專利名稱：抗人凋亡素2配體的單克隆抗體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及抗人凋亡素2配體(human apoptosis 2 ligand，簡(jiǎn)稱hApo-2L)的單克隆抗體的制備及應(yīng)用，是利用細(xì)胞工程、抗體工程技術(shù)，獲得分泌抗hApo-2L的單克隆抗體的細(xì)胞系，通過(guò)同品系的小鼠誘導(dǎo)腹水，制備抗hApo-2L的單克隆抗體；再通過(guò)蛋白質(zhì)純化、電泳、免疫等技術(shù)實(shí)現(xiàn)對(duì)該抗體的應(yīng)用。屬于生物工程領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
目前，抗癌藥物以化學(xué)合成和植物提取物為多，其療效均不能達(dá)到完全有效的控制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移和擴(kuò)散的水平，而且副作用普遍較大。
hApo-2L，是由Wiley等于1995年首次發(fā)現(xiàn)并克隆成功的一種凋亡激活因子，是繼TNF、FasL之后發(fā)現(xiàn)的第三個(gè)TNF家族成員，又稱腫瘤壞死因子相關(guān)的凋亡誘導(dǎo)配體(TNF relatedapoptosis-inducing ligand，簡(jiǎn)稱TRAIL)。與其他的TNF家族成員一樣，hApo-2L也能誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞發(fā)生凋亡，而且具有自身的優(yōu)點(diǎn)，如抑瘤的有效性hApo-2L單獨(dú)使用，就可以有效誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞的凋亡；抑瘤的廣譜性研究證實(shí)，hApo-2L可誘導(dǎo)近2/3現(xiàn)有的細(xì)胞系發(fā)生細(xì)胞凋亡，其中包括肝癌、乳腺癌、宮頸癌、前列腺癌、結(jié)腸癌、淋巴癌及腎臟腫瘤和中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤等；低的毒副作用體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)，hApo-2L對(duì)人臍靜脈血管內(nèi)皮細(xì)胞、肺成纖維細(xì)胞、乳腺細(xì)胞、腎臟細(xì)胞、前列腺細(xì)胞、結(jié)腸平滑肌細(xì)胞、星狀細(xì)胞等均無(wú)誘導(dǎo)凋亡的作用；另外hApo-2L還可以與化療藥物協(xié)同用藥。綜上所述，hApo-2L由于具有高效、廣譜、低毒等優(yōu)點(diǎn)而有望成為一種新的抗腫瘤藥物，因此受到廣泛關(guān)注。
但迄今為止，hApo-2L研究和開發(fā)進(jìn)展較慢，本發(fā)明提供一種抗hApo-2L的單克隆抗體的制備方法，用該方法制備的單克隆抗體可用于hApo-2L及相關(guān)分子的鑒定、純化以及hApo-2L及相關(guān)分子制品的定量等，以推動(dòng)hApo-2L及相關(guān)分子的研究和開發(fā)。
本發(fā)明用到雜交瘤細(xì)胞技術(shù)。該技術(shù)將骨髓瘤細(xì)胞與B淋巴細(xì)胞融合，以建立能分泌均質(zhì)抗體的雜交瘤細(xì)胞系為目的，也稱為單克隆抗體制備技術(shù)。該技術(shù)涉及到動(dòng)物免疫、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞融合、細(xì)胞克隆培養(yǎng)和免疫測(cè)定等一系列方法。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是提供一種抗hApo-2L的單克隆抗體，并闡明其制備和應(yīng)用方法。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案
1、抗hApo-2L的單克隆抗體的制備方法，該方法包括以下步驟(1)動(dòng)物的免疫選擇適齡的小鼠，以經(jīng)過(guò)適當(dāng)純化的抗原免疫。一段時(shí)間之后通過(guò)采血檢測(cè)抗體效價(jià)。選擇效價(jià)較高的小鼠留待融合。
(2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)以適當(dāng)?shù)呐囵B(yǎng)液培養(yǎng)骨髓瘤細(xì)胞并使之保持良好的狀態(tài)以利于細(xì)胞融合。
(3)細(xì)胞融合將(1)中備好的小鼠處死，取出脾臟，釋放B淋巴細(xì)胞。洗滌，此即為待融合的脾淋巴細(xì)胞。收集(2)中備好的細(xì)胞，洗滌，此即為待融合的骨髓瘤細(xì)胞。將上述兩種細(xì)胞混合離心，然后以PEG介導(dǎo)融合。融合后的細(xì)胞適當(dāng)稀釋，種板，適當(dāng)條件培養(yǎng)。
(4)雜交瘤細(xì)胞的篩選將上述培養(yǎng)物進(jìn)行選擇培養(yǎng)。在細(xì)胞集落長(zhǎng)到合適大小時(shí)，吸取培養(yǎng)液上清做抗體鑒定，篩選陽(yáng)性克隆。
(5)雜交瘤細(xì)胞的克隆以有限稀釋法克隆雜交瘤細(xì)胞，將稀釋到一定密度的細(xì)胞接種96孔板，盡可能使每孔只有一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)。形成集落的孔取上清做ELISA，鑒定陽(yáng)性克隆?？梢灾貜?fù)克隆若干次，直到雜交瘤細(xì)胞的陽(yáng)性孔率達(dá)到100％。將克隆化后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)做抗體鑒定。
(6)小鼠腹水的誘導(dǎo)選擇與雜交瘤細(xì)胞同源同系的小鼠誘導(dǎo)腹水。取到腹水以后，離心，上清留待純化單克隆抗體。
(7)單克隆抗體的純化利用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水上清中的單克隆抗體。
2、抗hApo-2L的單克隆抗體應(yīng)用，該應(yīng)用方法主要表現(xiàn)在以下幾個(gè)方面(1)hApo-2L及相關(guān)分子的鑒定，其鑒定方法可以通過(guò)下述兩種途徑實(shí)現(xiàn)一、用電泳技術(shù)，通過(guò)Western方法，進(jìn)行hApo-2L及相關(guān)分子的鑒定；二、利用中和實(shí)驗(yàn)進(jìn)行hApo-2L及相關(guān)分子的鑒定。
(2)hApo-2L及相關(guān)分子的純化購(gòu)得CNBr-activated Sepharose 4B干膠，根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書，制備親和柱，用以hApo-2L及相關(guān)分子的純化。
(3)hApo-2L及相關(guān)分子制品的定量通過(guò)標(biāo)記抗hApo-2L的單克隆抗體，利用ELISA方法，進(jìn)行hApo-2L及相關(guān)分子制品的定量。
本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)在于提供一種簡(jiǎn)便易行的方法制備和純化hApo-2L的單克隆抗體，更為重要的是該方法制備的單克隆抗體可以有多種用途，如hApo-2L及相關(guān)分子的鑒定、純化以及hApo-2L及相關(guān)分子制品的定量等。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例1、抗hApo-2L的單克隆抗體的制備方法(1)動(dòng)物的免疫將純化抗原和佐劑充分混合，然后選6～12周齡的BALB/c小鼠若干，每只經(jīng)背部或腹部皮下多點(diǎn)注射抗原5～10ug；2～4周后抗原減半，再次依上次方法免疫小鼠；1周后，把經(jīng)兩次免疫后的小鼠尾部或眼球采血測(cè)抗體效價(jià)。選擇效價(jià)高的小鼠休息2～3周，準(zhǔn)備融和。融和前三天，經(jīng)腹腔注射加強(qiáng)免疫一次。
(2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)把來(lái)自BALB/c小鼠的SP2/0細(xì)胞株以DMEM培養(yǎng)基傳代培養(yǎng)，一般兩天傳代一次。培養(yǎng)條件為37℃、5％CO2、飽和濕度。融合前一天傳代以保證融合時(shí)進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。
(3)細(xì)胞融合將(1)中備好的小鼠處死，取出脾臟，置200目不銹鋼篩網(wǎng)中，剔除脂肪和結(jié)締組織，撕開包膜，釋放B淋巴細(xì)胞，使細(xì)胞進(jìn)入含基礎(chǔ)培養(yǎng)液的培養(yǎng)皿內(nèi)。以基礎(chǔ)培養(yǎng)液離心洗滌此細(xì)胞1～2次，再以基礎(chǔ)培養(yǎng)液混懸。此即為待融合的脾淋巴細(xì)胞。收集(2)中備好的細(xì)胞，離心棄上清，并用基礎(chǔ)培養(yǎng)液洗滌2次。再以基礎(chǔ)培養(yǎng)液混懸。此即為待融合的SP2/0細(xì)胞。將上述兩種細(xì)胞懸液以一定比例混合離心，37℃水浴下往細(xì)胞中逐滴加入PEG溶液，1～2分鐘后加入完全培養(yǎng)液終止反應(yīng)，離心棄上清。然后以完全培養(yǎng)液懸起并適當(dāng)稀釋，種入96孔板，置37℃、5％CO2、飽和濕度下培養(yǎng)。
(4)雜交瘤細(xì)胞的篩選將上述96孔板于融合后2～12小時(shí)加入HAT選擇培養(yǎng)液。以后每隔幾天以HAT培養(yǎng)液置換孔中一定比例的培養(yǎng)液。這種選擇性培養(yǎng)大約持續(xù)兩周。在細(xì)胞集落長(zhǎng)到適當(dāng)大小時(shí)，吸取培養(yǎng)液上清做ELISA，篩選陽(yáng)性克隆。
(5)雜交瘤細(xì)胞的克隆以有限稀釋法克隆雜交瘤細(xì)胞，將稀釋到一定密度的細(xì)胞接種96孔板，盡可能使每孔只有一個(gè)細(xì)胞生長(zhǎng)。形成集落的孔取上清做ELISA，鑒定陽(yáng)性克隆。可以重復(fù)克隆若干次，直到雜交瘤細(xì)胞的陽(yáng)性孔率達(dá)到100％。將克隆化后的雜交瘤細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)，上清做抗體鑒定。
(6)小鼠腹水的誘導(dǎo)選擇與雜交瘤細(xì)胞同源同系的BALB/c小鼠，經(jīng)腹腔注入降植烷或無(wú)菌石蠟油，每只小鼠0.5ml；一周后，將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的雜交瘤細(xì)胞離心棄上清，以生理鹽水重懸，調(diào)節(jié)細(xì)胞密度至107個(gè)/ml左右，注入小鼠腹腔，每只0.5ml。一周以后，小鼠腹部增大，即為產(chǎn)生的腹水?？梢杂么轴橆^扎入腹腔抽取，隔日一次，直至小鼠死亡；也可以直接處死小鼠一次性收集。離心，上清留待純化單克隆抗體。
(7)單克隆抗體的純化利用辛酸-硫酸銨沉淀法純化腹水上清中的單克隆抗體。將腹水上清中加入1～5倍體積的10～100mM的醋酸緩沖液；攪拌下，每毫升腹水上清加入10～500μl辛酸，室溫放置一段時(shí)間或4℃較長(zhǎng)時(shí)間放置，高速低溫離心，棄沉淀留上清；調(diào)節(jié)pH，然后往上清中加入飽和硫酸銨溶液或固體硫酸銨使終濃度為40％～55％，4℃放置1小時(shí)以上，高速低溫離心，棄上清，沉淀即為所純化的單克隆抗體。
實(shí)施例2、hApo-2L及相關(guān)分子的鑒定本發(fā)明制備的單克隆抗體可以用以鑒定E.coli.表達(dá)的hApo-2L、酵母表達(dá)的hApo-2L和天然的hApo-2L；也可以鑒定hApo-2L及相關(guān)分子的各種生物制品，其鑒定方法可以通過(guò)下述兩種途徑實(shí)現(xiàn)一、Western blotting將上述含hApo-2L或相關(guān)分子的混合物做Western blotting，，在相應(yīng)的位置呈清晰單一條帶。具體步驟如下(1)蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺電泳方法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社1998)。選擇合適的凝膠，將含hApo-2L或相關(guān)分子的菌體上清、包涵體破碎液、生物制品溶液、或其他混合物上樣，進(jìn)行蛋白質(zhì)聚丙烯酰胺電泳。
(2)電轉(zhuǎn)移方法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社1998)。用轉(zhuǎn)移槽轉(zhuǎn)移蛋白質(zhì)。轉(zhuǎn)移膜可以是硝酸纖維素膜、PVDF膜或尼龍膜，配制適用于相應(yīng)轉(zhuǎn)移膜的轉(zhuǎn)移緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)移。注意當(dāng)進(jìn)行接觸濾紙、凝膠和膜的操作時(shí)，應(yīng)戴手套。
(3)免疫雜交及顯色方法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》(科學(xué)出版社1998)。用我們制備的單克隆抗體作為一抗，以抗IgG抗體偶聯(lián)物為二抗進(jìn)行免疫雜交，然后以發(fā)色底物顯色。
二、中和實(shí)驗(yàn)將上述含hApo-2L或相關(guān)分子的混合物做中和實(shí)驗(yàn)，中和組樣品活性低于對(duì)照組100倍以上。中和實(shí)驗(yàn)一般用于鑒別生物制品，如水針(含檸檬酸)、粉針(含白蛋白)等，具體步驟如下(1)按照hApo-2L生物活性測(cè)定方法(本實(shí)驗(yàn)室已申請(qǐng)專利，申請(qǐng)?zhí)?1144949.7)，將L929細(xì)胞接種于96孔板。
(2)將hApo-2L及相關(guān)分子制品做系列稀釋(固體制品應(yīng)先溶解)，獲得多個(gè)濃度梯度，然后加入一定濃度的單克隆抗體，合適的條件溫育。對(duì)照品也做系列稀釋，但不加入單克隆抗體中和，而以等體積的基本培養(yǎng)基取代。
(3)溫育后的樣品用MTT方法進(jìn)行生物活性測(cè)定，具體方法參閱本室已申請(qǐng)專利，申請(qǐng)?zhí)?1144949.7。
(4)通過(guò)和對(duì)照組的比較，計(jì)算中和組樣品活性降低的倍數(shù)。
實(shí)施例3、hApo-2L及相關(guān)分子的純化本發(fā)明制備的單克隆抗體可以純化E.coli.表達(dá)的hApo-2L和酵母表達(dá)的hApo-2L，具體步驟如下(1)親和介質(zhì)的偶聯(lián)購(gòu)自Amersham公司的CNBr-activated Sepharose 4B干膠，偶聯(lián)方法根據(jù)產(chǎn)品說(shuō)明書進(jìn)行。
(2)hApo-2L及相關(guān)分子的純化該抗體對(duì)hApo-2L及相關(guān)分子有良好的親和作用，結(jié)合率＞1mg/ml凝膠。將經(jīng)過(guò)純化純度達(dá)60％～90％的樣品經(jīng)透析或大比例稀釋，使蛋白樣品溶于1mM～50mM PB(pH為5.0～8.0，優(yōu)選方案為pH6.5～7.0)中該P(yáng)B內(nèi)含NaCl1mM～100mM，優(yōu)選方案為20mM～50mM，上樣；洗滌；然后以高濃度NaCl洗脫NaCl濃度為200mM～500mM，優(yōu)選方案為250mM～350mM。收集到的主要洗脫峰用SDS-PAGE檢測(cè)，純度可達(dá)95％以上。
實(shí)施例4、hApo-2L及相關(guān)分子制品的定量本發(fā)明制備的單克隆抗體可以用以多種hApo-2L及相關(guān)分子制品的定量，包括水針(含檸檬酸)、粉針(含白蛋白)等。定量實(shí)驗(yàn)可以通過(guò)ELISA進(jìn)行，具體步驟如下(1)抗體的標(biāo)記方法本發(fā)明應(yīng)用辣根過(guò)氧化物酶(HRPO)標(biāo)記單克隆抗體。方法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。(科學(xué)出版社1998)。方法簡(jiǎn)述如下稱取辣根過(guò)氧化物酶溶解，以NaIO4使之充分氧化，然后以乙二醇終止氧化；讓抗體和酶在碳酸鈉緩沖液中充分反應(yīng)，并加入NaBH4穩(wěn)定酶標(biāo)抗體復(fù)合物；最后通過(guò)鹽析和透析等步驟更換溶劑系統(tǒng)，使酶-抗體復(fù)合物溶于PBS中。
(2)夾心ELISA法參見F.奧斯伯等《精編分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)指南》。(科學(xué)出版社1998)。方法包括包被、加樣、加酶標(biāo)抗體、顯色、標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制、計(jì)算等幾個(gè)步驟。
權(quán)利要求
1.一種抗人凋亡素2配體的單克隆抗體，其特征在于該抗體有以下幾種應(yīng)用(1)人凋亡素2配體其相關(guān)分子的的鑒定；(2)人凋亡素2配體及相關(guān)分子的純化；(3)人凋亡素2配體及相關(guān)分子制品的定量。
2.一種抗人凋亡素2配體的單克隆抗體，其特征在于該抗體的制備方法包括以下步驟(1)動(dòng)物的免疫；(2)小鼠骨髓瘤細(xì)胞的培養(yǎng)；(3)細(xì)胞融合；(4)雜交瘤細(xì)胞的篩選；(5)雜交瘤細(xì)胞的克??；(6)小鼠腹水的誘導(dǎo)；(7)單克隆抗體的純化。
3.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用(1)人凋亡素2配體及相關(guān)分子的鑒定是指用Western方法或者中和實(shí)驗(yàn)的方法對(duì)人凋亡素2配體及相關(guān)分子的鑒定。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用(2)人凋亡素2配體及相關(guān)分子的純化是指應(yīng)用該單克隆抗體作為高效親和介質(zhì)進(jìn)行人凋亡素2配體及相關(guān)分子的純化。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述應(yīng)用，其特征在于所述應(yīng)用(3)人凋亡素2配體及相關(guān)分子制品的定量是指用ELISA方法對(duì)人凋亡素2配體及相關(guān)分子制品的定量。
全文摘要
本發(fā)明涉及抗人凋亡素2配體(human apoptosis 2ligand，簡(jiǎn)稱hApo－2L)的單克隆抗體制備及其應(yīng)用。經(jīng)抗原免疫小鼠，收集致敏的小鼠B淋巴細(xì)胞和小鼠骨髓瘤融合，利用ELISA方法判定陽(yáng)性克隆，建立分泌抗hApo－2L的單克隆抗體的細(xì)胞系。把陽(yáng)性的細(xì)胞擴(kuò)大培養(yǎng)并注入同品系小鼠的腹腔誘導(dǎo)腹水，經(jīng)過(guò)收集和純化，可以獲得抗hApo－2L的單克隆抗體。此抗體可用于hApo－2L及相關(guān)分子的鑒定、純化以及hApo－2L及相關(guān)分子制品的定量等。
文檔編號(hào)C12N5/18GK1626553SQ200310117380
公開日2005年6月15日 申請(qǐng)日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月12日
發(fā)明者牛曉霞, 劉金毅, 孫儉波, 程永慶 申請(qǐng)人:北京三元基因工程有限公司, 北京畢艾歐科技發(fā)展有限責(zé)任公司