專利名稱：類胡蘿卜素相關(guān)酶基因、重組酵母載體及轉(zhuǎn)基因方法和轉(zhuǎn)基因酵母的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種類胡蘿卜素重組酵母載體及轉(zhuǎn)基因酵母。
背景技術(shù)：
世界人口已達(dá)到60億，其中有20億缺乏營養(yǎng)。全世界有1.24億兒童缺乏β-胡蘿卜素，每年有50萬兒童因β-胡蘿卜素缺乏而致盲。我國居民普遍確乏β-胡蘿卜素，在我國每一分鐘有一名盲人產(chǎn)生。60％的小學(xué)生是近視，幼兒弱視在我國普遍存在，需要補(bǔ)充β-胡蘿卜素。
β-胡蘿卜素具有預(yù)防腫瘤、抑制致癌因素、預(yù)防心血管疾病并延緩疾病的進(jìn)程、降低慢性肝炎的炎癥與纖維化程度、改變各種免疫指標(biāo)而用來治療艾滋病等臨床作用。除此之外，β-胡蘿卜素是被世界衛(wèi)生組織(WHO)確認(rèn)為四大營養(yǎng)缺乏病之一的維生素A(視黃醇retinol)的前體。β-胡蘿卜素是補(bǔ)充維生素A的最好的途徑，因?yàn)橹苯訑z食維生素A量過多，會引起顱內(nèi)高壓(假性腦瘤)、高維生素A血癥、新生兒畸形、頭痛、皮膚病等。盡管β-胡蘿卜素廣泛存在于綠葉蔬菜和水果中，但由于它在脂溶狀態(tài)下才能被吸收，而沒有油脂的情況下不能被吸收，因而導(dǎo)致人們普遍缺乏β-胡蘿卜素，尤其在亞洲、非洲、歐洲等國家。β-胡蘿卜素缺乏的常見癥狀是包括從弱視到失明一系列眼病。
類胡蘿卜素是一類包括β-胡蘿卜素、蝦青素、葉黃素和番茄紅素的天然色素，常被用作食品添加劑的著色劑和營養(yǎng)強(qiáng)化劑，同時類胡蘿卜素還具有預(yù)防血管硬化、抑制腫瘤發(fā)生、增加宿主免疫力、抗氧化和抑制自由基產(chǎn)生等生理功能。目前，β-胡蘿卜素已被FAO和WHO等國際組織認(rèn)定為A類營養(yǎng)色素，并在50多個國家和地區(qū)獲準(zhǔn)作為營養(yǎng)、著色雙重功用的食品添加劑而被廣泛應(yīng)用于保健食品及醫(yī)藥和化妝品工業(yè)。國外幾家大的生產(chǎn)β-胡蘿卜素的廠家有瑞士羅氏，年產(chǎn)量350噸；德國BASF公司年產(chǎn)量150噸；匈牙利Darius公司，具體產(chǎn)量沒有查到。世界年需求量在1000噸，而目前年產(chǎn)量只有600噸。我國β-胡蘿卜素產(chǎn)量只有幾百公斤，而實(shí)際需求量達(dá)100噸。國內(nèi)主要生產(chǎn)企業(yè)有南京天舒生物工程有限公司(從胡蘿卜中提取)，上海市工業(yè)微生物研究所(天然微生物發(fā)酵)，武漢抗菌素廠(天然微生物發(fā)酵)。
類胡蘿卜素的生產(chǎn)方法有很多，主要有化學(xué)合成法、植物提取法和微生物發(fā)酵法三種。其中由微生物發(fā)酵法生產(chǎn)類胡蘿卜素有諸多優(yōu)點(diǎn)，有逐步實(shí)現(xiàn)產(chǎn)業(yè)化的趨勢。用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)的類胡蘿卜素安全無毒，被權(quán)威機(jī)構(gòu)認(rèn)為是天然食品添加劑。下面就將β-胡蘿卜素主要的生產(chǎn)方法進(jìn)行簡要的介紹。
1.化學(xué)合成法羅氏公司于1954年最先生產(chǎn)β-胡蘿卜素，1972年BASF公司也開始生產(chǎn)，這兩家公司都依靠一系列維生素A的前體物來制備。
(1)Roche法以β-紫羅蘭酮為起始原料，經(jīng)C14-醛、C16-醛生成C19-醛，與一分子乙炔縮合，生成中間體15，15’-脫二氫二羥基-β-胡蘿卜素。再通過Lindlar催化劑部分氫化和酸催化除去2分子水，生成15，15’-順-β-胡蘿卜素，最后異構(gòu)化生成β-胡蘿卜素，總收率達(dá)28％。
(2)BASF法利用Wittig試劑將2分子C15季磷鹽與一分子2，7-二甲基辛三烯二醛縮合，然后異構(gòu)化即得β-胡蘿卜素，收率超過80％。
(3)雙維生素A縮合法從維生素A醋酸酯(vitamin A acetate)開始，水解得維生素A醇，然后分別制成維生素A三苯基磷鹽化合物和維生素A醛，再以甲醇鈉為縮合劑，經(jīng)過Witting反應(yīng)縮合成β-胡蘿卜素。合成維生素A的工廠采用本法，具有相對的優(yōu)勢。用此法制備β-胡蘿卜素可降低生產(chǎn)成本。
缺點(diǎn)化學(xué)合成迅速的同時帶來一些負(fù)面效應(yīng)，在合成β-胡蘿卜素的同時生成的一些副產(chǎn)品有毒性，所以該法生產(chǎn)的β-胡蘿卜素不為人們所接受。
2.生物提取法可以從含胡蘿卜素較多的植物，如胡蘿卜、沙棘、苜蓿等中提取。將上述富含β-胡蘿卜素的植物榨汁，加熱，收集沉淀物。沉淀物用乙醇、乙醚等溶劑提取，提取液蒸去溶劑即得到β-胡蘿卜素。此外，從蠶中提取，收率不低。在桑蠶業(yè)發(fā)達(dá)地區(qū)廢物利用，可以形成一定規(guī)模，有一定經(jīng)濟(jì)價值，但成本高。
3.采用微生物發(fā)酵法生產(chǎn)前蘇聯(lián)和東歐幾個國家用三孢布拉霉菌發(fā)酵生產(chǎn)β-胡蘿卜素，已達(dá)到工業(yè)化。因微生物發(fā)酵生產(chǎn)過程屬于生物化學(xué)過程，具有反應(yīng)條件溫和、生產(chǎn)周期短、菌體可綜合利用、發(fā)酵過程易于產(chǎn)業(yè)化等優(yōu)點(diǎn)而成為當(dāng)今生物技術(shù)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)。
國外用三孢布拉霉菌(Blakeslea tripora)發(fā)酵生產(chǎn)技術(shù)比較成熟。三孢布拉霉菌屬于毛霉目，笄霉科布拉霉菌屬的菌種，生長十分迅速，生物量高，培養(yǎng)48h每升發(fā)酵液可獲50g以上的干菌體。產(chǎn)β-胡蘿卜素的能力強(qiáng)，培養(yǎng)5-6天總胡蘿卜素產(chǎn)量在1g/L以上，其中80％-90％是β-胡蘿卜素。國外微生物合成類胡蘿卜素的研究主要集中在絲狀真菌(三孢布拉霉)和紅酵母方面，其發(fā)酵水平已達(dá)到中試和能批量生產(chǎn)的程度。國內(nèi)利用三孢布拉霉的研究也已通過中試，但利用紅酵母的研究剛剛受到重視。三孢布拉霉由于菌酶生殖方式的原因其性狀易衰退，藍(lán)藻養(yǎng)殖受地域要求苛刻等都限制了它們的發(fā)展。一般認(rèn)為，利用酵母生產(chǎn)類胡蘿卜素雖然目前色素發(fā)酵水平不如三孢布拉霉的高，但酵母具有營養(yǎng)要求簡單、生長周期短及菌體營養(yǎng)豐富等許多優(yōu)點(diǎn)，具有很大的實(shí)用價值和開發(fā)前景。
目前，有利用化學(xué)合成和植物藻類提取來制備β-胡蘿卜素的，但是，化學(xué)合成產(chǎn)物及其雜和物對人體毒性較大，通常已被禁用于食品色素。若從西紅柿、胡蘿卜等植物和鹽藻類中提取類胡蘿卜素混合物，但是其中β-胡蘿卜素含量甚低，我們測試過黑龍江省的主要西紅柿品種的類胡蘿卜素混合物中95％以上僅是番茄紅素，成熟的西紅柿中幾乎不存在β-胡蘿卜素。因而從植物中提取天然β-胡蘿卜素受地域條件、原料來源、提取得率等限制，生產(chǎn)成本較高，而工業(yè)化生產(chǎn)轉(zhuǎn)基因酵母比較容易，且克服了上述的缺點(diǎn)。應(yīng)用酵母作為生物反應(yīng)器生物合成天然β-胡蘿卜素，可直接通過發(fā)酵提高主食及發(fā)酵食品的營養(yǎng)成分，符合人們的飲食習(xí)慣、符合社會對β-胡蘿卜素的迫切需要。
技術(shù)內(nèi)容本發(fā)明的目的就是提供一種類胡蘿卜素相關(guān)酶基因、重組酵母載體及轉(zhuǎn)基因方法和轉(zhuǎn)基因酵母。
本發(fā)明的類胡蘿卜素生物合成相關(guān)酶基因，其包括1)法尼脂焦磷酸合酶(FPS，farnesyl pyrophosphate synthase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的FPS，其堿基序列片段為ATT TGT ATA CGC AGG ACA GAG ATC2)牦牛兒牦牛兒焦磷酸合酶(GGPS，geranylgeranyl pyrophosphatesynthase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的GGPS，其堿基序列片段為ATG GTG GAT TCA TGG GTG GTT CAG3)八氫番茄紅素合酶(PSY，phytoene synthase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的PSY，其堿基序列片段為ATG TCT ATT TGT ACG CTA TGG GTC
4)八氫番茄紅素脫氫酶(PDS，phytoene desaturase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的ZDS，其堿基序列片段為ATG TCT CAA TTG GGA CAC ATA TCC5)ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ZDS，zeta-carotene desaturase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的ZDS，其堿基序列片段為ATG TCT TGT TCT TCT GCT TCT CTC6)番茄紅素β-環(huán)化酶(LycB，β-Lycopene cyclase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的LycB，其堿基序列片段為ATG GAT ACT TTA GTG AAA ACT CCC7)番茄紅素ε-環(huán)化酶(LycE，ε-Lycopene cyclase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的LycB，其堿基序列片段為ATG GAG TGT TTC AAA GTT CGA AAG本發(fā)明的類胡蘿卜素重組酵母載體，其特征在于利用FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE基因的PCR產(chǎn)物，連接到T-載體，再與酵母穿梭載體連接，構(gòu)建重組酵母載體pPIC3.5-FPS、pPIC3.5-GGPS、pPIC3.5-PSY、pPIC3.5-ZDS、pPIC3.5-PDS、pPIC3.5-LycB、pPIC3.5-LycE、pPIC9-FPS、pPIC9-GGPS、pPIC9-PSY、pPIC9-ZDS、pPIC9-PDS、pPIC9-LycB、pPIC9-LycE。
本發(fā)明類胡蘿卜素自由基因轉(zhuǎn)基因方法，取酵母感受態(tài)細(xì)胞分別與FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE的表達(dá)區(qū)或包含表達(dá)區(qū)的DNA片段混勻，不加任何修飾分別直接轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)移到電擊杯中，電擊后加入山梨醇，轉(zhuǎn)移混合物到無菌的離心管，涂混合物在固體培養(yǎng)基平板上，直到產(chǎn)生單菌落，得到轉(zhuǎn)基因酵母。
本發(fā)明類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母是含有外源類胡蘿卜素生物合成相關(guān)酶基因FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE。
本發(fā)明的類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母可以生物合成類胡蘿卜素。
本發(fā)明的類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母，可以生物合成一種使類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母體細(xì)胞呈圓形的蛋白-YRP。
本發(fā)明的類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母，可以生物合成一種使實(shí)驗(yàn)小鼠健康的蛋白-RHP。
本發(fā)明的類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母，其特征在于類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母菌體。


圖1是本發(fā)明未轉(zhuǎn)基因酵母美藍(lán)染色后，10×40顯微鏡下酵母形態(tài)觀察；圖2是本發(fā)明轉(zhuǎn)基因酵母美藍(lán)染色后，10×40顯微鏡下酵母形態(tài)觀察，類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母細(xì)胞體態(tài)變圓；圖3是本發(fā)明圓形轉(zhuǎn)基因酵母與非轉(zhuǎn)基因酵母RT-PCR分析結(jié)果，結(jié)果表明類胡蘿卜素相關(guān)酶基因作為外源基因，在轉(zhuǎn)基因酵母中表達(dá)；圖4是本發(fā)明圓形轉(zhuǎn)基因酵母與非轉(zhuǎn)基因酵母Northern blot分析結(jié)果，結(jié)果表明類胡蘿卜素相關(guān)酶基因作為外源基因，在轉(zhuǎn)基因酵母中能夠大量表達(dá)；圖5是本發(fā)明圓形轉(zhuǎn)基因酵母與非轉(zhuǎn)基因酵Western blot分析結(jié)果，結(jié)果表明類胡蘿卜素相關(guān)酶基因作為外源基因，在轉(zhuǎn)基因酵母中產(chǎn)生特異蛋白-YRP(Yeast road protein).推測此蛋白可能與轉(zhuǎn)基因酵母體細(xì)胞與非轉(zhuǎn)基因體細(xì)胞相比肥碩變圓有關(guān)；圖6本發(fā)明實(shí)驗(yàn)健康小鼠灌胃用轉(zhuǎn)基因酵母與非轉(zhuǎn)基因酵母RT-PCR分析結(jié)果，結(jié)果表明類胡蘿卜素相關(guān)酶基因作為外源基因，在轉(zhuǎn)基因酵母中表達(dá)；圖7是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)健康小鼠灌胃用轉(zhuǎn)基因酵母與非轉(zhuǎn)基因酵母Northern blot分析結(jié)果，結(jié)果表明類胡蘿卜素相關(guān)酶基因作為外源基因，在轉(zhuǎn)基因酵母中能夠大量表達(dá)；圖8是本發(fā)明實(shí)驗(yàn)健康小鼠灌胃用轉(zhuǎn)基因酵母與非轉(zhuǎn)基因酵Western blot分析結(jié)果，結(jié)果表明類胡蘿卜素相關(guān)酶基因作為外源基因，在轉(zhuǎn)基因酵母中產(chǎn)生特異蛋白-RHP(Rise health protein)，推測此蛋白可能與實(shí)驗(yàn)小鼠健康并且比對照組壽命長有關(guān)。
具體實(shí)施例方式本研究所用基因克隆自枸杞中。
1.PSY(八氫番茄紅素合成酶)PSY催化GGPP轉(zhuǎn)化成八氫番茄紅素，由PSY基因編碼，其cDNA長1.3kb，編碼423個氨基酸。
2.PDS(八氫番茄紅素脫氫酶)PDS催化八氫番茄紅素向ζ-胡蘿卜素轉(zhuǎn)化，由PDS基因編碼，其cDNA長2.1kb，編碼582個氨基酸。
利用PDS，PSY基因的PCR產(chǎn)物，連接到T-載體，再與酵母穿梭載體連接，構(gòu)建了重組酵母載體pPIC3.5PDS、pPIC9PSY。
基因的獲取從質(zhì)粒中利用PCR方法擴(kuò)增出PSY、PDS基因cDNA片段T-載體的連接用PDS，PSY基因的PCR產(chǎn)物，純化回收后與T-載體進(jìn)行連接。
T-載體的酶切利用Not I，BamH I限制性內(nèi)切酶切割含有外源基因的T-載體，純化回收，獲得具有Not I，BamH I粘端的片段。
酵母穿梭載體的連接利用Notl，BamH I限制性內(nèi)切酶切割酵母載體pPIC3.5，純化回收后與T-載體的酶切產(chǎn)物連接獲得重組酵母穿梭載體pPIC3.5PDS、pPIC9PSY。
用甲醇酵母菌液在YPD平板上劃線，28℃培養(yǎng)兩天。挑取單菌落于250ml YPD液體培養(yǎng)基中28℃振蕩培養(yǎng)，至OD600為1.3-1.5，1500g4℃5分鐘收集菌體，無菌水250ml重懸沉淀，反復(fù)洗滌兩次。再用20ml 1mol/L山梨醇重懸沉淀一次，最后收集沉淀于1.5ml離心管中，-70℃儲存。
酵母載體的線性化用Bgl II酶切酵母載體。
電擊轉(zhuǎn)化
取80ul的酵母感受態(tài)細(xì)胞與0.8-1ug的線性化載體DNA混勻，轉(zhuǎn)移到冰預(yù)冷的0.2cm的電擊杯，于冰上放置5分鐘，1500V電擊后立即加入1ml冰預(yù)冷的山梨醇，轉(zhuǎn)移混合物到無菌的離心管，涂200-600ul的混合物在MD平板上。28℃培養(yǎng)直到產(chǎn)生單菌落。利用電擊法將重組酵母載體導(dǎo)入Pichia酵母，獲得紅色轉(zhuǎn)基因酵母菌株1600株。
轉(zhuǎn)化菌株的分子鑒定1.PCR鑒定酵母基因組的提取挑取單菌落至5mlYPD液體培養(yǎng)基，28-30℃培養(yǎng)16小時，12000rpm離心2分鐘，收集沉淀，1mlddH2O劇烈振蕩懸浮沉淀，離心，去上清。加入200ulBreaking buffer，懸浮沉淀，加入200ul飽和酚，振蕩。加入100-200ul0.5mm玻璃珠，votex3-5分鐘，12000rpm離心3分鐘。取上清，用2.5倍的無水乙醇沉淀DNA。純化按《分子克隆》進(jìn)行。
PCR檢測PSY基因引物5’端CTC GAG AAA A6A GAG GCT GAA GCT GGA TCCATG ATT TGT ATA CGC AGG ACA GAG ATA CGG。3’端GC GGC CGC TTATTT CAG CCT CTT GTA TAT CTT。擴(kuò)增條件(總反應(yīng)體積25ul)94℃3分鐘，94℃1分鐘，58℃1分鐘，72℃1`30秒，30個循環(huán)，72℃10分鐘。特異帶大小約1.3kb。
PDS基因引物5’端CTC GAG AA A AGA GAG GCT GAA GCT GGA TCCATG CCC TTT CAC CTT CAA CTT AGT GAA。3’端GC GGC CGC TCA GTTTGG AAT GCT TGC TTC TGC。擴(kuò)增條件(總反應(yīng)體積25ul)94℃3分鐘，94℃1分鐘，54℃1分鐘，72℃2分鐘，30個循環(huán)，72℃10分鐘。特異帶大小約2.1kb。
PCR產(chǎn)物用1.2％瓊脂糖凝膠電泳檢測，溴化乙錠染色，紫外分析。
2.Southern鑒定(1)探針的標(biāo)記用引物從質(zhì)粒pPIC3.5PDS、pPIC9PSY DNA中PCR擴(kuò)增出1.3kb、2.1kb的特異目的片段，1％瓊脂糖凝膠電泳，進(jìn)行回收與純化，以回收產(chǎn)物作探針，采用隨機(jī)引物法探針標(biāo)記，用于雜交。方法參照DIG試劑盒說明進(jìn)行。
1)酶切片段或PCR產(chǎn)物用試劑盒進(jìn)行回收，溶于20μl體系。回收產(chǎn)物加入1～2μlDNA分子量標(biāo)記物，DGL2000或λ-DNA，沸水浴加熱變性10min。立即置于冰上，加入試劑Vial5 2μl Hexanucleotide Mix(隨機(jī)六聚體引物)Vial6 2μl dNTP labeling mixture(10×dNTPs，標(biāo)記混合物)Vial7 1μl Klenow enzyme混勻，稍離心，37℃進(jìn)行反應(yīng)1h以上，因延長時間有助于探針產(chǎn)量的提高，故37℃過夜。
2)反應(yīng)結(jié)束后，加入2μl 0.2mol/L EDTA(pH8.0)終止反應(yīng)。按常規(guī)方法進(jìn)行純化。即加入1/10體積的3mol/L NaAC，2倍體積的無水乙醇，上下顛倒數(shù)次混勻，-20℃放置2h。
3)12000rpm離心15min，棄上清，用75％乙醇洗滌沉淀2次，室溫晾干。加入20μl TE溶解沉淀，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> (2)探針標(biāo)記后的檢測1)取1μl探針作1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000連續(xù)梯度稀釋，同時作陽性對照。將稀釋的探針取1μl點(diǎn)在尼龍膜上。將尼龍膜置入Washing buffer(Maleicacid buffer，0.3％Tween20)中洗2min。
2)將尼龍膜在1×blocking solution中封閉30min。
3)將尼龍膜在含有anti-DIG-AP(1∶5000)的1×blockingsolution中封閉30min。在充足的Washing buffer中洗膜2次，每次15min。
4)在detection buffer中平衡3min。將尼龍膜轉(zhuǎn)移到含有NBT/BCIP的detection buffer中，暗室下靜置2h以上，觀察斑點(diǎn)顏色，結(jié)果表明探針標(biāo)記效果良好。
3.斑點(diǎn)雜交1)將樣品(包括質(zhì)粒對照、PCR陽性對照與待檢測的植物基因組DNA)在沸水浴中加熱變性10min，用移液器分別取樣品2～5μl，按順序點(diǎn)在事先準(zhǔn)備好的尼龍膜上，室溫晾干，固定，即80℃烘烤1～2h，4℃保存?zhèn)溆没蛑苯舆M(jìn)行以下實(shí)驗(yàn)。
2)預(yù)雜交將尼龍膜放入雜交管中，加入適量的預(yù)雜交液(按20ml/100cm2標(biāo)準(zhǔn))，放入雜交儀中，68℃預(yù)雜交8h以上；3)雜交棄預(yù)雜交液，加入含有預(yù)變性探針的雜交液(按2.5ml/100cm2標(biāo)準(zhǔn))，68℃雜交16h；4)檢測雜交結(jié)束后，棄去雜交液，加入適量的洗膜液I(2×SSC，0.1％SDS)，室溫洗膜2次，每次5min；再加入洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)，于68℃洗膜2次，每次15min；將尼龍膜取出，放入平皿中，用充足的Washing buffer室溫下洗膜5min。封閉將尼龍膜放入1％封閉液中封閉30min，再在含1/5000的anti-Dig-AP的1％封閉液中封閉30min，然后用充足的Washing buffer室溫下洗膜2次，每次15min。平衡將尼龍膜放入檢測液中平衡3min。顯色將尼龍膜放入顯色液(1∶50檢測液稀釋)中，避光顯色2h以上，觀察并照相。
4.高產(chǎn)菌株的獲得在MD平板上獲得大量的PSY、PDS基因轉(zhuǎn)化的紅色的酵母菌株，其它未轉(zhuǎn)化的菌株為白色，證明初步獲得高表達(dá)量的紅色酵母菌株。圖為單菌株繼代板。
通過繼代篩選和6代的遺傳穩(wěn)定性觀察表明，轉(zhuǎn)基因酵母具有遺傳穩(wěn)定性。
5.HPLC定量分析轉(zhuǎn)基因紅酵母中類胡蘿卜素含量稱取1g菌體，加入12ml 2M HCl，浸泡40min，100℃ 4min，迅速冷卻(冷水沖涮)。離心(50ml離心管10000rpm 10min)，洗滌沉淀，除去上清，每次5ml丙酮，分4次，共20ml，將沉淀洗入錐形瓶中，加入5ml石油醚，振搖1min，靜置5min。將提取液轉(zhuǎn)入盛有100ml 5％硫酸鈉的分液漏斗中，用10ml丙酮-石油醚(v∶v＝3∶7)混合物洗滌錐形瓶，洗滌液轉(zhuǎn)入分液漏斗中，重復(fù)上述操作1～3次，直到提取液無色，棄去下層水溶液，再用15ml 5％硫酸鈉反復(fù)振搖洗滌，直到下層水溶液清亮。
將提取液通過盛有10g無水硫酸鈉(吸水)的小漏斗，下接球形瓶，用大約4～5ml的石油醚分?jǐn)?shù)次洗凈分液漏斗和無水硫酸鈉層內(nèi)的色素，將提取液于旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器上減壓蒸發(fā)，溫度為60℃(大約為10～30min)，當(dāng)蒸發(fā)至大約1ml時，取下錐形瓶，用氮?dú)獯蹈桑⒓醇尤?ml三氯甲烷定容，-20℃保存?zhèn)溆谩?br> 轉(zhuǎn)基因酵母中的β-胡蘿卜素含量以β-胡蘿卜素標(biāo)樣為基準(zhǔn)，做標(biāo)準(zhǔn)曲線。經(jīng)HPLC測定后計(jì)算峰面積，經(jīng)計(jì)算PDS轉(zhuǎn)基因酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素為430ug/g(干菌體)；PSY轉(zhuǎn)基因酵母產(chǎn)β-胡蘿卜素為692.3-1290ug/g(干菌體)。
6.吸收峰試驗(yàn)配制β-胡蘿卜素標(biāo)準(zhǔn)液，稀釋終濃度至50ug/ml，點(diǎn)樣(至少5點(diǎn))，同時作標(biāo)準(zhǔn)曲線。放入石油醚預(yù)先飽和的層析缸中展開，剪下目的片段，放入裝有5ml石油醚的具塞試劑管中，利用分光光度計(jì)測其提取液吸光度，作標(biāo)準(zhǔn)曲線圖，計(jì)算目的樣品溶液濃度。
取一定量的類胡蘿卜素提取物，用丙酮配制類胡蘿卜素回收溶液，用DU2501紫外分光光度計(jì)在350-600nm波長區(qū)域內(nèi)做光譜掃描圖，結(jié)果如圖。由圖可知，最大吸收峰在475nm左右，可見其主要產(chǎn)物并不是β-胡蘿卜素?？傻棉D(zhuǎn)基因酵母菌體的類胡蘿卜素回收量為760ug/g(干菌體)，β-胡蘿卜素回收量為230ug/g(干菌體)。
7.形態(tài)學(xué)觀察轉(zhuǎn)基因酵母以圓餅型為主，大小直徑7～11um。在普通光學(xué)顯微鏡下細(xì)胞不呈紅色，細(xì)胞內(nèi)無紅色顆粒出現(xiàn)。經(jīng)美藍(lán)染色后，形態(tài)如圖8.轉(zhuǎn)基因酵母類胡蘿卜素的主要組份類胡蘿卜素的分離主要是由于它們化學(xué)結(jié)構(gòu)的不同而引起的。它們在有機(jī)溶劑中溶解度的差別，可通過薄層層析分離，TLC分離結(jié)果見圖(展開劑為丙酮∶石油醚＝3∶7)。由圖可知，轉(zhuǎn)基因酵母產(chǎn)物主要由三種類胡蘿卜素構(gòu)成，這與HPLC結(jié)果基本吻合，類胡蘿卜素薄層層析圖。
轉(zhuǎn)基因酵母(1)酵母的準(zhǔn)備用酵母片、發(fā)酵粉、啤酒酵母等的酵母菌液在固體酵母培養(yǎng)基平板上(如YPD、MD)劃線，20-32℃培養(yǎng)。挑取單菌落于液體培養(yǎng)基(如YPD、MD)中20-32℃培養(yǎng)，至OD600為0.1-3，離心收集菌體，無菌水重懸沉淀，反復(fù)洗滌兩次。再用0.1-500ml，0.1-2mol/L山梨醇重懸沉淀一次，最后收集沉淀于離心管中，-70℃或4℃儲存。
(2)外源基因片段的操作將三套分別來自枸杞(7個基因FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE)、龍膽(7個基因FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE)和龍膽的7個基因的修飾基因(編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基)等基因，分別制備成獨(dú)自基因DNA片段和表達(dá)載體裝載的基因片段來轉(zhuǎn)基因。
①獨(dú)自基因片段轉(zhuǎn)化酵母分別將FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE等基因的表達(dá)區(qū)或包含表達(dá)區(qū)的DNA片段，不加任何修飾分別直接轉(zhuǎn)化面包酵母、啤酒酵母、酵母片酵母等，獲得目的基因的轉(zhuǎn)基因酵母，通過基因組DNA水平的PCR檢測、RNA水平的RT-PCR檢測，都可以證明在面包酵母、啤酒酵母、酵母片酵母的基因組中有外源基因整合并表達(dá)。高壓液項(xiàng)色譜分析(HPLC)，可檢測出外源基因表達(dá)并生物合成類胡蘿卜素。
②利用載體轉(zhuǎn)化酵母分別將FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE等基因的表達(dá)區(qū)或包含表達(dá)區(qū)的DNA片段，與酵母穿梭載體重組，如穿梭載體pPIC3.5、pPIC9。獲得目的基因的轉(zhuǎn)基因酵母的穿梭載體，枸杞基因pPIC3.5-FPS、pPIC3.5-GGPS、pPIC3.5-PSY、pPIC3.5-ZDS、pPIC3.5-PDS、pPIC3.5-LycB、pPIC3.5-LycE、pPIC9-FPS、pPIC9-GGPS、pPIC9-PSY、pPIC9-ZDS、pPIC9-PDS、pPIC9-LycB、pPIC9-LycE，龍膽基因pPIC3.5-FPS、pPIC3.5-GGPS、pPIC3.5-PSY1、pPIC3.5-PSY2、pPIC3.5-PSY3、pPIC3.5-PSY4、pPIC3.5-ZDS、pPIC3.5-PDS、pPIC3.5-LycB1、pPIC3.5-LycB2、pPIC3.5-LycE、pPIC9-FPS、pPIC9-GGPS、pPIC9-PSY1、pPIC9-PSY2、pPIC9-PSY3、pPIC9-PSY4、pPIC9-ZDS、pPIC9-PDS、pPIC9-LycB1、pPIC9-LycB2、pPIC9-LycE，龍膽修飾基因pPIC3.5-FPS、pPIC3.5-GGPS、pPIC3.5-PSY1、pPIC3.5-PSY2、pPIC3.5-PSY3、pPIC3.5-PSY4、pPIC3.5-ZDS、pPIC3.5-PDS、pPIC3.5-LycB1、pPIC3.5-LycB2、pPIC3.5-LycE、pPIC9-FPS、pPIC9-GGPS、pPIC9-PSY1、pPIC9-PSY2、pPIC9-PSY3、pPIC9-PSY4、pPIC9-ZDS、pPIC9-PDS、pPIC9-LycB1、pPIC9-LycB2、pPIC9-LycE。
首先進(jìn)行酵母表達(dá)載體的外源基因線性化，用限制性內(nèi)切酶(如Bgl II)酶切酵母載體，進(jìn)行基因線性化處理，只保留目的基因和有利于與酵母基因組整合的AOX的DNA片段，電擊法轉(zhuǎn)基因入酵母，通過外源基因兩端的AOX片段，將目的基因整合到酵母染色體，細(xì)胞培養(yǎng)電擊轉(zhuǎn)化后的酵母，獲得轉(zhuǎn)基因酵母。
通過對轉(zhuǎn)基因酵母基因組DNA水平的PCR檢測、RNA水平的RT-PCR檢測，都可以證明在面包酵母、啤酒酵母、酵母片酵母等的基因組中有外源基因整合并表達(dá)。高壓液項(xiàng)色譜分析(HPLC)，可檢測出外源基因表達(dá)并生物合成類胡蘿卜素。
在固體培養(yǎng)基上獲得大量的FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE等基因的各個基因轉(zhuǎn)化的酵母菌株，有些白色的菌株是將酶分泌到胞外的，紅色的菌株為胞內(nèi)高表達(dá)菌株，PCR、RT-PDR等方法在轉(zhuǎn)基因酵母中能夠擴(kuò)增出具有轉(zhuǎn)入基因的特異括增基因片段，表明類胡蘿卜素生物合成途徑中相關(guān)酶的基因轉(zhuǎn)入酵母基因組。圖2為單菌株繼代板。通過繼代篩選和遺傳穩(wěn)定性觀察表明，轉(zhuǎn)基因酵母具有遺傳穩(wěn)定性。
權(quán)利要求
1.一種類胡蘿卜素生物合成相關(guān)酶基因，其包括1)法尼脂焦磷酸合酶(FPS，farnesyl pyrophosphate synthase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的FPS，其堿基序列片段為ATT TGT ATA CGC AGG ACA GAG ATC2)牦牛兒牦牛兒焦磷酸合酶(GGPS，geranylgeranyl pyrophosphatesynthase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的GGPS，其堿基序列片段為ATG GTG GAT TCA TGG GTG GTT CAG3)八氫番茄紅素合酶(PSY，phytoene synthase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的PSY，其堿基序列片段為ATG TCT ATT TGT ACG CTA TGG GTC4)八氫番茄紅素脫氫酶(PDS，phytoene desaturase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的ZDS，其堿基序列片段為ATG TCT CAA TTG GGA CAC ATA TCC5)ζ-胡蘿卜素脫氫酶(ZDS，zeta-carotene desaturase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的ZDS，其堿基序列片段為ATG TCT TGT TCT TCT GCT TCT CTC6)番茄紅素β-環(huán)化酶(LycB，β-Lycopene cyclase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的LycB，其堿基序列片段為ATG GAT ACT TTA GTG AAA ACT CCC7)番茄紅素ε-環(huán)化酶(LycE，ε-Lycopene cyclase)基因，基因編碼起始點(diǎn)第24個堿基處，替換單個堿基修飾的LycB，其堿基序列片段為ATG GAG TGT TTC AAA GTT CGA AAG
2.一種類胡蘿卜素重組酵母載體，其特征在于利用FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE基因的PCR產(chǎn)物，連接到T-載體，再與酵母穿梭載體連接，構(gòu)建重組酵母載體pPIC3.5-FPS、pPIC3.5-GGPS、pPIC3.5-PSY、pPIC3.5-ZDS、pPIC3.5-PDS、pPIC3.5-LycB、pPIC3.5-LycE、pPIC9-FPS、pPIC9-GGPS、pPIC9-PSY、pPIC9-ZDS、pPIC9-PDS、pPIC9-LycB、pPIC9-LycE。
3.一種類胡蘿卜素自由基因轉(zhuǎn)基因方法，其特征在于取酵母感受態(tài)細(xì)胞分別與FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE的表達(dá)區(qū)或包含表達(dá)區(qū)的DNA片段混勻，不加任何修飾分別直接轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)移到電擊杯中，電擊后加入山梨醇，轉(zhuǎn)移混合物到無菌的離心管，涂混合物在固體培養(yǎng)基平板上，直到產(chǎn)生單菌落，得到轉(zhuǎn)基因酵母。
4.一種類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母，其特征在于是含有外源類胡蘿卜素生物合成相關(guān)酶基因FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母，其特征在于類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母可以生物合成類胡蘿卜素。
6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母，其特征在于可以生物合成一種使類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母體細(xì)胞呈圓形的蛋白-YRP。
7.根據(jù)權(quán)利要求4所述的類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母，其特征在于可以生物合成一種使實(shí)驗(yàn)小鼠健康的蛋白-RHP。
8.根據(jù)權(quán)利要求4所述的類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母，其特征在于類胡蘿卜素相關(guān)酶基因轉(zhuǎn)基因酵母菌體。
全文摘要
一種類胡蘿卜素相關(guān)酶基因、重組酵母載體及轉(zhuǎn)基因方法和轉(zhuǎn)基因酵母，屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種類胡蘿卜素重組酵母載體及轉(zhuǎn)基因酵母。本發(fā)明主要是將類胡蘿卜素合成途徑中相關(guān)酶基因?qū)虢湍副磉_(dá)載體中。通過DNA重組，將類胡蘿卜素合成酶基因?qū)虢湍钢?。檢測特異基因在酵母中的表達(dá)。選擇類胡蘿卜素含量高的轉(zhuǎn)基因酵母等。
文檔編號C12N15/52GK1629294SQ20031011595
公開日2005年6月22日 申請日期2003年12月19日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月19日
發(fā)明者季靜 申請人:季靜