專利名稱：用畢赤酵母分泌表達(dá)高甜度莫奈靈的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬生物技術(shù)工程領(lǐng)域，提供了利用畢赤酵母高效生產(chǎn)高甜度莫奈靈的方法。本發(fā)明還提供了人工合成編碼高甜度莫奈靈的基因，攜帶該基因的表達(dá)載體以及能高效分泌表達(dá)高甜度莫奈靈的酵母工程菌。
背景技術(shù)：
天然莫奈靈來源于西非一種熱帶植物(Dioscorephyllum cumminsii)的果實(shí)，是一種蛋白甜味劑，具有糖類、糖醇類、配糖體類和人工甜味劑等其他類型甜味劑無法比擬的優(yōu)點(diǎn)(1)甜度高，莫奈靈的甜度是相同重量蔗糖甜度的3000倍。用其代替蔗糖用于生產(chǎn)，可大大降低原料包裝、保藏、運(yùn)輸?shù)荣M(fèi)用，從而大幅度降低生產(chǎn)成本。(2)熱量低，莫奈靈碳水化合物含量為0，代謝產(chǎn)生的熱量少，糖尿病、肥胖癥、高血壓、心血管病等患者均可食用。(3)口味純正，無不良余味。(4)安全，長期食用對(duì)人體無任何毒副作用。(5)對(duì)細(xì)菌作用的穩(wěn)定性高，不會(huì)導(dǎo)致齲齒。(6)莫奈靈還是一種增香劑，尤其對(duì)天然香料，效果更明顯。因此莫奈靈是一種理想的甜味劑，可廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、飼料等工業(yè)，市場(chǎng)前景廣闊。
目前，獲得莫奈靈的途徑有四條(1)從天然植物來源中提取，莫奈靈天然植物來源非產(chǎn)有限，又很難在其他地區(qū)引種成功；(2)用固定相合成法合成，所用原料是氨基酸，成本太高；(3)從轉(zhuǎn)基因植物中提取，現(xiàn)已獲得的轉(zhuǎn)基因植物中莫奈靈的表達(dá)量太低，而且植物生長周期長；(4)利用基因工程菌發(fā)酵生產(chǎn)。微生物生長快，易培養(yǎng)，因此構(gòu)建基因工程菌，通過發(fā)酵生產(chǎn)莫奈靈是實(shí)現(xiàn)莫奈靈規(guī)?；a(chǎn)的有效途徑。迄今，莫奈靈已在幾種微生物中以胞內(nèi)形式表達(dá)。崔洪志等采用原核生物偏愛的密碼子合成的莫奈靈基因，在大腸桿菌中表達(dá)效率為菌體可溶性蛋白的20％(崔洪志等，中國農(nóng)業(yè)科學(xué)，1999，32(1)58-62)。在此基礎(chǔ)上，郭三堆等通過定點(diǎn)突變，獲得高甜度莫奈靈基因(其產(chǎn)物甜度為相同重量蔗糖的4500倍)，并獲得大腸桿菌工程菌，高甜度莫奈靈在發(fā)酵液中的產(chǎn)量為240mg/L(郭三堆等，中國發(fā)明專利，ZL 98102420.3)。Kondo等將莫奈靈基因表達(dá)于產(chǎn)朊假絲酵母(Candida utilis)，取得的單產(chǎn)為10mg/g濕菌重(Kondo et al，Nat Biotechnol，1997 May；15(5)453-457)。于學(xué)紅等構(gòu)建了畢赤酵母工程菌，莫奈靈產(chǎn)量達(dá)到1.8g/L(于學(xué)紅等，復(fù)旦學(xué)報(bào)(自然科學(xué)版)，2002，41(6)650-654)。但由于現(xiàn)有的工程菌存在產(chǎn)量低，胞內(nèi)表達(dá)提取困難的兩大難題，使莫奈靈生產(chǎn)成本居高不下，仍然無法滿足工業(yè)化生產(chǎn)和商業(yè)開發(fā)的要求，從而限制了莫奈靈的應(yīng)用。
本發(fā)明的目的是，利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建高效表達(dá)、有效分泌高甜度莫奈靈的酵母工程菌。以期解決目前莫奈靈基因工程菌存在的單產(chǎn)低、從胞內(nèi)提取困難的兩大難題，建立一種簡便、快速、可低成本、大規(guī)模生產(chǎn)高甜度莫奈靈的方法。

發(fā)明內(nèi)容
畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)是目前應(yīng)用最廣泛的表達(dá)系統(tǒng)，已成功的表達(dá)了多種有應(yīng)用價(jià)值的外源蛋白。本發(fā)明利用畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，構(gòu)建了可高效分泌表達(dá)高甜度莫奈靈的重組酵母工程菌，建立了工程菌高密度發(fā)酵工藝和簡便的高甜度莫奈靈提純工藝，使高甜度莫奈靈的生產(chǎn)成本大大降低，為實(shí)現(xiàn)高甜度莫奈靈的規(guī)模生產(chǎn)和廣泛應(yīng)用奠定了基礎(chǔ)。
本發(fā)明的完成包括以下幾個(gè)步驟1.人工設(shè)計(jì)合成高甜度莫奈靈基因根據(jù)高甜度莫奈靈的氨基酸序列，本發(fā)明采用畢赤酵母偏愛密碼子并結(jié)合其他一些新基因設(shè)計(jì)原理設(shè)計(jì)合成了高甜度莫奈靈基因，編碼序列Sequence No.1。
2.構(gòu)建分泌型表達(dá)載體以酵母分泌型表達(dá)載體pPIC9K為基礎(chǔ)，將高甜度莫奈靈基因以正確的閱讀框架融合到a-因子信號(hào)肽的下游，構(gòu)建了重組分泌表達(dá)載體pPIC9KM。表達(dá)檢測(cè)結(jié)果表明，a-因子信號(hào)肽能有效引導(dǎo)高甜度莫奈靈的分泌。
3.轉(zhuǎn)化酵母，篩選高表達(dá)酵母工程菌將線性化表達(dá)載體轉(zhuǎn)化畢赤酵母，經(jīng)篩選獲得高效分泌表達(dá)高甜度莫奈靈的酵母工程菌GS115/pPIC9KM，因表達(dá)載體整合到了酵母基因組中，因此工程菌的遺傳穩(wěn)定性好。
4.高密度發(fā)酵表達(dá)在30L發(fā)酵罐中進(jìn)行發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，確定了酵母工程菌的高密度發(fā)酵工藝。高甜度莫奈靈在發(fā)酵液中的分泌表達(dá)量達(dá)2g/L，高于已有報(bào)道的水平。
5.高甜度莫奈靈的提純高甜度莫奈靈分泌至胞外，且畢赤酵母自身分泌的內(nèi)源蛋白又很少，使得高甜度莫奈靈的提純工藝與從胞內(nèi)提取的方式相比大為簡化。只需經(jīng)離心收集上清、超濾濃縮和離子交換層析即可得到純度＞98％的高甜度莫奈靈。
本發(fā)明所涉及的酵母工程菌由中國微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心保藏，保藏日期為2003年12月12日，分類命名為巴氏畢赤酵母，編號(hào)為CGMCC No.1073。
本發(fā)明提供的高甜度莫奈靈生產(chǎn)方法與已有的其他方式相比，有明顯的優(yōu)勢(shì)(1)產(chǎn)率高；(2)原料價(jià)廉易得；(3)工藝簡便。因此，生產(chǎn)成本大幅度降低。上述優(yōu)勢(shì)使本發(fā)明具有明顯的技術(shù)創(chuàng)新性和工藝先進(jìn)性，產(chǎn)率提高，成本降低，更適合于工業(yè)化生產(chǎn)高甜度莫奈靈。
具體實(shí)施例方式
實(shí)施例一 高甜度莫奈靈基因的設(shè)計(jì)、合成及克隆根據(jù)高甜度莫奈靈的氨基酸序列，采用畢赤酵母偏愛密碼子設(shè)計(jì)了高甜度莫奈靈基因。為了克隆方便，在序列5’端和3’端分別引入BamHI和EcoRI位點(diǎn)。為了保證高甜度莫奈靈基因按正確的閱讀框架，融合到分泌表達(dá)載體的α-因子信號(hào)肽編碼序列的下游，基因序列前重建XhoI位點(diǎn)和α-因子信號(hào)肽切割位點(diǎn)(Lys Arg)的編碼序列(AAG AGA)。
按照上述設(shè)計(jì)好的序列人工合成了6條寡核苷酸片段，然后用多聚核苷酸激酶使寡核苷酸片段磷酸化，再經(jīng)退火和連接獲得高甜度莫奈靈基因。
用BamHI和EcoRI雙酶切高甜度莫奈靈基因，克隆到質(zhì)粒pUC19的BamHI和EcoRI為點(diǎn)之間，獲得重組質(zhì)粒pUC19M。測(cè)序驗(yàn)證，高甜度莫奈靈基因序列與設(shè)計(jì)完全相符。
實(shí)施例二 重組分泌表達(dá)載體pPIC9KM的構(gòu)建用XhoI和EcoRI從pUC19M上切下高甜度莫奈靈基因，與同樣雙酶切處理的pPIC9K連接，獲得重組載體pPIC9KM。連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌，提取質(zhì)粒DNA，用BamHI和NotI雙酶切鑒定，證實(shí)高甜度莫奈靈基因已定向插入到pPIC9K上α-因子信號(hào)肽編碼序列下游的XhoI和EcoRI位點(diǎn)之間。進(jìn)一步測(cè)序證明，高甜度莫奈靈基因已與α-因子信號(hào)肽編碼序列形成了正確的閱讀框架。
實(shí)施例三 高表達(dá)高甜度莫奈靈酵母工程菌GS115/pPIC9KM的獲得首先用BglII酶切重組質(zhì)粒pPIC9KM，使之線性化，然后電擊轉(zhuǎn)化酵母受體菌畢赤酵母GS115(His-，Mut+)，再經(jīng)組氨酸營養(yǎng)缺陷型篩選、分子檢測(cè)(PCR、Southem雜交、Northern雜交和Westhem雜交)和蛋白表達(dá)檢測(cè)(SDS-PAGE)獲得可高效表達(dá)、有效分泌高甜度莫奈靈的酵母工程菌GS115/pPIC9KM。
實(shí)施例四 高甜度莫奈靈的大規(guī)模生產(chǎn)將酵母工程菌GS115/pPIC9KM在30L發(fā)酵罐上用補(bǔ)料-分批發(fā)酵方式(Fed-bach-fermentation)進(jìn)行高密度發(fā)酵，發(fā)酵液中分泌表達(dá)的高甜度莫奈靈達(dá)2g/L。離心發(fā)酵液，上清經(jīng)超濾濃縮，過CM-Sephdex離子交換層析，即可得到純度＞98％的有甜味活性的高甜度莫奈靈。
序列表rganization Applicant----------------------Street中關(guān)村南大街12號(hào)City北京StateCountry中國PostalCode100081PhoneNumber010-68919850FaxNumberEmailAddress<110>OrganizationName中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所Application Project-------------------<120>Title用畢赤酵母分泌表達(dá)高甜度莫奈靈<130>AppFi1eReference用畢赤酵母分泌表達(dá)高甜度莫奈靈<140>CurrentAppNumber<141>CurrentFilingDate＿＿-＿-＿Sequence No.1--------<213>OrganismName人工序列<400>PreSequenceStringggagagtgggagatcattgatattggaccattcactcaaaaccttggaaagttcgctgttgatgaggagaacaagattggacaatacggaagacttactttcaacaaggttattagaccatgcatgaagaagactatctacgagaacgagagagagatcaggggatacgagtaccaactttacgtctacgcttctaacaagcttttcagagctgatatctctgaggagtacaagactagaggaagaaagcttcttaggttcaacggaccagttccaccacca<212>TypeDNA<211>Length282SequenceName高甜度莫奈靈基因SequenceDescriptionSequence No.2--------<213>OrganismNameGS115/pPIC9KM<400>PreSequenceStringGEWEIIDIGP FTQNLGKFAV DEENKIGQYG RLTFNKVIRP CMKKTIYENE REIRGYEYQL 60YVYASNKLFR ADISEEYKTR GRKLLRFNGP VPPP 94<212>TypePRT<211>Length94SequenceName高甜度莫奈靈氨基酸序列SequenceDescription
權(quán)利要求
1.高甜度莫奈靈DNA序列Sequence No.1，其特征在于該序列由畢赤酵母偏愛密碼子組成。
2.包含根據(jù)權(quán)利要求1中DNA序列的重組表達(dá)載體。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的重組表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的重組細(xì)胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的重組細(xì)胞，其為重組真核細(xì)胞。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的重組真核細(xì)胞，其為重組畢赤酵母。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的重組畢赤酵母，保藏登記號(hào)為CGMCC NO.1073。
7.生產(chǎn)高甜度莫奈靈的方法，其特征在于在酵母中表達(dá)權(quán)力要求1的DNA序列，然后從重組細(xì)胞培養(yǎng)液中分離氨基酸序列為Sequence No.2的高甜度莫奈靈。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所說的酵母選自畢赤酵母、釀酒酵母、多形漢遜酵母、粟酒裂殖酵母。
9.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所說的重組細(xì)胞是重組畢赤酵母。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所說的重組畢赤酵母是畢赤酵母CGMCC NO.1073。
全文摘要
本發(fā)明提供了一種用畢赤酵母分泌表達(dá)高甜度莫奈靈的新型工藝方法。將人工合成的高甜度莫奈靈基因插入酵母表達(dá)質(zhì)粒中，轉(zhuǎn)化酵母后經(jīng)篩選得到高表達(dá)分泌型酵母工程菌，并建立了酵母工程菌的高密度發(fā)酵工藝以及高甜度莫奈靈的分離純化方法。本發(fā)明制備方法簡便，容易純化，表達(dá)水平高，成本低，可用來大規(guī)模工業(yè)化廉價(jià)生產(chǎn)高甜度莫奈靈。高甜度莫奈靈是一種高甜度、低熱量、口味純正、安全無毒的蛋白甜味劑，可廣泛應(yīng)用于食品、飲料、醫(yī)藥、飼料等工業(yè)，市場(chǎng)前景廣闊。
文檔編號(hào)C12N15/11GK1546663SQ20031012136
公開日2004年11月17日 申請(qǐng)日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月15日
發(fā)明者郭三堆, 李敏 申請(qǐng)人:中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所