專利名稱：用于基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒及其制備方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明的技術(shù)方案涉及芽孢桿菌屬載體的DNA重組技術(shù)，具體地說(shuō)是用于早期感受態(tài)基因與脂肽合成酶基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒及其制備方法。
背景技術(shù)：
枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)作為Bacillus的模式種，是重要的工業(yè)酶的來(lái)源。它在不利的環(huán)境條件下會(huì)產(chǎn)生芽孢，整個(gè)分化過(guò)程由一系列基因介導(dǎo)，這些基因有序而又協(xié)調(diào)地表達(dá)，其中至少有6個(gè)σ因子和139個(gè)基因參與。一旦環(huán)境條件適應(yīng)，枯草芽孢桿菌又可以恢復(fù)正常生長(zhǎng)。另外，枯草芽孢桿菌還可自發(fā)進(jìn)入感受態(tài)。目前，對(duì)枯草芽孢桿菌的研究主要包括細(xì)胞壁的合成與細(xì)胞生長(zhǎng)及細(xì)胞分裂；中間代謝過(guò)程酶的基因定位；芽孢形成和萌發(fā)有關(guān)的生化和形態(tài)學(xué)變化的基因的確定；轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)過(guò)程中遺傳交換機(jī)制；感受態(tài)等基因的分析與定位；DNA、RNA與蛋白質(zhì)的合成以及抗生素產(chǎn)生基因定位等。1968年發(fā)現(xiàn)枯草芽孢桿菌可以產(chǎn)生脂肽合成酶。細(xì)菌的信號(hào)傳導(dǎo)和遺傳控制是在復(fù)雜的調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中進(jìn)行的，脂肽合成酶基因處于該調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的中心位置，細(xì)菌在感知外界的刺激和內(nèi)部的各種反應(yīng)，如營(yíng)養(yǎng)水平、細(xì)胞濃度、感受態(tài)、芽孢形成等，都與脂肽合成酶基因有直接或間接的聯(lián)系。但遺憾的是，多年來(lái)人們只著重于感受態(tài)和芽孢的相關(guān)研究，卻忽略了具有如此重要的處于調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中心位置的脂肽合成酶基因的研究。迄今為止，枯草芽孢桿菌的srfA操縱子結(jié)構(gòu)是研究最為深入和廣泛的脂肽合成酶基因(Bourret，R.B.Protein phosphorylationin chemotaxis and two-component regulatory systems of bacteria.J.Biol.Chem.1989，2647085-7088)。從90年代至今，雖然有文獻(xiàn)報(bào)道枯草芽孢桿菌的早期感受態(tài)基因comA與srfA基因的相互作用關(guān)系，但在這些文獻(xiàn)中報(bào)道的實(shí)驗(yàn)受體菌均采用不產(chǎn)脂肽或低產(chǎn)脂肽菌株(1.Cosby，W.M.Altered srf expression in Bacillussubtilis resulting from changes in culture pH is dependent on the Spookoligopeptide permease and the ComQX system of extracellular control.J.Bacteriol.1998，1801438-1445；2.Kim S.B.Involvement of acetyl phosphatein the in vivo activation of the response regulator ComA in Bacillus subtilis.FEMS Microbiol Lett.2001，195179-183；3.Hahn，J.Growth stage signaltransduction and the requirement for srfA induction in development ofcompetence.J.Bacteriol.1991，1737275-7282)，幾乎所有的實(shí)驗(yàn)都采用srfA基因5’末端的幾kb的序列與lacZ形成融合，或是連接在自主復(fù)制質(zhì)粒上，或是整合在基因組染色體上，只獲得了一定量的間接證據(jù)，因此具有局限性。只有以脂肽高產(chǎn)菌株為研究對(duì)象，研究早期感受態(tài)基因comA與脂肽合成酶基因lps的相互作用關(guān)系才能完善該調(diào)控機(jī)制理論，而且只有制備出早期感受態(tài)基因comA與脂肽合成酶基因lps表達(dá)時(shí)間研究所需的質(zhì)粒才能對(duì)脂肽高產(chǎn)菌株中comA和lps基因的表達(dá)時(shí)序進(jìn)行深入研究。CN1371423公開了環(huán)狀脂肽?；D(zhuǎn)移酶編碼區(qū)的核苷酸序列的測(cè)定、以及所述酰基轉(zhuǎn)移酶全氨基酸序列的測(cè)定、含有編碼所述酶的基因的表達(dá)載體以及提供通過(guò)在宿主細(xì)胞中表達(dá)所述表達(dá)載體而制備環(huán)狀脂肽?；D(zhuǎn)移酶的方法；CN1240482和日本專利03-098595都是公開了利用Bacillus subtilis生產(chǎn)多肽的方法。這些報(bào)道與本發(fā)明的技術(shù)主題雖然有點(diǎn)關(guān)聯(lián)，但是并不屬于同一技術(shù)領(lǐng)域，也無(wú)法作為本發(fā)明專利性的對(duì)比文獻(xiàn)?？傊?，通過(guò)對(duì)國(guó)內(nèi)外文獻(xiàn)數(shù)據(jù)庫(kù)的檢索尚未發(fā)現(xiàn)有有關(guān)早期感受態(tài)基因comA與脂肽合成酶基因lps表達(dá)時(shí)序研究所需的質(zhì)粒及其制備方法的報(bào)道。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明所要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供用于基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒及其制備方法，本發(fā)明的質(zhì)粒有兩種，將這兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到由天然物質(zhì)分離獲得的脂肽高產(chǎn)菌株中制備成基因工程菌株，用來(lái)分別研究早期感受態(tài)基因comA與脂肽合成酶基因lps的表達(dá)時(shí)間。
本發(fā)明解決該技術(shù)問(wèn)題所采用的技術(shù)方案是本發(fā)明的用于基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒，包括pMUTIN-COMA系列質(zhì)粒和pDGlps-lacZ系列質(zhì)粒，其中pMUTIN-COMA系列質(zhì)粒包含pMUTIN-COMA1和pMUTIN-COMA2質(zhì)粒，pMUTIN-COMA1的構(gòu)建如圖2所示，pMUTIN-COMA2的構(gòu)建如圖3所示；pDGlps-lacZ系列質(zhì)粒包含pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ和pDGlps(-230～+304)-lacZ質(zhì)粒，pDGlps(-288～+124)-lacZ的構(gòu)建如圖4所示，pDGlps(-288～+262)-lacZ的構(gòu)建如圖5所示，pDGlps(-230～+257)-lacZ的構(gòu)建如圖6所示，pDGlps(-230～+304)-lacZ的構(gòu)建如圖7所示。
pDGlps-lacZ質(zhì)粒中攜帶的脂肽合成酶基因lps的啟動(dòng)子區(qū)，即簡(jiǎn)稱為Plps的序列如下所示GAATTCGC TCTTCGCA AGGGTGTC TTTTTTTT GCCTTTTT TTCGGTTTTTGTGCGG TACACATA GTCATGTA AAGATTGT AAATTGCA GTCAGCAATAAAAAGA ATTGAACG CAGCAGTT CGGTTTAA AAATTTTT ATTTTTCTGTAAATAA TGTTTAGT GGAAATGA TTGCGGCA TCCCGCAA AAATATCCCTGTAAAT AAACTGGA ATCTTTCG GCATCCCG CATGAAAC TTTTCACCCATTTTTC GGTGATAA AAACATTT TTTTCATT TAAAGTGA ACGGTAGTAAGATAAA AAATATTG AAAACAAT GAATAAAT AGCCAAAA ATGTTTCCTATTAGGA TAGGGGAT CTTGCGGT CTTTATCC GCTTATGT TAAACGCCGCAATGCT GACTGACG GCTGCCCG TTTTTATA GCGGCAAT CTGTTTTTTGTTTGGA AGCTCTGC TTTTTAAG TGTAGTAC TTTGGGCT ATTTCGGCTGGTAGTT CATAAGAA TTAAAAGC TGATATGG ATAAGAAA GAGAAAATGCGTTGCA CAGGATCC本發(fā)明的用于基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒的制備方法如下第一步，B.subtilis MO-L010基因組DNA的提取按照下列Bacillus基因組DNA的提取方法，對(duì)B.subtilis MO-L010基因組DNA進(jìn)行提取，得到DNA片斷大小為23kb左右；Bacillus基因組DNA的提取方法①挑取LB培養(yǎng)基平板上新鮮活化的單菌落于5ml LB培養(yǎng)基中，于37℃震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，②轉(zhuǎn)移3ml菌液于5ml離心管中，4℃，轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心5分鐘，棄掉上清液，③將細(xì)菌沉淀物用0.5M NaCl洗一次，盡量空干上清液，④將沉淀重懸于pH＝8.0的50mM Tris緩沖液1ml中，然后加入新鮮配置的溶解在pH＝8.0的0.25M Tris緩沖液中的濃度為10mg/ml的溶菌酶溶液0.2ml和0.25M的EDTA溶液0.8ml，混勻后于37℃放置1小時(shí)，再加入200μl 10％SDS溶液，混勻后于55℃下放置5分鐘，⑤加入體積比為1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混勻，用轉(zhuǎn)速為12000r/min的離心機(jī)，離心10分鐘，形成上下兩相，⑥轉(zhuǎn)移⑤中上相至一新的離心管中，重復(fù)上個(gè)步驟直到無(wú)白色變性蛋白層出現(xiàn)，⑦取上清液，加入3μl 10mg/ml的去DNase的RNase溶液，于37℃水浴1小時(shí)，⑧加入體積比為1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混勻，用轉(zhuǎn)速為12000r/min的離心機(jī)，離心10分鐘，形成上下兩相，⑨轉(zhuǎn)移⑧中上相至一新的離心管中，加入1/10體積的pH＝5.2的3mol/LNaAc溶液和2倍體積的冷無(wú)水乙醇，于-70℃下放置30分鐘，⑩將⑨的液體于4℃下，轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心10分鐘，棄上清液，用70％乙醇洗兩次，干燥后溶于100μl的TE溶液中，在-20℃下保存?zhèn)溆?；第二步，全長(zhǎng)comA序列的擴(kuò)增及測(cè)序按照下列引物設(shè)計(jì)及合成方法，獲得全長(zhǎng)comA序列擴(kuò)增引物如下上游引物5’CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’引物設(shè)計(jì)及合成方法參考Bacillus subtilis全基因組、comA、Psrf序列，以及質(zhì)粒pMUTIN2、pDG1728、pUC19、pHT315序列，使用OLIGO6.0和Primer Premier5.0引物分析軟件進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)，上海Sangon或BioAsia合成；
按照下列DNA擴(kuò)增方法，以B.subtilis MO-L010基因組DNA為模板擴(kuò)增出全長(zhǎng)comA，由上海生工測(cè)序，全長(zhǎng)comA序列4753～5964bp如下CCATAAGC TTGGGGCT TTCTGGCA TTAAGGAG AGAGTCAG GGCTTTAGATGGGCGC CTTCGGAT TGAAACAA GTGAAGGA AAGGGCTT TAAGGCTGATATTGAA ATCGAATT GTAATGGA TTTATAAC GGAAACGA CTTGGCACAGGCCAAG TCTTTTTT ATAAAATG GAAAAGAG TGAGTAAA AGGGAGGAAAACATGA AAAAGATA CTAGTGAT TGATGACC ATCCGGCT GTCATGGAAGGCACCA AGACAATT TTGGAAAC GGATTCGA ATTTGTCT GTTGATTGTCTCAGTC CTGAACCG AGCGAACA GTTTATCA AGCCGCAT GATTTCTCGTCATATG ATCTCATT TTAATGGA TCTGAATC TAGGCGGC GAGGTCAATGGGATGG AGCTTTCT AAACAGAT TTTACAAG AGAATCCT CATTGTAAAATTATCG TGTATACC GGTTATGA GGTCGAGG ATTATTTC GAGGAAGCGATTCGTG CGGGTCTG CACGGTGC CATCAGCA AAACGGAA TCTAAAGAAAAGATCA CCCAATAC ATATACCA CGTACTCA ATGGAGAA ATTTTAGTCGATTTTG CTTACTTT AAACAGCT GATGACTC AGCAAAAA ACAAAGCCGGCTCCTT CCTCTCAA AAAGAACA AGATGTGC TCACACCT AGAGAATGCCTGATTC TTCAAGAA GTTGAAAA AGGATTTA CAAACCAA GAAATCGCAGATGCCC TTCATTTA AGCAAGCG GTCCATTG AATACAGC TTGACATCGATTTTCA ATAAGCTG AATGTCGG TTCACGGA CGGAAGCG GTTTTGATAGCGAAAT CAGACGGT GTACTTTA AATGTTGG GGGTGTAG ATGATGGATACGAAAC ACACATTG CTTGAAGC GCTTGGTA TAGAGATT GTTGAAAACACAGCGG AACGATGC GTTGCGGT CATGCCGG TGGATCAT CGGACGGTGCAGCCGT TCGGATAT TTGCATGG GGGCGCTT CAGTGGCC CTGGCGGAAACAGCGG CGAGCGCA GGTGCACA GAACCTGA TTGATCAT TCAACACAGGCTTGTG TCGGTTTG GAGATTAA CGCCAACC ATTTAAAA TCTGTAAAGGAAGGAA CGGTAAAG GCGATAGC CGAGCCCG TTCATATC GGCAGAACGACGATTG TCTATCAC ATTCACAT ATATGACG AGCAAGAG AGGCTGATCTGAATTC CCADNA擴(kuò)增方法①在200μl薄壁離心管中依次加入下列試劑，成分 體積(μl) 說(shuō)明H2O 33.75 按順序加入薄壁管，在冰上操作10×Ex Taq Buffer(Mg2+free) 5.0025mmol/L MgCl24.002.5mmol/L dNTP Mixture 5.0020pmol/μl上游引物 1.0020pmol/μl下游引物 1.00DNA模板1.0015ng/μl基因組DNA或0.5ng/μl質(zhì)粒TaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.25total volume 50.00②在4℃短暫離心，使液體集中在管的底部，③將薄壁管放在PCR儀中按如下程序開始循環(huán)，熱蓋 103℃熱變性 94℃ 5min
復(fù)性40～50℃ 30sec30個(gè)循環(huán)延伸72℃ 1min/2min保溫72℃ 9min4℃ 無(wú)限長(zhǎng)第三步，構(gòu)建pUCCOMA質(zhì)粒按照第二步的引物設(shè)計(jì)及合成方法，獲得comA編碼序列擴(kuò)增引物，如下上游引物5’GTA AAA GCT TGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’TGT TCT AGA CAA TCG TCG TTC T 3’按照第二步的DNA擴(kuò)增方法，以B.subtilis MO-L010基因組DNA為模板擴(kuò)增出comA編碼序列，并將該序列亞克隆于pUC19載體上，構(gòu)建如圖1所示的pUCCOMA質(zhì)粒，pUCCOMA質(zhì)粒的擴(kuò)增、提取都按照以下E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒DNA的提取等方法進(jìn)行，E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法E.coli JM109感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化參照Promega公司pGEM-T Easy VectorSystems Technical Mannual；E.coli DH5α感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化①在LB液體培養(yǎng)基中接入單菌落，于37℃下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.3～0.4，在4℃，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心10分鐘，收集菌體，②用原體積1/10的PIPES緩沖液輕懸，冰浴30分鐘，PIPES緩沖液的組成為PIPES 2ml、0.5M CaCl212ml、甘油14ml、重蒸水72ml，③在4℃，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心10分鐘，棄盡上清液，輕緩地用1/25 PIPES緩沖液重懸，即成感受態(tài)細(xì)胞，④每100μl感受態(tài)細(xì)胞加入4μl DNA連接產(chǎn)物，彈勻后冰浴30分鐘，⑤于42℃準(zhǔn)確熱激45秒，立即放置在冰上2分鐘，加入200μl LB培養(yǎng)基重懸，在37℃，100r/min振蕩預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)，⑥將預(yù)培養(yǎng)物涂布于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板，20分鐘后倒置平皿，在37℃下正置培養(yǎng)16～20小時(shí)，⑦挑選單菌落，用下列方法提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行電泳，酶切和PCR鑒定，E.coli質(zhì)粒DNA提取方法E.coli質(zhì)粒提取使用經(jīng)典的堿裂解法提取，參照MolecuLar Cloning Alaboratory Mannual，3rded；第四步本發(fā)明質(zhì)粒的構(gòu)建方法I.pMUTIN-COMA質(zhì)粒的構(gòu)建方法1.按照第二步的引物設(shè)計(jì)及合成方法，獲得擴(kuò)增comA response regulatory序列355bp的引物分別如下上游引物5’TTG GAA TTC ATG AAA AAG ATA CTA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’將PCR擴(kuò)增的comA response regulatory序列355bp克隆于pMUTIN4質(zhì)粒，構(gòu)建pMUTIN-COMA1質(zhì)粒，如圖2所示，2.按照第二步的引物設(shè)計(jì)及合成方法，獲得擴(kuò)增comA response regulator序列和HTH-LUXR區(qū)的5’端序列共482bp的引物分別如下上游引物5’GCC AAG CTT GGA AAA CAT GAA AAA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’將PCR擴(kuò)增的comA response regulator序列和HTH-LUXR區(qū)的5’端序列共482bp克隆于pMUTIN4構(gòu)建質(zhì)粒pMUTN-COMA2質(zhì)粒，如圖3所示，構(gòu)建時(shí)將pMUTIN4的lacZ基因與comA基因的讀框融合，發(fā)生同源重組后lacZ基因則完全依賴于PcomA轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，lacZ基因本身的RBS被置換為B.subtilis 168 spoVG基因的RBS，保證lacZ基因在B.subtilis細(xì)胞保持很高的表達(dá)活性；II.pDGlps-lacZ質(zhì)粒的構(gòu)建方法1.按照第二步的引物設(shè)計(jì)及合成方法，獲得脂肽合成酶基因lps的啟動(dòng)子區(qū)，即簡(jiǎn)稱為Plps的序列擴(kuò)增引物如下
上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’CTA GGA TCC GAA ATA GCC CAA AGT 3’以B.subtilis MO-L010全基因組DNA為模板，擴(kuò)增Plps，由上海生工測(cè)序，Plps的序列如下所示GAATTCGC TCTTCGCA AGGGTGTC TTTTTTTT GCCTTTTT TTCGGTTTTTGTGCGG TACACATA GTCATGTA AAGATTGT AAATTGCA GTCAGCAATAAAAAGA ATTGAACG CAGCAGTT CGGTTTAA AAATTTTT ATTTTTCTGTAAATAA TGTTTAGT GGAAATGA TTGCGGCA TCCCGCAA AAATATCCCTGTAAAT AAACTGGA ATCTTTCG GCATCCCG CATGAAAC TTTTCACCCATTTTTC GGTGATAA AAACATTT TTTTCATT TAAAGTGA ACGGTAGTAAGATAAA AAATATTG AAAACAAT GAATAAAT AGCCAAAA ATGTTTCCTATTAGGA TAGGGGAT CTTGCGGT CTTTATCC GCTTATGT TAAACGCCGCAATGCT GACTGACG GCTGCCCG TTTTTATA GCGGCAAT CTGTTTTTTGTTTGGA AGCTCTGC TTTTTAAG TGTAGTAC TTTGGGCT ATTTCGGCTGGTAGTT CATAAGAA TTAAAAGC TGATATGG ATAAGAAA GAGAAAATGCGTTGCA CAGGATCC2.使用下列4對(duì)引物lps5’端序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增的4種lps5’端序列插入pDG1728質(zhì)粒中多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建攜帶Plps的重組質(zhì)粒pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ，pDGlps(-230～+304)-lacZ，它們的構(gòu)建分別如圖4、5、6、7所示，使用引物分別為pDGlps(-288～+124)-lacZ上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’GCA GGA TCC CGT CAG TCA GCA TTG 3’pDGlps(-288～+262)-lacZ上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’CTA GGA TCC GAA ATA GCC CAA AGT 3’pDGlps(-230～+257)-lacZ上游引物5’GTA GAA TTC TCT TCG CAA GGG TGT 3’下游引物5’AAC GGA TCC TCT CTT TCT TAT CCA 3’
pDGlps(-230～+304)-lacZ上游引物5’GTA GAA TTC TCT TCG CAA GGG TGT 3’下游引物5’CAG GGA TCC TGT GCA ACG CAT TTT 3’pDG1728質(zhì)粒攜帶amyE基因兩段末端序列和無(wú)啟動(dòng)子的lacZ基因編碼序列，它的同源重組發(fā)生在amyE基因序列固定位點(diǎn)處；同時(shí)lacZ基因的轉(zhuǎn)錄需要在多克隆位點(diǎn)處插入啟動(dòng)子。
本發(fā)明的有益效果是本發(fā)明提供了研究脂肽高產(chǎn)菌株B.subtilis MO-L010早期感受態(tài)基因comA與脂肽合成酶基因lps表達(dá)時(shí)序所需的質(zhì)粒及其制備方法，并用于研究comA和lps的時(shí)序表達(dá)模式中，同時(shí)優(yōu)化了適合脂肽高產(chǎn)菌株B.subtilisMO-L010的感受態(tài)細(xì)胞制備方法。文獻(xiàn)1.Yasbin，R.E.Transformation andtransfection in lysogenic strains of Bacillus subtilisEvidence forselective induction of prophage in competence cells.J.Bacteriol.1975，121296-304.；2.Anagnostopoulos，C.Requirements for transformation inBacillus subtilis.Bacterio.1961，81741-746.；3.Dubnau，D.Fate oftransforming DNA following uptake by competent Bacillus subtilis I formationand properties of the donor-recipient complex.J.Mol.Biol.1971，56209-221分別報(bào)道了3種枯草芽孢桿菌感受態(tài)細(xì)胞制備方法，它們用于脂肽高產(chǎn)菌株B.subtilis MO-L010都沒(méi)能獲得高轉(zhuǎn)化效率的感受態(tài)細(xì)胞，本發(fā)明將其中的高滲透壓制備感受態(tài)細(xì)胞方法進(jìn)行了優(yōu)化，制備出B.subtilis MO-L010的良好感受態(tài)細(xì)胞，其轉(zhuǎn)化自主復(fù)制質(zhì)粒的效率達(dá)到108個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA，整合質(zhì)粒的轉(zhuǎn)化率達(dá)到1～10個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA。


下面結(jié)合附圖和實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)一步說(shuō)明。
圖1pUCCOMA質(zhì)粒的構(gòu)建圖2pMUTIN-COMA1質(zhì)粒的構(gòu)建圖3pMUTIN-COMA2質(zhì)粒的構(gòu)建圖4pDGlps(-288～+124)-lacZ質(zhì)粒的構(gòu)建圖5pDGlps(-288～+262)-lacZ質(zhì)粒的構(gòu)建圖6pDGlps(-230～+257)-lacZ質(zhì)粒的構(gòu)建圖7pDGlps(-230～+304)-lacZ質(zhì)粒的構(gòu)建具體實(shí)施方式
實(shí)施例1按照上述本發(fā)明的用于基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒的制備方法，制取pMUTIN-COMA系列質(zhì)粒，包含pMUTIN-COMA1和pMUTIN-COMA2質(zhì)粒，pMUTIN-COMA1的構(gòu)建如圖2所示，pMUTIN-COMA2的構(gòu)建如圖3所示。
實(shí)施例2用本發(fā)明pMUTIN-COMA系列質(zhì)粒構(gòu)建B.subtilis NK-LRL1菌株，研究comA基因的表達(dá)時(shí)間。
1.按照B.subtilis MO-L010菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，制備感受態(tài)細(xì)胞，B.subtilis MO-L010菌株感受態(tài)細(xì)胞的制備方法①挑單菌落接種于5ml LB液體培養(yǎng)基中，于37℃180r/min振蕩培養(yǎng)過(guò)夜，全部轉(zhuǎn)移到含0.5M山梨醇的100ml LB液體培養(yǎng)基中，于37℃180r/min振蕩培養(yǎng)至OD600為0.7～0.75；②冰上預(yù)冷20分鐘后，在4℃，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心10分鐘，用預(yù)冷的含0.5M山梨醇；0.5M甘露醇；10％甘油的電擊緩沖液洗四次；③將沉淀重懸于2ml的預(yù)冷的電擊緩沖液中，終細(xì)胞濃度為1.3～1.4×1010cfu/ml，即得感受態(tài)細(xì)胞，直接存儲(chǔ)于-70℃下，該感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化自主復(fù)制質(zhì)粒的效率達(dá)到108個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA，轉(zhuǎn)化整合質(zhì)粒的效率達(dá)到1～10個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA；2.按照下列B.subtilis MO-L010感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化方法，將pMUTIN-COMA1與pMUTIN-COMA2各1μg混勻后，電轉(zhuǎn)化B.subtilis MO-L010，篩選紅霉素抗性菌株即為B.subtilis NK-LRL1菌株，B.subtilis MO-L010感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化方法①60μl感受態(tài)細(xì)胞與1μl質(zhì)粒DNA混合，自主復(fù)制質(zhì)粒，濃度25～50ng/μL；整合質(zhì)粒濃度1～5ug/μl，以不加質(zhì)粒的感受態(tài)細(xì)胞作陰性對(duì)照；②轉(zhuǎn)移至預(yù)冷的電轉(zhuǎn)化杯中；冰上放置1～5分鐘；③1mm electrode gap轉(zhuǎn)化杯，采用2kV/mm，4.5～5.9ms電擊，2mm electrodegap轉(zhuǎn)化杯，采用2.5kV/mm，4.0～5.9ms電擊一次，所用儀器為BioRad，MicropμLserTM；④立即加入500μl含有0.5M山梨醇和0.38M甘露醇的LB培養(yǎng)基；⑤轉(zhuǎn)移至無(wú)菌的1.5ml離心管，37℃，100r/min，預(yù)培養(yǎng)3小時(shí)；⑥將培養(yǎng)液鋪在1/2含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板上，正置2小時(shí)后倒置培養(yǎng)，1/2LB培養(yǎng)基包括胰蛋白胨0.5％、NaCl0.25％、酵母粉0.25％，pH＝7.0～7.2；⑦挑選單菌落，提取質(zhì)粒進(jìn)行電泳、酶切、PCR鑒定。
采用以上方法進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞制備和轉(zhuǎn)化，轉(zhuǎn)化自主復(fù)制質(zhì)粒效率為108個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA，整合載體的轉(zhuǎn)化率為1～10個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA。
3.將B.subtilis NK-LRL1菌株分別用脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基、產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基、芽孢桿菌誘導(dǎo)感受態(tài)培養(yǎng)基于37℃培養(yǎng)，間隔取樣，按照β-半乳糖苷酶活性測(cè)定方法，測(cè)試每個(gè)樣品的β-半乳糖苷酶活性。
1升脂肽發(fā)酵培養(yǎng)基含葡萄糖10g、MgSO4.7H2O0.2g、KH2PO44.1g、NH4NO34g、Na2HPO414.3g、酵母粉0.1g、0.4mol/l的FeSO42μl、0.7mol/l的CaCl24μl，pH＝7.0；1升產(chǎn)孢培養(yǎng)基含蛋白胨1g、葡萄糖1g、酵母粉0.7g、(NH4)2SO40.2g、MgSO4.7H2O0.2g、K2HPO41g，pH＝7.2；1升芽孢桿菌誘導(dǎo)感受態(tài)培養(yǎng)基含葡萄糖5g、(NH4)SO414g、KH2PO46g、檸檬酸三鈉1g、MgSO4.7H2O0.2g、酪氨酸0.2g、酵母粉1g，pH＝7.0；β-半乳糖苷酶活性測(cè)定方法
①無(wú)菌取不同時(shí)間的菌液，在波長(zhǎng)595nm處測(cè)吸光度OD595，4℃12000r/min離心3分鐘；②棄上清液，用冷的1.5ml 25mM pH＝7.4Tris-HCl緩沖液，洗一次；③棄上清液，用1.9ml Z buffer懸起細(xì)胞，加入0.48ml lysozyme貯液，該貯液是將濃度為2.5mg/ml的lysozyme溶于Z buffer中，現(xiàn)用現(xiàn)配，輕混，于37℃溫浴5分鐘；④加24μL 10％Trion-X-100，輕混，貯于冰上；⑤30℃預(yù)熱樣品5分鐘，加0.6ml ONPG溶液，該ONPG溶液是將濃度為4.0mg/ml ONPG溶于Z buffer中獲得，樣品溫浴在30℃水浴中記錄時(shí)間；⑥當(dāng)樣品由無(wú)色轉(zhuǎn)為明顯的黃色后，加1M Na2CO31.2ml終止反應(yīng)，記錄終止時(shí)間；⑦用12000r/min離心10分鐘，以含有1.6ml Z buffer，0.4ml ONPG和1.0ml Na2CO3空白樣3ml為對(duì)照，測(cè)420nm波長(zhǎng)處的吸光度OD420；⑧計(jì)算酶活Unit Definition(1000×OD420)/(reaction time(min)×OD595)Z-bufferNa2HPO4.7H2O 60mM、NaH2PO440mM、KCL 10mM、MgSO4.7H2O 1mM、β-mercaptopethanol 5.0mM，現(xiàn)用現(xiàn)加入Z-bufferB.subtilis NK-LRL1在產(chǎn)脂肽培養(yǎng)基、產(chǎn)芽孢培養(yǎng)基和感受態(tài)培養(yǎng)基中β-半乳糖苷酶活性大小變化趨勢(shì)相同，表明在脂肽大分子代謝產(chǎn)物的合成、感受態(tài)生理狀態(tài)的自發(fā)形成、細(xì)胞分化發(fā)育為芽孢的三個(gè)過(guò)程中，comA的表達(dá)時(shí)序特征是一致的。細(xì)菌進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)早期，PcomA控制的lacZ基因就擁有了很高的轉(zhuǎn)錄與表達(dá)活性；在整個(gè)對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，β-glactosidase活性不斷增強(qiáng)，直至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與平衡期的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，進(jìn)入平衡期后，β-glactosidase活性開始下降。
實(shí)施例3按照上述本發(fā)明的用于基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒的制備方法，制取pDGlps-lacZ系列質(zhì)粒構(gòu)，包含pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ和pDGlps(-230～+304)-lacZ質(zhì)粒，pDGlps(-288～+124)-lacZ的構(gòu)建如圖4所示，pDGlps(-288～+262)-lacZ的構(gòu)建如圖5所示，pDGlps(-230～+257)-lacZ的構(gòu)建如圖6所示，pDGlps(-230～+304)-lacZ的構(gòu)建如圖7所示。
實(shí)施例4用本發(fā)明pDGlps-lacZ系列質(zhì)粒構(gòu)建Bacillus subtilisNK-LRL2菌株，研究lps基因的表達(dá)時(shí)間1.按照實(shí)施例1的B.subtilis MO-L010感受態(tài)細(xì)胞的制備方法，制備感受態(tài)細(xì)胞，該感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化自主復(fù)制質(zhì)粒的效率達(dá)到108個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA，轉(zhuǎn)化整合質(zhì)粒的效率達(dá)到1～10個(gè)轉(zhuǎn)化子/μgDNA，2.按照實(shí)施例1的B.subtilis MO-L010感受態(tài)細(xì)胞的電轉(zhuǎn)化方法，將攜帶Plps的重組質(zhì)粒pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ，pDGlps(-230～+304)-lacZ各0.5μg混勻電轉(zhuǎn)化B.subtilis MO-L010感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)入宿主菌后這些質(zhì)粒大部分會(huì)很快丟失，僅有很少的一些質(zhì)粒與染色體發(fā)生同源重組獲得穩(wěn)定遺傳。同源重組中有發(fā)生雙交換的，也有發(fā)生單交換的，只有Plps～lacZ和抗生素選擇標(biāo)記置換出amyE兩個(gè)片段間序列，造成amyE基因突變的雙交換同源重組，才是本實(shí)驗(yàn)篩選的目標(biāo)。目標(biāo)菌株抗生素表型為Spcr，Erythromycin-Lincomycins，將篩選的目標(biāo)菌株命名為Bacillus subtilis NK-LRL2。
3.將B.subtilis NK-LRL2接種于產(chǎn)脂肽、產(chǎn)芽孢和誘導(dǎo)感受態(tài)三種培養(yǎng)基中，按照本發(fā)明提供的β-半乳糖苷酶活性測(cè)定方法，檢測(cè)β-半乳糖苷酶活性，監(jiān)測(cè)Plps的表達(dá)水平和最佳表達(dá)時(shí)期。
B.subtilis NK-LRL2菌株P(guān)lps控制的lacZ基因表達(dá)與PcomA控制的lacZ基因表達(dá)變化趨勢(shì)差異很大。在三種培養(yǎng)基中，當(dāng)B.subtilis NK-LRL2處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)，β-半乳糖苷酶表達(dá)活性很低，到對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期與平衡期交界的轉(zhuǎn)折點(diǎn)，β-半乳糖苷酶的表達(dá)量激增，直到生長(zhǎng)末期表達(dá)量才下降。由此可見，comA基因與lps基因
Plps的序列如下所示GAATTCGC TCTTCGCA AGGGTGTC TTTTTTTT GCCTTTTT TTCGGTTTTTGTGCGG TACACATA GTCATGTA AAGATTGT AAATTGCA GTCAGCAATAAAAAGA ATTGAACG CAGCAGTT CGGTTTAA AAATTTTT ATTTTTCTGTAAATAA TGTTTAGT GGAAATGA TTGCGGCA TCCCGCAA AAATATCCCTGTAAAT AAACTGGA ATCTTTCG GCATCCCG CATGAAAC TTTTCACCCATTTTTC GGTGATAA AAACATTT TTTTCATT TAAAGTGA ACGGTAGTAAGATAAA AAATATTG AAAACAAT GAATAAAT AGCCAAAA ATGTTTCCTATTAGGA TAGGGGAT CTTGCGGT CTTTATCC GCTTATGT TAAACGCCGCAATGCT GACTGACG GCTGCCCG TTTTTATA GCGGCAAT CTGTTTTTTGTTTGGA AGCTCTGC TTTTTAAG TGTAGTAC TTTGGGCT ATTTCGGCTGGTAGTT CATAAGAA TTAAAAGC TGATATGG ATAAGAAA GAGAAAATGCGTTGCA CAGGATCC全長(zhǎng)comA序列4753～5964bp如下CCATAAGC TTGGGGCT TTCTGGCA TTAAGGAG AGAGTCAG GGCTTTAGATGGGCGC CTTCGGAT TGAAACAA GTGAAGGA AAGGGCTT TAAGGCTGATATTGAA ATCGAATT GTAATGGA TTTATAAC GGAAACGA CTTGGCACAGGCCAAG TCTTTTTT ATAAAATG GAAAAGAG TGAGTAAA AGGGAGGAAAACATGA AAAAGATA CTAGTGAT TGATGACC ATCCGGCT GTCATGGAAGGCACCA AGACAATT TTGGAAAC GGATTCGA ATTTGTCT GTTGATTGTCTCAGTC CTGAACCG AGCGAACA GTTTATCA AGCCGCAT GATTTCTCGTCATATG ATCTCATT TTAATGGA TCTGAATC TAGGCGGC GAGGTCAATGGGATGG AGCTTTCT AAACAGAT TTTACAAG AGAATCCT CATTGTAAAATTATCG TGTATACC GGTTATGA GGTCGAGG ATTATTTC GAGGAAGCGATTCGTG CGGGTCTG CACGGTGC CATCAGCA AAACGGAA TCTAAAGAAAAGATCA CCCAATAC ATATACCA CGTACTCA ATGGAGAA ATTTTAGTCGATTTTG CTTACTTT AAACAGCT GATGACTC AGCAAAAA ACAAAGCCGGCTCCTT CCTCTCAA AAAGAACA AGATGTGC TCACACCT AGAGAATGCCTGATTC TTCAAGAA GTTGAAAA AGGATTTA CAAACCAA GAAATCGCAGATGCCC TTCATTTA AGCAAGCG GTCCATTG AATACAGC TTGACATCGATTTTCA ATAAGCTG AATGTCGG TTCACGGA CGGAAGCG GTTTTGATAGCGAAAT CAGACGGT GTACTTTA AATGTTGG GGGTGTAG ATGATGGATACGAAAC ACACATTG CTTGAAGC GCTTGGTA TAGAGATT GTTGAAAACACAGCGG AACGATGC GTTGCGGT CATGCCGG TGGATCAT CGGACGGTGCAGCCGT TCGGATAT TTGCATGG GGGCGCTT CAGTGGCC CTGGCGGAAACAGCGG CGAGCGCA GGTGCACA GAACCTGA TTGATCAT TCAACACAGGCTTGTG TCGGTTTG GAGATTAA CGCCAACC ATTTAAAA TCTGTAAAGGAAGGAA CGGTAAAG GCGATAGC CGAGCCCG TTCATATC GGCAGAACGACGATTG TCTATCAC ATTCACAT ATATGACG AGCAAGAG AGGCTGATCTGAATTC CCA
權(quán)利要求
1.用于基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒，包括pMUTIN-COMA系列質(zhì)粒和pDGlps-lacZ系列質(zhì)粒，其中pMUTIN-COMA系列質(zhì)粒包含pMUTIN-COMA1和pMUTIN-COMA2質(zhì)粒，pMUTIN-COMA1的構(gòu)建如圖2所示，pMUTIN-COMA2的構(gòu)建如圖3所示；pDGlps-lacZ系列質(zhì)粒包含pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ和pDGlps(-230～+304)-lacZ質(zhì)粒，pDGlps(-288～+124)-lacZ的構(gòu)建如圖4所示，pDGlps(-288～+262)-lacZ的構(gòu)建如圖5所示，pDGlps(-230～+257)-lacZ的構(gòu)建如圖6所示，pDGlps(-230～+304)-lacZ的構(gòu)建如圖7所示。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒，其特征在于pDGlps-lacZ質(zhì)粒中攜帶的脂肽合成酶基因lps的啟動(dòng)子區(qū)，簡(jiǎn)稱為Plps的序列如下所示GAATTCGC TCTTCGCA AGGGTGTC TTTTTTTT GCCTTTTT TTCGGTTTTTGTGCGG TACACATA GTCATGTA AAGATTGT AAATTGCA GTCAGCAATAAAAAGA ATTGAACG CAGCAGTT CGGTTTAA AAATTTTT ATTTTTCTGTAAATAA TGTTTAGT GGAAATGA TTGCGGCA TCCCGCAA AAATATCCCTGTAAAT AAACTGGA ATCTTTCG GCATCCCG CATGAAAC TTTTCACCCATTTTTC GGTGATAA AAACATTT TTTTCATT TAAAGTGA ACGGTAGTAAGATAAA AAATATTG AAAACAAT GAATAAAT AGCCAAAA ATGTTTCCTATTAGGA TAGGGGAT CTTGCGGT CTTTATCC GCTTATGT TAAACGCCGCAATGCT GACTGACG GCTGCCCG TTTTTATA GCGGCAAT CTGTTTTTTGTTTGGA AGCTCTGC TTTTTAAG TGTAGTAC TTTGGGCT ATTTCGGCTGGTAGTT CATAAGAA TTAAAAGC TGATATGG ATAAGAAA GAGAAAATGCGTTGCA CAGGATCC
3.用于權(quán)利要求1所述的基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒的制備方法，其特征在于有如下步驟，第一步，B.subtilis MO-L010基因組DNA的提取按照下列Bacillus基因組DNA的提取方法，對(duì)B.subtilis MO-L010基因組DNA進(jìn)行提取，得到DNA片斷大小為23kb左右；Bacillus基因組DNA的提取方法①挑取LB培養(yǎng)基平板上新鮮活化的單菌落于5ml LB培養(yǎng)基中，于37℃震蕩培養(yǎng)12小時(shí)，②轉(zhuǎn)移3ml菌液于5ml離心管中，4℃，轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心5分鐘，棄掉上清液，③將細(xì)菌沉淀物用0.5M NaCl洗一次，盡量空干上清液，④將沉淀重懸于pH＝8.0的50mM Tris緩沖液1ml中，然后加入新鮮配置的溶解在pH＝8.0的0.25M Tris緩沖液中的濃度為10mg/ml的溶菌酶溶液0.2ml和0.25M的EDTA溶液0.8ml，混勻后于37℃放置1小時(shí)，再加入200μl 10％SDS溶液，混勻后于55℃下放置5分鐘，⑤加入體積比為1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混勻，用轉(zhuǎn)速為12000r/min的離心機(jī)，離心10分鐘，⑥轉(zhuǎn)移上相至一新的離心管中，重復(fù)上個(gè)步驟直到無(wú)白色變性蛋白層出現(xiàn)，⑦取上清液，加入3μl 10mg/ml的去DNase的RNase溶液，于37℃水浴1小時(shí)，⑧加入體積比為1∶1的酚-氯仿1.5～2ml，混勻，用轉(zhuǎn)速為12000r/min的離心機(jī)，離心10分鐘，形成上下兩相，⑨轉(zhuǎn)移⑧中上相至一新的離心管中，加入1/10體積的pH＝5.2的3mol/L NaAc溶液和2倍體積的冷無(wú)水乙醇，于-70℃下放置30分鐘，⑩將⑨的液體于4℃下，轉(zhuǎn)速為12000r/min，離心10分鐘，棄上清液，用70％乙醇洗兩次，干燥后溶于100μl的TE溶液中，在-20℃下保存?zhèn)溆?；第二步，全長(zhǎng)comA序列的擴(kuò)增及測(cè)序按照下列引物設(shè)計(jì)及合成方法，獲得全長(zhǎng)comA序列擴(kuò)增引物如下上游引物5’CCA TAA GCT TGG GGC TTT CTG GCA 3’下游引物5’TGG GAA TTC AGA TCA GCC TCT CTT 3’引物設(shè)計(jì)及合成方法參考Bacillus subtilis全基因組、comA、Psrf序列，以及質(zhì)粒pMUTIN2、pDG1728、pUC19、pHT315序列，使用OLIGO6.0和Primer Premier 5.0引物分析軟件進(jìn)行輔助設(shè)計(jì)，上海Sangon或BioAsia合成；按照下列DNA擴(kuò)增方法，以B.subtilis MO-L010基因組DNA為模板擴(kuò)增出全長(zhǎng)comA，由上海生工測(cè)序，全長(zhǎng)comA序列4753～5964bp如下CCATAAGC TTGGGGCT TTCTGGCA TTAAGGAG AGAGTCAG GGCTTTAGATGGGCGC CTTCGGAT TGAAACAA GTGAAGGA AAGGGCTT TAAGGCTGATATTGAA ATCGAATT GTAATGGA TTTATAAC GGAAACGA CTTGGCACAGGCCAAG TCTTTTTT ATAAAATG GAAAAGAG TGAGTAAA AGGGAGGAAAACATGA AAAAGATA CTAGTGAT TGATGACC ATCCGGCT GTCATGGAAGGCACCA AGACAATT TTGGAAAC GGATTCGA ATTTGTCT GTTGATTGTCTCAGTC CTGAACCG AGCGAACA GTTTATCA AGCCGCAT GATTTCTCGTCATATG ATCTCATT TTAATGGA TCTGAATC TAGGCGGC GAGGTCAATGGGATGG AGCTTTCT AAACAGAT TTTACAAG AGAATCCT CATTGTAAAATTATCG TGTATACC GGTTATGA GGTCGAGG ATTATTTC GAGGAAGCGATTCGTG CGGGTCTG CACGGTGC CATCAGCA AAACGGAA TCTAAAGAAAAGATCA CCCAATAC ATATACCA CGTACTCA ATGGAGAA ATTTTAGTCGATTTTG CTTACTTT AAACAGCT GATGACTC AGCAAAAA ACAAAGCCGGCTCCTT CCTCTCAA AAAGAACA AGATGTGC TCACACCT AGAGAATGCCTGATTC TTCAAGAA GTTGAAAA AGGATTTA CAAACCAA GAAATCGCAGATGCCC TTCATTTA AGCAAGCG GTCCATTG AATACAGC TTGACATCGATTTTCA ATAAGCTG AATGTCGG TTCACGGA CGGAAGCG GTTTTGATAGCGAAAT CAGACGGT GTACTTTA AATGTTGG GGGTGTAG ATGATGGATACGAAAC ACACATTG CTTGAAGC GCTTGGTA TAGAGATT GTTGAAAACACAGCGG AACGATGC GTTGCGGT CATGCCGG TGGATCAT CGGACGGTGCAGCCGT TCGGATAT TTGCATGG GGGCGCTT CAGTGGCC CTGGCGGAAACAGCGG CGAGCGCA GGTGCACA GAACCTGA TTGATCAT TCAACACAGGCTTGTG TCGGTTTG GAGATTAA CGCCAACC ATTTAAAA TCTGTAAAGGAAGGAA CGGTAAAG GCGATAGC CGAGCCCG TTCATATC GGCAGAACGACGATTG TCTATCAC ATTCACAT ATATGACG AGCAAGAG AGGCTGATCTGAATTC CCADNA擴(kuò)增方法①在200μl薄壁離心管中依次加入下列試劑，成分 體積(μl)說(shuō)明H2O 33.75按順序加入薄壁管，在冰上操作10×Ex Taq Buffer(Mg2+free) 5.0025mmol/L MgCl24.002.5mmol/L dNTP Mixture 5.0020pmol/μl上游引物 1.0020pmol/μl下游引物 1.00DNA模板1.00 15ng/μl基因組DNA或0.5ng/μl質(zhì)粒TaKaRa Ex Taq(5U/μl) 0.25total volume 50.00②在4℃短暫離心，使液體集中在管的底部，③將薄壁管放在PCR儀中按如下程序開始循環(huán)，熱蓋 103℃熱變性 94℃ 5min 延伸 72℃ 1min/2min保溫 72℃ 9min4℃ 無(wú)限長(zhǎng)第三步，構(gòu)建pUCCOMA質(zhì)粒按照第二步的引物設(shè)計(jì)及合成方法，獲得comA編碼序列擴(kuò)增引物，如下上游引物5’GTA AAA GCT TGG AAA ACA TGA AAA 3’下游引物5’TGT TCT AGA CAA TCG TCG TTC T 3’按照第二步的DNA擴(kuò)增方法，以B.subtilisMO-L010基因組DNA為模板擴(kuò)增出comA編碼序列，并將該序列亞克隆于pUC19載體上，構(gòu)建如圖1所示的pUCCOMA質(zhì)粒，pUCCOMA質(zhì)粒的擴(kuò)增、提取都按照以下E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備、轉(zhuǎn)化及質(zhì)粒DNA的提取等方法進(jìn)行，E.coli感受態(tài)細(xì)胞的制備和轉(zhuǎn)化方法E.coli JM109感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化參照Promega公司pGEM-T Easy Vector SystemsTechnical Mannual；E.coli DH5α感受態(tài)的制備和轉(zhuǎn)化①在LB液體培養(yǎng)基中接入單菌落，于37℃下振蕩培養(yǎng)至OD600為0.3～0.4，在4℃，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心10分鐘，收集菌體，②用原體積1/10的PIPES緩沖液輕懸，冰浴30分鐘，PIPES緩沖液的組成為PIPES2ml、0.5M CaCl212ml、甘油14ml、重蒸水72ml，③在4℃，轉(zhuǎn)速為5000r/min，離心10分鐘，棄盡上清液，輕緩地用1/25 PIPES緩沖液重懸，即成感受態(tài)細(xì)胞，④每100μl感受態(tài)細(xì)胞加入4μl DNA連接產(chǎn)物，彈勻后冰浴30分鐘，⑤于42℃準(zhǔn)確熱激45秒，立即放置在冰上2分鐘，加入200μl LB培養(yǎng)基重懸，在37℃，100r/min振蕩預(yù)培養(yǎng)1小時(shí)，⑥將預(yù)培養(yǎng)物涂布于含相應(yīng)抗生素的LB培養(yǎng)基平板，20分鐘后倒置平皿，在37℃下正置培養(yǎng)16～20小時(shí)，⑦挑選單菌落，用下列方法提取質(zhì)粒，然后進(jìn)行電泳，酶切和PCR鑒定，E.coli質(zhì)粒DNA提取方法E.coli質(zhì)粒提取使用經(jīng)典的堿裂解法提取，參照MolecuLar Cloning A laboratoryMannual，3rded；第四步本發(fā)明質(zhì)粒的構(gòu)建方法I.pMUTIN-COMA質(zhì)粒的構(gòu)建方法1.按照第二步的引物設(shè)計(jì)及合成方法，獲得擴(kuò)增comA response regulatory序列355bp的引物分別如下上游引物5’TTG GAA TTC ATG AAA AAG ATA CTA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’將PCR擴(kuò)增的comA response regulatory序列355bp克隆于pMUTIN4質(zhì)粒，構(gòu)建pMUTIN-COMA1質(zhì)粒，2.按照第二步的引物設(shè)計(jì)及合成方法，獲得擴(kuò)增comA response regulator序列和HTH-LUXR區(qū)的5’端序列共482bp的引物分別如下上游引物5’GCC AAG CTT GGA AAA CAT GAA AAA 3’下游引物5’GTT AGG ATC CAA ACC GAC ACA 3’將PCR擴(kuò)增的comA response regulator序列和HTH-LUXR區(qū)的5’端序列共482bp克隆于pMUTIN4構(gòu)建質(zhì)粒pMUTN-COMA2質(zhì)粒；II.pDGlps-lacZ質(zhì)粒的構(gòu)建方法1.按照第二步的引物設(shè)計(jì)及合成方法，獲得脂肽合成酶基因lps的啟動(dòng)子區(qū)，即簡(jiǎn)稱為Plps的序列擴(kuò)增引物如下上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’CTA GGA TCC GAA ATA GCC CAA AGT 3’以B.subtilis MO-L010全基因組DNA為模板，擴(kuò)增Plps，由上海生工測(cè)序，Plps的序列如下所示GAATTCGC TCTTCGCA AGGGTGTC TTTTTTTT GCCTTTTT TTCGGTTTTTGTGCGG TACACATA GTCATGTA AAGATTGT AAATTGCA GTCAGCAATAAAAAGA ATTGAACG CAGCAGTT CGGTTTAA AAATTTTT ATTTTTCTGTAAATAA TGTTTAGT GGAAATGA TTGCGGCA TCCCGCAA AAATATCCCTGTAAAT AAACTGGA ATCTTTCG GCATCCCG CATGAAAC TTTTCACCCATTTTTC GGTGATAA AAACATTT TTTTCATT TAAAGTGA ACGGTAGTAAGATAAA AAATATTG AAAACAAT GAATAAAT AGCCAAAA ATGTTTCCTATTAGGA TAGGGGAT CTTGCGGT CTTTATCC GCTTATGT TAAACGCCGCAATGCT GACTGACG GCTGCCCG TTTTTATA GCGGCAAT CTGTTTTTTGTTTGGA AGCTCTGC TTTTTAAG TGTAGTAC TTTGGGCT ATTTCGGCTGGTAGTT CATAAGAA TTAAAAGC TGATATGG ATAAGAAA GAGAAAATGCGTTGCA CAGGATCC2.使用下列4對(duì)引物lps 5’端序列進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將PCR擴(kuò)增的4種lps5’端序列插入pDG1728質(zhì)粒中多克隆位點(diǎn)，構(gòu)建攜帶Plps的重組質(zhì)粒pDGlps(-288～+124)-lacZ、pDGlps(-288～+262)-lacZ、pDGlps(-230～+257)-lacZ，pDGlps(-230～+304)-lacZ，使用引物分別為pDGlps(-288～+124)-lacZ上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’GCA GGA TCC CGT CAG TCA GCA TTG 3’pDGlps(-288～+262)-lacZ上游引物5’TTG GAA TTC GCT CTT CGC AAG GGT 3’下游引物5’CTA GGA TCC GAA ATA GCC CAA AGT 3’pDGlps(-230～+257)-lacZ上游引物5’GTA GAA TTC TCT TCG CAA GGG TGT 3’下游引物5’AAC GGA TCC TCT CTT TCT TAT CCA 3’pDGlps(-230～+304)-lacZ上游引物5’GTA GAA TTC TCT TCG CAA GGG TGT 3’下游引物5’CAG GGA TCC TGT GCA ACG CAT TTT 3’。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于基因表達(dá)時(shí)序研究的質(zhì)粒及其制備方法，包括pMUTIN－COMA系列質(zhì)粒和pDGlps－lacZ系列質(zhì)粒，pMUTIN－COMA系列質(zhì)粒包含pMUTIN－COMA1，其構(gòu)建如圖2所示和pMUTIN－COMA2質(zhì)粒，其構(gòu)建如圖3所示；pDGlps－lacZ系列質(zhì)粒包含pDGlps(－288～+124)－lacZ、pDGlps(－288～+262)－lacZ、pDGlps(－230～+257)－lacZ和pDGlps(－230～+304)－lacZ質(zhì)粒，它們的構(gòu)建分別如圖4、圖5、圖6、圖7所示。將這兩種質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)化到由天然物質(zhì)分離獲得的脂肽高產(chǎn)菌株中制備成基因工程菌，用來(lái)分別研究早期感受態(tài)基因comA與脂肽合成酶基因lps的表達(dá)時(shí)間。
文檔編號(hào)C12N15/52GK1570120SQ200310122108
公開日2005年1月26日 申請(qǐng)日期2003年12月25日 優(yōu)先權(quán)日2003年12月25日
發(fā)明者劉如林, 黃英, 梁鳳來(lái), 顧曉波, 王淑芳 申請(qǐng)人:南開大學(xué)