專(zhuān)利名稱(chēng)：人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒及檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及病毒核酸的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，更具體涉及一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量檢測(cè)試劑盒，同時(shí)，本發(fā)明還涉及一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒的檢測(cè)方法，適用于人巨細(xì)胞病毒的臨床或?qū)嶒?yàn)室定量檢測(cè)，人巨細(xì)胞病毒感染的早期診斷，監(jiān)視和預(yù)測(cè)巨細(xì)胞病毒流行性，以及對(duì)療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)、評(píng)估。
背景技術(shù)：
HCMV在人群中感染非常普遍，但大多數(shù)呈臨床非顯性感染或潛伏感染，在絕大多數(shù)免疫正常個(gè)體，常呈無(wú)癥狀感染；但在免疫缺陷個(gè)體、胎兒和嬰幼兒可出現(xiàn)明顯病癥。HCMV是引起新生兒先天性感染的重要病原微生物之一。在孕婦，原發(fā)或新的HCMV復(fù)發(fā)感染均可引起新生兒宮內(nèi)感染或圍生期感染，可導(dǎo)致死胎、流產(chǎn)及先天性畸形，智力發(fā)育障礙，嚴(yán)重的可引起巨細(xì)胞包涵體病。HCMV還會(huì)引起器官移植及骨髓移植并發(fā)癥，并與一些腫瘤的發(fā)生相關(guān)。因此，早期準(zhǔn)確檢測(cè)HCMV，對(duì)防止其傳播具有重要意義。
目前HCMV的臨床檢測(cè)主要采用血清學(xué)診斷方法，即酶聯(lián)免疫檢測(cè)技術(shù)(ELISA檢測(cè))，可分別檢測(cè)抗HCMV IgM和抗HCMV IgG，前者陽(yáng)性結(jié)果表明活動(dòng)性感染，是主要的參考指標(biāo)，如同時(shí)抗HCMV IgG陰性，則表明為原發(fā)性感染；后者主要用于了解人群感染情況。ELISA法快速、簡(jiǎn)單，因此在臨床上應(yīng)用最為廣泛。但新生兒免疫保護(hù)力低，不產(chǎn)生或滯后產(chǎn)生IgM，易造成假陰性[Yan SS，F(xiàn)edorko PF.Recent advances in laboratory diagnosis of humancytomegalovirus infection[J].Clin.Applied Immunol Rev.2002，2155-167]，免疫缺陷患者免疫系統(tǒng)不健全，也易造成假陰性。同時(shí)受患兒體內(nèi)IgG和類(lèi)風(fēng)濕因子等的干擾，又易造成假陽(yáng)性。該法檢測(cè)抗體，時(shí)間上具有滯后性，當(dāng)病患被病原體感染一段時(shí)間后產(chǎn)生抗體才能檢測(cè)到；且該法只能定性，不能定量，因而需要一種更簡(jiǎn)單、快速、高靈敏度和高特異的檢測(cè)方法。
另一種CMV感染常用的檢測(cè)方法是病毒培養(yǎng)法。傳統(tǒng)的培養(yǎng)法需7-12天，改良后的方法可在16小時(shí)左右獲得結(jié)果。該法可判定CMV活動(dòng)性感染，是診斷HCMV感染的標(biāo)準(zhǔn)方法，但周期較長(zhǎng)，不適合于快速診斷。
實(shí)驗(yàn)室常用的檢測(cè)方法是PCR法，該法是一種定性檢測(cè)法，快速、成本低，但由于極易非特異性擴(kuò)增人類(lèi)基因組片段，因此假陽(yáng)性率高，在臨床上不易普及。
總之，目前已有巨細(xì)胞病毒臨床檢測(cè)方法普遍有假陽(yáng)性率、假陰性率高，靈敏度低，操作時(shí)間長(zhǎng)的缺點(diǎn)。
熒光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)發(fā)展出多個(gè)分支，可采用外參照定量方法，也可采用內(nèi)參照定量方法。擴(kuò)增后產(chǎn)物采用熒光顯示，定量方法多樣化，算法更為精確。其中最有代表性的有Taqman技術(shù)和熒光染料嵌入技術(shù)。其它熒光定量PCR技術(shù)還有雙重標(biāo)記的序列特異性熒光探針或能量信號(hào)轉(zhuǎn)移探針等。
熒光染料嵌入技術(shù)利用熒光染料SYBR Green I嵌入雙鏈DNA后熒光強(qiáng)度增加的特性，將熒光信號(hào)帶入雙鏈DNA，以熒光強(qiáng)度的變化率顯示擴(kuò)增產(chǎn)物的量。優(yōu)點(diǎn)是廣譜適用于所有雙鏈DNA，缺點(diǎn)是特異性不高。
Taqman探針采用雙熒光標(biāo)記技術(shù)，其5’端標(biāo)記報(bào)告基團(tuán)(R)，3’端標(biāo)記淬滅基團(tuán)(Q)。其中報(bào)告基團(tuán)與淬滅基團(tuán)在探針完整的條件下會(huì)產(chǎn)生熒光能量轉(zhuǎn)移現(xiàn)象，即報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)產(chǎn)生的熒光會(huì)被淬滅基團(tuán)完全吸收，表現(xiàn)為報(bào)告基團(tuán)受激發(fā)后不能產(chǎn)生熒光的現(xiàn)象。而若PCR擴(kuò)增過(guò)程中有特異靶基因存在，標(biāo)記探針在退火過(guò)程中與目標(biāo)基因特異性結(jié)合，PCR延伸過(guò)程中，當(dāng)引物延伸到探針位置時(shí)，Taq酶便以其5’-3’外切酶的活性將探針酶解，從而使5’端的報(bào)告基團(tuán)擺脫了3’端淬滅基團(tuán)的抑制，恢復(fù)熒光特性，其熒光強(qiáng)度隨擴(kuò)增過(guò)程而動(dòng)態(tài)增強(qiáng)，據(jù)此構(gòu)成定量體系。在擴(kuò)增過(guò)程中，或擴(kuò)增完成后，只要通過(guò)適當(dāng)?shù)脑O(shè)備檢測(cè)產(chǎn)物的熒光強(qiáng)度即可推算出擴(kuò)增產(chǎn)物的量，實(shí)現(xiàn)實(shí)時(shí)跟蹤自動(dòng)化檢測(cè)或終點(diǎn)分析PCR檢測(cè)的目的。
在定量計(jì)算的方法上，Martell等將熒光量增至擴(kuò)增前10倍時(shí)所進(jìn)行的循環(huán)數(shù)定為CT點(diǎn)[Maril Martell，et al.J Clin Microbiol，1999；37(2)327-332]。PCR條件相同時(shí)，模板量越高，CT值越低，CT值與模板量的對(duì)數(shù)值呈線形關(guān)系，依據(jù)CT值用已知濃度的DNA或RNA制作標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒，該試劑盒準(zhǔn)確、靈敏、快速的檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種人巨細(xì)胞熒光定量試劑盒的檢測(cè)方法，方法簡(jiǎn)便，操作時(shí)間短，對(duì)病毒感染早期準(zhǔn)確診斷。
為了達(dá)到上述任務(wù)，本發(fā)明采取以下技術(shù)措施一種用于快速檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒的熒光定量PCR試劑盒，它包括a)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板；b)陰性參控品；c)陽(yáng)性參控品；d)Taq DNA聚合酶；e)PCR引物和特異性熒光探針；f)熒光定量反應(yīng)液；g)DNA提取液。
標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板是含有插入人巨細(xì)胞病毒136個(gè)核苷酸特異序列的pMD18-T載體質(zhì)粒。pMD18-T載體購(gòu)自TaKaRa公司，由該公司經(jīng)pUC18載體改建而成，是一種高效克隆PCR產(chǎn)物的專(zhuān)用載體，具有同pUC18載體完全相同的功能，且能大大提高PCR產(chǎn)物的連接、克隆效率。將人巨細(xì)胞病毒136個(gè)堿基克隆到該載體中，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α增殖后用堿裂解法提取[具體實(shí)驗(yàn)條件和方法見(jiàn)J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)]，經(jīng)DNA純化試劑盒純化(購(gòu)自Clonetec公司)，用分光光度計(jì)測(cè)A260定量并稀釋至1×1010拷貝/μl，-20℃保存。其中，插入的人巨細(xì)胞病毒136個(gè)堿基序列為1 GACTATCCCT CTGTCCTCAG TAATTGTGGC TGAGAACAGT GATCAGGAAG51 AAAGTGAGCA GAGTGATGAG GAAGAGGAGG AGGGTGCTCA GGAGGAGCGG101 GAGGACACTG TGTCTGTCAA GTCTGAGCCA GTGTCT.
并在其中選擇了一對(duì)PCR引物，和一條熒光探針，探針位于一對(duì)PCR引物之間，熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液中鎂離子在每個(gè)反應(yīng)體系中終濃度為0.2-10mM，Taq酶用量為1-7單位/反應(yīng)。
陰性參控品是指陰性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，最好是經(jīng)確證的陰性血清，也可用無(wú)菌雙蒸水替代。
陽(yáng)性參控品是指陽(yáng)性質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)品，是人巨細(xì)胞病毒AD169株經(jīng)人胚肺成纖維細(xì)胞增殖后的培養(yǎng)物凍干粉，使用前用無(wú)菌雙蒸水溶解。
熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液中鎂離子在每個(gè)反應(yīng)體系中終濃度為0.2-10mM，Taq酶(購(gòu)自華美公司)用量為1-7單位/反應(yīng)。
PCR引物和熒光探針是根據(jù)人巨細(xì)胞病毒Towne株Major IE基因exon4序列區(qū)段設(shè)計(jì)，上游始于987堿基處，下游終止于1122堿基處1 GACTATCCCT CTGTCCTCAG TAATTGTGGC TGAGAACAGT GATCAGGAAG51 AAAGTGAGCA GAGTGATGAG GAAGAGGAGG AGGGTGCTCA GGAGGAGCGG101 GAGGACACTG TGTCTGTCAA GTCTGAGCCA GTGTCT.
根據(jù)上述136堿基序列選擇了一對(duì)PCR引物和一條熒光探針，熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，3’端標(biāo)記的熒光受體基團(tuán)為ROX。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，PCR引物序列為引物15’GACTATCCCTCTGTCCTCAGTA 3’，引物25’AGACACTGGCTCAGACTTGA 3’.
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，熒光探針為5’cctcatcactctgctcactttcttc 3’.
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，熒光定量反應(yīng)液由PCR 10×buffer 2μl，10μmol/LPCR引物1和引物2各0.5μl，25mmol/L MgCl25μl，2.5mmol/L dNTPs 1.2μl，無(wú)菌雙蒸水4.1μl組成。
在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，裂解液包括10mM尿素，6M鹽酸胍，10mMTrisHCl(pH4.4)，20％TritonX-100在本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選方案中，定量PCR條件為1.95℃ 0-20秒；2.94℃ 15-20秒，50℃ 20-30秒，72℃ 20秒，40循環(huán)。
該試劑盒的檢測(cè)方法包括以下步驟
a、雙蒸水溶解陽(yáng)性參控品；b、使用DNA提取液分別從待測(cè)標(biāo)本、陰性參控品、溶解的陽(yáng)性參控品中提取人巨細(xì)胞病毒核酸；c、分別取步驟b中的核酸、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和雙蒸水，加入到含有Taq DNA聚合酶、PCR引物和特異性熒光探針、熒光定量反應(yīng)液，目的是組成PCR反應(yīng)體系d、使用熒光定量檢測(cè)儀對(duì)c中的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)檢測(cè)，目的是測(cè)定循環(huán)域值；e、通過(guò)比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的循環(huán)域值而對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量，該步驟由儀器自動(dòng)完成或操作員手動(dòng)完成。
本發(fā)明提供的用于檢測(cè)人巨細(xì)胞病毒的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒，適用于適用于人巨細(xì)胞病毒的臨床或?qū)嶒?yàn)室定量及定性檢測(cè)，人巨細(xì)胞病毒感染的早期診斷，監(jiān)視和預(yù)測(cè)巨細(xì)胞病毒流行性，以及對(duì)療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)、評(píng)估。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有以下優(yōu)點(diǎn)和效果1、定量準(zhǔn)確。與傳統(tǒng)的ELISA法、病毒培養(yǎng)法或PCR法等定性方法比較，該試劑盒的優(yōu)勢(shì)在于可以準(zhǔn)確定量檢測(cè)病毒核酸。
2、靈敏度及特異性高。由于采用了一對(duì)特異性引物和一條特異性探針的“雙保險(xiǎn)”設(shè)計(jì)，靈敏度及特異性均較常規(guī)法大大提高。應(yīng)用該技術(shù)可比病毒培養(yǎng)法及ELISA法更早檢測(cè)到病毒感染，甚至在出現(xiàn)臨床癥狀之前即可檢測(cè)。
3、檢測(cè)速度快，僅1小時(shí)，加上核酸的提取，共僅需3-4小時(shí)；4、步驟簡(jiǎn)單；5、可同時(shí)進(jìn)行高通量的樣品檢測(cè)；具體實(shí)施方式
下列實(shí)施例中未注明具體實(shí)驗(yàn)條件和方法，通常按照常規(guī)條件如J.薩姆布魯克等主編，科學(xué)出版社，1992，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南(第二版)；D.L.斯佩克特等，科學(xué)出版社，2001，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)指南；呂鴻聲，科學(xué)出版社，1982，或接照制造廠商所建議的條件。
實(shí)施例1人巨細(xì)胞病毒的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒組成及配制1.PCR引物序列為引物15’GACTATCCCTCTGTCCTCAGTA 3’，22bases引物25’AGACACTGGCTCAGACTTGA3’，20bases2.熒光探針序列為5’cctcatcactctgctcactttcttc 3’，25bases定量PCR擴(kuò)增片段長(zhǎng)136bp。
3.10×PCR buffer50mM Tris-HCl(pH8.0)、250mM KCl、1mg/ml明膠
4.熒光定量反應(yīng)液(每人份)10×PCR buffer2μldNTPs(2.5mM) 1.2μlMgCl2(25mM) 5μlPCR引物1(10μM) 0.5μlPCR引物2(10μM) 0.5μl雙蒸水4.1μl總量 13.3μl5.標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的制備實(shí)驗(yàn)室細(xì)胞增殖HCMV標(biāo)準(zhǔn)株AD169，待出現(xiàn)明顯的致細(xì)胞病變效應(yīng)后，提取DNA，選用PCR引物1、引物2進(jìn)行PCR反應(yīng)，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性3min；95℃ 15s，50℃ 25s，70℃30s，擴(kuò)增30個(gè)循環(huán)；72℃ 7min延伸。將產(chǎn)物克隆到pMD18-T載體(購(gòu)自TaKaRa公司)，大腸桿菌DH5α中增殖，測(cè)序驗(yàn)證。提取質(zhì)粒，紫外分光光度計(jì)定量，稀釋至1×1010拷貝/μl，-20℃保存。使用時(shí)系列稀釋為1×105拷貝/μl、1×104拷貝/μl、1×103拷貝/μl。
6.陰性參控品取HCMV陰性血清，經(jīng)ELISA測(cè)定為陰性，采用引物1、引物2 PCR檢查也為陰性。
7.陽(yáng)性參控品取HCMV陽(yáng)性血清，經(jīng)ELISA測(cè)定為陽(yáng)性，采用引物1、引物2 PCR檢查也為陽(yáng)性。
8.DNA提取液1)裂解液10mM尿素，6M鹽酸胍，10mMTrisHCl(pH4.4)，20％TritonX-1002)蛋白酶K購(gòu)自Merk公司，溶解為20mg/ml3)玻璃奶購(gòu)自Pharmarcia公司4)抑制劑去除液5M鹽酸胍，20mM TrisHCl(pH6.6)，加乙醇至36％(V/V)5)洗滌液1mMEDTA，20mM TrisHCl(pH6.6)，加乙醇至70％(V/V)實(shí)施例2人巨細(xì)胞病毒的熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)臨床血清其檢測(cè)步驟如下a、雙蒸水溶解陽(yáng)性參控品；b、使用DNA提取液分別從待測(cè)血清標(biāo)本、陰性參控品、溶解的陽(yáng)性參控品中提取人巨細(xì)胞病毒核酸；DNA提取1)1.5ml離心管加入200μl血清(或陰性參控品，又或陽(yáng)性參控品)，200μl裂解液及50μl蛋白酶K(20mg/ml)，立即混勻。
2)72℃水浴10分鐘。
3)加入玻璃奶10μl，搖勻，室溫放置5分鐘。
4)30秒最大轉(zhuǎn)速離心，去上清。
5)加入抑制劑去除液500μl，搖勻。
6)30秒最大轉(zhuǎn)速離心，去上清。
7)加入洗液450μl，搖勻。
8)30秒最大轉(zhuǎn)速離心，去上清。
9)重復(fù)步驟7)、8)一次。
10)晾干離心管，加入25μl溶解液，搖勻，室溫放置5分鐘。
11)1分鐘最大轉(zhuǎn)速離心，收集上清。
c、分別取步驟b中的核酸、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和雙蒸水，加入到含有Taq DNA聚合酶、PCR引物和特異性熒光探針、熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系；反應(yīng)體系熒光定量反應(yīng)液 13.3μl熒光探針(1uM) 1μlTaq酶(3U/μl) 0.7μl處理樣本上清/標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板/雙蒸水 5μl總量 20μld、使用熒光定量檢測(cè)儀對(duì)c中的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)檢測(cè)，測(cè)定循環(huán)域值；在熒光定量檢測(cè)儀上設(shè)定程序?yàn)?.95℃ 0秒，2.94℃ 18秒，50℃ 20秒72℃ 20秒，35cycles；3.40℃0秒。把熒光檢測(cè)的程序設(shè)置在每個(gè)循環(huán)的第二步結(jié)束時(shí)進(jìn)行，檢測(cè)波長(zhǎng)為530nm。將反應(yīng)管放入熒光定量檢測(cè)儀開(kāi)始反應(yīng)。
e、通過(guò)比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的循環(huán)域值而對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。定量結(jié)果軟件計(jì)算得出定量結(jié)果。根據(jù)稀釋倍數(shù)換算實(shí)際結(jié)果。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)武漢市兒童醫(yī)院<120>人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒及檢測(cè)方法<130>人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒及檢測(cè)方法<160>4<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>136<212>DNA<213>人工合成<400>1gactatccct ctgtcctcag taattgtggc tgagaacagt gatcaggaag aaagtgagca60gagtgatgag gaagaggagg agggtgctca ggaggagcgg gaggacactg tgtctgtcaa120gtctgagcca gtgtct136<210>2<211>22<212>DNA<213>人工合成<400>2gactatccct ctgtcctcag ta 22<210>3<211>20<212>DNA<213>人工合成<400>3agacactggc tcagacttga20<210>4<211>25<212>DNA<213>人工合成
<400>4cctcatcact ctgctcactt tcttc 2權(quán)利要求
1.一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒，它由標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、陰性參控品、陽(yáng)性參控品、Taq DNA聚合酶、PCR引物和特異性熒光探針、熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液、DNA提取液組成，其特征在于所述的待測(cè)巨細(xì)胞病毒特異性核酸序列為136堿基1 GACTATCCCT CTGTCCTCAG TAATTGTGGC TGAGAACAGT GATCAGGAAG51 AAAGTGAGCA GAGTGATGAG GAAGAGGAGG AGGGTGCTCA GGAGGAGCGG101 GAGGACACTG TGTCTGTCAA GTCTGAGCCA GTGTCT.并在其中選擇了一對(duì)PCR引物，和一條熒光探針，探針位于一對(duì)PCR引物之間，熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液中鎂離子在每個(gè)反應(yīng)體系中終濃度為0.2-10mM，Taq酶用量為1-7單位/反應(yīng)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒，其特征在于所述的PCR引物序列為引物15’GACTATCCCTCTGTCCTCAGTA 3’，22堿基引物25’AGACACTGGCTCAGACTTGA 3’，20堿基。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒，其特征在于所述的熒光探針的序列為5’cctcatcactctgctcactttcttc 3’，25堿基。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒，其特征在于標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板含有插入人巨細(xì)胞病毒特異序列的pMD18-T載體質(zhì)粒，所述的特異性插入序列為136堿基1 GACTATCCCT CTGTCCTCAG TAATTGTGGC TGAGAACAGT GATCAGGAAG51 AAAGTGAGCA GAGTGATGAG GAAGAGGAGG AGGGTGCTCA GGAGGAGCGG101 GAGGACACTG TGTCTGTCAA GTCTGAGCCA GTGTCT.
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒，其特征在于陰性參控品為HCMV陰性血清。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒，其特征在于陽(yáng)性參控品為巨細(xì)胞病毒AD169株細(xì)胞培養(yǎng)物凍干粉。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒，其特征在于DNA提取液包括I)裂解液尿素，鹽酸胍，TrisHCl的pH4.4，TritonX-100；II)蛋白酶K；III)玻璃奶；IV)抑制劑去除液鹽酸胍，TrisHCl的pH6.6，加乙醇至36％；V)洗滌液EDTA，TrisHCl的pH6.6，加乙醇至70％。
8.一種利用權(quán)利要求1所述的一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒檢測(cè)方法，包括以下步驟a、雙蒸水溶解陽(yáng)性參控品；b、使用DNA提取液分別從待測(cè)標(biāo)本、陰性參控品、溶解的陽(yáng)性參控品中提取人巨細(xì)胞病毒核酸；c、分別取步驟b中的核酸、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板和雙蒸水，加入到含有Taq DNA聚合酶、PCR引物和特異性熒光探針、熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系；d、使用熒光定量檢測(cè)儀對(duì)c中的反應(yīng)體系進(jìn)行PCR循環(huán)檢測(cè)，測(cè)定循環(huán)域值；e、通過(guò)比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板的循環(huán)域值而對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量。
全文摘要
本發(fā)明公開(kāi)了一種人巨細(xì)胞病毒熒光定量試劑盒及檢測(cè)方法，該試劑盒包括標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、陰性參控品、陽(yáng)性參控品、Taq DNA聚合酶、PCR引物和特異性熒光探針、熒光聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)液、DNA提取液。該試劑盒從血清中提取人巨細(xì)胞病毒DNA，采用一對(duì)特異性引物及一條特異性熒光標(biāo)記探針在定量PCR儀上反應(yīng)，同時(shí)進(jìn)行定量檢測(cè)。利用該試劑盒及方法可準(zhǔn)確、快速、有效、方便地對(duì)人巨細(xì)胞病毒進(jìn)行定性及定量檢測(cè)，對(duì)病毒感染進(jìn)行早期診斷，監(jiān)視和預(yù)測(cè)巨細(xì)胞病毒流行性，以及對(duì)療效進(jìn)行監(jiān)測(cè)、評(píng)估。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1544655SQ20031011138
公開(kāi)日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月14日
發(fā)明者張楚瑜, 鄒俊煊, 游上游 申請(qǐng)人:武漢大學(xué), 武漢市兒童醫(yī)院