專利名稱：紫花苜蓿Na的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與應用，特別是涉及一種紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因與應用。
背景技術(shù)：
鹽脅迫主要是由Na+引起，細胞質(zhì)中過高的Na+濃度引起的離子毒害、滲透脅迫以及K+/Na+比率的不平衡使得植物新陳代謝異常，從而對大多數(shù)器官造成傷害。而Na+在植物細胞中區(qū)隔化是植物抵御鹽分脅迫、提高耐鹽性的一種重要機制。大量研究顯示鹽生植物以及較耐鹽的甜土植物液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白具有催化Na+和H+的跨膜逆向運輸功能，從而可以將細胞質(zhì)中過多Na+區(qū)隔在液泡里。而液泡膜上H+移位酶即H+-ATPase和H+-PPiase產(chǎn)生跨膜的H+電化學勢梯度為Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白提供驅(qū)動力。
Na+在液泡中累積一方面可以使過多的Na+離開代謝位點，減輕Na+對酶類和膜系統(tǒng)的傷害；另一方面，植物可以利用累積在液泡內(nèi)的Na+作為滲透調(diào)節(jié)劑，降低細胞水勢，抵抗鹽份造成的滲透脅迫，變害為利。同時鹽分在液泡中累積還是維持細胞質(zhì)中較高的K+/Na+比的最有效的機制之一。
既然液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白對植物的耐鹽性起重要的作用，因此對于植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白基因的克隆、表達、結(jié)構(gòu)與功能的分析，有利于在分子水平上詳細了解該基因，從而促進植物耐鹽基因工程的進展。目前編碼該蛋白的基因在許多鹽生植物以及一些甜土植物都已克隆出來，并且經(jīng)過功能分析顯示，其表達水平的高低對植物的耐鹽性具有重要的調(diào)節(jié)作用。在擬南芥、蕓苔、西紅柿中過表達擬南芥的液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白(AtNHX1)，獲得的轉(zhuǎn)基因植株在鹽脅迫條件，液泡中累積Na+能力水平大大上調(diào)，其耐鹽性大幅度地提高。而在非鹽脅迫條件下，轉(zhuǎn)基因植株長勢良好，沒表現(xiàn)出明顯的生長缺陷。目前含有AtNHX1基因西紅柿在美國已經(jīng)開始大面積的推廣。
紫花苜蓿作為一種較為耐鹽的甜土植物，也具有將細胞質(zhì)中過高濃度Na+區(qū)隔到液泡中的功能。研究顯示，其懸浮培養(yǎng)細胞的液泡中Na+、Cl-含量分別占到原生質(zhì)體Na+、Cl-總量的73.8％-91.2％和74％-89.4％。
發(fā)明創(chuàng)造內(nèi)容本發(fā)明的目的是提供一種紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白及其編碼基因。
本發(fā)明所提供的紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，來源于紫花苜蓿(Medicagosativa)，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
序列表中序列1由2232個堿基組成，其讀碼框為自5’端第336到第1961位堿基；序列表中序列2由541個氨基酸殘基組成。
含有本發(fā)明基因的表達載體及細胞系均屬于本發(fā)明的保護范圍。
擴增紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因中任一片段的引物對也在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。
本發(fā)明的紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因?qū)檐俎Ｄ望}分子機制研究，以及對植物耐鹽性狀的改良打下堅實的基礎，具有重要意義。


圖1為中間片段擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜圖2為3’端擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜圖3為5’端擴增產(chǎn)物凝膠電泳圖譜圖4為紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白與其它植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白同源性分析圖5為紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白與其他植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白疏水性比較圖6示PBINHX表達載體的構(gòu)建圖7為200mM的NaCl脅迫下野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥Na+含量的直方圖具體實施方式
實施例1、紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白編碼基因的獲得1.1簡并引物設計通過比較現(xiàn)已公開的植物液泡膜上Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白氨基酸的序列，尋找保守區(qū)域，并根據(jù)保守區(qū)域序列設計一對簡并引物MsNHX15’-CCACCCAT(AT)AT(AT)TT(CT)AATGC(AGC)GG(AG)TT-3’
MsNHX25’-TAAC(AT)ACACC(CG)TC(AG)CC(AG)AAGAC(AG)AG(AC)CT-3’1.2材料處理紫花苜蓿品種中苜一號(Medicago sativa L.)種子在24℃下催芽2d后，在26℃光照培養(yǎng)，每天光照12h，至兩葉一心期開始用1％(170mmol/L)NaCl脅迫處理6h，提取總RNA。
1.3 RNA的提取RNA提取參照張勁松等人的方法進行(張勁松，等.中國科學，B輯，1995，25(5)659～669)，苜蓿葉片在液氮中研碎，懸于抽提液(4mol/L硫氰酸胍中鈉，5g/l十二烷基肌氨酸，25mmol/L檸檬酸鈉，0.1mol/Lβ巰基乙醇)，混合物用酸性苯酚、氯仿抽提，上清中加入無水乙醇沉淀總RNA，再經(jīng)4mol/LLiCl懸浮RNA沉淀、氯仿抽提1次，然后用乙酸鈉/乙醇沉淀總RNA，最后將RNA溶于水中，貯存于-20℃?zhèn)溆茫?.8％的瓊脂糖檢測RNA的完整性。
1.4中間片段的擴增苜蓿cDNA合成按Promega公司M-MLV Reverse Transcriptase說明書(Promega，Cat.No.
M1701)的實驗程序合成cDNA第一鏈，反應體系為，2ug制備的RNA模板，1.0ulOligo(dT)18，5ul5×RT緩沖液，1.25uldNTP(10mmol/L)，1ulRNA酶蛋白質(zhì)抑制劑(RNAasin)，1ul逆轉(zhuǎn)錄酶，42℃反應60min，70℃變性5min，合成的cDNA貯存于-20℃?zhèn)溆谩?br> 中間片段的擴增體系為25ul，反應條件94℃變性4分鐘；94℃變性30s，56℃退火30s，72℃延伸1min，循環(huán)40次；72℃延伸5min。取5μl反應液，1.5％瓊脂糖凝膠電泳檢測。獲得一300bp左右的DNA片段(如圖1所示)。
1.5A/T克隆回收純化的PCR產(chǎn)物5ul，pMD-18T載體1ul，連接緩沖液5ul，16℃連接過夜，將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)菌體PCR、質(zhì)粒酶切鑒定含有目的片段的陽性克隆，由上海生工測序，測序結(jié)果得到SEQ ID №3。
1.5該基因cDNA全序列的獲得以獲得的cDNA片段序列為基礎，設計用于擴增3’端和5端’特異引物GSP15’-ATAACCACGGGTGCTACTTTTGC-3’GSP25’-CATAGGCACTGAGCAGACCTGTCACAACG-3’按照SMART RACE cDNA Amplification Kit(Clontech，Cat.no.K1811-1)的方法作RT-PCR。3’端的擴增的循環(huán)參數(shù)為94℃變性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，35個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴出一1500bp左右的DNA片斷(如圖2所示)。5’端的擴增循環(huán)參數(shù)為94℃變性5s，72℃延伸3min，5個循環(huán)；94℃變性5s，70℃退火10s，72℃延伸3min，5個循環(huán)；94℃變性5s，68℃退火10s，72℃延伸2min，25個循環(huán)。產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳檢測擴出一1000bp左右的DNA片段(如圖3所示)。產(chǎn)物回收純化，連接，轉(zhuǎn)化，測序，測序結(jié)果3’端序列為SEQ ID №4，5’端序列為SEQ ID №5。
借助DNA拼接軟件contig，獲得該基因的cDNA的完整序列，該序列全長為2232bp，具有SEQ ID №1的DNA序列，336-1961bp為其完整編碼區(qū)域，編碼的蛋白含有541個氨基酸殘基，具有SEQ ID №2的氨基酸殘基序列。
實施例2、紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的功能分析2.1序列比較分析用BLAST和DNAMAN軟件對克隆出紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的序列進行比較分析，結(jié)果表明紫花苜蓿液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白與擬南芥、水稻、小麥、大麥、冰葉日中花、裂葉牽牛、堿篷等液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運器具有極大的同源性(如圖4所示)。其中與裂葉牽牛InNHX1(BAB16380)有78％的同源性，與擬南芥的AtNHX1(AAD16946)有77％的同源性，與堿篷的SsNHX1(AAP15178)有77％的同源性，與冰葉日中花的AgNHX1(BAB11940)有77％的同源性，與水稻的OsNHX1(BAA83337)有74％的同源性，與大麥的HvNHX2(AA091943)有73％的同源性，與小麥的TaNHX(AAK76737)有70％的同源性。另外，如圖5所示，蛋白的疏水性分析顯示紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白與這些植物Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白具有類似的疏水結(jié)構(gòu)，具有多個跨膜結(jié)構(gòu)。說明其與這些的植物液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白具有類似功能。
2.2轉(zhuǎn)基因分析2.2.1表達載體的構(gòu)建設計引物2對引物用于構(gòu)建植物表達載體A15’-CGGAGTCCACCGATTCATCATCACGC-3’A25’-TTTGAGCTCCGTTGAATGACTTTTCACAAATC-3’B15’-atggctattgaaatgtcttctattg-3’，B25’-gcTCAACCCCATTGATTACCATTGCGT-3’，(其中下劃線分別表示BamH I，Sac I酶切位點)。
PBINHX表達載體的構(gòu)建過程如圖6所示，提取苜蓿的總RNA，用oligo(dT)18作反轉(zhuǎn)錄。反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物用引物A1，A2進行PCR，得到MsNHX1的全長cDNA，連接到pMD-18T載體上，獲得重組克隆載體，命名為pMD-NHX。以載體pMD-NHX為摸板，用引物B1和B2進行PCR擴增。用BamH I和Sac I分別雙酶切PCR產(chǎn)物和PBI21載體，回收、純化酶切產(chǎn)物。按照載體∶插入片段為1∶3的比例，取適量線性化載體PBI121和MsNHX1的cDNA片段混合，用T4DNA連接酶于16℃連接過夜，從而獲得含有MsNHX1編碼序列的重組表達載體，命名為PBINHX。
2.2.2農(nóng)桿菌感受態(tài)細胞制備及重組載體對其轉(zhuǎn)化挑取農(nóng)桿菌LBA4404單菌落接種到2ml YEB液體培養(yǎng)基(含鏈霉素125ug/ml)中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜。將過夜培養(yǎng)物500ul接種于50ml的YEB液體培養(yǎng)基中，285 000g，4℃離心5min，收集菌體200rmp振蕩培養(yǎng)至OD600為0.5左右。5 000g，4℃離心5min，收集菌體。于冰上加入10ml 0.15M的Nacl溶液懸浮細胞。5 000g，4℃離心5min，收集菌體。加入預冷的1ml 20mMCaCl重懸。取200ul感受太細胞，加入1ug表達載體DNA，冰浴30min，液氮中凍1min。37℃熱激。加入1ml的YEB液體培養(yǎng)基，28℃振蕩培養(yǎng)4h，10 000g離心30s，加入100ul的YEB重懸細胞。菌液涂布于含有100ug/mlkan和125ug/ml鏈霉素的YEB固體選擇培養(yǎng)基平板上，28℃培養(yǎng)過夜。
2.2.3真空滲透法轉(zhuǎn)化擬南芥(1)待萌發(fā)植物培養(yǎng)至莖高3-10cm時，去其頂生花序，避免傷及腋生花序，刺激腋生花序的生長。繼續(xù)生長7-9天后，即可轉(zhuǎn)化。
(2)農(nóng)桿菌在4ml YEB中活化48小時，然后將菌液倒入250ml YEB中繼續(xù)培養(yǎng)至OD600 1.2-1.8(約需48小時)。
(3)5000rpm離心10分鐘，收集菌液，用滲透培養(yǎng)基懸浮菌液至OD600＝0.8。
(4)將農(nóng)桿菌懸液倒在搪瓷盤中，將生有植物的培養(yǎng)杯倒扣其間，保證植物包括基生葉以上部分都浸沒在菌液中，中間不能有大氣泡，放入真空箱中，0.05Ba，抽真空10分鐘。
(5)放氣后，取出轉(zhuǎn)化的植物，橫放在一個塑料盤內(nèi)，用塑料蓋好，以保持濕度，閉光恒溫培養(yǎng)2天后，豎立培養(yǎng)。
(6)莢果變黃后，小心收集種子。
2.2.4陽性植株的篩選(1)制備MS(0.43％ MS鹽，3％蔗糖，1％瓊脂，用KOH調(diào)pH至5.7)選擇培養(yǎng)基。
(2)T1代種子表面消毒(2min in 70％乙醇，10min in 0.5％次氯酸鈉，無菌水2min×5次)。
(3)平鋪于含相應抗生素(40μg/ml Kan和50μg/ml的羧芐西啉鈉)的MS選擇培養(yǎng)基中，密度為1000-2000粒種子/皿。
(4)4℃春化3天，移入生長箱中(22℃恒溫，24小時光照，光強為30-40μmol.m-2.s-1)。
(5)7天后挑選轉(zhuǎn)化體，表現(xiàn)為真葉健康呈深綠色，根伸長至培養(yǎng)基中。
(6)將轉(zhuǎn)化體轉(zhuǎn)至正常的MS培養(yǎng)基中，10天后轉(zhuǎn)入土壤。
(7)收獲T2代種子，備用觀察，并做生理生化鑒定。
2.2.5轉(zhuǎn)基因植耐鹽性的鑒定(1)植株根彎勾法耐鹽性生理鑒定將野生型T2代種子經(jīng)表面消毒后，播種于正常MS培養(yǎng)基中，22℃恒溫，24小時光照，光強為30-40μmol.m-2.s-1生長5天，根長約2厘米。從中隨機選取四棵，轉(zhuǎn)移到另一MS培養(yǎng)基中，倒置培養(yǎng)，繼續(xù)生長5天，此組為對照組。隨機選取另外四棵，轉(zhuǎn)到含100mM NaCl的MS培養(yǎng)基中，180°倒置培養(yǎng)，繼續(xù)生長5天，此組為轉(zhuǎn)化組。
(2)轉(zhuǎn)基因植株的鹽脅迫處理鑒定將野生型和T3轉(zhuǎn)基因擬南芥代種子分別在1/4MS，和含100ug/ml Kan的抗性平板上萌發(fā)，在抗性平板上生長兩周后，將幼苗載入土中，在室溫中培養(yǎng)兩周后進行NaCl脅迫處理，用0、10Mm、100mM、200mM的NaCl澆灌植株，兩天澆灌一次。兩周后觀察表型。并將上述材料從培養(yǎng)土中取出，取地上部分測鮮重、干重。同時，取上述材料在70℃烘烤至恒重后稱干重，并用Z 5300型原子吸收光譜儀進行Na+含量的測定。
2.2.6結(jié)果分析(1)以根彎勾生長方法做植物耐鹽性生理鑒定，在對照組中，對于野生型和轉(zhuǎn)基因，植株倒置培養(yǎng)5天后，野生型植株根平均伸長2.1厘米，轉(zhuǎn)基因植株植株根平均伸長2.0厘米，野生型植株和轉(zhuǎn)基因植株差別并不明顯，除具有一定彎曲長度的主根外，都有比較發(fā)達的側(cè)根出現(xiàn)。而在100mM NaCl培養(yǎng)基中倒置生長5天后，野生型植株根平均伸長0.4厘米，幾乎不表現(xiàn)彎曲，也無明顯的側(cè)根出現(xiàn)；轉(zhuǎn)基因植株植株根平均伸長1.9厘米，彎曲明顯，且有明顯的側(cè)根出現(xiàn)，與對照組差別不大。說明，轉(zhuǎn)基因植株的耐鹽能力得到了部分提高。
(2)對T3轉(zhuǎn)基因擬南芥和對照擬南芥進行鹽處理兩周后，在0、10mM的NaCl鹽脅迫下，無論是野生型還是轉(zhuǎn)基因擬南芥植株長勢都很正常。但是在100mM，200mM的NaCl處理下，野生型擬南芥的根生長受到抑制，且變短變粗、分叉減少，葉片變黃，基部葉片脫落并伴有壞死。但轉(zhuǎn)基因擬南芥的根的生長情況優(yōu)于對照，沒有受到明顯的生長限制。
在鹽脅迫下，轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部分的鮮重、干重明顯高于野生型；如在100mM的NaCl處理下，與未經(jīng)鹽處理的相比，野生型擬南芥的鮮重下降了42％，而轉(zhuǎn)基因擬南芥卻僅下降約21％。
另外，在200mM的NaCl脅迫下，對照和轉(zhuǎn)基因擬南芥地上部分的Na+含量都升高，但轉(zhuǎn)基因植株中Na+含量升高更為顯著，結(jié)果如圖6所示。說明克隆出來的紫花苜蓿液泡膜Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白與基因可以增強植物的耐鹽性，可以作為植物耐鹽基因工程的侯選基因加以應用，用來改良植物的耐鹽性狀。
序列表<160>5<210>1<211>2232<212>DNA<213>紫花苜蓿(Medicago sativa)<220>
<221>CDS<222>(336)..(1961)<400>1acgcggggaa tccaacccat tgtataacaa caactaccgg agatatataa tatctctctc 60ctctaaatag aatatcgaca gagtgactca acaagattat taggagtgat aatcttccac120ggcagctcaa aaacaaacaa catccgattc atcatcacgc gttgctcgag agatacttgt180gttgatgaga tcagaaggtt cttaaaatgg acagctcaga aacataaata tctgggattc240attattacta ctggactttg aaatttggaa attcagcaat aatctcaatt tgttcttaaa300tctgcttttg aaatttgtgg agggtggacg acatc atg gct att gaa atg tct 353Met Ala Ile Glu Met Ser1 5tct att gtt tca aaa cta tca atg tta tcc act tcc gat cat gct tct 401Ser Ile Val Ser Lys Leu Ser Met Leu Ser Thr Ser Asp His Ala Ser10 15 20gtt gtt tct atg aac ttg ttt gtg gca ctt ctg tgt gct tgt att gtc 449Val Val Ser Met Asn Leu Phe Val Ala Leu Leu Cys Ala Cys Ile Val25 30 35ctt ggt cat ctt ctc gag gag aat cga tgg atg aat gaa tcc atc act 497Leu Gly His Leu Leu Glu Glu Asn Arg Trp Met Asn Glu Ser Ile Thr40 45 50gcc ctt ttg att ggt att tgc act ggt gta gtg att ttg ctg ttt agt 545Ala Leu Leu Ile Gly Ile Cys Thr Gly Val Val Ile Leu Leu Phe Ser
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權(quán)利要求
1.一種紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白，是具有序列表中SEQ ID №2氨基酸殘基序列的蛋白質(zhì)，或者是將SEQ ID №2的氨基酸殘基序列經(jīng)過一個或幾個氨基酸殘基的取代、缺失或添加且具有與SEQ ID №2的氨基酸殘基序列相同活性的由SEQ ID №2衍生的蛋白質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的蛋白質(zhì)，其特征在于所述紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白是序列表中的SEQ ID №2。
3.紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因，是下列核苷酸序列之一1)序列表中的SEQ ID №1；2)編碼序列表中SEQ ID №2蛋白質(zhì)序列的多核苷酸；3)與序列表中的SEQ ID №1限定的DNA序列具有90％以上同源性，且編碼相同功能蛋白質(zhì)的DNA序列。
4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的基因，其特征在于所述紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因是序列表中的SEQ ID №1。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的基因，其特征在于所述紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因的讀碼框為序列表中SEQ ID №1的自5’端第336到第1961位堿基。
6.含有權(quán)利要求3所述紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因的表達載體。
7.含有權(quán)利要求3所述紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因的細胞系。
8.擴增權(quán)利要求3所述紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因中任一片段的引物。
9.權(quán)利要求3所述紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因在苜蓿耐鹽分子機制研究中的應用。
10.權(quán)利要求3所述紫花苜蓿Na+/H+逆向轉(zhuǎn)運蛋白的編碼基因在植物耐鹽性狀改良中的應用。
全文摘要
本發(fā)明公開一種紫花苜蓿Na
文檔編號C12N15/29GK1634984SQ20031011293
公開日2005年7月6日 申請日期2003年12月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月26日
發(fā)明者楊青川, 吳明生, 王憑青, 康俊梅 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學院畜牧研究所