專(zhuān)利名稱(chēng)：一種微生物(sgm－1)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說(shuō)是一種微生物及其制備方法。
背景技術(shù)：
植物寄生性線(xiàn)蟲(chóng)對(duì)農(nóng)林業(yè)生產(chǎn)的為害極大，全球每年因此而造成的損失達(dá)數(shù)百億美元，在我國(guó)僅黑龍江省每年因大豆胞囊線(xiàn)蟲(chóng)(Heterodera glycines)為害造成損失近10億元人民幣。菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)是一重要的植物病原真菌，可侵染多種農(nóng)作物、果樹(shù)、蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物，特別是造成油菜、大豆、向日葵、花生、芹菜和黃瓜等作物產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失。對(duì)這兩類(lèi)病害的防治目前尚無(wú)經(jīng)濟(jì)可行的辦法，生物防治可能是重要途徑之一。
捕食線(xiàn)蟲(chóng)絲孢菌是植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)的重要天敵，在自然條件下對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)的群體數(shù)量具重要的調(diào)控作用。迄今已報(bào)道的捕食線(xiàn)蟲(chóng)絲孢菌計(jì)有6屬，分別是節(jié)叢孢屬(Arthrobotrys)、隔指孢屬(Dactylella)、單頂孢屬(Monacrosporium)、毒蟲(chóng)霉屬(Nematoctonus)、三叉孢屬(Tridentaria)和三角粽孢屬(Triposorina)，其中又以前三屬數(shù)量最多、分布最廣和經(jīng)濟(jì)上最為重要。捕食線(xiàn)蟲(chóng)被認(rèn)為是捕食線(xiàn)蟲(chóng)真菌在自然界中的重要生存方式之一。然而，Tzean & Estey(1978)發(fā)現(xiàn)在培養(yǎng)條件下捕食線(xiàn)蟲(chóng)真菌A.oligospora、A.robusta和A.superba在平板上除能以粘性菌網(wǎng)捕食植物寄生線(xiàn)蟲(chóng)外，也可以通過(guò)形成菌環(huán)寄生于Matruchotia varians、Rhizoctonia solani和Geotrichum sp.等真菌上，并在光學(xué)和電子顯微鏡下觀(guān)察到這些真菌可以降解寄主真菌的細(xì)胞壁。雖然這一捕食線(xiàn)蟲(chóng)絲孢菌的菌寄生現(xiàn)象已被發(fā)現(xiàn)二十余年，但僅有的少量研究也都僅限于在平板上和滅菌土中進(jìn)行。我們?cè)趯?duì)我國(guó)核盤(pán)菌的重寄生真菌資源的調(diào)查中發(fā)現(xiàn)許多捕食線(xiàn)蟲(chóng)真菌在自然土壤中可以寄生于菌核上，進(jìn)一步的接種試驗(yàn)確認(rèn)了這些捕食線(xiàn)蟲(chóng)真菌的菌寄生和捕食線(xiàn)蟲(chóng)的特性。這一研究結(jié)果豐富了土壤真菌生態(tài)學(xué)的內(nèi)容，并為研制可以同時(shí)防治線(xiàn)蟲(chóng)病和菌核病的多功能生防菌劑提供了思路。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)病和菌核病，而提供一種從土壤中篩選培養(yǎng)出特定的拮抗性微生物來(lái)同時(shí)防治這兩種病害，本發(fā)明還提供了該微生物的制備方法。
植物病害的生物防治，就是利用拮抗性微生物來(lái)防治植物的病害。為了有效地分離篩選到能對(duì)上述病害有抑制作用的生防菌株，本發(fā)明采取了菌核誘捕法，通過(guò)用菌核本身作誘餌篩選到兩棲單頂孢(M.janus)SGM-1，該菌種已在中國(guó)專(zhuān)利局指定的保藏單位(中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心)保藏，其保藏登記號(hào)為CGMCC No.1036。
SGM-1菌株具有下述性質(zhì)培養(yǎng)特征
在PDA上25℃光照培養(yǎng)7天后，菌絲體發(fā)達(dá)，絮狀，白色，菌落直徑約80mm，產(chǎn)水溶性色素，呈橙紅色。在CMA上25℃光照培養(yǎng)5天后，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，菌落直徑約65mm，不產(chǎn)色素。
鏡檢形態(tài)分生孢子梗分生孢子梗直立、單生，無(wú)分枝，梗長(zhǎng)150-260μm，由基部向頂端漸細(xì)，基部寬約6μm左右，頂部約2μm左右。
分生孢子分生孢子擬陀螺狀，長(zhǎng)20～35μm，1-2個(gè)分隔。遠(yuǎn)軸端細(xì)胞特大，球形，直徑約20μm左右；基部細(xì)胞呈倒三角形，與梗連接處平截。
該菌捕食線(xiàn)蟲(chóng)器官為三維粘性菌網(wǎng)；具厚垣孢子，間生，球形。
上述微生物的土壤分離方法是采集根際土樣，加入菌核(50粒/100克土樣)并混勻，25℃恒溫誘捕寄生菌；4周后取出，經(jīng)自來(lái)水漂洗、1％NaClO表面滅菌1分鐘和無(wú)菌水充分漂洗后，置于放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，25℃保濕培養(yǎng)2周后，在體視鏡下檢查菌核表面的重寄生菌，挑單孢至PDA平板培養(yǎng)，純化分離獲得。
上述微生物對(duì)核盤(pán)菌菌核表現(xiàn)較強(qiáng)寄生能力兩棲單頂孢菌株SGM-1長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿后，放入表面消毒過(guò)的菌核。22-25℃下共培養(yǎng)2周后，取出菌核，用1％NaClO表面消毒1分鐘，再用無(wú)菌水漂洗3次后，放置于培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，22-25℃下保濕培養(yǎng)10天后，體視鏡下觀(guān)察到50％的菌核表面長(zhǎng)出SGM-1菌株的孢子。
上述微生物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)表現(xiàn)較強(qiáng)寄生能力菌株SGM-1孢子液鋪于CMA培養(yǎng)基平板上，22-25℃下培養(yǎng)24小時(shí)使孢子萌發(fā)。然后往平板上接入線(xiàn)蟲(chóng)(H.glycines)，5天后顯微鏡下檢測(cè)到近100％的線(xiàn)蟲(chóng)停止活動(dòng)。
上述微生物的液體發(fā)酵及菌劑制備方法，其特征在于該生產(chǎn)方法按以下步驟進(jìn)行1)試管培養(yǎng)基采用固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，將兩棲單頂孢SGM-1菌株接種在試管培養(yǎng)基上，22-25℃下培養(yǎng)72-96小時(shí)；2)擴(kuò)大培養(yǎng)基采用液體培養(yǎng)基，以蔗糖和大豆蛋白胨分別作為碳、氮源(C/N為5∶1-15∶1)，其它組分及用量同查彼(Czapek)培養(yǎng)基，另加入0.05-0.2％(W/V)的天冬酰胺和1-5ppm硫胺。121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時(shí)，將試管中兩棲單頂孢SGM-1菌株接種在錐形瓶中，置于搖床上22-25℃振蕩黑暗培養(yǎng)72-96小時(shí)作為種子液；3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖和大豆蛋白胨分別作為碳、氮源(C/N為5∶1-15∶1)，其它組分及用量同查彼(Czapek)培養(yǎng)基，另加入0.05-0.2％(W/V)的天冬酰胺和1-5ppm硫胺，121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時(shí)，將錐形瓶中的培養(yǎng)物按5-10％的比例接入發(fā)酵液，22-25℃振蕩黑暗培養(yǎng)96-120小時(shí)得到相應(yīng)拮抗菌的菌漿。
4)菌劑的制備硅藻土121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，晾干2-3天。將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1∶1-2∶1(V/W)混勻，晾干即得到相應(yīng)拮抗菌的菌劑。
采用本發(fā)明制成的拮抗性微生物殺菌劑可用來(lái)同時(shí)防治菌核病和線(xiàn)蟲(chóng)病。另外，這一微生物可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶及纖維素酶等多種酶類(lèi)，大大促進(jìn)了土壤中植物殘?bào)w的分解，有效地提高了土壤中的營(yíng)養(yǎng)成分和有機(jī)質(zhì)含量，降低了化肥、農(nóng)藥的用量，減輕了對(duì)環(huán)境的污染，為實(shí)現(xiàn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供了可能。
實(shí)施例采集根際土樣，加入菌核(50粒/100克土樣)并混勻，25℃恒溫誘捕寄生菌；4周后取出，經(jīng)自來(lái)水漂洗、1％NaClO表面滅菌1分鐘和無(wú)菌水充分漂洗后，置于放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，25℃保濕培養(yǎng)2周后，在體視鏡下檢查菌核表面的重寄生菌，挑單孢至PDA平板培養(yǎng)，純化分離獲得。
上述微生物對(duì)核盤(pán)菌菌核表現(xiàn)較強(qiáng)寄生能力兩棲單頂孢菌株SGM-1長(zhǎng)滿(mǎn)培養(yǎng)皿后，放入表面消毒過(guò)的菌核。25℃下共培養(yǎng)2周后，取出菌核，用1％NaClO表面消毒1分鐘，再用無(wú)菌水漂洗3次后，放置于培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，25℃下保濕培養(yǎng)10天后，體視鏡下觀(guān)察到50％的菌核表面長(zhǎng)出SGM-1菌株的孢子。
上述微生物對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)表現(xiàn)較強(qiáng)寄生能力菌株SGM-1孢子液鋪于CMA培養(yǎng)基平板上，25℃下培養(yǎng)24小時(shí)使孢子萌發(fā)。然后往平板上接入線(xiàn)蟲(chóng)(H.glycines)，5天后顯微鏡下檢測(cè)到近100％的線(xiàn)蟲(chóng)停止活動(dòng)。
上述微生物的液體發(fā)酵及菌劑制備方法，其特征在于該生產(chǎn)方法按以下步驟進(jìn)行1)試管培養(yǎng)基采用固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，將兩棲單頂孢SGM-1菌株接種在試管培養(yǎng)基上，25℃下培養(yǎng)96小時(shí)；2)擴(kuò)大培養(yǎng)基采用液體培養(yǎng)基，以蔗糖和大豆蛋白胨分別作為碳、氮源(C/N為10∶1)其它組分及用量同查彼(Czapek)培養(yǎng)基，另加入0.15％(W/V)的天冬酰胺和4ppm硫胺。121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時(shí)，將試管中兩棲單頂孢SGM-1菌株接種在錐形瓶中，置于搖床上25℃振蕩黑暗培養(yǎng)96小時(shí)作為種子液；3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖和大豆蛋白胨分別作為碳、氮源(C/N為10∶1)，其它組分及用量同查彼(Czapek)培養(yǎng)基，另加入0.15％(W/V)的天冬酰胺和4ppm硫胺。121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時(shí)，將錐形瓶中的培養(yǎng)物按10％的比例接入發(fā)酵液，25℃振蕩黑暗培養(yǎng)96小時(shí)得到相應(yīng)拮抗菌的菌漿。
4)菌劑的制備硅藻土121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，晾干3天。將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1∶1(V/W)混勻，晾干即得到相應(yīng)拮抗菌的菌劑。
采用本發(fā)明制成的拮抗性微生物殺菌劑可用來(lái)同時(shí)防治菌核病和線(xiàn)蟲(chóng)病。另外，這一微生物可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶及纖維素酶等多種酶類(lèi)，大大促進(jìn)了土壤中植物殘?bào)w的分解，有效地提高了土壤中的營(yíng)養(yǎng)成分和有機(jī)質(zhì)含量，降低了化肥、農(nóng)藥的用量，減輕了對(duì)環(huán)境的污染，為實(shí)現(xiàn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供了可能。
權(quán)利要求
1.一種微生物，其特征在于它是用于植物核盤(pán)菌和線(xiàn)蟲(chóng)病害生物防治的兩棲單頂孢(Monacrosporium janus)SGM-1菌株，其保藏編號(hào)為CGMCC No.1036。
2.按權(quán)利要求1所述的微生物的分離方法，其特征在于上述兩棲單頂孢菌株SGM-1按以下方法分離培養(yǎng)獲得采集根際土樣，加入菌核并混勻，25℃恒溫誘捕寄生菌；4周后取出，經(jīng)自來(lái)水漂洗、1％NaClO表面滅菌1分鐘和無(wú)菌水充分漂洗后，置于放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，25℃保濕培養(yǎng)2周后，在體視鏡下檢查菌核表面的重寄生菌，挑單孢至PDA平板培養(yǎng)，純化分離獲得。
3.按權(quán)利要求1或2所述的微生物的液體發(fā)酵及菌劑制備方法，其特征在于該生產(chǎn)方法按以下步驟進(jìn)行1)試管培養(yǎng)基采用固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，將兩棲單頂孢SGM-1菌株接種在試管培養(yǎng)基上，22-25℃下培養(yǎng)72-96小時(shí)；2)擴(kuò)大培養(yǎng)基采用液體培養(yǎng)基，以蔗糖和大豆蛋白胨分別作為碳、氮源(C/N為5∶1-15∶1)，其它組分及用量同查彼(Czapek)培養(yǎng)基，另加入0.05-0.2％(W/V)的天冬酰胺和1-5ppm硫胺。121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時(shí)，將試管中兩棲單頂孢SGM-1菌株接種在錐形瓶中，置于搖床上22-25℃振蕩黑暗培養(yǎng)72-96小時(shí)作為種子液；3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以蔗糖和大豆蛋白胨分別作為碳、氮源(C/N為5∶1-15∶1)，其它組分及用量同查彼(Czapek)培養(yǎng)基，另加入0.05-0.2％(W/V)的天冬酰胺和1-5ppm硫胺，121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時(shí)，將錐形瓶中的培養(yǎng)物按5-10％的比例接入發(fā)酵液，22-25℃振蕩黑暗培養(yǎng)96-120小時(shí)得到相應(yīng)拮抗菌的菌漿；4)菌劑的制備硅藻土121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，晾干2-3天。將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1∶1-2∶1(V/W)混勻，晾干即得到相應(yīng)拮抗菌的菌劑。
全文摘要
本發(fā)明是一種微生物及其制備方法。其特征在于它是用于植物核盤(pán)菌和線(xiàn)蟲(chóng)病害生物防治的兩棲單頂孢(Monacrosporium janus)菌株SGM－1，其保藏編號(hào)為CGMCC No.1036。上述菌株對(duì)核盤(pán)菌(Sclerotinia sclerotiorum)菌核表現(xiàn)較強(qiáng)寄生能力，其平板回接菌核2周能寄生50％的菌核。上述菌株對(duì)線(xiàn)蟲(chóng)(Heterodera glycines)亦表現(xiàn)較強(qiáng)寄生能力，平板條件下5天內(nèi)捕食近100％的線(xiàn)蟲(chóng)。采用本發(fā)明的拮抗性微生物接種，經(jīng)過(guò)擴(kuò)大培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基制備得到相應(yīng)的的菌漿，與滅菌硅藻土載體混勻而制成一種用于植物核盤(pán)菌和線(xiàn)蟲(chóng)病害生物防治的菌劑。
文檔編號(hào)C12N1/14GK1621510SQ200310115190
公開(kāi)日2005年6月1日 申請(qǐng)日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者李世東, 張擁華, 劉杏忠, 繆作清, 郭榮君 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物防治研究所