專利名稱：花生四烯酸油脂及其微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法，特別是利用野生菌株生產(chǎn)高產(chǎn)量花生四烯酸油脂和其制備方法。
背景技術(shù)：
花生四烯酸(AA)和亞油酸、亞麻酸作為人體必需的3種脂肪酸具有多種生理功能。AA是人體最重要的，含量最豐富的二十碳多不飽和脂肪酸(C20PuFA)，主要存在于器官肌肉和血液組織中，與磷脂結(jié)合成結(jié)構(gòu)脂類起著重要作用。在人體的腦和神經(jīng)組織中，AA含量一般占多不飽和脂肪酸(PuFAs)總量的40-50％，在神經(jīng)末梢甚至高達(dá)70％。AA還是許多二十碳烯酸衍生物的直接前體，包括前列腺素E2(PGE2)、前列環(huán)素(PGI2)、血栓烷素A2(TXA2)、白細(xì)胞三烯B4(LTB4)和C4(LTC4)等等。這些生物活性物質(zhì)對脂蛋白的代謝、血液流變學(xué)、血管彈性、白細(xì)胞功能和血小板激活等具有重要的調(diào)節(jié)作用。AA還具有酯化膽固醇，抑制血小板聚集、增加血管彈性、降低血液粘度、調(diào)節(jié)白細(xì)胞功能、提高免疫力等一系列生理活性。臨床試驗(yàn)還發(fā)現(xiàn)，富含AA的飲食能明顯改善蛋白尿、腎小球動脈硬化和腎小管功能紊亂，對糖尿病微血管病變具有改善作用； 同時對糖尿病的各種慢性并發(fā)癥也具有良好的防治作用。所以，其營養(yǎng)保健功能體現(xiàn)在嬰幼兒生長發(fā)育、特別是嬰幼兒智力及視神經(jīng)發(fā)育、孕產(chǎn)婦營養(yǎng)、心腦血管疾病、糖尿病、腫瘤等許多方面。
在植物油中，絕大多數(shù)都不含AA，少數(shù)植物油中含有AA，但其含量均非常低，無法從植物油獲得AA產(chǎn)品。從整體上說，雖然AA廣泛存在于動物體內(nèi)，但來源于動物組織的AA無論是在產(chǎn)量上還是在成本上都無法滿足市場的需求。人們長期以來渴望獲得大量成本低、AA含量高的產(chǎn)品。
采用發(fā)酵法由微生物來生產(chǎn)花生四烯酸是一種替代性來源，已發(fā)現(xiàn)許多微生物都能合成AA，其中以高山被孢霉(Mortierella alpina)最具應(yīng)用前景。高山被孢霉是一種絲狀真菌，它在以碳水化合物為碳源的培養(yǎng)基中生長時，菌體內(nèi)會積累較多的油脂，其油脂的脂肪酸組成中含有豐富的多不飽和脂肪酸，尤其是AA含量較高，被認(rèn)為是最好的生產(chǎn)花生四烯酸油脂的菌種，并且荷蘭、英國和美國FDA先后通過了野生被孢霉及其產(chǎn)物食用安全的認(rèn)證。
WO 9213086(公開于1992年8月6日)公開了一種真菌產(chǎn)油脂，該油脂含有約10％至50％的AR，該油脂中的EPA含量不超過AA的五分之一、十分之一或者基本不含EPA。所述真菌可以是被孢霉屬，具體為高山被孢霉菌。
CN1175976A公開了一種生產(chǎn)花生四烯酸油脂的發(fā)酵方法及其獲得的油脂，所述的油脂中AA含量與EPA含量之比至少約5∶1，更好10∶1，最好至少20∶1，且AA含量可達(dá)到接近70％。該文獻(xiàn)方法中采用的微生物也是高山被孢霉菌，是通過控制過程中的pH值實(shí)現(xiàn)高AA含量的。
但是，上述文獻(xiàn)的不足之處在于，在提高AA在油脂中含量的同時，EPA的含量仍較高，其給出的實(shí)例中EPA與AA之比最少也超過5％。而高含量的二十碳五烯酸對嬰幼兒的不利影響限制了AA在嬰幼兒食品中的廣泛應(yīng)用。而且，現(xiàn)有技術(shù)中生產(chǎn)花生四烯酸油脂的方法及獲得的產(chǎn)品中仍然存在著油脂中花生四烯酸含量偏低，或者EPA含量偏高的缺陷，同時還存在發(fā)酵所采用的培養(yǎng)基成本高，以及非野生性菌種發(fā)酵存在的生產(chǎn)不穩(wěn)定以及食用安全等諸多問題。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明提出一種花生四烯酸油脂及其微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法，其任務(wù)正是為了克服上述技術(shù)的不足，提供一種篩選的野生高產(chǎn)菌株和相應(yīng)的花生四烯酸油脂的廉價發(fā)酵生產(chǎn)方法，從而提高花生四烯酸油脂的品質(zhì)和生產(chǎn)穩(wěn)定性，同時降低了花生四烯酸油脂的生產(chǎn)成本，避免其他人工改造菌種可能帶來的生產(chǎn)穩(wěn)定性甚至引起食用安全爭議等新問題。
本發(fā)明的任務(wù)是通過下列技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的本發(fā)明提供了一種由高山被孢霉(Mortierella alpina)菌種M0223生產(chǎn)的甘油三酯類油脂，該油脂含有65.5-73.5％的花生四烯酸殘基，且二十碳五烯酸殘基的含量為花生四烯酸殘基含量的0.69-3.7％。
上述甘油三酯類油脂的制備方法包括(1)將高山被孢霉Mortierella alpina M0223菌種培養(yǎng)活化，在裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基由碳源、氮源和無機(jī)鹽組成，其中，碳源選自淀粉水解糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖的一種或多種，氮源選自豆餅粉、酵母膏、蛋白胨、魚粉、豆芽汁、牛肉膏、硝酸鉀、硝酸鈉中的一種或多種，無機(jī)鹽選自磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鈉中的一種或多種；(2)將種子培養(yǎng)所得菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶或者發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源和無機(jī)鹽組成，其中，碳源選自淀粉水解糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、纖維二糖、糖蜜、脂肪酸和甘油中的一種或多種，氮源選自豆餅粉、花生餅粉、酵母膏、蛋白胨、魚粉、牛肉膏、玉米漿、硝酸鉀、硝酸鈉中的一種或多種，無機(jī)鹽選自磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鈉中的一種或多種；(3)發(fā)酵結(jié)束后，收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂，其中所述搖瓶種子培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為80-200rpm，培養(yǎng)溫度為18-28℃，振蕩培養(yǎng)時間為3-5天；所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件為菌種接種量為每100毫升的發(fā)酵培養(yǎng)基接入5-15毫升的搖瓶種子液，搖床轉(zhuǎn)速為120-240rpm，培養(yǎng)溫度為18-28℃，從發(fā)酵培養(yǎng)的第三天到第五天采用流加補(bǔ)料或分批補(bǔ)料方式，共補(bǔ)充相當(dāng)于不高于90g/L葡萄糖的碳源和不高于9g/L硝酸鉀的氮源，共振蕩培養(yǎng)6-9天；所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)條件為菌種接種量按每100毫升的發(fā)酵培養(yǎng)基接入5-15毫升(即體積比為5-15％)的搖瓶種子液接入一級發(fā)酵罐，多級發(fā)酵則將前一級發(fā)酵罐的種子液按體積比為5-15％的接種量接入下一級發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速60-150rpm，通氣量為每分鐘每升發(fā)酵液通入0.1-1.5升空氣；發(fā)酵溫度范圍18-28℃，發(fā)酵6-9天，發(fā)酵過程采用流加補(bǔ)料或分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法從發(fā)酵的第三天到第五天共補(bǔ)充相當(dāng)于不高于90克/升的葡萄糖的碳源，以及不高于9克/升硝酸鉀的氮源。
此外，可以將從干菌體中得到的粗油再進(jìn)行脫膠、堿煉、脫色、脫臭和抗氧化中的一種或多種處理，得到本發(fā)明的花生四烯酸油脂產(chǎn)品。
上述方法的進(jìn)一步的特征是種子培養(yǎng)基優(yōu)選配方為每百毫升含40-60克新鮮黃豆芽提取汁和3-8克的葡萄糖。所述種子培養(yǎng)基的制備為稱取40-60克新鮮黃豆芽加水煮沸0.5-1小時過濾后，加入葡萄糖3-8克溶解后定容至100ml。
所述方法中發(fā)酵培養(yǎng)基優(yōu)選配方為淀粉水解糖50-100克/升，豆餅粉汁蛋白1.5-8克/升，硝酸鉀1.5-4.5克/升，K2HPO4.3H2O 1.5-4.5克/升，MgSO4.7H2O0.2-1.0克/升，pH5.5-7.0。其中，淀粉水解糖是由淀粉先采用高溫淀粉酶液化、再采用糖化酶進(jìn)行糖化的雙酶法制備；而有機(jī)氮源如豆餅粉汁是由豆餅粉采用熱水提取制備，并要求以碳酸鈉或氫氧化鈉維持提取過程中pH在7.0-8.0范圍內(nèi)。
所述方法的發(fā)酵培養(yǎng)條件的優(yōu)選方案為最適發(fā)酵溫度范圍22-25℃，pH范圍5.5-6.0。
以上所述淀粉水解糖的淀粉來源包括玉米粉、紅薯粉、小麥粉和土豆粉中的一種或多種。
此外，上述發(fā)酵過程中還可以通過采用變溫控制發(fā)酵，分別提高菌體生長量和花生四烯酸油脂的合成。即在發(fā)酵的第3至5天前，控制發(fā)酵溫度在24-28℃范圍內(nèi)，促進(jìn)菌體生長；在發(fā)酵到第3至5天以后，控制發(fā)酵溫度在18-22℃范圍內(nèi)，促進(jìn)花生四烯酸油脂的合成。
本發(fā)明所采用的野生高產(chǎn)被孢霉菌株M0223，已在中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會，中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心進(jìn)行菌種保藏菌種分類命名高山被孢霉M0223，拉丁文名稱Mortierella alpina M0223，保藏單位名稱中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心保藏單位地址中國北京市海淀區(qū)中關(guān)村北一條13號，中國科學(xué)院微生物研究所郵政編碼100080保藏日期2003年3月10日保藏編號CGMCC No.0903由于采用上述技術(shù)方案，使本發(fā)明技術(shù)與已有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點(diǎn)及效果(1)通過高產(chǎn)菌種及相應(yīng)發(fā)酵工藝的優(yōu)化，特別是采用優(yōu)化的培養(yǎng)基和補(bǔ)料發(fā)酵工藝，生產(chǎn)出花生四烯酸殘基含量特別高同時二十碳五烯酸含量非常低的油脂，其花生四烯酸殘基含量可達(dá)到65.5-73.5％，且二十碳五烯酸含量可僅為花生四烯酸殘基含量的0.69-3.7％。明顯優(yōu)于同類發(fā)明。
(2)因?yàn)樗镁N為直接從自然界篩選獲得的高產(chǎn)野生菌株，菌種性狀及生產(chǎn)能力非常穩(wěn)定。且不存在其他人工育種方法帶來的菌種生產(chǎn)性能不穩(wěn)定甚至可能帶來的食用安全等問題。
(3)發(fā)酵原料皆為農(nóng)副產(chǎn)品，廉價易得，因而發(fā)酵成本大大低于同類發(fā)明。
采用本發(fā)明所用的菌種及相應(yīng)的發(fā)酵生產(chǎn)工藝，能夠?qū)崿F(xiàn)花生四烯酸在油脂中的含量最高達(dá)到73.5％，二十碳五烯酸(EPA)殘基含量最低水平為花生四烯酸(AA)殘基含量的0.69％，花生四烯酸最高產(chǎn)量超過9.0g/L。以上技術(shù)指標(biāo)明顯高于國內(nèi)外同類發(fā)明的專利水平和其他報道的工業(yè)性規(guī)模的發(fā)酵水平。。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1搖瓶發(fā)酵1、菌種活化制備種子前采用PDA斜面進(jìn)行菌種活化，并將活化的菌種轉(zhuǎn)入PDA固體培養(yǎng)基中培養(yǎng)積累大量孢子供種子大量制備用。
2、種子擴(kuò)大將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的被孢霉M0223的孢子用無菌水加玻璃珠振蕩洗脫后，通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中。種子培養(yǎng)基配方為5.0％(w/v)葡萄糖，50％(w/v)豆芽汁。豆芽汁制備按稱取50克新鮮黃豆芽加水煮沸1小時過濾后，濾液定容至100ml時豆芽汁濃度為50％(w/v)。搖瓶種子培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為140rpm，培養(yǎng)溫度為25℃，振蕩培養(yǎng)時間為3天。
3、搖瓶發(fā)酵將2中所述的搖瓶菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)玉米粉水解糖(以葡萄糖含量計算)80，豆餅汁中蛋白質(zhì)含量5，硝酸鈉3，K2HPO4.3H2O3，MgSO4.7H2O0.5，pH5.5。玉米粉水解糖是由玉米粉按照先液化、后糖化的雙酶法制備，水解糖中葡萄糖濃度用DNS法確定；豆餅汁制備由豆餅粉采用熱水提取制備，并要求以碳酸鈉或氫氧化鈉維持提取過程中pH在7.0-8.0范圍內(nèi)，豆餅汁中蛋白質(zhì)濃度用福林酚法確定。菌種接種量按照體積比為8％(V/V)，搖瓶在25℃下按150rpm振蕩培養(yǎng)7天，收獲菌體，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析獲得菌體量為30.6g/L，油脂含量為36.2％，氣相色譜檢測花生四烯酸含量為66.5％，二十碳五烯酸殘基含量為花生四烯酸殘基含量的3.61％，花生四烯酸產(chǎn)量為7.37g/L。表1為實(shí)例1發(fā)酵后真菌油脂成分。
表1實(shí)例1發(fā)酵后真菌油脂成分

實(shí)施例2搖瓶發(fā)酵1、菌種活化同實(shí)施例1。
2、種子擴(kuò)大將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的被孢霉M0223的孢子用無菌水加玻璃珠振蕩洗脫后，通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中。種子培養(yǎng)基配方為玉米淀粉水解糖5.0％(w/v)，豆餅蛋白質(zhì)4.5g/L。玉米淀粉水解糖和豆餅汁的制備見實(shí)施例1。搖瓶種子培養(yǎng)條件為 搖床轉(zhuǎn)速為100rpm，培養(yǎng)溫度為24℃，振蕩培養(yǎng)時間為3天。
3、搖瓶發(fā)酵將2中所述的搖瓶菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)糖蜜(以葡萄糖含量計算)40，玉米粉水解糖(以葡萄糖含量計算)20，豆餅粉蛋白質(zhì)3，玉米漿0.5％(v/v)，硝酸鈉3，K2HPO4.3H2O 3，MgSO4.7H2O 0.5，pH 5.5。玉米粉水解糖和豆餅粉蛋白質(zhì)的制備方法見實(shí)施例1。菌種接種量為12％(V/V)，搖瓶先在25℃下150rpm振蕩培養(yǎng)4天，再在21℃下150rpm振蕩培養(yǎng)4天，收獲菌體，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析獲得菌體量為29.6g/L，油脂含量為37.1％，氣相色譜檢測花生四烯酸含量為66.2％，二十碳五烯酸殘基含量為花生四烯酸殘基含量的3.17％，花生四烯酸產(chǎn)量達(dá)到7.27g/L。表2為實(shí)例2發(fā)酵后真菌油脂成分。
表2實(shí)例2發(fā)酵后真菌油脂成分

實(shí)施例3搖瓶發(fā)酵1、菌種活化同實(shí)施例1。
2、種子擴(kuò)大將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的被孢霉M0223的孢子用無菌水加玻璃珠振蕩洗脫后，通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中。種子培養(yǎng)基配方為葡萄糖3％(w/v)，蔗糖2.0％(w/v)，酵母膏5g/L，蛋白胨3g/L。玉米淀粉水解糖的制備見實(shí)施例1。搖瓶種子培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為100rpm，培養(yǎng)溫度為26℃，振蕩培養(yǎng)時間為天。
3、搖瓶發(fā)酵將2中所述的搖瓶菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)紅薯淀粉水解糖(以葡萄糖含量計算)80，花生餅粉蛋白質(zhì)1.5，硝酸鈉4.5，K2HPO4.3H2O3，MgSO4.7H2O 0.5，pH5.5。紅薯淀粉水解糖按照先液化、后糖化的雙酶法制備，水解糖中葡萄糖濃度用DNS法確定；花生餅粉蛋白質(zhì)制備方法為花生餅粉采用熱水提取，浸汁汁中蛋白質(zhì)濃度用福林酚法確定。接種量為11％(V/V)，搖瓶在25℃下按150rpm振蕩培養(yǎng)5天，19℃下按150rpm振蕩培養(yǎng)4天，收獲菌體，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析獲得菌體量為28.7g/L，油脂含量為36.9％，氣相色譜檢測花生四烯酸含量為65.8％，二十碳五烯酸殘基含量為花生四烯酸殘基含量的3.50％，花生四烯酸產(chǎn)量達(dá)到6.99g/L。表3為實(shí)例3發(fā)酵后真菌油脂成分。
表3實(shí)例3發(fā)酵后真菌油脂成分

實(shí)施例4搖瓶發(fā)酵1、菌種活化同實(shí)施例1。
2、種子擴(kuò)大將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的被孢霉的孢子用無菌水加玻璃珠振蕩洗脫后，通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中。種子培養(yǎng)基配方為3.0％(w/v)小麥淀粉水解糖，1.0％果糖，0.5％酵母膏，0.3％牛肉膏。搖瓶種子培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為80rpm，培養(yǎng)溫度為24℃，振蕩培養(yǎng)時間為5天。小麥淀粉水解糖是由小麥粉按照先液化、后糖化的雙酶法制備，水解糖中葡萄糖濃度用DNS法確定。
3、搖瓶發(fā)酵將2中所述的搖瓶菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)玉米粉水解糖(以葡萄糖含量計算)80，酵母膏3，牛肉膏3，硝酸鉀3，K2HPO4.3H2O 3，MgSO4.7H2O 0.5，pH5.8。玉米粉水解糖是由玉米粉按照先液化、后糖化的雙酶法制備，水解糖中葡萄糖濃度用DNS法確定。接種量為8％(V/V)，搖瓶在20℃下按150rpm振蕩培養(yǎng)9天，收獲菌體，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析獲得菌體量為28.6g/L，油脂含量為38.2％，氣相色譜檢測花生四烯酸含量為73.5％，二十碳五烯酸殘基含量為花生四烯酸殘基含量的1.50％，花生四烯酸產(chǎn)量達(dá)到8.03g/L。表4為實(shí)例4發(fā)酵后真菌油脂成分。
表4實(shí)例4發(fā)酵后真菌油脂成分

實(shí)施例5搖瓶發(fā)酵1、菌種活化同實(shí)施例1。
2、種子擴(kuò)大將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的被孢霉的孢子用無菌水加玻璃珠振蕩洗脫后，通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中。種子培養(yǎng)基配方為5.0％(w/v)葡萄糖，50％(w/v)豆芽汁，0.3％酵母膏。豆芽汁制備同實(shí)施例1。搖瓶種子培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)溫度為22℃，振蕩培養(yǎng)時間為3天。
3、搖瓶發(fā)酵將2中所述的搖瓶菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)玉米粉水解糖(以葡萄糖含量計算)50，豆餅汁中蛋白質(zhì)含量4.5，硝酸鉀3，K2HPO4.3H2O 3，MgSO4.7H2O 0.5，pH5.6。玉米粉水解糖和豆餅汁的制備同實(shí)施例1。接種量為10％(V/V)，搖瓶在22℃下按150rpm振蕩培養(yǎng)，然后在第3天、4天、5天進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料培養(yǎng)基為(g/L)玉米粉水解糖(以葡萄糖含量計算)20，硝酸鉀1.5，繼續(xù)培養(yǎng)至第9天，收獲菌體，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析獲得菌體量為36.6g/L，油脂含量為38.2％，氣相色譜檢測花生四烯酸含量為65.5％，二十碳五烯酸殘基含量為花生四烯酸殘基含量的2.0％，花生四烯酸產(chǎn)量達(dá)到9.16g/L。表5為實(shí)例5發(fā)酵后真菌油脂成分。
表5實(shí)例5發(fā)酵后真菌油脂成分

實(shí)施例6搖瓶發(fā)酵1、菌種活化同實(shí)施例1。
2、種子擴(kuò)大將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的被孢霉的孢子用無菌水加玻璃珠振蕩洗脫后，通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中。種子培養(yǎng)基配方為5.0％(w/v)麥芽糖，50％(w/v)豆芽汁，0.3％豆餅蛋白。豆芽汁和豆餅蛋白的制備同實(shí)施例1。搖瓶種子培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為180rpm，培養(yǎng)溫度為22℃，振蕩培養(yǎng)時間為3天。
3、搖瓶發(fā)酵將2中所述的搖瓶菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶進(jìn)行發(fā)酵培養(yǎng)，搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)土豆淀粉水解糖(以葡萄糖含量計算)50，玉米粉水解糖(以葡萄糖含量計算)20，豆餅蛋白質(zhì)1.5，牛肉膏3，硝酸鉀4.5，K2HPO4.3H2O 3，MgSO4.7H2O 0.5，pH5.5。土豆淀粉水解糖和豆餅汁的制備同實(shí)施例1。接種量為12％(V/V)，搖瓶在23℃下150rpm振蕩培養(yǎng)，然后在第3天、4天進(jìn)行補(bǔ)料，補(bǔ)料培養(yǎng)基為(g/L)玉米粉水解糖(以葡萄糖含量計算)10，硝酸鉀1，繼續(xù)培養(yǎng)至第9天，收獲菌體，進(jìn)行相關(guān)指標(biāo)分析獲得菌體量為33.6g/L，油脂含量為36.7％，氣相色譜檢測花生四烯酸含量為72.8％，二十碳五烯酸殘基含量為花生四烯酸殘基含量的0.69％，花生四烯酸產(chǎn)量達(dá)到8.98g/L。表6為實(shí)例6發(fā)酵后真菌油脂成分。
表6實(shí)例6發(fā)酵后真菌油脂成分

實(shí)施例7 5L發(fā)酵罐發(fā)酵1、菌種活化同實(shí)施例1
2、種子制備將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的被孢霉的孢子用無菌水加玻璃珠振蕩洗脫后，通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中。種子培養(yǎng)基配方為6.0％(w/v)玉米淀粉水解糖，0.5％(w/v)酵母膏，0.3％(w/v)牛肉膏。搖瓶種子培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為150rpm，培養(yǎng)溫度為25℃，振蕩培養(yǎng)時間為3天。然后再轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
3、5L發(fā)酵罐發(fā)酵采用B.Brown公司5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的裝量為3.5L，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)玉米粉水解糖中含葡萄糖50，酵母膏5，牛肉膏3，硝酸鈉3.5，K2HPO4.3H2O 3.5，MgSO4.7H2O 1.0，pH調(diào)至6.5，并加入0.3％的泡敵。按10％(V/V)接種量將菌種從2中的種子搖瓶接入5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐電機(jī)攪拌轉(zhuǎn)速150rpm，空氣流量0.3VVM，培養(yǎng)溫度控制在23℃，從第3到第5天采用流加方式補(bǔ)充葡萄糖10g/L/天和硝酸鈉2g/L/天，共培養(yǎng)8天，收獲菌體并分析發(fā)酵結(jié)果獲得菌體量30.2g/L，油脂含量36.1％，花生四烯酸在油脂中的含量達(dá)到72.3％，二十碳五烯酸殘基含量為花生四烯酸殘基含量的3.46％，花生四烯酸產(chǎn)量達(dá)到7.88g/L。表7是實(shí)例7發(fā)酵后真菌油脂成分。
表7實(shí)例7發(fā)酵后真菌油脂成分

實(shí)施例8 5L發(fā)酵罐發(fā)酵1、菌種活化同實(shí)施例1
2、種子制備將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的被孢霉的孢子用無菌水加玻璃珠振蕩洗脫后，通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中。種子培養(yǎng)基配方為4％(w/v)紅薯淀粉水解糖，1.0％(w/v)蔗糖，50％豆芽汁。淀粉水解糖和豆芽汁的制備同實(shí)施例1。搖瓶種子培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為120rpm，培養(yǎng)溫度為22℃，振蕩培養(yǎng)時間為4天。然后再轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
3、5L發(fā)酵罐發(fā)酵采用B.Brown公司5L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的裝量為3.5L，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)紅薯淀粉水解糖中含葡萄糖50，豆餅粉蛋白4.5，硝酸鉀3.5，K2HPO4.3H2O 3.5，MgSO4.7H2O 1.0，pH調(diào)至6.0，并加入0.3％的泡敵。按12％(V/V)接種量將菌種從2中的種子搖瓶接入5L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐電機(jī)攪拌轉(zhuǎn)速60rpm，空氣流量0.8 VVM，培養(yǎng)溫度控制在24℃，從第3到第5天采用分批方式補(bǔ)充葡萄糖30g/L/天，硝酸鈉2g/L/天，共培養(yǎng)9天，收獲菌體并分析發(fā)酵結(jié)果獲得菌體量31.2g/L，油脂含量34.8％，花生四烯酸在油脂中的含量達(dá)到65.5％，二十碳五烯酸殘基含量為花生四烯酸殘基含量的3.05％，花生四烯酸產(chǎn)量達(dá)到7.11g/L。表8是實(shí)例8發(fā)酵后真菌油脂成分。
表8實(shí)例8發(fā)酵后真菌油脂成分

實(shí)施例9 100L發(fā)酵罐發(fā)酵1、菌種活化同實(shí)施例1。
2、種子擴(kuò)大將生長在PDA固體培養(yǎng)基上的被孢霉的孢子用無菌水加玻璃珠振蕩洗脫后，通過無菌操作接入裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中。種子培養(yǎng)基配方為7％(w/v)葡萄糖，45％(w/v)豆芽汁，豆芽汁制備同實(shí)施例1。搖瓶種子培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為160rpm，培養(yǎng)溫度為23℃，振蕩培養(yǎng)時間為4天。然后再轉(zhuǎn)入發(fā)酵罐中繼續(xù)發(fā)酵培養(yǎng)。
3、100L發(fā)酵罐發(fā)酵采用國產(chǎn)100L發(fā)酵罐進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵罐中培養(yǎng)基的裝量為70L，發(fā)酵培養(yǎng)基配方為(g/L)玉米粉水解糖中含葡萄糖100，豆餅汁蛋白7，硝酸鈉2.8，K2HPO4.3H2O 3.5，MgSO4.7H2O 1.0，pH調(diào)至6.5，并加入0.3％的泡敵。按10％(V/V)接種量將菌種從2中的種子搖瓶接入100L發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐電機(jī)攪拌轉(zhuǎn)速120rpm，空氣流量1.2VVM，培養(yǎng)溫度控制在23℃，第3，4，5天各補(bǔ)充葡萄糖20g/L，硝酸鉀1.5g/L，共培養(yǎng)8天，收獲菌體并分析發(fā)酵結(jié)果獲得菌體量31.3g/L，油脂含量36.4％，花生四烯酸在油脂中的含量達(dá)到70.3％，二十碳五烯酸殘基含量為花生四烯酸殘基含量的3.70％，花生四烯酸產(chǎn)量達(dá)到8.01g/L。表9為實(shí)例9發(fā)酵后真菌油脂成分。
表9實(shí)例9發(fā)酵后真菌油脂成分

在100L發(fā)酵罐又進(jìn)行了六批次生產(chǎn)穩(wěn)定性實(shí)驗(yàn)，平均菌體量為30.5g/L，油脂含量為36.2％，花生四烯酸在油脂中的含量超過67.0％，花生四烯酸產(chǎn)量超過7.0g/L，EPA含量低于花生四烯酸含量的3.7％。表明該菌種在發(fā)酵罐中發(fā)酵生產(chǎn)花生四烯酸油脂的性能穩(wěn)定，品質(zhì)好，具有重要應(yīng)用價值。
權(quán)利要求
1.一種花生四烯酸油脂，其特征在于所述的油脂由高山被孢霉Mortierella alpina菌種M0223生產(chǎn)，含有65.5-73.5％的花生四烯酸殘基，且二十碳五烯酸殘基的含量為花生四烯酸殘基含量的0.69-3.7％，其余為其他脂肪酸殘基。
2.權(quán)利要求1所述花生四烯酸油脂的制備方法，其特征在于所述的方法步驟為(1)將高山被孢霉Mortierella alpina M0223菌種培養(yǎng)活化，在裝有種子培養(yǎng)基的搖瓶中進(jìn)行種子培養(yǎng)，種子培養(yǎng)基由碳源、氮源和無機(jī)鹽組成，其中，碳源選自淀粉水解糖、葡萄糖、麥芽糖、蔗糖的一種或多種，氮源選自豆餅粉、酵母膏、蛋白胨、魚粉、豆芽汁、牛肉膏、硝酸鉀、硝酸鈉中的一種或多種，無機(jī)鹽選自磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鈉中的一種或多種；(2)將種子培養(yǎng)所得菌種接入裝有發(fā)酵培養(yǎng)基的搖瓶或者發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)基由碳源、氮源和無機(jī)鹽組成，其中，碳源選自淀粉水解糖、葡萄糖、麥芽糖、果糖、蔗糖、糊精、乳糖、半乳糖、木糖、纖維二糖、糖蜜、脂肪酸和甘油中的一種或多種，氮源選自豆餅粉、花生餅粉、酵母膏、蛋白胨、魚粉、牛肉膏、玉米漿、硝酸鉀、硝酸鈉中的一種或多種，無機(jī)鹽選自磷酸氫二鉀或磷酸二氫鉀、硫酸鎂、氯化鈣、硫酸鈉中的一種或多種；(3)發(fā)酵結(jié)束后，收集濕菌體，烘干后提取干菌體中的油脂，其中所述搖瓶種子培養(yǎng)條件為搖床轉(zhuǎn)速為80-200rpm，培養(yǎng)溫度為18-28℃，振蕩培養(yǎng)時間為3-5天；所述搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)條件為菌種接種量為每100毫升的發(fā)酵培養(yǎng)基接入5-15毫升的搖瓶種子液，搖床轉(zhuǎn)速為120-240rpm，培養(yǎng)溫度為18-28℃，從發(fā)酵培養(yǎng)的第三天到第五天采用流加補(bǔ)料或分批補(bǔ)料方式，共補(bǔ)充相當(dāng)于不高于90g/L葡萄糖的碳源和不高于9g/L硝酸鉀的氮源，共振蕩培養(yǎng)6-9天；所述發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)條件為菌種接種量按每100毫升的發(fā)酵培養(yǎng)基接入5-15毫升的搖瓶種子液接入一級發(fā)酵罐，多級發(fā)酵則將前一級發(fā)酵罐的種子液按體積比為5-15％的接種量接入下一級發(fā)酵罐中，發(fā)酵罐攪拌轉(zhuǎn)速60-150rpm，通氣量為每分鐘每升發(fā)酵液通入0.1-1.5升空氣；發(fā)酵溫度范圍18-28℃，發(fā)酵6-9天，發(fā)酵過程采用流加補(bǔ)料或分批補(bǔ)料培養(yǎng)方法從發(fā)酵的第三天到第五天共補(bǔ)充相當(dāng)于不高于90克/升的葡萄糖的碳源，以及不高于9克/升硝酸鉀的氮源。
3.權(quán)利要求2所述的花生四烯酸油脂的制備方法，其特征在于，將從干菌體中得到的粗油再進(jìn)行脫膠、堿煉、脫色、脫臭和抗氧化中的一種或多種處理，得到花生四烯酸油脂產(chǎn)品。
4.權(quán)利要求2或3所述的花生四烯酸油脂的制備方法，其特征在于，所述的種子培養(yǎng)基的配方為每百毫升含40-60克新鮮黃豆芽提取汁和3-8克的葡萄糖；種子培養(yǎng)基是通過稱取40-60克新鮮黃豆芽加水煮沸0.5-1小時過濾后，加入葡萄糖3-8克溶解后定容至100ml而制備的。
5.權(quán)利要求2或3所述的花生四烯酸油脂的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵培養(yǎng)基的配方為淀粉水解糖50-100克/升，豆餅粉汁蛋白1.5-8克/升，硝酸鉀1.5-4.5克/升，K2HPO4.3H2O 1.5-4.5克/升，MgSO4.7H2O 0.2-1.0克/升，pH5.5-7.0；所述的發(fā)酵培養(yǎng)基中，淀粉水解糖是由淀粉先采用高溫淀粉酶液化、再采用糖化酶進(jìn)行糖化的雙酶法制備的；有機(jī)氮源如豆餅粉汁是由豆餅粉采用熱水提取制備的，并且在提取過程中以碳酸鈉或氫氧化鈉維持pH在7.0-8.0范圍內(nèi)。
6.權(quán)利要求2或3所述的花生四烯酸油脂的制備方法，其特征在于，所述的發(fā)酵培養(yǎng)條件為最適發(fā)酵溫度范圍22-25℃，pH范圍5.5-6.0。
7.權(quán)利要求2或3所述的花生四烯酸油脂的制備方法，其特征在于，所述淀粉水解糖的淀粉來源包括玉米粉、紅薯粉、小麥粉和土豆粉中的一種或多種。
8.權(quán)利要求2或3所述的花生四烯酸油脂的制備方法，其特征在于，所述發(fā)酵過程中采用變溫控制，即在發(fā)酵的第3至5天前，發(fā)酵溫度控制在24-28℃范圍；在發(fā)酵到第3至5天以后，發(fā)酵溫度控制在18-22℃范圍。
全文摘要
花生四烯酸油脂及其微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法涉及微生物發(fā)酵生產(chǎn)方法，克服產(chǎn)品花生四烯酸含量低，成本高的不足，增強(qiáng)生產(chǎn)穩(wěn)定性和食用安全。所述花生四烯酸油脂利用高山被孢霉Mortierella alpina M0223生產(chǎn)，花生四烯酸殘基含量65.5－73.5％，二十碳五烯酸殘基含量為花生四烯酸殘基含量的0.69－3.7％。本方法步驟為菌種培養(yǎng)活化，種子培養(yǎng)，菌種接入搖瓶或者發(fā)酵罐發(fā)酵培養(yǎng)，收集濕菌體，烘干后提取油脂。本發(fā)明大大提高了產(chǎn)品品質(zhì)，降低了成本，避免了人工改造菌種帶來的生產(chǎn)穩(wěn)定性和食用安全問題。本發(fā)明的油脂精制后可用作嬰幼兒營養(yǎng)強(qiáng)化劑和食品添加劑以及醫(yī)藥、化妝品原料。
文檔編號C12P7/64GK1539982SQ20031011129
公開日2004年10月27日 申請日期2003年10月28日 優(yōu)先權(quán)日2003年10月28日
發(fā)明者余龍江, 朱敏, 周蓬蓬, 吳元喜, 李為, 楊英 申請人:華中科技大學(xué), 武漢市福星生物藥業(yè)有限公司