL-2融合基因，原核表達(dá)獲得Ag85B/IL-2融合蛋白。Ag85B/IL-2融合蛋白用于治療膀胱腫瘤及預(yù)防其復(fù)發(fā)，既發(fā)揮兩者的免疫協(xié)同作用，又能減少BCG和IL-2引起的毒副作用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種重組蛋白，它是將結(jié)核分枝桿菌主要分泌抗原Ag85B或其它分枝桿菌分泌Ag85B抗原與人IL-2融合而形成的基因工程重組融合蛋白。
本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種編碼本發(fā)明重組融合蛋白的基因序列。
本發(fā)明的再一個(gè)目是提供了該重組融合蛋白在制備用于腫瘤免疫治療，尤其是膀胱腫瘤治療和預(yù)防其復(fù)發(fā)的藥物或蛋白疫苗中的用途。
本發(fā)明提供的重組融合蛋白中，結(jié)核分枝桿菌主要分泌抗原Ag85B或其它分枝桿菌分泌Ag85B抗原可以位于該融合蛋白的氨基端，也可位于該融合蛋白的羧基端，Ag85B與IL-2之間可以沒有連接子，亦可由富含甘氨酸的連接子(Linker)連接，從而增加融合蛋白的柔韌性，有利于兩種蛋白單體的正確折疊。連接子氨基酸序列可以為SEQ ID NO1，也可為SEQ ID NO2。
SEQ ID NO1 GGGGSSEQ ID NO2 GGGGSGT本發(fā)明所述的Ag85B抗原還可以為卡介苗、恥垢分枝桿菌中的Ag85B抗原。
本發(fā)明還提供了一種編碼本發(fā)明的重組融合蛋白的基因。該基因可以具有如SEQ ID NO3所示的核苷酸序列。
SEQ ID NO3TTCTCCCGGCCGGGGCTGCCGGTCGAGTACCTGCAGGTGCCGTCGCCGTCGATGGGCCGCGACATCAAGGTTCAGTTCCAGAGCGGTGGGAACAACTCACCTGCGGTTTATCTGCTCGACGGCCTGCGCGCCCAAGACGACTACAACGGCTGGGATATCAACACCCCGGCGTTCGAGTGGTACTACCAGTCGGGACTGTCGATAGTCATGCCGGTCGGCGGGCAGTCCAGCTTCTACAGCGACTGGTACAGCCCGGCCTGCGGTAAGGCTGGCTGCCAGACTTACAAGTGGGAAACCTTCCTGACCAGCGAGCTGCCGCAATGGTTGTCCGCCAACAGGGCCGTGAAGCCCACCGGCAGCGCTGCAATCGGCTTGTCGATGGCCGGCTCGTCGGCAATGATCTTGGCCGCCTACCACCCCCAGCAGTTCATCTACGCCGGCTCGCTGTCGGCCCTGCTGGACCCCTCTCAGGGGATGGGGCCTAGCCTGATCGGCCTCGCGATGGGTGACGCCGGCGGTTACAAGGCCGCAGACATGTGGGGTCCCTCGAGTGACCCGGCATGGGAGCGCAACGACCCTACGCAGCAGATCCCCAAGCTGGTCGCAAACAACACCCGGCTATGGGTTTATTGCGGGAACGGCACCCCGAACGAGTTGGGCGGTGCCAACATACCCGCCGAGTTCTTGGAGAACTTCGTTCGTAGCAGCAACCTGAAGTTCCAGGATGCGTACAACGCCGCGGGCGGGCACAACGCCGTGTTCAACTTCCCGCCCAACGGCACGCACAGCTGGGAGTACTGGGGCGCTCAGCTCAACGCCATGAAGGGTGACCTGCAGAGTTCGTTAGGCGCCGGCGGTGGCGGAGGCTCTGGTACCGCACCTACTTCAAGTTCTACAAAGAAAACACAGCTACAACTGGAGCATTTACTGCTGGATTTACAGATGATTTTGAATGGAATTAATAATTACAAGAATCCCAAACTCACCAGGATGCTCACATTTAAGTTTTACATGCCCAAGAAGGCCACAGAACTGAAACATCTTCAGTGTCTAGAAGAAGAACTCAAACCTCTGGAGGAAGTGCTAAATTTAGCTCAAAGCAAAAACTTTCACTTAAGACCCAGGGACTTAATCAGCAATATCAACGTAATAGTTCTGGAACTAAAGGGATCTGAAACAACATTCATGTGTGAATATGCTGATGAGACAGCAACCATTGTAGAATTTCTGAACAGATGGATTACCTTTTGTCAAAGCATCATCTCAACACTGACTTGA本發(fā)明提供的重組融合蛋白具有如SEQ ID NO4氨基酸序列。該融合蛋白即結(jié)核分枝桿菌分泌抗原Ag85B與人IL-2融合而成的融合蛋白，被灌注入膀胱腫瘤患者膀胱內(nèi)后，可以通過Ag85B與膀胱壁纖維粘連蛋白(FN)結(jié)合的特性(Naito M，et al.The novel fibronectin-binding motifand key residues of mycobacteria.J Bio Chem，1998，273(5)，2905-2909)，介導(dǎo)該融合蛋白與膀胱壁粘附，Ag85B經(jīng)過MHC II類途徑加工提呈，可以誘導(dǎo)機(jī)體的Th1型細(xì)胞免疫反應(yīng)，分泌Th1型細(xì)胞因子IFN-γ和IL-12等，并刺激膀胱癌患者外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的增殖反應(yīng)；IL-2能促進(jìn)T、B細(xì)胞增殖分化，增強(qiáng)T細(xì)胞活性，活化NK細(xì)胞、誘導(dǎo)其它細(xì)胞因子和LAK細(xì)胞、以及TIL細(xì)胞的產(chǎn)生。兩者在誘導(dǎo)機(jī)體免疫反應(yīng)方面發(fā)揮協(xié)同作用，通過機(jī)體局部和全身性的免疫反應(yīng)來滅殺腫瘤細(xì)胞，達(dá)到預(yù)防復(fù)發(fā)和治療作用。
SEQ ID NO4MFSRPGLPVEYLQVPSPSMGRDIKVQFQSGGNNSPAVYLLDGLRAQDDYNGWDINTPAFEWYYQSGLSIVMPVGGQSSFYSDWYSPACGKAGCQTYKWETFLTSELPQWLSANRAVKPTGSAAIGLSMAGSSAMILAAYHPQQFIYAGSLSALLDPSQGMGPSLIGLAMGDAGGYKAADMWGPSSDPAWERNDPTQQIPKLVANNTRLWVYCGNGTPNELGGANIPAEFLENFVRSSNLKFQDAYNAAGGHNAVFNFPPNGTHSWEYWGAQLNAMKGDLQSSLGAGGGGGSGTAPTSSSTKKTQLQLEHLLLDLQMILNGINNYKNPKLTRMLTFKFYMPKKATELKHLQCLEEELKPLEEVLNLAQSKNFHLRPRDLISNINVIVLELKGSETTFMCEYADETATIVEFLNRWITFCQSIISTLT本發(fā)明的重組融合蛋白可以用已知的基因工程方法，通過原核表達(dá)或者真核表達(dá)獲取。
發(fā)明的用途適用于制備用于腫瘤免疫治療的藥物，尤其適用于制備膀胱腫瘤治療和預(yù)防其復(fù)發(fā)的藥物或蛋白疫苗。
發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)本發(fā)明與BCG和IL-2相比，在治療膀胱腫瘤和預(yù)防膀胱腫瘤復(fù)發(fā)時(shí)有如下優(yōu)點(diǎn)1.具有Ag85B和IL-2的雙功能活性，能同時(shí)發(fā)揮兩者免疫作用；2.Ag85B為分枝桿菌的主要分泌性蛋白，具有BCG的免疫原性，但又不具有BCG活菌疫苗的毒副作用；3.Ag85B與IL-2融合，兩者具有免疫協(xié)同作用，從而相應(yīng)減少IL-2的臨床用量，其毒副作用也降低；4.Ag85B具有與膀胱壁纖維粘連蛋白(FN)結(jié)合的特性，從而靶向性的引導(dǎo)融合蛋白粘附于膀胱壁，延長藥物的作用時(shí)間。


本發(fā)明通過實(shí)施例進(jìn)一步說明，實(shí)施例包括如下附圖附圖1為Ag85B PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA電泳圖；
附圖2為質(zhì)粒pUC18-Ag85B的限制性內(nèi)切酶切電泳圖；附圖3為hIL-2 PCR擴(kuò)增產(chǎn)物DNA電泳圖；附圖4為質(zhì)粒pUC18-IL-2的限制性內(nèi)切酶切電泳圖；附圖5為質(zhì)粒pUC-Ag85B/IL-2的限制性內(nèi)切酶切電泳圖；附圖6為質(zhì)粒pG Ag85B/IL-2的限制性內(nèi)切酶切電泳圖；附圖7 Ag85B/IL-2融合基因的部份序列的測序報(bào)告；附圖8為質(zhì)粒pG-Ag85B/IL-2重組大腸桿菌BL21表達(dá)的SDS-PAGE電泳圖；附圖9為pG Ag85B/IL-2重組大腸桿菌BL21誘導(dǎo)表達(dá)產(chǎn)物的Western blot圖；附圖10為Ag85B/IL-2融合蛋白經(jīng)RP-HPLC純化后SDS-PAGE電泳圖；附圖11為Ag85B/IL-2融合蛋白RP-HPLC純度分析圖；附圖12為Ag85B/IL-2融合蛋白刺激作用下的人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ含量對比圖；附圖13為Ag85B/IL-2融合蛋白刺激作用下的人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-12含量對比圖；附圖14為Ag85B/IL-2融合蛋白激活的殺傷細(xì)胞對膀胱腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒作用對比圖。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1獲取結(jié)核分枝桿菌(Edman株)Ag85B抗原的編碼基因結(jié)核分枝桿菌(Edman株)來源于山東省醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所。采用7H9液體培養(yǎng)基培養(yǎng)結(jié)核桿菌，培養(yǎng)溫度37℃，2周后離心培養(yǎng)物，收集菌體，從中提取結(jié)核桿菌基因組DNA。
提取結(jié)核分枝桿菌基因組DNA的方法參照Molecular clonging一書(J.Sambrook，Isolation of high-molecular-weight DNA from mammaliancells，9.16-9.22，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Molecular cloning，1989)。
采用PCR法自結(jié)核桿菌基因組DNA中擴(kuò)增Ag85B結(jié)構(gòu)基因。采用的5`端引物序列為；5`CGGAATTCTTCTCCCGGCCG 3`(SEQ ID NO5)；3`端引物序列為5`GGGGTACCAGAGCCTCCGCCACC GCCGGCGCCTAACG 3`(SEQ ID NO6)。
所述PCR操作程序?yàn)樵谝?0ul微量離心管中加入下列反應(yīng)試劑模板DNA 2ul10×PCR緩沖液(含氯化鎂)5uldNTPs(10mmol/L)4ul5`端和3`端引物(0.01mmol/L)各1ulTaqDNA聚合物(5u/ul)1ul加去離子水至終體積50ul反應(yīng)條件94℃，5min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，90sec；30個(gè)循環(huán)后，72℃充分延伸10min。
Ag85B PCR結(jié)果參見附圖1。
Ag85B目的基因經(jīng)純化后用EcoRI+KpnI雙酶切，與同樣用EcoRI+KpnI雙酶切的pUC18質(zhì)粒(購自Promega公司)連接，酶切、連接、轉(zhuǎn)化及重組克隆的篩選按Molecular clonging進(jìn)行。構(gòu)建含有結(jié)核桿菌Ag85B結(jié)構(gòu)基因的質(zhì)粒pUC18-Ag85B。
質(zhì)粒pUC18-Ag85B的限制性內(nèi)切酶切鑒定結(jié)果參見附圖2。
該實(shí)施例成功獲取結(jié)核分枝桿菌(Edman株)Ag85B抗原的編碼基因，并構(gòu)建出含有結(jié)核桿菌Ag85B編碼基因的質(zhì)粒pUC18-Ag85B。
實(shí)施例2獲取人IL-2的編碼基因自絲裂原刺激的人Jurkat T淋巴瘤細(xì)胞(來自中科院細(xì)胞所)中提取總RNA，提取方法按上海生工公司RNA提取試劑盒進(jìn)行。采用RT-PCR法獲得人Jurkat T細(xì)胞瘤cDNA。
自上述cDNA中用PCR法擴(kuò)增人IL-2的編碼基因。采用的5`端引物序列為5`GG GGTACCGCACCTACTTC 3`(SEQ ID NO7)；3`端引物序列為5`CGGGATCCTCAAGTCAGTGT 3`(SEQ ID NO8)所述PCR操作程序?yàn)樵谝?0ul微量離心管中加入下列反應(yīng)試劑模板DNA 1ul10×PCR緩沖液(含氯化鎂)5uldNTPs(10mmol/L)4ul5`端和3`端引物(0.01mmol/L)各1ulTaqDNA聚合物(5u/ul)1ul加去離子水至終體積50ul反應(yīng)條件94℃，5min；94℃，30sec；55℃，30sec；72℃，90sec；30個(gè)循環(huán)后，72℃充分延伸10min。
hIL-2 PCR擴(kuò)增結(jié)果參見附圖3。
人IL-2目的基因經(jīng)純化后用KpnI+BamHI雙酶切，與同樣用KpnI+BamHI雙酶切的pUC18質(zhì)粒(購自Promega公司)連接，酶切、連接、轉(zhuǎn)化及重組克隆的篩選按Molecular clonging進(jìn)行。構(gòu)建含有人IL-2編碼基因的質(zhì)粒pUC18-IL-2。
質(zhì)粒pUC18-IL-2的限制性內(nèi)切酶切鑒定結(jié)果參見附圖4。
該實(shí)施例成功獲取人IL-2編碼基因，并構(gòu)建出含有人IL-2編碼基因的質(zhì)粒pUC18-IL-2。
實(shí)施例3構(gòu)建Ag85B-IL-2原核表達(dá)質(zhì)粒pG-Ag85B/IL-2。
采用KpnI+BamHI雙酶切pUC18-IL-2，膠回收IL-2基因片段，與同樣用KpnI+BamHI雙酶切的pUC18-Ag85B質(zhì)粒連接，酶切、連接、轉(zhuǎn)化及重組克隆的篩選按Molecular clonging進(jìn)行。構(gòu)建含有Ag85B/IL-2融合基因的質(zhì)粒pUC-Ag85B/IL-2。
質(zhì)粒pUC-Ag85B/IL-2的限制性內(nèi)切酶切鑒定結(jié)果參見附圖5。
采用EcoRI+SalI雙酶切質(zhì)粒pU-Ag85B/IL-2，膠回收Ag85B/IL-2融合基因片段，與同樣用EcoRI+SalI雙酶切的pGEX4T-1質(zhì)粒(購自Promega公司)連接，構(gòu)建含有Ag85B/IL-2融合基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pG-Ag85B/IL-2。
質(zhì)粒pG-Ag85B/IL-2的限制性內(nèi)切酶切鑒定結(jié)果參見附圖6。
基因序列測定用ABI公司的DNA測序儀進(jìn)行。結(jié)果表明Ag85B/IL-2融合基因的序列與設(shè)計(jì)的完全一致。Ag85B/IL-2融合基因的部份序列的測序結(jié)果參見附圖7。
該實(shí)施例成功構(gòu)建了含有Ag85B/IL-2融合基因的原核表達(dá)質(zhì)粒pG-Ag85B/IL-2。
實(shí)施例4質(zhì)粒pG-Ag85B/IL-2轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21并誘導(dǎo)表達(dá)。
1.BL21感受態(tài)菌的制備。
(1)將-20℃凍存的大腸桿菌BL21劃線接種于含氨芐青霉素(100ug/ml)LB瓊脂板上，37℃孵育箱內(nèi)培養(yǎng)過夜(16～18h)。
(2)取單菌落接種于3～5ml含氨芐青霉素LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩(200rpm/min)培養(yǎng)過夜。
(3)取250μl菌液加入25ml LB液體培養(yǎng)基中，37℃振蕩培養(yǎng)約2～4h，至OD600＝0.4～0.5時(shí)，停止培養(yǎng)。
(4)將菌液移入離心管中，冰浴10min，5000rpm離心10min。
(5)棄培養(yǎng)液，沉淀用5ml冰預(yù)冷的0.1mol/LCaCl2重懸后，5000rpm，10min離心洗滌一次。
(6)上述沉淀中加入10ml冰冷的100mmol/L CaCl2，冰浴2～4小時(shí)即可用于轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)。
2.質(zhì)粒pG-Ag85B/IL-2的轉(zhuǎn)化(1)在3只預(yù)冷的1.5ml的消毒EP管中按表加入感受態(tài)細(xì)菌和質(zhì)粒DNA。
EP管號 感受態(tài)細(xì)菌質(zhì)粒DNA①轉(zhuǎn)化組95μl 5μl②陰性對照組100μl-③陽性對照組98μl 2μl(2)將上述EP管冰浴30min～1h，42℃熱休克90sec，冰浴2min。
(3)各管加入不含抗生素的LB液體培養(yǎng)基400μl，37℃水浴5min，置搖床37℃振蕩培養(yǎng)45min～1.5h。
(4)分別用消毒槍頭吸取100μl上述的培養(yǎng)液，加入含氨芐青霉素的LB平板和普通LB平板，用彎頭消毒玻棒將液體均勻涂于板上，于37℃培養(yǎng)箱中正向放置1h后，倒置過夜培養(yǎng)。用限制性酶切方法鑒定重組克隆。
(5)質(zhì)粒和菌種的保存質(zhì)粒冰凍保存于-20℃。菌種在含有20-50％甘油的培養(yǎng)液中-70℃保存。
3.Ag85B/IL-2融合基因的原核表達(dá)(1)用鑒定好的陽性重組子菌液劃板，挑取新鮮的單菌落接種入3ml的LB(含Amp 100μg/mL)，37℃振搖過夜。
(2)將飽和菌液以1∶100的稀釋度加入5ml LB(含Amp100μg/mL)，37℃振搖到OD600為0.6左右。
(3)加入IPTG至終濃度1mmol/L，繼續(xù)37℃振搖培養(yǎng)4h。4℃離心5min(5000rpm)，收集細(xì)菌體，立即使用或凍存。
(4)取適量菌體，加10μl滅菌去離子水徹底懸浮后，加入10μl×SDS加樣緩沖液于細(xì)菌中，100℃加熱3min以使蛋白變性。同樣方法處理高分子量蛋白Marker。用SDS-PAGE(濃縮膠5％，分離膠11％)分析以上樣品，確定融合蛋白有無表達(dá)。
(5)SDS-PAGE電泳分析檢測重組蛋白。結(jié)果參見附圖8。
圖中表明pG-Ag85B/IL-2在BL21菌中獲得了高效表達(dá)，表達(dá)量約40％。由于表達(dá)載體pGEX4T-1啟動(dòng)子后帶有GST基因，所以Ag85B/IL-2蛋白是以GST-Ag85B/IL-2融合蛋白的形式表達(dá)的，分子量約為71KD，并以不溶解的包涵體的形式存在。
4.GST-Ag85B/IL-2融合蛋白的Westrn blot鑒定pG-Ag85B/IL-2重組菌誘導(dǎo)表達(dá)后，行SDS-PAGE，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜。利用兔抗人IL-2單克隆抗體免疫鑒定表達(dá)產(chǎn)物，結(jié)果參見附圖9。
圖中顯示在71KD處出現(xiàn)一明顯條帶，與GST-Ag85B/IL-2融合蛋白理論大小一致。
實(shí)施例5
Ag85B/IL-2融合蛋白的純化。
1.細(xì)菌收集與包涵體的提取(1)收集1L誘導(dǎo)表達(dá)的工程菌，4℃5000rpm離心10min收集表達(dá)后菌體。
(2)加入10mmol/L PBS(pH7.5)，磁力攪拌30min，4℃5000rpm離心10min，收集沉淀。
(3)同上重復(fù)洗滌兩次。
(4)在冰浴中超聲破菌2min/次，共10次，間隔10sec，輸出功率70W。用細(xì)菌裂解緩沖液懸浮。
(5)4℃8000rpm離心20min，收集沉淀。
細(xì)菌裂解緩沖液的配制PBS(pH7.5)10mmol/LEDTA 1mmol/L2.洗滌包涵體(1)按每克包涵體加入10ml新配制的預(yù)冷4℃的包涵體洗滌液，以磁力旋渦懸浮之。
(2)4℃，8000rpm離心20min，棄去上清。
(3)同上處理，重復(fù)5次。
包涵體洗滌液的配制Triton X-100 0.5％(V/V)PBS(pH7.5) 10mmol/L尿素 1mmol/L3.溶解包涵體向洗滌后包涵體中加入30ml新配制的預(yù)冷的包涵體溶解液，以磁力輕柔攪拌，放置于4℃冰箱溶解過夜。次日，在4℃下以15000rpm離心20min，小心吸取上清，放置于4℃保存?zhèn)溆谩?br> 包涵體溶解液的配制尿素 8mol/Lβ-巰基乙醇 0.1mmol/L4.包涵體的復(fù)性向溶解的包涵體中加入9倍體積的復(fù)性緩沖液，室溫放置30min，用KOH保持pH到10.7；用HCL調(diào)pH至8.0，至少在室溫放置30min。10000rpm，4℃離心15min，收集上清，裝入透析袋(截留分子量50～80kD)以去離子水透析48h，透析完成后收集透析袋中蛋白溶液，濃縮凍干。置-70℃保存。
復(fù)性緩沖液的配制KH2PO4(pH10.7) 50mmol/LEDTA(pH8.0) 1mmol/L還原型谷胱甘肽2mmol/L氧化型谷胱甘肽1mmol/L5.Ag85B/IL-2融合蛋白的Glutathione Sepharose親和層析及凝血酶(Thrombin)酶切采用Pharmacia AKTA explore 100儀對包涵體復(fù)性液進(jìn)行Glutathione Sepharose親和層析。層析柱為XK 2b，柱床體積50ml。樣品流速10ml/min。用10mMolPBS pH7.5，10mMol谷胱甘肽GSH溶液洗脫GST-Ag85B/IL-2融合蛋白。紫外監(jiān)測波長為280nm，收集蛋白峰。將重組蛋白樣品用10mMolPBS pH7.5稀釋至1mg/ml，每ml樣品溶液中加入凝血酶(sigma)0.2u混勻，室溫下作用5h，酶解率大于90％。
5.Ag85B/IL-2融合蛋白的離子交換層析采用Pharmacia公司的Q Sepharase Fast Flow介質(zhì)對親和層析后的融合蛋白進(jìn)一步純化。預(yù)裝一根20cm長Q Sepharase Fast Flow柱，10mMol PBS pH7.5沖洗層析柱，1Mol Nacl，10mMolPBS pH7.5平衡后上柱。流速2.5ml/min。先以0-100％Nacl連續(xù)濃度梯度洗脫以確定最適冼脫條件，再行Nacl分步洗脫，收集紫外吸收峰樣品。
6.Ag85B/IL-2融合蛋白的RP-HPLC純化將離子交換層析收集到的目的蛋白樣品在AKTA Explore 100上進(jìn)行RP-HPLC純化。選用3ml Resource RPC反相柱，柱長15cm，直徑3.5cm。離子交換層析后的樣品稀釋5倍后上柱，流動(dòng)相為乙腈溶液，流速1.0ml/min，紫外監(jiān)測波長為280nm，在10倍柱床體積內(nèi)經(jīng)0％～60％溶液梯度洗脫，收集主峰，低溫凍干備用。
7.Ag85B/IL-2融合蛋白的SDS-PAGE電泳鑒定及純度分析用11％的分離膠、4％濃縮膠對純化的樣品進(jìn)行電泳分析，初始電壓8V/cm，待樣品進(jìn)入分離膠時(shí)增加電壓至15V/cm，電泳3h。電泳結(jié)束后，揭下凝膠置于玻璃平皿中，加入3～5倍膠體積的固定液室溫固定1h以上；倒掉固定液，用考馬斯亮藍(lán)R-250染色液染色4h以上，吸出染色液，加適量固定液洗滌凝膠一次，加入脫色液進(jìn)行漂洗，其間更換脫色液數(shù)次，直至蛋白條帶清晰為止。以Bio-Rad凝膠掃描分析系統(tǒng)進(jìn)行掃描。附圖10表明Ag85B/IL-2融合蛋白分子量大小約45KD，純度大于95％。用等電聚焦法測定其等電點(diǎn)約為5.31。
將目的蛋白再用RP-HPLC進(jìn)行純度分析結(jié)果參見附圖11。結(jié)果表明Ag85B/IL-2融合蛋白的純度大于98％。
8.Ag85B/IL-2融合蛋白的N末端氨基酸序列測定Ag85B/IL-2融合蛋白的SDS-PAGE電泳結(jié)束后，電轉(zhuǎn)印至PVDF膜，進(jìn)行N末端氨基酸序列測定，由北京大學(xué)生命科學(xué)院完成。
測序結(jié)果Ag85B/IL-2融合蛋白N末端氨基酸序列測定與設(shè)計(jì)完全一致。
實(shí)施例6Ag85B/IL-2融合蛋白的生物學(xué)活性試驗(yàn)一、Ag85B/IL-2融合蛋白的IL-2活性測定用IL-2依賴性細(xì)胞株CTLL-2細(xì)胞測定Ag85B/IL-2融合蛋白的IL-2活性。
1、方法(1)用RPMI1640稀釋IL-2標(biāo)準(zhǔn)品和待測樣品，IL-2標(biāo)準(zhǔn)品從100U/ml濃度開始倍比稀釋，待測樣品也為倍比稀釋，稀釋后于96孔板中終體積為100ul，每個(gè)濃度設(shè)3個(gè)重復(fù)孔；
(2)含10-15％小牛血清(FCS)，200u/ml rIL-2的RPMI-1640培養(yǎng)CTLL-2傳代2-4次后，收集對數(shù)生長期的CTLL-2細(xì)胞(第三軍醫(yī)大學(xué)免疫教研室提供)，用RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)液1500rpm，10min，4℃洗滌細(xì)胞2-3次，然后重懸于2-5ml含10％FCS的RPMI1640中，制成細(xì)胞懸液，用0.5％臺盼藍(lán)檢測細(xì)胞存活率(大于95％)。
(3)調(diào)整濃度為1×105/ml。在稀釋樣品的培養(yǎng)板中，每孔加100ul細(xì)胞(4)將細(xì)胞培養(yǎng)板置37℃，5％CO2，飽和溫度中培養(yǎng)32-40h(待陰性孔90％細(xì)胞死亡時(shí))；(5)加入MTT(5mg/ml)20ul/孔，于振蕩器上振蕩1min，37℃，5％CO2培養(yǎng)2-5h；(6)取出培養(yǎng)板，以2000r/min離心5min，吸棄上清液，每孔加入DMSO120ul，振蕩30s后，在酶標(biāo)儀上測OD570值。
(7)實(shí)驗(yàn)結(jié)果觀察分析以IL-2待測樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋度為橫軸，以檢測細(xì)胞OD值為縱軸作圖，求出標(biāo)準(zhǔn)品的最高OD值的50％的稀釋度，找出待測樣品相應(yīng)50％IL-2標(biāo)準(zhǔn)品最高OD的稀釋度。
2、結(jié)果Ag85B/IL-2融合蛋白的IL-2比活性為2500u/mg。
二、Ag85B/IL-2融合蛋白對人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)Th1型細(xì)胞因子釋放的促進(jìn)作用1、人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)的分離健康供血者的肝素抗凝血5ml，加入等量37℃Hank’s液混勻，取稀釋血液10ml距分離液面上約1cm沿管壁輕輕疊加于5ml淋巴細(xì)胞分層液上，保持淋巴細(xì)胞分層液與血樣品之間的界限清晰，2000rmp，離心30min。吸取中層白膜狀的單個(gè)核細(xì)胞層液體，加入8ml 37℃ Hank’s液洗滌2次，每次1500rmp離心10min。沉淀的細(xì)胞用含10％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)液配成1.0×106/ml單細(xì)胞懸液，置細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，37℃、5％CO2孵箱孵育，待用。
2、效應(yīng)細(xì)胞的誘導(dǎo)于6孔培養(yǎng)板中加入新鮮制備的PBMC(細(xì)胞濃度為1×106/ml)，每孔1ml，分別加入0.8ug/ml Ag85B/IL-2重組蛋白、Ag85B蛋白、500u/ml rIL-2、0.8ug/ml Ag85B蛋白聯(lián)合500u/ml rIL-2、0.8ug/ml BCG，置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，于第3天測定細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子的含量。
3、細(xì)胞培養(yǎng)上清中Th1型細(xì)胞因子IL-12和IFN-γ的測定(ELISA法)(1)分別取用抗人IL-12和IFN-γ單抗包被的96孔板，加入IL-12和IFN-γ標(biāo)準(zhǔn)品和不同蛋白刺激的PBMC培養(yǎng)上清(100ul/孔)，另設(shè)空白對照孔，每組三個(gè)復(fù)孔，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光37℃孵箱孵育60分鐘。
(2)甩盡孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液350ul/孔，洗板4次。
(3)除空白孔外，加入生物素化的抗體工作液(100ul/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光37℃孵箱孵育60分鐘。
(3)盡孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液350ul/孔，洗板4次。
(4)除空白孔外，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的親合素工作液(100ul/孔)，用封板膠紙封住反應(yīng)孔，避光37℃孵箱孵育60分鐘。
(5)甩盡孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液350ul/孔，洗板4次。
(6)加入顯色劑(100ul/孔)，避光37℃孵箱孵育20分鐘。
(7)加入終止液(100ul/孔)，混勻后5分鐘內(nèi)測量OD450值。
4、結(jié)果表1不同刺激物作用下的人外周血單核細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-12和IFN-γ含量(pg/ml)不同刺激物檢測指標(biāo)Ag85B/IL-2 Ag85B IL-2 Ag85B+IL-2 BCGIL-12 99.072±4.502 37.452±2.131*25.362±1212*71.521±3.562▲51.855±3.087*IFN-γ100.135±2.837 10.367±4.834**81.067±1.804▲98.667±1.001 6.667±4.202**與Ag85B/IL-2組相比，*表示P＜0.01；**表示P＜0.001；▲表示P＜0.05上述表的柱形對比圖參見附圖12、13。
5、結(jié)論Ag85B/IL-2重組蛋白刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IL-12濃度顯著高于Ag85B，IL-2，Ag85B+IL-2和BCG刺激組；Ag85B/IL-2重組蛋白刺激的人外周血單個(gè)核細(xì)胞培養(yǎng)上清中的IFN-γ濃度顯著高于Ag85B，IL-2和BCG刺激組，與Ag85B+IL-2刺激組無顯著性差異。
結(jié)果說明Ag85B/IL-2重組蛋白具有較強(qiáng)的促進(jìn)人外周血單個(gè)核細(xì)胞Th1型細(xì)胞因子釋放的功能。
三、Ag85B/IL-2融合蛋白激活的人外周血單個(gè)核細(xì)胞(PBMC)對膀胱腫瘤細(xì)胞的殺傷活性1.制備效應(yīng)細(xì)胞于6孔培養(yǎng)板中加入新鮮制備的PBMC(調(diào)整濃度為1×106/ml)，每孔1ml，按0.8ug/ml的濃度加入Ag85B/IL-2誘導(dǎo)AIAK效應(yīng)細(xì)胞，以0.8ug/ml Ag85B蛋白誘導(dǎo)的AAK效應(yīng)細(xì)胞、500u/ml rIL-2誘導(dǎo)的LAK細(xì)胞、0.8ug/ml Ag85B蛋白聯(lián)合500u/ml rIL-2聯(lián)合誘導(dǎo)的ALAK效應(yīng)細(xì)胞、以及0.8ug/ml BCG誘導(dǎo)的BAK效應(yīng)細(xì)胞作為對照，置37℃，5％CO2孵箱中培養(yǎng)，于第3天收獲細(xì)胞作細(xì)胞毒測定。
2.細(xì)胞毒實(shí)驗(yàn)(MTT法)(1)6孔培養(yǎng)板上以效靶比40∶1先加入效應(yīng)細(xì)胞，再加入相應(yīng)靶細(xì)胞(T24，BIU-87，BTT739，EJ)，另設(shè)各靶細(xì)胞對照孔，效應(yīng)細(xì)胞對照孔，分設(shè)3個(gè)重復(fù)孔。
(2)于37℃，5％CO2培養(yǎng)24h.
(3)每孔加MTT(5mg/ml)20ul，繼續(xù)培養(yǎng)4h.
(4)2000rpm，離心5min，棄上清。
(5)各孔加DMSO120ul(6)震蕩10min，充分溶解MTT還原產(chǎn)物甲肷。
(7)在酶標(biāo)儀上測570nm處OD值。
(8)殺傷活性的計(jì)算公式
3.實(shí)驗(yàn)結(jié)果及結(jié)論表2不同效應(yīng)細(xì)胞對膀胱腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性(％)(n＝3，效靶比40∶1)效應(yīng)細(xì)胞 BIU-87 T24 EJ BTT739融合蛋白誘導(dǎo)的 60.4±2.1 94.6±4.3 89.4±3.5 77.7±1.5AIAK細(xì)胞IL-2誘導(dǎo)的LAK細(xì)胞 43.0±1.3▲92.5±2.5▲62.9±6.1▲61.1±3.8▲Ag85B誘導(dǎo)的AAK細(xì) 48.8±1.6▲93.4±4.3★75.7±2.4▲71.6±2.5▲胞Ag85B+IL-2誘導(dǎo)的 52.6±2.7▲94.4±1.5 89.1±3.8 75.2±1.5▲ALAK細(xì)胞BOG誘導(dǎo)的BAK細(xì)胞 52.0±2.2▲49.7±2.5▲73.6±2.5▲53.9±3.4▲注▲表示與AIAK細(xì)胞組相比P＜0.01；★表示與AIAK細(xì)胞組相比P＜0.05上述表的柱形對比圖參見附圖14。
結(jié)果表明Ag85B/IL-2融合蛋白誘導(dǎo)的AIAK細(xì)胞對BIU-87和BTT739膀胱腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性顯著高于LAK細(xì)胞、AAK細(xì)胞、ALAK細(xì)胞及BAK細(xì)胞；對T24和EJ膀胱腫瘤細(xì)胞的細(xì)胞毒活性顯著高于LAK細(xì)胞、AAK細(xì)胞及BAK細(xì)胞。
結(jié)論Ag85B/IL-2融合蛋白誘導(dǎo)的AIAK細(xì)胞對膀胱腫瘤細(xì)胞具有較強(qiáng)的細(xì)胞毒活性，比單用Ag85或IL-2誘導(dǎo)的殺傷細(xì)胞的細(xì)胞毒活性高。
實(shí)施例7Ag85B/IL-2融合蛋白對膀胱癌荷瘤小鼠的抑瘤效應(yīng)觀察1.材料BTT739為一種在T739小鼠體內(nèi)建立可移植膀胱移行細(xì)胞癌的細(xì)胞株，南京鐵道醫(yī)學(xué)院提供，本科室凍存，T739小鼠購自中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物室。
2.分組5周齡的T739小鼠40只，分Ag85B/IL-2融合蛋白疫苗組和空白對照組，每組20只3.實(shí)驗(yàn)方法(1)膀胱腫瘤動(dòng)物模型制備鼠源性膀胱移行癌細(xì)胞BTT739在RPMI1640培養(yǎng)基中常規(guī)培養(yǎng)，即用含15％小牛血清的RPMI-1640培養(yǎng)基，添加適量抗生素(100單位/ml青霉素和100μg/ml鏈霉素)，置37℃、5％CO2混合氣體孵箱中培養(yǎng)。細(xì)胞換液時(shí)間2-3天，2-4天傳代，傳代前以0.25％胰蛋白酶消化2min，調(diào)整細(xì)胞濃度為3×106/ml，待用。荷瘤鼠模型采用細(xì)胞懸液接種法5周齡近交系同基因鼠T739，無菌條件下右前腋下皮下接種BTT739腫瘤細(xì)胞100μl/鼠(3×105個(gè)細(xì)胞/只)，制備荷瘤小鼠動(dòng)物模型。
(2)給藥方法空白對照組荷瘤鼠給予PBS 0.1ml瘤內(nèi)注射；治療組荷瘤鼠給予Ag85B/IL-2融合蛋白(200ug/ml)0.1ml瘤內(nèi)注射兩組分別于接種腫瘤細(xì)胞后第0、3、7、13、18天于接種腫瘤部位給藥，第21天脫臼法處死小鼠，稱取瘤重，根據(jù)下列公式計(jì)算移植瘤生長抑制率，然后將腫瘤組織液氮中凍存，備用。
結(jié)果表3Ag85B/IL-2融合蛋白對膀胱癌荷瘤鼠的抑瘤效應(yīng)瘤生長抑制組別 鼠數(shù)平均瘤重(g)率(％)PBS組 20 9.26±1.15 -Ag85B/IL-2融合蛋白20 4.49±1.06★51.52注★表示與對照組相比P＜0.01結(jié)論Ag85B/IL-2融合蛋白能明顯抑制膀胱腫瘤荷瘤鼠體內(nèi)腫瘤的生長。
實(shí)施例8Ag85B/IL-2融合蛋白對膀胱腫瘤荷瘤小鼠的存活期的延長作用的觀察1.材料及動(dòng)物模型的制備同前2.實(shí)驗(yàn)方法對照組荷瘤鼠給予PBS 0.1ml瘤內(nèi)注射；治療組荷瘤鼠給予Ag85B/IL-2融合蛋白(200ug/ml)0.1ml瘤內(nèi)注射兩組分別于接種腫瘤細(xì)胞后第0、3、7、13、18天于接種腫瘤部位給藥，觀察兩組荷瘤鼠存活天數(shù)。
結(jié)果表4Ag85B/IL-2融合蛋白對膀胱癌荷瘤鼠的生存期的延長作用鼠生存延長組別 鼠數(shù) 存活天數(shù)(d)率(％)PBS組 20 23.88±3.56 -Ag85B/IL-2融合蛋白20 33.00±3.16★38.19注★表示與對照組相比P＜0.01結(jié)論Ag85B/IL-2重組融合蛋白能顯著延長膀胱腫瘤荷瘤小鼠的存活期。
實(shí)施例9Ag85B/IL-2融合蛋白對腫瘤的治療方法在治療表淺型膀胱腫瘤和預(yù)防膀胱腫瘤術(shù)后復(fù)發(fā)時(shí)可以是這樣實(shí)現(xiàn)的膀胱腫瘤患者排空膀胱后，將Ag85B/IL-2融合蛋白用生理鹽水溶解，按無菌導(dǎo)尿術(shù)將尿管置入膀胱，緩慢將Ag85B/IL-2融合蛋白溶液注入膀胱腔內(nèi)。保留2小時(shí)，每15分鐘更換1次體位，輪流更換為平位、仰位、俯位和左右側(cè)臥位，以便使藥物與膀胱壁廣泛接觸。每周灌注1次，連續(xù)6周為一個(gè)療程。必要時(shí)可適當(dāng)延長療程。
在免疫治療其它腫瘤時(shí)是這樣實(shí)現(xiàn)的根據(jù)腫瘤的特性，將一定量的Ag85B/IL-2融合蛋白用注射用生理鹽水溶解后，通過定期皮下注射、肌肉注射或者瘤體內(nèi)注射，激活機(jī)體免疫系統(tǒng)而發(fā)揮抗腫瘤作用。
權(quán)利要求
1.一種重組融合蛋白Ag85B/IL-2，其特征是它是由結(jié)核分枝桿菌Ag85B抗原，或其它分枝桿菌中的Ag85B抗原和人IL-2融合而成的融合蛋白。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白Ag85B/IL-2，其特征是Ag85B抗原可以為卡介苗或恥垢分枝桿菌中的Ag85B抗原。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組融合蛋白Ag85B/IL-2，其特征是Ag85B抗原可以位于融合蛋白的氨基端，也可位于融合蛋白的羧基端。
4.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的重組融合蛋白Ag85B/IL-2，其特征是Ag85B抗原與人IL-2之間可以通過柔性結(jié)構(gòu)氨基酸編碼的連接子連接，亦可沒有連接子。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的重組融合蛋白Ag85B/IL-2，其特征是其連接子氨基酸序列可以為SEQ ID NO1，也可為SEQ ID NO2。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的重組融合蛋白Ag85B/IL-2，其特征是它可具有如SEQ ID NO3所示的編碼基因和如SEQ ID NO4所示氨基酸序列。
7.根據(jù)權(quán)利要求1到6所述的重組融合蛋白Ag85B/IL-2，其特征是可以通過原核表達(dá)或者真核表達(dá)獲取。
8.Ag85B/IL-2融合蛋白在制備用于免疫治療腫瘤的藥物，尤其是在制備膀胱腫瘤治療和預(yù)防其復(fù)發(fā)的藥物或蛋白疫苗中的用途。
全文摘要
本發(fā)明提供一種基因工程重組的Ag85B/IL－2融合蛋白。它是利用結(jié)核分枝桿菌Ag85B抗原或其它分枝桿菌中的Ag85B抗原與人IL－2融合而成的融合蛋白。本發(fā)明還提供了編碼該重組融合蛋白的基因。該重組融合蛋白具有活化免疫細(xì)胞、提高機(jī)體抗腫瘤免疫反應(yīng)的功能，適用于制備用于腫瘤免疫治療的藥物，尤其適用于制備膀胱腫瘤治療和預(yù)防其復(fù)發(fā)的藥物或蛋白疫苗。
文檔編號C12N15/63GK1544473SQ200310111009
公開日2004年11月10日 申請日期2003年11月22日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月22日
發(fā)明者靳鳳爍, 楊登科 申請人:靳鳳爍, 楊登科