專利名稱：適用于高密度發(fā)酵的畢赤酵母新菌株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明提供了一種利用基因重組技術(shù)構(gòu)建的適用于高密度發(fā)酵的畢赤酵母新菌株，屬生物技術(shù)領(lǐng)域。
背景技術(shù)：
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，已成功的表達(dá)了多種有應(yīng)用價(jià)值的外源蛋白。但畢赤酵母非常好氧，因此在高密度發(fā)酵中發(fā)酵后期供氧不足問題尤為突出，成為制約進(jìn)一步提高外源蛋白在畢酵母中表達(dá)的瓶頸因素。傳統(tǒng)的解決辦法有(1)增加設(shè)備的供氧能力，如加大攪拌、通風(fēng)等(2)加助溶劑，提高溶氧。但上述辦法不但受設(shè)備、能耗限制，還使發(fā)酵成本大幅度增加。
透明顫菌血紅蛋白具有在貧氧條件下促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)、提高蛋白合成能力的功能，VHb這一特性在耗氧量大，溶氧易成為限制性因素的抗生素工業(yè)，基因工程菌高密度發(fā)酵和供氧受限制的動(dòng)、植物細(xì)胞培養(yǎng)的過程中具有良好的應(yīng)用前景。透明顫菌血紅蛋白基因已在大腸桿菌、假單胞桿菌、鏈霉菌、霉菌和釀酒酵母等多種微生物中成功表達(dá)，并已應(yīng)用于工業(yè)生產(chǎn)中提高α-淀粉酶、青霉素?；?、放線紫紅菌素等的產(chǎn)量。但至今未見透明顫菌血紅蛋白基因在畢赤酵母中應(yīng)用的報(bào)道。
本發(fā)明的目的將透明顫菌血紅蛋白基因應(yīng)用于畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，通過構(gòu)建新型畢赤酵母受體菌，解決畢赤酵母高密度發(fā)酵中的氧氣供求矛盾，為更多外源蛋白在畢赤酵母中的高效表達(dá)提供優(yōu)良宿主。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明將透明顫菌血紅蛋白基因?qū)肽壳皬V泛應(yīng)用的畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)受體菌，獲得了一種適用于高密度發(fā)酵的新型畢赤酵母。
本發(fā)明的完成包括以下幾個(gè)步驟1.人工設(shè)計(jì)合成透明顫菌血紅蛋白基因根據(jù)透明顫菌血紅蛋白的氨基酸序列，采用畢赤酵母偏愛密碼子并結(jié)合其他一些新基因設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)合成了透明顫菌血紅蛋白基因，編碼序列Sequence No.1。
2.構(gòu)建胞內(nèi)表達(dá)載體以酵母胞內(nèi)載體pPIC3.5K為基礎(chǔ)，構(gòu)建了透明顫菌血紅蛋白基因的重組胞內(nèi)表達(dá)載體pPIC3.5KV。
3.轉(zhuǎn)化酵母，篩選適量表達(dá)透明顫菌血紅蛋白的重組酵母線性化處理表達(dá)載體pPIC3.5KV，轉(zhuǎn)化畢赤酵母GS115，經(jīng)篩選獲得在胞內(nèi)適量表達(dá)透明顫菌血紅蛋白的重組酵母GS115/pPIC3.5KV，在貧氧條件下，GS115/pPIC3.5KV與GS115相比有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，因此更適于用作外源蛋白在畢赤酵母中表達(dá)的受體菌。
本發(fā)明所涉及的重組酵母由中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期為2003年12月12日，分類命名為巴氏畢赤酵母，編號(hào)為CGMCC No.1074。
透明顫菌血紅蛋白在本發(fā)明構(gòu)建的重組畢赤酵母中的表達(dá)，提高了該菌株利用氧的能力，促進(jìn)其在貧氧條件下的細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，可提高外源蛋白的產(chǎn)率。同時(shí)，可以降低氧氣和能量的消耗，還不許附加的設(shè)備投資，因此可大幅度降低高密度發(fā)酵成本。因此，本發(fā)明所構(gòu)建的畢赤酵母新菌株具有廣闊的應(yīng)用前景。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)的設(shè)計(jì)合成與克隆根據(jù)透明顫菌血紅蛋白(VHb)的氨基酸序列，采用畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)了vgb基因。為了克隆方便，在序列5’端和3’端分別引入BamHI和EcoRI位點(diǎn)，并在兩個(gè)酶切位點(diǎn)的外側(cè)分別加上了3個(gè)保護(hù)堿基。為了保證vgb基因能在畢赤酵母中高效起始轉(zhuǎn)錄，在起始密碼子ATG前加上了AAACG，與ATG構(gòu)成Kozak序列。
按照上述設(shè)計(jì)好的序列人工合成了6條寡核苷酸片段，然后用多聚核苷酸激酶使寡核苷酸片段磷酸化，再進(jìn)行退火和連接反應(yīng)獲得透明顫菌血紅蛋白基因。
用BamHI和EcoRI雙酶切透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)，與同樣雙酶切處理的pUC19連接，獲得重組質(zhì)粒pUC19V，轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5a。經(jīng)測(cè)序驗(yàn)證，序列與設(shè)計(jì)完全相符。
實(shí)施例二 畢赤酵母胞內(nèi)表達(dá)載體的構(gòu)建用BamHI和EcoRI從pUC19V上切下vgb基因，與同樣雙酶切處理的pPIC3.5K連接，獲得重組載體pPIC3.5KV。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒DNA，用BamHI和NotI雙酶切鑒定，證明vgb基因已定向克隆到pPIC3.5K的BamHI和EcoRI位點(diǎn)之間。
實(shí)施例三 酵母轉(zhuǎn)化及重組酵母的篩選用SacI酶切5-10μg重組質(zhì)粒pPIC3.5KV使之線性化，通過電擊法轉(zhuǎn)化宿主菌畢赤酵母GS115(His-，Mut+)，再經(jīng)組氨酸營(yíng)養(yǎng)缺陷型篩選、分子檢測(cè)(PCR、Southern雜交、Northern雜交)和蛋白表達(dá)檢測(cè)(SDS-PAGE)和CO-差示光譜檢測(cè)獲得在胞內(nèi)適量表達(dá)透明顫菌血紅蛋白的重組酵母GS115/pPIC3.5KV。
實(shí)施例四 vgb基因表達(dá)對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)的影響將重組酵母GS115/pPIC3.5KV和對(duì)照菌GS115分別在正常和貧氧條件下誘導(dǎo)培養(yǎng)，定時(shí)取樣測(cè)定菌體密度OD600，繪制生長(zhǎng)曲線，分析不同溶氧條件下vgb基因表達(dá)對(duì)畢赤酵母生長(zhǎng)的影響。在氧貧乏條件下，GS115/pPIC3.5KV明顯比對(duì)照菌GS115長(zhǎng)勢(shì)要好；在正常培養(yǎng)條件下，誘導(dǎo)72小時(shí)之前，GS115/pPIC3.5KV與對(duì)照菌GS115生長(zhǎng)差別甚微，但隨著誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，菌體密度增大，GS115/pPIC3.5KV的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)逐漸明顯。以上結(jié)果可以說明，vgb基因的表達(dá)在氧充足條件下，對(duì)畢赤酵母的生長(zhǎng)沒有明顯的作用；但在貧氧條件下，卻能夠明顯促進(jìn)畢赤酵母的生長(zhǎng)，提高菌體的生長(zhǎng)速度。
序列表SEQUENCE LISTING<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所<120>適用于高密度發(fā)酵的畢赤酵母新菌株<130>適用于高密度發(fā)酵的畢赤酵母新菌株<160>1<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>435<212>DNA<213>人工序列<400>1cttgatcaac agactatcaa catcatcaag gctactgttc cagtgttgaa ggagcatgga 60gttactatca ctactacttt ctacaagaac ttgttcgcta agcatccaga ggtgagacca120ttgttcgata tgggaagaca agagtctctt gagcaaccaa aggctcttgc tatgactgtt180cttgctgctg ctcagaacat cgagaacctt ccagctatcc ttccagctgt gaagaagatc240gctgtgaagc attgccaagc tggagttgct gctgctcact acccaatcgt tggacaagag300ttgcttggag ctatcaagga ggtgcttgga gatgctgcta ctgatgatat ccttgatgct360tggggaaagg cttacggagt gatcgctgat gtgttcatcc aagttgaggc tgacttgtac420gctcaagctg ttgag 43權(quán)利要求
1.透明顫菌血紅蛋白DNA序列Sequence No.1，其特征在于該序列由畢赤酵母偏愛密碼子組成。
2.包含根據(jù)權(quán)利要求1中DNA序列的重組表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組畢赤酵母，其特征在于可表達(dá)權(quán)力要求1中所述的DNA序列，在貧氧條件下有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，適用于高密度發(fā)酵。
4.根據(jù)權(quán)利要求4的重組畢赤酵母，保藏登記號(hào)為CGMCC NO.1074。
5.用畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的方法，其特征在于受體菌為權(quán)力要求3中所述的重組酵母。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的方法，其中所說重組酵母為重組畢赤酵母。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所說的重組畢赤酵母是畢赤酵母CGMCC NO.1074。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種適用于高密度發(fā)酵的畢赤酵母新菌株。將人工合成的透明顫菌血紅蛋白基因(vgb)轉(zhuǎn)入畢赤酵母，構(gòu)建出透明顫菌血紅蛋白基因重組畢赤酵母。因透明顫菌血紅蛋白能從分子水平上提高重組菌對(duì)氧氣的利用能力，貧氧條件下促進(jìn)細(xì)胞生長(zhǎng)和產(chǎn)物合成，該重組酵母在貧氧條件具有明顯的生長(zhǎng)優(yōu)勢(shì)，更適用于高密度發(fā)酵，是用畢赤酵母表達(dá)外源蛋白的理想宿主。
文檔編號(hào)C12N15/81GK1546646SQ20031012136
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者李敏, 郭三堆, 李 敏 申請(qǐng)人:中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所