專利名稱：一種微生物(hld－1)及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物技術(shù)領(lǐng)域，具體地說是一種微生物及其制備方法。
背景技術(shù)：
菌核病菌(Sclerotinia sclerotiorum)——核盤菌是一重要的植物病原真菌，可侵染多種農(nóng)作物、果樹、蔬菜和經(jīng)濟(jì)作物，特別是造成油菜、大豆、向日葵、花生、芹菜和黃瓜等作物產(chǎn)量和品質(zhì)的嚴(yán)重?fù)p失。這種病原菌通過產(chǎn)生菌核在土壤中越冬和越夏存活，并成為下一季的重要初侵染源。國外大量研究結(jié)果表明，土壤中存在著豐富的重寄生真菌，對菌核有著天然的控制作用。篩選土壤中對菌核具強(qiáng)烈重寄生作用的真菌是對這一病害生物防治的重要基礎(chǔ)。
粘帚霉屬真菌(Gliocladium sp.)是土壤中常見菌，已經(jīng)證實(shí)其中的多個種是核盤菌的重要重寄生真菌，能寄生菌核及其菌絲，顯著減少菌核形成，侵入菌核使其組織細(xì)胞崩解。盡管如此，這一極具生防前景的真菌卻仍未得到廣泛應(yīng)用。缺乏具有強(qiáng)寄生能力和良好生產(chǎn)性狀的菌株及其相關(guān)研究(包括生物學(xué)特性)的欠缺是制約其應(yīng)用的關(guān)鍵因素。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是針對菌核病而提供一種從土壤中篩選培養(yǎng)出特定的拮抗微生物來防治植物真菌病害，本發(fā)明還提供了該微生物的制備方法。
植物病害的生物防治，就是利用拮抗性微生物來防治植物的病害。為了有效地分離篩選到能對上述病害有抑制作用的生防菌株，本發(fā)明采取了菌核誘捕法，通過用菌核本身作誘餌篩選到粘帚霉(Gliocladium sp.)HLD-1，該菌株已于2003年11月21日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(CGMCC)，其保藏編號為CGMCC No.1037。
粘帚霉HLD-1菌株具有下述性質(zhì)培養(yǎng)特征在PDA上25℃培養(yǎng)，3-10天觀察，菌落生長速度不是很快，早期形成大量密集白色生菌絲，絨絮狀。后產(chǎn)孢逐漸變成灰綠色，孢子聚集成束狀突起。7天后，整個菌落中央逐漸塌陷，呈現(xiàn)暗綠至墨綠色。從接種中心至菌落外緣呈塌陷，束狀突起及最外邊的毛絨狀白色氣生菌絲。菌落背面淡黃色。
在CMA上25℃培養(yǎng)，氣生菌絲不發(fā)達(dá)，較均勻地著生孢子(孢子團(tuán)淺綠色)。不產(chǎn)色素。
鏡檢形態(tài)分生孢子梗及分生孢子分生孢子梗無色透明，上部著生帚狀分枝，在水中鏡檢觀察共有兩種類型一種象青霉菌一樣較密集，形成“毛刷”；另一種象輪枝菌，分枝對稱輪生。分生孢子(瓶梗孢子)2.5-5.5×2.5-3.5μm，無色透明，單細(xì)胞，連續(xù)向頂端產(chǎn)生孢子并集聚于粘液滴中。
上述微生物的土壤分離方法是采集根際土樣，加入菌核(50粒/100克土樣)并混勻，25℃恒溫誘捕寄生菌；4周后取出，經(jīng)自來水漂洗、1％NaClO表面滅菌1分鐘和無菌水充分漂洗后，置于放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，25℃保濕培養(yǎng)2周后，在體視鏡下檢查菌核表面的重寄生菌，挑單孢至PDA平板培養(yǎng)，純化分離獲得。
上述微生物對核盤菌表現(xiàn)強(qiáng)寄生能力制備粘帚霉HLD-1菌株孢子懸液(濃度為106-109個孢子/ml)，菌核浸泡其中，5分鐘后取出，保濕寄生培養(yǎng)24小時，然后用1％NaClO表面消毒1分鐘，無菌水清洗3次，再保濕培養(yǎng)約5-7天，在體視鏡下觀察到大部分(＞90％)菌核上長出上述微生物。這表明上述微生物的孢子在保濕條件下24小時內(nèi)能夠寄生大部分菌核。
上述微生物的液體發(fā)酵和菌劑制備方法，其特征在于該生產(chǎn)方法按以下步驟進(jìn)行1)試管培養(yǎng)基采用固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，將粘帚霉HLD-1菌株接種在試管培養(yǎng)基上，22-28℃下培養(yǎng)4-5天；2)擴(kuò)大培養(yǎng)基采用液體馬鈴薯葡萄糖(PD)培養(yǎng)基，將試管中粘帚霉HLD-1菌株接種在錐形瓶中，置于搖床上22-28℃振蕩黑暗培養(yǎng)3-4天作為種子液；3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖和尿素分別作為碳、氮源(C/N為6∶1-15∶1)，其它組分及用量同查彼(Czapek)培養(yǎng)液，121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時，將錐形瓶中的培養(yǎng)物按5-10％的比例接入發(fā)酵液，22-28℃振蕩黑暗培養(yǎng)3-4天得到相應(yīng)拮抗菌的菌漿。
4)菌劑的制備硅藻土121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，晾干2-3天。將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1∶1-2∶1(V/W)混勻，晾干即得到相應(yīng)拮抗菌的菌劑。
采用本發(fā)明制成的拮抗性微生物殺菌劑可用來防治發(fā)生普遍的菌核病，同時對立枯、根腐等其它多種植物土壤真菌病害也有防治作用。另外，這一微生物可以產(chǎn)生幾丁質(zhì)酶、葡聚糖酶及纖維素酶等多種酶類，大大促進(jìn)了土壤中植物殘體的分解，有效地提高了土壤中的營養(yǎng)成分和有機(jī)質(zhì)含量，降低了化肥、農(nóng)藥的用量，減輕了對環(huán)境的污染，為實(shí)現(xiàn)可持續(xù)農(nóng)業(yè)的發(fā)展提供了可能。
實(shí)施例采集根際土樣，加入菌核(50粒/100克土樣)并混勻，25℃恒溫誘捕寄生菌；4周后取出，經(jīng)自來水漂洗、1％NaClO表面滅菌1分鐘和無菌水充分漂洗后，置于放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，25℃保濕培養(yǎng)2周后，在體視鏡下檢查菌核表面的重寄生菌，挑單孢至PDA平板培養(yǎng)，純化分離獲得。
上述微生物對核盤菌表現(xiàn)強(qiáng)寄生能力制備粘帚霉HLD-1菌株孢子懸液(濃度為109個孢子/ml)，菌核浸泡其中，5分鐘后取出，保濕寄生培養(yǎng)24小時，然后用1％NaClO表面消毒1分鐘，無菌水清洗3次，再保濕培養(yǎng)7天，在體視鏡下觀察到大部分(95％)菌核上長出上述微生物。這表明上述微生物的孢子在保濕條件下24小時內(nèi)能夠寄生大部分菌核。
上述微生物的液體發(fā)酵和菌劑制備方法，其特征在于該生產(chǎn)方法按以下步驟進(jìn)行1)試管培養(yǎng)基采用固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，將粘帚霉HLD-1菌株接種在試管培養(yǎng)基上，26℃下培養(yǎng)4天；2)擴(kuò)大培養(yǎng)基采用液體馬鈴薯葡萄糖(PD)培養(yǎng)基，將試管中粘帚霉HLD-1菌株接種在錐形瓶中，置于搖床上26℃振蕩黑暗培養(yǎng)4天作為種子液；3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖和尿素分別作為碳、氮源(C/N為8∶1)，其它組分及用量同查彼(Czapek)培養(yǎng)液，121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時，將錐形瓶中的培養(yǎng)物按8％的比例接入發(fā)酵液，26℃振蕩黑暗培養(yǎng)4天得到相應(yīng)拮抗菌的菌漿。
4)菌劑的制備硅藻土121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，晾干3天。將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1∶1(V/W)混勻，晾干即得到相應(yīng)拮抗菌的菌劑。
采用本發(fā)明制成的拮抗性微生物殺菌劑可用來防治在作物上發(fā)生普遍的菌核病，同時對立枯、根腐等其它多種植物土壤真菌病害也有防治作用。
權(quán)利要求
1.一種微生物，其特征在于它是用于植物核盤菌病害生物防治的粘帚霉(Gliocladium sp.)HLD-1菌株，其保藏編號為CGMCC No.1037。
2.按權(quán)利要求1所述的微生物的分離方法，其特征在于上述粘帚霉屬菌株HLD-1按以下方法分離培養(yǎng)獲得采集根際土樣，加入菌核并混勻，25℃恒溫誘捕寄生菌；4周后取出，經(jīng)自來水漂洗、1％NaClO表面滅菌1分鐘和無菌水充分漂洗后，置于放置在培養(yǎng)皿內(nèi)的濾紙片上，25℃保濕培養(yǎng)2周后，在體視鏡下檢查菌核表面的重寄生菌，挑單孢至PDA平板培養(yǎng)，純化分離獲得。
3.按權(quán)利要求1或2所述的微生物的液體發(fā)酵及菌劑制備方法，其特征在于該生產(chǎn)方法按以下步驟進(jìn)行1)試管培養(yǎng)基采用固體馬鈴薯葡萄糖瓊脂(PDA)培養(yǎng)基，將粘帚霉HLD-1菌株接種在試管培養(yǎng)基上，22-28℃下培養(yǎng)4-5天；2)擴(kuò)大培養(yǎng)基采用液體馬鈴薯葡萄糖(PD)培養(yǎng)基，將試管中粘帚霉HLD-1菌株接種在錐形瓶中，置于搖床上22-28℃振蕩黑暗培養(yǎng)3-4天作為種子液；3)液體發(fā)酵培養(yǎng)基以葡萄糖和尿素分別作為碳、氮源(C/N為6∶1-15∶1)，其它組分及用量同查彼(Czapek)培養(yǎng)液，121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，待滅菌培養(yǎng)液冷卻至室溫時，將錐形瓶中的培養(yǎng)物按5-10％的比例接入發(fā)酵液，22-28℃振蕩黑暗培養(yǎng)3-4天得到相應(yīng)拮抗菌的菌漿。4)菌劑的制備硅藻土121℃高壓濕熱滅菌30分鐘，晾干2-3天。將液體發(fā)酵獲得的菌漿與硅藻土按1∶1-2∶1(V/W)混勻，晾干即得到相應(yīng)拮抗菌的菌劑。
全文摘要
一種用于植物核盤菌病害生物防治的菌株，其名稱為粘帚霉屬(Gliocladium sp.)CGMCCNo.1037。上述菌株對核盤菌表現(xiàn)強(qiáng)寄生能力，其孢子24小時內(nèi)保濕培養(yǎng)條件下能侵入大部分核盤菌菌核。一種用于植物核盤菌病害生物防治的菌劑，它是用上述菌株接種，經(jīng)過擴(kuò)大培養(yǎng)基、液體發(fā)酵培養(yǎng)基制備得到相應(yīng)的的菌漿，與滅菌硅藻土載體混勻而制成。
文檔編號C12N1/14GK1621511SQ20031011519
公開日2005年6月1日 申請日期2003年11月26日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月26日
發(fā)明者張擁華, 李世東, 繆作清, 郭榮君 申請人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物防治研究所