專利名稱：人呼吸道合胞病毒熒光定量pcr試劑盒及其檢測(cè)方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于病毒核酸的檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種人呼吸道合胞病毒熒光定量PCR試劑盒，同時(shí)，本發(fā)明還涉及一種熒光定量PCR試劑盒檢測(cè)人呼吸道合胞病毒的方法，熒光定量PCR是通過(guò)實(shí)時(shí)監(jiān)控收集PCR體系中的熒光信號(hào)，對(duì)樣品中的初始模板進(jìn)行定量，可廣泛應(yīng)用于醫(yī)學(xué)、生物學(xué)等相應(yīng)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
呼吸道合胞病毒感染是僅次于流行性感冒病毒感染的一種常見的急性呼吸道疾病，如嬰幼兒重癥肺炎和毛細(xì)支氣管炎。近年來(lái)由于抗生素的廣泛應(yīng)用，細(xì)菌性呼吸道感染率降低，使得人的急性呼吸道感染病例中90％以上是由病毒引起，以病毒性肺炎和毛細(xì)支氣管炎為特征。我國(guó)調(diào)查資料表明，肺炎是城鄉(xiāng)嬰幼兒死亡的首要原因，占兒童死亡率的20％。每年45％-50％住院的嬰幼兒毛細(xì)支氣管炎及25％嬰幼兒肺炎是由呼吸道合胞病毒直接感染所致。
呼吸道合胞病毒有A和B兩個(gè)亞型，亞型之間各基因變異比較大，暴發(fā)性流行時(shí)以某一亞型占優(yōu)勢(shì)，具有地域性的特點(diǎn)。流行開始的預(yù)兆是住院兒童中毛細(xì)支氣管炎和肺炎人數(shù)大量增多，尤其是小于6個(gè)月的嬰幼兒占多數(shù)。流行期間1歲以內(nèi)兒童50％被感染。我國(guó)很多省、市都有流行報(bào)道。在流行季節(jié)，醫(yī)院內(nèi)的工作人員有60％感染，并攜帶和傳播呼吸道合胞病毒。兒科病房和嬰兒室有45％通過(guò)醫(yī)生、護(hù)士攜帶病毒引起感染。幼兒園和家庭也是傳播場(chǎng)所之一。
呼吸道合胞病毒通過(guò)鼻、眼表面粘膜接觸感染，病毒在呼吸道粘膜上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞中復(fù)制，無(wú)病毒血癥。易感者為3歲以內(nèi)的嬰幼兒。6周到6個(gè)月以內(nèi)的嬰幼兒感染后，25％-40％發(fā)展成嚴(yán)重的下呼吸道疾病，其中引起肺炎和支氣管炎占5％-40％，毛細(xì)支氣管炎占50％-90％。嬰幼兒是呼吸道合胞病毒感染的高危人群，如為早產(chǎn)兒、新生兒、有先天性心臟病、肺支氣管發(fā)育異常、免疫缺陷、艾滋病患兒等，病死率增高達(dá)37％，平均為3％-5％。值得注意的是出生后1-3周的新生兒、早產(chǎn)兒感染后不表現(xiàn)臨床癥狀，突發(fā)性發(fā)作成典型的毛細(xì)支氣管炎，常常誤診，病死率更高。
目前呼吸道合胞病毒的臨床檢驗(yàn)常用病毒分離培養(yǎng)法、免疫學(xué)方法和普通RT-PCR法。病毒分離培養(yǎng)雖有“金色指標(biāo)”之稱，但其技術(shù)復(fù)雜、費(fèi)時(shí)長(zhǎng)(通常需1周)，而且其靈敏度容易受病毒不穩(wěn)定性的影響，不適合用于早期診斷。免疫學(xué)方法雖能達(dá)到快速診斷目的，但其靈敏度和特異性變化較大，容易出現(xiàn)假陽(yáng)性，且某些底物具有致癌作用，使臨床應(yīng)用受到一定限制。普通RT-PCR法只能定性或半定量檢測(cè)，無(wú)法評(píng)價(jià)治療方案的效果，且操作步驟繁瑣，技術(shù)要求高，易造成產(chǎn)物污染，出現(xiàn)假陽(yáng)性，無(wú)法標(biāo)準(zhǔn)化，不利推廣。
近年來(lái)發(fā)展起來(lái)的熒光定量PCR(Fluorogenetic Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR)技術(shù)以其靈敏度高、速度快、特異性強(qiáng)等優(yōu)點(diǎn)，已在病原體的定性檢測(cè)(McGoldrick A，Lowings J P，Ibata G，et al.A Novel Approach to the Detectlon ofClassical Swine Fever Virus by RT-PCR wih a Fluorogenic Probe(TaoMan)[J].JVirol Methods，1998，72125-135；Bhudevi B，Weinstock D.Fluorogenic RT-PCRassay(TaqMan)for Detection and Classification of Bovine Viral Diarrhea Virus[J].Vet.Microbiol.，2001，831-10)、定量檢測(cè)(Desire N，Dehee A，Schneider V，etal.Quantification of Human Immunodeficiency Virus Type 1 Proviral Load by aTaqMan Real-Time PCR Assay[J].J.Clin.Microbiol，2001，391303-1310；MartellM，Gomez J，Esteban JI，et al.High-Throughput Real-Time ReverseTranscription-PCR Quantitation of Hepatitis C Virus RNA[J].J.Clin.Microbiol，1999，37327-332；Kearns AM，Turner AJL，Eltringham GJA，et al.Rapid Detectionand Quantification of CMV DNA in Urine using Lightcycler-based Real-time PCR[J].J.Clin.Virol，2002，24131-134；Florence KP，Glaucia PB，Mireille S，et al.Quantitation of HCV RNA using real-time PCR and fluorimetry[J].J.Virol.Methods，2001，95111-119)、腫瘤基因檢測(cè)(Gelmini S et al.Clin Chem.1997，43(5)752-758；Bieche I et al.Int J Cancer.1998，78(5)661-666)、免疫分析(Lang R et al.J Immunol Methods.1997，203(2)181-192)、基因表達(dá)水平分析(Hirayama Yetal.Blood，1998，92(1)46-52；Shimokama T et al.Biochem Biophys Res Commun，1998，246(1)287-292；Nellemann C，Vinggaard AM，Dalgaard M，et al.Quantification of Antiandrogen Effect Determined by LightCycler Technology[J].Toxicology，2001，16329-38)及其多態(tài)性(Ibrahim MS et al.Mol Cell Probes，1997，11(2)143-147)的研究等多個(gè)領(lǐng)域得到應(yīng)用。對(duì)感染者體內(nèi)病毒活性的直接檢測(cè)和定量研究，不僅對(duì)于了解患病程度，預(yù)測(cè)、評(píng)價(jià)治療效果有十分重要意義，同時(shí)也使對(duì)病毒感染發(fā)病機(jī)制的研究進(jìn)入量化階段，而且對(duì)新藥的研究與試用等極為重要。國(guó)外在相關(guān)的這些方面研究很多，但僅停留在實(shí)驗(yàn)室研究階段。經(jīng)檢索尚無(wú)檢測(cè)人呼吸道合胞病毒的熒光定量PCR試劑盒的開發(fā)與應(yīng)用。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的在于提供了一種人呼吸道合胞病毒熒光定量PCR試劑盒，能快速、靈敏、準(zhǔn)確的檢測(cè)人呼吸道合胞病毒。
本發(fā)明的另一個(gè)目的在于提供了一種熒光定量PCR呼吸道合胞病毒檢測(cè)方法，該方法簡(jiǎn)便，檢測(cè)速度快，操作方便安全，省時(shí)效率高。
本發(fā)明的熒光定量PCR試劑盒在快速定量檢測(cè)人呼吸道合胞病毒中可廣泛應(yīng)用。
為了解決上述任務(wù)，本發(fā)明采取以下措施一種快速定量檢測(cè)人呼吸道合胞病毒的熒光定量PCR試劑盒，該試劑盒包括(a)RNA提取液，(b)逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV(10-1000U每個(gè)反應(yīng)體系)(c)RNA酶抑制劑RNasin(10-100U每個(gè)反應(yīng)體系)，(d)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，(e)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，(f)HotStart Taq DNA聚合酶(1-10U每個(gè)反應(yīng)體系)，(g)熒光定量反應(yīng)液，(h)標(biāo)準(zhǔn)陰性參控液。該試劑盒中的(a)RNA提取液使用Trizol一步法；(d)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液含有引物P1(濃度0.1-10umol/L)5’TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT 3’，RT5×buffer，dNTPs(濃度0.1-10mmol/L)，滅菌雙蒸水；(e)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板是含有人呼吸道合胞病毒核衣殼N蛋白基因3’端195個(gè)堿基片段SEQ ID NO.1與PGEM-T Easy載體構(gòu)成的PGEMT195重組質(zhì)粒，SEQ ID NO.1序列為5’TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGATACACTCAACAAAGATCAACTTCTGTCATCCAGCAAATACACCATCCAACGGAGCACAGGAGATAGTATTGATACTCCTAATTATGATGTGCAGAAACACATCAATAAGTTATGTGGCATGTTATTAATCACAGAAGATGCTAATCATAAATTCACTGGGTTAATAGGTATGT 3’，該質(zhì)粒轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α增殖后用超純質(zhì)粒提取試劑盒提取純化，用紫外分光光度計(jì)測(cè)A260定量并稀釋至1×107拷貝/uL，-20℃保存，使用前10倍稀釋至1×106拷貝數(shù)/uL、1×105拷貝數(shù)/uL、1×104拷貝數(shù)/uL。(g)熒光定量反應(yīng)液含有引物P1(0.1-10umol/L)5’TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT 3’，引物P2(0.1-10umol/L)5’ACATACCTATTAACCCAGTGAAT3’和熒光探針FP(0.01-10umol/L)5’FAM-TCATCCAGCAAAT(TAMRA)ACACCATCCAACG 3’，熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)是FAM，5’和3’中間標(biāo)記有熒光淬滅基團(tuán)TAMRA，以及MgCl2(0.1-10mmol/L)，dNTPs(0.1-10mmol/L)，滅菌雙蒸水(h)標(biāo)準(zhǔn)陰性參控液只含有(f)和(g)。
根據(jù)本發(fā)明提供的試劑盒，按照熒光定量PCR試劑盒對(duì)人呼吸道合胞病毒進(jìn)行檢測(cè)的方法，該方法包括下列步驟(1)用(a)RNA提取液從濃縮過(guò)的待測(cè)標(biāo)本咳痰抽提液、鼻拭子抽提液或咽拭子抽提液中提取RNA，然后加(b)逆轉(zhuǎn)錄酶，(c)RNA酶抑制劑和(d)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；(2)將(e)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板10倍稀釋至1×106拷貝數(shù)/uL、1×105拷貝數(shù)/uL、1×104拷貝數(shù)/uL。
(3)分別取第(1)步中的cDNA和第(2)步中稀釋好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，加入到含(f)Taq DNA聚合酶和(g)熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中與(h)標(biāo)準(zhǔn)陰性參控液一起用熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行PCR檢測(cè)；(4)通過(guò)比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值而對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量；在定量PCR儀自帶軟件給出的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)濃度。
在本發(fā)明提供檢測(cè)呼吸道合胞病毒的熒光定量PCR試劑盒中，有一條兩端標(biāo)記有熒光基團(tuán)和淬滅基團(tuán)的特異性熒光探針，在探針完整時(shí)，兩基團(tuán)在空間結(jié)構(gòu)上距離相互靠近，5’端熒光報(bào)告基團(tuán)產(chǎn)生的熒光因?yàn)闊晒夤舱衲芰哭D(zhuǎn)移(FRET)而被3’端淬滅基團(tuán)淬滅，故體系中沒有熒光信號(hào)的變化。在PCR退火和延伸過(guò)程中，探針與模板特異性結(jié)合，隨引物的延伸，Taq DNA聚合酶利用其5’→3’外切酶活性對(duì)探針進(jìn)行切割，釋放出報(bào)告基團(tuán)，破壞了兩基團(tuán)之間的FRET，從而脫離了3’端熒光淬滅基團(tuán)的屏蔽，報(bào)告基團(tuán)所釋放的熒光可以被內(nèi)置在定量檢測(cè)儀內(nèi)的熒光計(jì)檢測(cè)，熒光量的增加與PCR產(chǎn)物的積累量呈比例關(guān)系。對(duì)HRSV的定量可通過(guò)與標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值(Ct，Threshold Cycle)相比較得出。Ct值與起始模數(shù)呈一定比例關(guān)系，Ct值越小，起始模板數(shù)越多，相反，Ct值越大，起始模板數(shù)越少。利用陽(yáng)性梯度標(biāo)準(zhǔn)模板的Ct值制成標(biāo)準(zhǔn)曲線，再根據(jù)待測(cè)樣品的Ct值可準(zhǔn)確測(cè)出該樣品的起始拷貝數(shù)。
在本發(fā)明提供檢測(cè)呼吸道合胞病毒的熒光定量PCR試劑盒中，針對(duì)呼吸道合胞病毒檢測(cè)中的特殊性，對(duì)不同的靶片段進(jìn)行反應(yīng)體系(引物和探針濃度、Mg2+濃度、退火溫度等)的優(yōu)化，并將FQ-PCR技術(shù)和定量檢測(cè)系統(tǒng)相結(jié)合，將其用于人呼吸道合胞病毒的定量檢測(cè)。通過(guò)優(yōu)化方案，反復(fù)實(shí)驗(yàn)，建立了定量檢測(cè)HRSV的方法，并研制出人呼吸道合胞病毒定量檢測(cè)的試劑盒，該試劑盒的靈敏度可在每個(gè)反應(yīng)體系中檢出10個(gè)病毒粒子。
本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有下列優(yōu)點(diǎn)(1)特異性更強(qiáng)，靈敏度更高。由于多使用了一條可與模板互補(bǔ)配對(duì)的熒光探針，提高了特異性，而且所設(shè)計(jì)的引物和探針與HRSV特異性結(jié)合，與其他呼吸道病毒無(wú)明顯的同源性，特異性極高，且適合于檢測(cè)各種亞型的HRSV(A、B亞型)。另外由自動(dòng)化儀器收集熒光信號(hào)，避免了肉眼判斷的主觀性，結(jié)果可靠，又進(jìn)一步提高了靈敏度，即使僅存在單個(gè)拷貝的目的片段液可得到有效的檢測(cè)。
(2)全封閉反應(yīng)，無(wú)須PCR后處理，避免污染，保證了結(jié)果的可靠可重復(fù)。
(3)分析PCR產(chǎn)物的對(duì)數(shù)期，摒棄常規(guī)PCR受多因素干擾的終點(diǎn)分析法，使得定量更準(zhǔn)確可靠，而且定量范圍可寬達(dá)10個(gè)數(shù)量級(jí)。
(4)在線式實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)熒光，結(jié)果客觀又直觀。
(5)可實(shí)現(xiàn)單管雙檢或多檢，還可設(shè)計(jì)針對(duì)性內(nèi)標(biāo)，監(jiān)控模板抽提效率及排除抑制劑干擾。
(6)不接觸有毒試劑，操作安全，省時(shí)高效。
(7)檢測(cè)速度快，約需1小時(shí)，加上核酸的提取，總共僅需3-4小時(shí)。
(8)可以同時(shí)進(jìn)行大批量的樣品檢測(cè)，有利于規(guī)?；詣?dòng)化。
(9)目前使用最廣的熒光定量?jī)x器主要有四種PE公司生產(chǎn)的ABI系列定量檢測(cè)儀；Roche公司生產(chǎn)的LightCycler定量檢測(cè)儀；iCycler iQ系統(tǒng)，BioRad公司；Corbett公司的Rotor Gene系統(tǒng)。這四種檢測(cè)系統(tǒng)均可以用TaqMan類型的探針，從而使得我們所設(shè)計(jì)的含有TaqMan探針的檢測(cè)試劑盒能夠得到大面積的推廣使用。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1人呼吸道合胞病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒的配置(1)RNA提取液，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶(200U/uL)，dNTPs(10mM)、HotStart TaqDNA聚合酶(2.5U/uL)、RNA酶抑制劑(40U/uL)、MgCl2(25mM)。
(2)M-MLV 5×Buffer組成50mM Tris-HCl(PH8.3，25℃)、3mM MgCl2、75mM KCl、10mM DDT；(3)熒光PCR 10×Buffer組成200mM KCl、200mM Tris-HCl(PH8.4，25℃)(4)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液引物P1 2uL(10umol/L)，M-MLV 5×buffer 4uL，dNTPs3uL(10mmol/L)，滅菌雙蒸水9uL。
(5)熒光定量反應(yīng)液PCR 10×buffer 2uL，P1，P2各0.5uL(10umol/L)，熒光探針FP 1uL(1umol/L)，MgCl22uL(25mmol/L)，dNTPs 0.5uL(10mmol/L)，滅菌雙蒸水8uL。
實(shí)施例2用熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒檢測(cè)呼吸道合胞病毒(1)取離心處理過(guò)的咳痰抽提液、鼻拭子抽提液或咽拭子抽提液300μl，加入900uLRNA提取液，再加入200ul氯仿，振蕩15s，室溫孵化10min。4℃ 12000g離心10min，RNA位于上層。將上層更換至新的1.5ml的EP管，加入500ul異丙醇，-20℃下孵化10min，再室溫下12000g離心10min。棄上清，加入1ml 75％的乙醇洗RNA沉淀，振蕩混勻，4℃12000g離心3min。棄上清，37℃干燥5min。用18uL逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液溶解沉淀，從而得到病毒RNA。
(2)加入RNA酶抑制劑1uL，M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶1uL。42℃ 60min，95℃5min滅活M-MLV逆轉(zhuǎn)錄酶，得到的cDNA于4℃保存。
(3)將陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板10倍稀釋為1×106拷貝數(shù)/uL、1×105拷貝數(shù)/uL、1×104拷貝數(shù)/uL。
(4)取熒光定量PCR反應(yīng)液14.5uL，分別加0.5uL hotstrat TaqDNA聚合酶，再加入第2步所得cDNA和第3步稀釋好的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板各5uL，另外一管加(h)標(biāo)準(zhǔn)陰性參控液，在熒光定量PCR檢測(cè)儀(Rotor-Gene)上平行做PCR檢測(cè)。循環(huán)條件為94℃預(yù)變性5min；94℃ 20s，55℃ 25s，72℃ 30s，擴(kuò)增45個(gè)循環(huán)。在每個(gè)循環(huán)的第三步結(jié)束時(shí)進(jìn)行熒光檢測(cè)，檢測(cè)波長(zhǎng)為510nm。
(5)循環(huán)結(jié)束后，運(yùn)行Rotor Gene PCR檢測(cè)儀自帶軟件，讀取待檢樣品拷貝數(shù)。
(6)結(jié)果為陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)模板1×106拷貝數(shù)/uL、1×105拷貝數(shù)/uL、1×104拷貝數(shù)/uL其CT值分別為20.21、23.41、26.61。檢測(cè)的樣品的CT值為33.01，換算為每mL檢測(cè)樣品中含有2.2×103拷貝個(gè)病毒粒子。
SEQUENCE LISTING<110>武漢大學(xué)武漢市兒童醫(yī)院<120>人呼吸道合胞病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其方法<130>人呼吸道合胞病毒熒光定量PCR檢測(cè)試劑盒及其方法<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>3212<212>DNA<213>人工合成<400>1gggcgaattg ggcccgacgt cgcatgctcc cggccgccat ggcggccgcg ggaattcgat60tttagcaaag tcaagttgaa tgatacactc aacaaagatc aacttctgtc atccagcaaa120tacaccatcc aacggagcac aggagatagt attgatactc ctaattatga tgtgcagaaa180cacatcaata agttatgtgg catgttatta atcacagaag atgctaatca taaattcact240gggttaatag gtatgtaatc actagtgaat tcgcggccgc ctgcaggtcg accatatggg300agagctccca acgcgttgga tgcatagctt gagtattcta tagtgtcacc taaatagctt360ggcgtaatca tggtcatagc tgtttcctgt gtgaaattgt tatccgctca caattccaca420caacatacga gccggaagca taaagtgtaa agcctggggt gcctaatgag tgagctaact480cacattaatt gcgttgcgct cactgcccgc tttccagtcg ggaaacctgt cgtgccagct540gcattaatga atcggccaac gcgcggggag aggcggtttg cgtattgggc gctcttccgc600ttcctcgctc actgactcgc tgcgctcggt cgttcggctg cggcgagcgg tatcagctca660ctcaaaggcg gtaatacggt tatccacaga atcaggggat aacgcaggaa agaacatgtg720agcaaaaggc cagcaaaagg ccaggaaccg taaaaaggcc gcgttgctgg cgtttttcca780taggctccgc ccccctgacg agcatcacaa aaatcgacgc tcaagtcaga ggtggcgaaa840cccgacagga ctataaagat accaggcgtt tccccctgga agctccctcg tgcgctctcc900tgttccgacc ctgccgctta ccggatacct gtccgccttt ctcccttcgg gaagcgtggc960gctttctcat agctcacgct gtaggtatct cagttcggtg taggtcgttc gctccaagct1020gggctgtgtg cacgaacccc ccgttcagcc cgaccgctgc gccttatccg gtaactatcg1080tcttgagtcc aacccggtaa gacacgactt atcgccactg gcagcagcca ctggtaacag1140gattagcaga gcgaggtatg taggcggtgc tacagagttc ttgaagtggt ggcctaacta1200cggctacact agaagaacag tatttggtat ctgcgctctg ctgaagccag ttaccttcgg1260aaaaagagtt ggtagctctt gatccggcaa acaaaccacc gctggtagcg gtggtttttt1320tgtttgcaag cagcagatta cgcgcagaaa aaaaggatct caagaagatc ctttgatctt1380ttctacgggg tctgacgctc agtggaacga aaactcacgt taagggattt tggtcatgag1440attatcaaaa aggatcttca cctagatcct tttaaattaa aaatgaagtt ttaaatcaat1500ctaaagtata tatgagtaaa cttggtctga cagttaccaa tgcttaatca gtgaggcacc1560
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1.一種人呼吸道合胞病毒熒光定量PCR試劑盒，其特征是該試劑盒包括(a)RNA提取液，使用Trizol一步法；(b)逆轉(zhuǎn)錄酶M-MLV，使用濃度為10-1000U每個(gè)反應(yīng)體系；(c)RNA酶抑制劑，使用濃度為10-100U每個(gè)反應(yīng)體系；(d)逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液，使用的引物P1為5’TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT 3’，使用濃度為0.1-10umol/L，還包括有RT 5×buffer溶液，dNTPs溶液，使用的濃度為0.1-10mmol/L和無(wú)菌雙蒸水；(e)標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板，含有人呼吸道合胞病毒核衣殼N蛋白基因3’端195個(gè)堿基片段SEQ ID NO.1與PGEM-T Easy載體構(gòu)成的PGEMT195重組質(zhì)粒；(f)Hotstart Taq DNA聚合酶，使用濃度為1-10U每個(gè)反應(yīng)體系；(g)熒光定量PCR反應(yīng)液；(h)標(biāo)準(zhǔn)陰性參控液，即無(wú)模板熒光定量反應(yīng)液，由(f)和(g)組成。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人呼吸道合胞病毒熒光定量PCR試劑盒，其特征是熒光定量PCR反應(yīng)液中引物P1為5’TTAGCAAAGTCAAGTTGAATGAT 3’，使用濃度為0.1-10umol/L，引物P2為5’ACATACCTATTAACCCAGTGAAT3’，使用濃度為0.1-10umol/L，熒光探針FP為5’FAM-TCATCCAGCAAAT(TAMRA)ACACCATCCAACG 3’，使用濃度為0.01-10umol/L，熒光探針5’端標(biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)，5’與3’端之間或者3’末端標(biāo)記熒光淬滅基團(tuán)，以及PCR 10×buffer溶液，MgCl2的使用濃度為0.1-10mmol/L。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的一種人呼吸道合胞病毒熒光定量PCR試劑盒，其特征是PGEMT195重組質(zhì)粒的序列為5’GGGCGAATTGGGCCCGACGTCGCATGCTCCCGGCCGCCATGGCGGCCGCGGGAATTCGATTTTAGCAAAGTCAAGTTGAATGATACACTCAACAAAGATCAACTTCTGTCATCCAGCAAATACACCATCCAACGGAGCACAGGAGATAGTATTGATACTCCTAATTATGATGTGCAGAAACACATCAATAAGTTATGTGGCATGTTATTAATCACAGAAGATGCTAATCATAAATTCACTGGGTTAATAGGTATGTAATCACTAGTGAATTCGCGGCCGCCTGCAGGTCGACCATATGGGAGAGCTCCCAACGCGTTGGATGCATAGCTTGAGTATTCTATAGTGTCACCTAAATAGCTTGGCGTAATCATGGTCATAGCTGTTTCCTGTGTGAAATTGTTATCCGCTCACAATTCCACACAACATACGAGCCGGAAGCATAAAGTGTAAAGCCTGGGGTGCCTAATGAGTGAGCTAACTCACATTAATTGCGTTGCGCTCACTGCCCGCTTTCCAGTCGGGAAACCTGTCGTGCCAGCTGCATTAATGAATCGGCCAACGCGCGGGGAGAGGCGGTTTGCGTATTGGGCGCTCTTCCGCTTCCTCGCTCACTGACTCGCTGCGCTCGGTCGTTCGGCTGCGGCGAGCGGTATCAGCTCACTCAAAGGCGGTAATACGGTTATCCACAGAATCAGGGGATAACGCAGGAAAGAACATGTGAGCAAAAGGCCAGCAAAAGGCCAGGAACCGTAAAAAGGCCGCGTTGCTGGCGTTTTTCCATAGGCTCCGCCCCCCTGACGAGCATCACAAAAATCGACGCTCAAGTCAGAGGTGGCGAAACCCGACAGGACTATAAAGATACCAGGCGTTTCCCCCTGGAAGCTCCCTCGTGCGCTCTCCTGTTCCGACCCTGCCGCTTACCGGATACCTGTCCGCCTTTCTCCCTTCGGGAAGCGTGGCGCTTTCTCATAGCTCACGCTGTAGGTATCTCAGTTCGGTGTAGGTCGTTCGCTCCAAGCTGGGCTGTGTGCACGAACCCCCCGTTCAGCCCGACCGCTGCGCCTTATCCGGTAACTATCGTCTTGAGTCCAACCCGGTAAGACACGACTTATCGCCACTGGCAGCAGCCACTGGTAACAGGATTAGCAGAGCGAGGTATGTAGGCGGTGCTACAGAGTTCTTGAAGTGGTGGCCTAACTACGGCTACACTAGAAGAACAGTATTTGGTATCTGCGCTCTGCTGAAGCCAGTTACCTTCGGAAAAAGAGTTGGTAGCTCTTGATCCGGCAAACAAACCACCGCTGGTAGCGGTGGTTTTTTTGTTTGCAAGCAGCAGATTACGCGCAGAAAAAAAGGATCTCAAGAAGATCCTTTGATCTTTTCTACGGGGTCTGACGCTCAGTGGAACGAAAACTCACGTTAAGGGATTTTGGTCATGAGATTATCAAAAAGGATCTTCACCTAGATCCTTTTAAATTAAAAATGAAGTTTTAAATCAATCTAAAGTATATATGAGTAAACTTGGTCTGACAGTTACCAATGCTTAATCAGTGAGGCACCTATCTCAGCGATCTGTCTATTTCGTTCATCCATAGTTGCCTGACTCCCCGTCGTGTAGATAACTACGATACGGGAGGGCTTACCATCTGGCCCCAGTGCTGCAATGATACCGCGAGACCCACGCTCACCGGCTCCAGATTTATCAGCAATAAACCAGCCAGCCGGAAGGGCCGAGCGCAGAAGTGGTCCTGCAACTTTATCCGCCTCCATCCAGTCTATTAATTGTTGCCGGGAAGCTAGAGTAAGTAGTTCGCCAGTTAATAGTTTGCGCAACGTTGTTGCCATTGCTACAGGCATCGTGGTGTCACGCTCGTCGTTTGGTATGGCTTCATTCAGCTCCGGTTCCCAACGATCAAGGCGAGTTACATGATCCCCCATGTTGTGCAAAAAAGCGGTTAGCTCCTTCGGTCCTCCGATCGTTGTCAGAAGTAAGTTGGCCGCAGTGTTATCACTCATGGTTATGGCAGCACTGCATAATTCTCTTACTGTCATGCCATCCGTAAGATGCTTTTCTGTGACTGGTGAGTACTCAACCAAGTCATTCTGAGAATAGTGTATGCGGCGACCGAGTTGCTCTTGCCCGGCGTCAATACGGGATAATACCGCGCCACATAGCAGAACTTTAAAAGTGCTCATCATTGGAAAACGTTCTTCGGGGCGAAAACTCTCAAGGATCTTACCGCTGTTGAGATCCAGTTCGATGTAACCCACTCGTGCACCCAACTGATCTTCAGCATCTTTTACTTTCACCAGCGTTTCTGGGTGAGCAAAAACAGGAAGGCAAAATGCCGCAAAAAAGGGAATAAGGGCGACACGGAAATGTTGAATACTCATACTCTTCCTTTTTCAATATTATTGAAGCATTTATCAGGGTTATTGTCTCATGAGCGGATACATATTTGAATGTATTTAGAAAAATAAACAAATAGGGGTTCCGCGCACATTTCCCCGAAAAGTGCCACCTGATGCGGTGTGAAATACCGCACAGATGCGTAAGGAGAAAATACCGCATCAGGAAATTGTAAGCGTTAATATTTTGTTAAAATTCGCGTTAAATTTTTGTTAAATCAGCTCATTTTTTAACCAATAGGCCGAAATCGGCAAAATCCCTTATAAATCAAAAGAATAGACCGAGATAGGGTTGAGTGTTGTTCCAGTTTGGAACAAGAGTCCACTATTAAAGAACGTGGACTCCAACGTCAAAGGGCGAAAAACCGTCTATCAGGGCGATGGCCCACTACGTGAACCATCACCCTAATCAAGTTTTTTGGGGTCGAGGTGCCGTAAAGCACTAAATCGGAACCCTAAAGGGAGCCCCCGATTTAGAGCTTGACGGGGAAAGCCGGCGAACGTGGCGAGAAAGGAAGGGAAGAAAGCGAAAGGAGCGGGCGCTAGGGCGCTGGCAAGTGTAGCGGTCACGCTGCGCGTAACCACCACACCCGCCGCGCTTAATGCGCCGCTACAGGGCGCGTCCATTCGCCATTCAGGCTGCGCAACTGTTGGGAAGGGCGATCGGTGCGGGCCTCTTCGCTATTACGCCAGCTGGCGAAAGGGGGATGTGCTGCAAGGCGATTAAGTTGGGTAACGCCAGGGTTTTCCCAGTCACGACGTTGTAAAACGACGGCCAGTGAATTGTAATACGACTCACTATA3’共3212bp，其中下劃線代表的序列為SEQ ID NO.1(共195bp)。
4.利用權(quán)利要求1所述的一種人呼吸道合胞病毒熒光定量PCR試劑盒的檢測(cè)方法，該方法包括下列步驟(1)用RNA提取液從濃縮過(guò)的待測(cè)標(biāo)本咳痰抽提液、鼻拭子抽提液或咽拭子抽提液中提取RNA，然后加逆轉(zhuǎn)錄酶，RNA酶抑制劑和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液將病毒RNA逆轉(zhuǎn)錄成cDNA；(2)將標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板10倍稀釋至1×106拷貝數(shù)/uL、1×105拷貝數(shù)/uL、1×104拷貝數(shù)/uL；(3)分別取第(1)步中的cDNA和第(2)步中的陽(yáng)性標(biāo)準(zhǔn)品，加入到含Taq DNA聚合酶和熒光定量反應(yīng)液的PCR反應(yīng)體系中與標(biāo)準(zhǔn)陰性參控液一起用熒光定量PCR檢測(cè)儀進(jìn)行PCR檢測(cè)；(4)通過(guò)比較待測(cè)樣品和標(biāo)準(zhǔn)品的循環(huán)域值而對(duì)待測(cè)樣品的起始拷貝數(shù)進(jìn)行定量，在熒光定量PCR儀自帶軟件生成的標(biāo)準(zhǔn)曲線上找出待測(cè)樣品對(duì)應(yīng)的拷貝數(shù)濃度。
全文摘要
本發(fā)明公開了一種人呼吸道合胞病毒(HumanRespiratory Syncytial Virus，HRSV)熒光定量PCR試劑盒及其檢測(cè)方法，該試劑盒包括RNA提取液、逆轉(zhuǎn)錄酶、RNA酶抑制劑、逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)液、標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板、Taq DNA聚合酶、熒光定量反應(yīng)液和標(biāo)準(zhǔn)陰性參控液。利用該試劑盒，首先提取待測(cè)樣品中病毒總RNA，逆轉(zhuǎn)錄成cDNA，然后與標(biāo)準(zhǔn)陽(yáng)性模板一起作熒光定量PCR，根據(jù)熒光定量PCR儀器所帶的軟件計(jì)算出待測(cè)樣品中呼吸道合胞病毒的起始濃度。本發(fā)明檢測(cè)速度快，操作方便安全，省時(shí)效率高，可有效的對(duì)嬰幼兒及成人病毒性呼吸道感染患者進(jìn)行病毒RNA的檢測(cè)，從而達(dá)到了早期診斷和有效預(yù)防呼吸道合胞病毒感染。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1544656SQ20031011138
公開日2004年11月10日 申請(qǐng)日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月14日
發(fā)明者張楚瑜, 張其威, 游上游 申請(qǐng)人:武漢大學(xué), 武漢市兒童醫(yī)院