專(zhuān)利名稱(chēng)：一種快速檢測(cè)全基因組范圍多基因變化的芯片的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)全基因組范圍多基因變化的芯片，即單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片，以及所述芯片用于檢測(cè)全基因組范圍內(nèi)基因變化，特別是多基因變化的用途。
背景技術(shù)：
DNA的異常變化包括分子水平的點(diǎn)突變、缺失、基因重排和細(xì)胞水平的各種染色體畸變。目前已知，人體復(fù)雜疾病如絕大部分腫瘤、高血壓、糖尿病等等，一般都涉及多個(gè)基因的改變。而且，由于個(gè)體差異，相同疾病在不同患者的所涉及的基因變化并不一定完全相同。因此，復(fù)雜疾病的分子診斷應(yīng)該盡可能同時(shí)檢測(cè)患者存在的全部基因改變。
比較基因組雜交技術(shù)(CGH)是一種能夠?qū)φ麄€(gè)基因組的DNA拷貝數(shù)改變進(jìn)行檢測(cè)的方法[Kallioniemi et al.，1994]。但是，這種方法是染色體水平的，無(wú)法檢測(cè)小于1Mb的改變。Vysis公司最近開(kāi)發(fā)了由BAC[Bacterial Artificial Chromosome]和PAC[P1 BacterophageArtificial Chromosome]組成的微陣列，但是這些BAC和PAC均至少幾百kb。顯然，目前現(xiàn)有技術(shù)均無(wú)法實(shí)現(xiàn)全基因組范圍內(nèi)的多基因改變的快速檢查。
為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述問(wèn)題，本發(fā)明人成功地開(kāi)發(fā)一種快速檢測(cè)全基因組范圍多基因變化的芯片，該芯片基于不含重復(fù)序列的UniSTS和已知的功能基因而設(shè)計(jì)，定名為單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)(UniSTS)合并基因芯片，能實(shí)現(xiàn)全基因組范圍內(nèi)多基因變化的快速檢測(cè)。

發(fā)明內(nèi)容
序列標(biāo)志位點(diǎn)(STS，sequence tagged sites)是一大類(lèi)染色體DNA位標(biāo)，有些STS屬于基因內(nèi)的序列，有些來(lái)自非基因序列，有些STS是兩個(gè)或幾個(gè)核苷酸以不同次數(shù)重復(fù)的多態(tài)性序列(如微衛(wèi)星DNA)。
本發(fā)明的一個(gè)方面，涉及一種用于快速檢測(cè)待測(cè)樣品中全基因組范圍內(nèi)多基因變化的芯片，即單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片，所述芯片由不含重復(fù)序列、在基因組中呈單拷貝的UniSTS和在基因組中呈單拷貝的功能基因的序列作為探針、以及適于制備DNA芯片的固相載體而組成，其中去除與所述功能基因序列在基因組中它處有同源的序列。
在本發(fā)明所述單拷貝UniSTS合并基因芯片中，所選探針可根據(jù)正?；蚪M中存在的單拷貝序列加以確定，從而使得在與樣品雜交時(shí)不存在同源序列的干擾，所得結(jié)果是目的探針特異的。對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員而言，正?；蚪M中的單拷貝序列能夠從GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中很方便地獲得。
而一旦確定所選的探針序列，從所述基因組序列中篩查與所選的的探針序列的同源序列的方法、以及將所篩查的同源序列刪除的方法均為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知。
適于制備本發(fā)明所述DNA芯片的固相載體為本領(lǐng)域技術(shù)人員知曉的那些，包括但不限于載玻片、硅化玻璃、聚丙乙烯、聚丙烯、交聯(lián)樹(shù)脂、改性濾紙、等。實(shí)際上，能夠使用任意形式的載體，只要不影響待測(cè)樣品與探針的雜交反應(yīng)。
采用本發(fā)明所述單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片，由于芯片上的探針均屬于基因組中的單拷貝序列，在與待測(cè)樣品雜交時(shí)，不僅不存在同源序列的干擾，所得結(jié)果是目的探針特異的，而且也不受重復(fù)序列的影響。這對(duì)獲得正確的雜交結(jié)果尤為重要。
采取本發(fā)明所述單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片，其效果明顯優(yōu)于目前使用最多的cDNA芯片雜交方法，即使不用Cot-1 DNA封閉，也不會(huì)產(chǎn)生太強(qiáng)的背景。目前現(xiàn)有芯片在與待測(cè)樣品雜交時(shí)之所以用Cot-1 DNA封閉，是因?yàn)樾酒系奶结樞蛄泻陀糜陔s交的樣品序列中，均含有許多重復(fù)序列。
另一方面，鑒于諸如腫瘤、高血壓、糖尿病等復(fù)雜疾病的發(fā)生雖然在分子水平上涉及多基因變化，然而發(fā)生變化的基因或基因組DNA序列常常僅僅占所屬BAC或PAC序列的一部分。因此使用常規(guī)BAC或PAC制備的芯片時(shí)，發(fā)生病變基因或基因組DNA序列的雜交信號(hào)將會(huì)不同程度地被BAC或PAC中非病變序列的雜交背景所遮蓋。采用單拷貝UniSTS合并基因芯片則完全克服了BAC或PAC芯片的這種缺陷，能夠獲得特異而且靈敏的檢測(cè)結(jié)果。
更為重要的是，由于諸如腫瘤、高血壓、糖尿病等復(fù)雜疾病中改變的DNA序列并不一定全部屬于表達(dá)的功能基因序列。因此，采用僅含有已知基因的常規(guī)芯片檢測(cè)時(shí)，會(huì)漏檢反映疾病變化的非表達(dá)序列中存在的改變，特別是在功能基因表達(dá)中起重要作用的調(diào)控序列中出現(xiàn)的改變。單拷貝UniSTS合并基因芯片可以檢測(cè)基因及非表達(dá)序列的變化。在本發(fā)明中，所述基因變化包括但不限于DNA分子水平的點(diǎn)突變、替換、插入、缺失、基因重排、基因擴(kuò)增或基因缺失，還應(yīng)當(dāng)包括任何待測(cè)樣品中涉及復(fù)雜疾病的其他形式的多基因改變。
本發(fā)明的另一方面還包括所述單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片用于檢測(cè)待測(cè)樣品中全基因組范圍多基因變化的用途，例如，本發(fā)明所述芯片可用于待測(cè)樣品中基因擴(kuò)增的檢測(cè)，和/或用于基因缺失的檢測(cè)。通過(guò)本發(fā)明所述芯片對(duì)待測(cè)樣品中基因的擴(kuò)增和缺失的檢測(cè)，能夠用于疾病診斷，包括鑒別診斷；疾病的預(yù)后判斷；用于疾病相關(guān)基因的基礎(chǔ)研究和臨床研究；以及用于疾病易感性的預(yù)警，以便及時(shí)預(yù)防疾病的發(fā)生；以及用于疾病治療監(jiān)測(cè)，以判斷治療的效果。
實(shí)施例實(shí)施例一單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片制備方法一可以采用如下方法步驟制備本發(fā)明所述單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片
1)從GenBank中[NCBI-MapViewer]獲得目的染色體區(qū)域范圍內(nèi)不含重復(fù)序列的UniSTS位點(diǎn)；2)通過(guò)同源查詢(xún)[NCBI-Blast]去除在基因組中與其它序列有同源(即部分同源)的UniSTS位點(diǎn)，獲得最終選定的UniSTS位點(diǎn)；3)從GenBank中獲得目的染色體區(qū)域范圍內(nèi)已知的功能基因，通過(guò)同源查詢(xún)[NCBI-Blast]去除基因DNA序列中與基因組其它序列有同源(即部分同源)的部分，獲得功能基因DNA中的單拷貝序列，并為擴(kuò)增這些單拷貝序列設(shè)計(jì)引物；4)用功能基因DNA中的單拷貝序列的引物和UniSTS位點(diǎn)的引物(GenBank中均已提供)進(jìn)行PCR；5)用PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣于常規(guī)的固相載體介質(zhì)如載玻片上(每個(gè)探針重復(fù)點(diǎn)樣三次)，即制備成芯片。
實(shí)施例二單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片制備方法二可以采用如下方法步驟制備本發(fā)明所述單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片1)從GenBank中獲得目的染色體區(qū)域范圍內(nèi)的功能基因和不含重復(fù)序列的UniSTS位點(diǎn)；2)對(duì)每個(gè)功能基因和UniSTS按照常規(guī)方法設(shè)計(jì)寡核苷酸探針；3)采用類(lèi)似于實(shí)施例1所述的方法，對(duì)設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針進(jìn)行同源查詢(xún)，去除在基因組中與其它序列有同源(即部分同源)的寡核苷酸序列，獲得最終選定的寡核苷酸探針；4)在載玻片上進(jìn)行原位合成選定的寡核苷酸探針(每個(gè)探針在連續(xù)三個(gè)位點(diǎn)重復(fù)合成)，即制備成芯片。
實(shí)施例三單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片與待測(cè)樣品的雜交與結(jié)果判斷單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片與待測(cè)樣品的雜交與結(jié)果判斷的方法步驟如下
1)被測(cè)DNA的熒光標(biāo)記、芯片雜交以及雜交信號(hào)的檢測(cè)，均按照一般芯片雜交的方法[例如Lu et al.，2001]進(jìn)行；2)對(duì)檢測(cè)到的擴(kuò)增和缺失的UniSTS位點(diǎn)，進(jìn)行GenBank查詢(xún)，即可獲知何者屬于已知基因，或位于何種已知基因附近。
實(shí)施例四利用單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片檢測(cè)食管癌患者樣本中的基因變化利用本發(fā)明所述單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片檢測(cè)食管癌患者樣本中的基因變化，具體方法如下1)根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道(Wei et al.，2002)，食管癌3q和11q13存在高頻率的擴(kuò)增，鑒此選取以下UniSTS，并按照實(shí)施例一的方法制備芯片SHGC-84720，RH65804，RH103798，RH47977，SHGC-141861，SHGC-77558，SHGC-77561，SHGC-8728，SHGC-77567，SHGC-77564，RH94147，WI-14081，SHGC-53491，RH91810，STS-L07077，RH46594，RH41895，G16564，G57075，G31473，G61027，G16688，G56307，G58794，G60692，G23521，G16578，Beta-肌動(dòng)蛋白(作為內(nèi)參照)；2)根據(jù)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南中描述的方法，提取待測(cè)食管癌組織標(biāo)本的DNA和任何正常的DNA(正常人外周血DNA或正常胎盤(pán)DNA，也可以購(gòu)買(mǎi)商售正常DNA產(chǎn)品)，其中正常DNA用作參照DNA；3)根據(jù)Lu et al.等人，2001，的方法，用Cy3和Cy5分別標(biāo)記步驟2)中所制備的食管癌標(biāo)本DNA和正常DNA各1微克；4)將步驟3)中所標(biāo)記的兩種DNA等比例混合，與制備的UniSTS芯片雜交；5)根據(jù)Lu et al.等人，2001，的方法進(jìn)行洗滌和信號(hào)檢測(cè)。其中，標(biāo)記Cy3和Cy5分別發(fā)綠色和紅色熒光，因而強(qiáng)綠色信號(hào)指示腫瘤基因擴(kuò)增，強(qiáng)紅色信號(hào)指示腫瘤基因缺失。如果顯示綠、紅較均等的混合色信號(hào)，則表明腫瘤樣品中該基因沒(méi)有異常變化。
在本實(shí)施例中，利用如上述所制備的芯片檢測(cè)結(jié)果顯示RH47977，SHGC-77558，SHGC-8728，SHGC-77567，SHGC-77564，WI-14081，SHGC-53491，STS-L07077，G31473，G60692在相當(dāng)比例的食管癌中有高頻率的擴(kuò)增。
查詢(xún)GenBank發(fā)現(xiàn)，這些UniSTS分別位于LOC254827，IRA1，KCNMB2，KCNMB2，ANC_2H01，SOX2，ATP11B，EHHADH，F(xiàn)AD104，LOC254827基因內(nèi)部或附近。
上述檢測(cè)結(jié)果表明，采用本發(fā)明所述單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片，能夠在一次檢測(cè)中同時(shí)反映出位于待測(cè)樣品全基因組中多個(gè)不同基因發(fā)生的改變，有利于在分子水平上進(jìn)行疾病的診斷、預(yù)后判斷和治療監(jiān)測(cè)。
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本工作受?chē)?guó)家高技術(shù)研究發(fā)展計(jì)劃基金(2001AA221151)、國(guó)家科技攻關(guān)計(jì)劃基金(2002BA711A06)、國(guó)家杰出青年科學(xué)基金(30125026)、國(guó)家重點(diǎn)基礎(chǔ)研究發(fā)展規(guī)劃基金(G1998051205，2002CB513101)和教育部高等學(xué)校博士學(xué)科點(diǎn)基金(20010023016)資助。
權(quán)利要求
1.一種單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片，所述芯片由不含重復(fù)序列、在基因組中呈單拷貝的序列標(biāo)志位點(diǎn)和在基因組中呈單拷貝的功能基因的序列作為探針，以及適于制備DNA芯片的固相載體而組成。
2.權(quán)利要求1所述的芯片，其中序列標(biāo)志位點(diǎn)選自樣品正?；蚪M中存在的一個(gè)或多個(gè)單拷貝序列，功能基因選自樣品正常基因組中呈單拷貝的一個(gè)或多個(gè)功能基因。
3.一種單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片的制備方法，其包括如下步驟方法A1)從GenBank中獲得目的染色體區(qū)域范圍內(nèi)不含重復(fù)序列的UniSTS位點(diǎn)；2)通過(guò)同源查詢(xún)?nèi)コ诨蚪M中與其它序列有同源(即部分同源)的UniSTS位點(diǎn)，獲得最終選定的UniSTS位點(diǎn)；3)從GenBank中獲得目的染色體區(qū)域范圍內(nèi)已知的功能基因，通過(guò)同源查詢(xún)?nèi)コ駾NA序列中與基因組其它序列有同源(即部分同源)的部分，獲得功能基因DNA中的單拷貝序列，并為擴(kuò)增這些單拷貝序列設(shè)計(jì)引物；4)用功能基因DNA中的單拷貝序列的引物和UniSTS位點(diǎn)的引物(GenBank中均已提供)進(jìn)行PCR；5)用PCR產(chǎn)物點(diǎn)樣(每個(gè)探針重復(fù)點(diǎn)樣三次)，即制備成芯片；或者方法B1)從GenBank中獲得目的染色體區(qū)域范圍內(nèi)的功能基因和不含重復(fù)序列的UniSTS位點(diǎn)；2)對(duì)每個(gè)功能基因和UniSTS按照常規(guī)方法設(shè)計(jì)寡核苷酸探針；3)對(duì)設(shè)計(jì)的寡核苷酸探針進(jìn)行同源查詢(xún)，去除在基因組中與其它序列有同源(即部分同源)的寡核苷酸序列，獲得最終選定的寡核苷酸探針；4)在載玻片上進(jìn)行原位合成選定的寡核苷酸探針(每個(gè)探針在連續(xù)三個(gè)位點(diǎn)重復(fù)合成)，即制備成芯片。
4.權(quán)利要求1所述芯片用于檢測(cè)待測(cè)樣品中全基因組范圍內(nèi)多基因變化的用途。
5.權(quán)利要求4所述的用途，其中所述基因變化包括DNA分子水平的點(diǎn)突變、替換、插入、缺失、基因重排、擴(kuò)增或缺失。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種快速檢測(cè)全基因組范圍多基因變化的芯片，即單拷貝序列標(biāo)志位點(diǎn)合并基因芯片，以及所述芯片用于檢測(cè)全基因組范圍內(nèi)基因變化，特別是多基因變化的用途。
文檔編號(hào)C12Q1/68GK1618984SQ200310115360
公開(kāi)日2005年5月25日 申請(qǐng)日期2003年11月21日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月21日
發(fā)明者王明榮, 徐昕, 蔡巖, 韓亞玲, 吳旻 申請(qǐng)人:中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院腫瘤醫(yī)院腫瘤研究所