專利名稱：用于產(chǎn)生體細胞的細胞系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明是關(guān)于細胞系統(tǒng)及產(chǎn)生體細胞的方法。
背景技術(shù)：
許多臨床上常見的慢性神經(jīng)退化疾病，如帕金森氏癥、阿茲海默癥、亨丁頓氏癥及肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥，都是由于中樞神經(jīng)系統(tǒng)(CNS)中的神經(jīng)細胞退化及死亡造成的結(jié)果。神經(jīng)細胞不像表皮及肝臟細胞，無法快速地再生。雖然CNS中的干細胞在正常及神經(jīng)細胞受損的情況下都可復(fù)制及分化，但其復(fù)制速度相當慢，且分化成神經(jīng)細胞的比例非常低。CNS中大部分的干細胞會分化成神經(jīng)膠質(zhì)細胞，因而無法挽救神經(jīng)退化疾病。
神經(jīng)細胞移植提供一個治療神經(jīng)退化疾病的方向，研究人員已試著在活體外及活體內(nèi)從不同的干細胞產(chǎn)生神經(jīng)細胞。一般相信干細胞具有某些特性，包括自我更新、多潛能性、增殖、長壽及分化。在臨床的應(yīng)用上，胚胎、臍帶血及骨髓是最普遍的人類干細胞來源。在胚胎中可治療中樞神經(jīng)系統(tǒng)病變的干細胞主要是神經(jīng)干細胞及囊胚的胚胎干細胞(R.L.Rietze et al.，2001，Nature 412；736-739)。研究也指出為了修還脊髓創(chuàng)傷，以胚胎干細胞(J.W.McDonald et al.，1999，NatureMedicine 51410-1412)或神經(jīng)干細胞(Q.L.Cao et al.，2001，Experimental Neurology 16748-58)移植后，這些細胞主要分化成星細胞及寡樹突細胞，極少數(shù)轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)細胞。除了取得困難、移植后的生存率不高及轉(zhuǎn)變?yōu)樯窠?jīng)細胞的比例極低外，胚胎組織的移植也因為宗教、法律及道德爭議而受到阻礙。
借由直接植入臍帶血中的造血干細胞以治療受損神經(jīng)細胞仍有待研究。然而，活體外模式顯示，臍帶血中的造血干細胞培養(yǎng)在含有0.001％的β-巰基乙醇(βME)培養(yǎng)基中可轉(zhuǎn)型成神經(jīng)細胞的前趨物，其中10％的細胞可進一步被誘導(dǎo)而分化成神經(jīng)細胞及神經(jīng)膠質(zhì)細胞(J.R.Sanchez-Ramos et al.，2001，Experimental Neurology 171109-115；及Y.Ha et al.，2001，Neuroreport 12(16)3523-3527)。由于臍帶血干細胞轉(zhuǎn)變成神經(jīng)細胞的比例相對地較低，因此臍帶血的應(yīng)用及研究主要集中在血液疾病。
骨髓中含有造血干細胞，其提供紅血球、血小板、單核細胞、顆粒細胞及淋巴細胞前趨物的持續(xù)來源。此外，骨髓也含有達到非血液組織干細胞標準的細胞。已有報告指出，老鼠成熟骨髓中的造血干細胞可分化成腦中的微神經(jīng)膠質(zhì)細胞及大神經(jīng)膠質(zhì)細胞(M.A.Eglitis etal.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.944080-4085)。骨髓基質(zhì)中的非造血干細胞被稱為骨髓基質(zhì)細胞(BMSC)或骨髓間葉細胞。BMSC在活體外可分化成骨生成細胞、軟骨生成細胞、脂肪生成細胞、肌纖維生成細胞及其它系統(tǒng)(M.F.Pittenger et al.，1999，Science 284143-147及B.E.Petersen et al.，1999，Science 2841168-1170)。最近，BMSC已被報告可在活體內(nèi)分化為神經(jīng)細胞(S.A.Azizi et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.953908-3913；及G C.Kopen et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.9610711-10716)。
以上所有產(chǎn)生神經(jīng)細胞的多能性細胞都有一個共通的問題這些細胞大部分都分化成神經(jīng)膠質(zhì)細胞(星狀細胞、寡樹突細胞等)而非神經(jīng)細胞。只有在BMSC的活體外培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)BME在神經(jīng)分化上有顯著的效果，其可誘導(dǎo)80％的培養(yǎng)BMSC分化成神經(jīng)細胞(D.Woodbury etal.，2000，Journal of Neuroscience Research 61364-370)。然而，BME對蛋白質(zhì)具有毒性而不適用于人體(K.White et al.，1973，Journal ofpharmaceutical Sciences 62237-241)。因此仍需要開發(fā)新的多功能細胞來源用于產(chǎn)生神經(jīng)細胞。
數(shù)十年來有數(shù)百萬人受到心臟損害而使心肌細胞死亡。心臟受損區(qū)域形成疤痕組織而損害心臟的功能。盡管治療方法有進展且對疾病病理學(xué)的基礎(chǔ)的了解有顯著地增進，每年因心血管疾病死亡的人數(shù)尚未降低到令人滿意的程度。因此，心血管研究人員持續(xù)尋找再生心肌細胞，希望能發(fā)現(xiàn)替換受損心臟組織的方法。
因為建立多效性細胞可能會對早期人類心臟分化、功能性基因體學(xué)、藥學(xué)測試、細胞治療及組織工程的研究造成巨大沖擊，因此尋找可用于分化為有用的心肌細胞，且完全不需憂慮如上所討論的道德及技術(shù)上的問題的新穎細胞的需求日漸增加。

發(fā)明內(nèi)容
為克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺點，本發(fā)明提供產(chǎn)生體細胞的細胞系統(tǒng)。特別地，本發(fā)明的細胞系統(tǒng)包括臍帶間葉細胞。
另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生體細胞的方法，其包括培養(yǎng)臍帶間葉細胞及誘導(dǎo)培養(yǎng)的臍帶間葉細胞細胞分化的步驟。
在一具體實施例中，此培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由外胚層衍生的細胞。
在另一具體實施例中，此培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由中胚層衍生的細胞。
在更另一具體實施例中，此培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由內(nèi)胚層衍生的細胞。


圖1表示臍帶間葉細胞在2mMβ-巰基乙醇中培養(yǎng)48小時后，(A)NF及(B)NeuN的免疫染色結(jié)果。
圖2表示臍帶間葉細胞在(A)FBS-DMEM培養(yǎng)基(控制組)及(B)培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后的型態(tài)。
圖3表示臍帶間葉細胞在培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后，(A)NF及(B)NeuN的免疫染色結(jié)果。
圖4表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基處理不同時間后，其表現(xiàn)NF的比例。
圖5表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基處理后，GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法結(jié)果。
圖6表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)9天后，其(A)parvalbumin(PV)及(B)calbindin-D28K(CB)的免疫染色結(jié)果。
圖7表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后，其GAD的(A)免疫染色及(B)西方墨點法結(jié)果。
圖8(A)表示經(jīng)培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基誘導(dǎo)的臍帶間葉細胞在處理后第0、3、6及9天時，其細胞密度的改變(比例尺100μm)；(B)表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基處理后，以DAPI染色定量細胞密度。
圖9表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天(3D)及9天(9D)后，以DAPI+BrdU雙重染色及NF+BrdU雙重染色的結(jié)果。
圖10表示臍帶間葉細胞在(A)不提供細胞分化因子，及(B)提供細胞分化因子后，其C-肌鈣蛋白I及F-肌動蛋白絲的表現(xiàn)的照片影像。
具體實施例方式
培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可增殖及分化成各種體細胞。
在此使用的「臍帶間葉細胞」乙詞是指位于哺乳類動物臍帶，較佳為人類臍帶間質(zhì)組織中的細胞。
根據(jù)本發(fā)明，臍帶間葉細胞是從臍帶中分離出來，并在已知的細胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)使其增殖。根據(jù)本發(fā)明，適用于培養(yǎng)臍帶間葉細胞的培養(yǎng)基包括但不限于達爾克必需基本培養(yǎng)基(DMEM)。培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可直接用于產(chǎn)生體細胞，或冷凍于液態(tài)氮中用于將來使用。
根據(jù)本發(fā)明，培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可經(jīng)由適當處理而引發(fā)其分化。在本發(fā)明一具體實施例中，培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可分化成來自內(nèi)胚層的體細胞，包括但不限于神經(jīng)細胞及視網(wǎng)膜。在本發(fā)明另一具體實施例中，培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可分化成來自中胚層的體細胞，包括但不限于肌肉細胞(骨骼肌、平滑肌、心肌細胞及心血管細胞)、骨原細胞、軟骨原細胞、腸胃器官及肝臟。在本發(fā)明更另一具體實施例中，培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可分化成來自內(nèi)胚層的體細胞，包括但不限于腸胃器官的黏膜表皮。
培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可添加適當?shù)奶砑游锒T導(dǎo)其神經(jīng)細胞分化。如在培養(yǎng)胚胎干細胞或神經(jīng)干細胞時可加入神經(jīng)生長因子(NGF)以誘導(dǎo)神經(jīng)細胞分化(AM Wobus et al.，1997，Journal of Molecular &Cellular Cardiology 291525-1539.；E Cattaneo及R McKey，1990，Nature 347762-765.)。其它從骨髓基質(zhì)細胞誘導(dǎo)神經(jīng)細胞分化的方法包括但不限于加入視網(wǎng)酸(RA)、表皮生長因子(EGF)及腦源神經(jīng)性因子(BDNF)(J Sanchez-Ramos et al.，2000，Experimental Neurology 164247-256)。另一實驗結(jié)果顯示，β-巰基乙醇(βME)可引發(fā)骨髓基質(zhì)細胞分化成神經(jīng)細胞(D Woodbury et al.，2000，Journal of NeuroscienceResearch 61364-370)。
培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可添加適當添加物而誘導(dǎo)其心肌細胞分化。如可在培養(yǎng)胚胎干細胞時加入催產(chǎn)素以誘導(dǎo)心肌細胞分化(J Paquin etal.，2002，PNAS 99(14)9550-9555)。另一個由骨髓基質(zhì)細胞誘導(dǎo)心肌細胞分化的方法是以5-疊氮胞(5-azacytidine)處理。電子顯微鏡顯示有包括典型肌節(jié)及心房顆粒的類心肌細胞的超結(jié)構(gòu)產(chǎn)生，(K Fukuda，2001，Artificial Organs 25(3)187-193)。
在本發(fā)明一較佳具體實施例中，以借由將神經(jīng)細胞培養(yǎng)于基礎(chǔ)培養(yǎng)基6至9天而制備的培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間葉細胞，可高度(87％)分化成功能性后分裂神經(jīng)細胞。培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的培養(yǎng)基是另一個同時申請專利的標的(序號091136135)。
在本發(fā)明的另一較佳具體實施例中，培養(yǎng)于加有細胞分化因子，如5-疊氮胞，的培養(yǎng)基中的臍帶間葉細胞可分化成心肌細胞或心血管細胞。
以下分析是用以定性根據(jù)本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的神經(jīng)細胞。
NF的免疫細胞化學(xué)神經(jīng)纖維(NF)是神經(jīng)細胞中的主要細胞骨骼，其負責(zé)調(diào)整神經(jīng)細胞樹突的大小、外觀及直徑。只有在發(fā)育晚期及成熟期的神經(jīng)細胞才會表現(xiàn)NF。對NF的免疫染色可用以確定神經(jīng)細胞處于晚期。
NeuN的免疫細胞化學(xué)神經(jīng)細胞特定核蛋白(NeuN)是脊椎動物中樞神經(jīng)系統(tǒng)神經(jīng)細胞細胞核中的特殊蛋白。在活體外NeuN可和DNA結(jié)合。已知在神經(jīng)細胞發(fā)育中，NeuN的出現(xiàn)較NF早。因此對NeuN的免疫染色可用以確定神經(jīng)細胞處于轉(zhuǎn)型早期。
GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法在哺乳動物的CNS中，麩胺酸是主要的刺激神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)。大部分的神經(jīng)細胞都有麩胺酸受體來接收刺激信息。其中主要有二類麩胺酸受體離子型及代謝型。離子型受體可依照其不同的選擇性激動劑，進一步再分為NMDA(N-甲基-D-天門冬胺酸)受體、AMPA(α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異唑基丙酸)受體及KA(海人草酸)受體。KA受體是由GluR5、GluR6、GluR7、KA1及KA2等次單元形成。因此，利用西方墨點法檢測GluR5、GluR6、GluR7及KA2可確定神經(jīng)細胞具有合成功能性蛋白質(zhì)的能力。
Ca2+結(jié)合蛋白的免疫細胞化學(xué)Ca2+在細胞的信息傳遞途徑中扮演重要的角色。然而，在細胞中大部分的Ca2+并不是單獨作用，而是和Ca2+結(jié)合蛋白相結(jié)合。Ca2+結(jié)合蛋白可以緩沖細胞內(nèi)的Ca2+濃度，進而調(diào)節(jié)Ca2+的活性。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中存在著許多種類的Ca2+結(jié)合蛋白，分布最廣的是parvalbumin(PV)、calbindin-D28K(CB)及calretinin。PV及CB皆屬于EF-hand型Ca2+結(jié)合蛋白家族。在胚胎神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育期間，PV及CB被認為是神經(jīng)細胞特定表現(xiàn)的Ca2+結(jié)合蛋白。因此，對PV及CB的免疫染色可用以確定神經(jīng)細胞具有合成功能性蛋白質(zhì)的能力。
BrdU及DAPI的雙重標記DAPI(4′，6-二基-2-苯基二鹽酸鹽)是一種螢光染料，可自由地通過細胞膜和核膜，并和細胞核中的DNA結(jié)合，通常用以計算細胞的數(shù)目。此外，在細胞復(fù)制過程中，細胞須合成另一組染色體，并將外加的BrdU(溴化去氧尿核，其為胸腺嘧啶核酸的相似物)納入所合成的染色體中。因此，觀察BrdU的納入可用以確定細胞的復(fù)制。BrdU及DAPI的雙重標記可確定神經(jīng)細胞的復(fù)制。
BrdU及NF的雙重標記如上所述，NF的免疫染色用以確定是否為神經(jīng)細胞，BrdU則用以確定細胞的復(fù)制。因此，NF及BrdU的雙重標記可確定神經(jīng)細胞的復(fù)制能力。
GAD的免疫細胞化學(xué)GABA是神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)的一，其是由麩胺酸經(jīng)麩胺酸去羧基(GAD)催化而合成。因此，利用對GAD的免疫染色可確定神經(jīng)細胞具有合成神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)GABA的能力。
根據(jù)本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的神經(jīng)細胞可用于治療神經(jīng)退化疾病，如帕金森氏癥、阿茲海默癥、亨丁頓氏癥，及肌萎縮性脊髓側(cè)索硬化癥或因中風(fēng)及外傷造成的神經(jīng)細胞死亡。
以下的分析是用于定性根據(jù)本發(fā)明的方法所產(chǎn)生的心肌細胞及心血管細胞。
心臟肌鈣蛋白(Troponin)I/F-肌動蛋白的免疫細胞化學(xué)利用免疫細胞化學(xué)，可于形成收縮的心肌細胞之間葉細胞中研究心臟特殊蛋白質(zhì)的存在及其空間組織。特殊的心臟細胞標記，如心臟肌鈣蛋白I，已被證明(Kehat et al.，2001.)可在收縮的心肌細胞中陽性染色，以證實該細胞性質(zhì)為心肌細胞而非骨骼肌細胞。此外，為證明該間葉細胞可組成整齊的排列，就像心臟組織的細胞排列方式，該細胞也以F-肌動蛋白(其為維持完整細胞結(jié)構(gòu)的細胞骨架必需蛋白質(zhì))染色。
由以下的實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不應(yīng)以此限定本發(fā)明的范圍。
實施例1人類臍帶間葉細胞的制備人類臍帶間葉細胞是從一提供接生服務(wù)的診所(蔡氏婦產(chǎn)科診所，臺北市北投區(qū)石牌路一段72號)取得。臍帶以無菌操作方式收集并在4℃下儲存于HBSS(Biochrom L201-10)不超過24小時。
臍帶先泡在75％的乙醇中30秒以消毒。在無菌操作臺中將消毒過的臍帶置于無鈣及無鎂離子的緩沖溶液(CMF，Gibco 14185-052)，以消毒過的器具將臍帶縱切，并將其中的血管及間葉組織(瓦頓氏凝膠)去除。將間葉組織切成0.5立方公分的小塊，以250×g離心5分鐘。去除上清液，并以適量的無血清DMEM(Gibco 12100-046)清洗沉淀物二次，再以250×g離心5分鐘。間葉組織在37℃下以膠原 處理14至18小時，清洗后，再以2.5％的胰蛋白 于37℃及震蕩下處理30分鐘。加入FBS(Hyclone SH30071.03)至間葉組織以終止胰蛋白反應(yīng)。此時間葉組織已變成間葉細胞。
間葉細胞以10％FBS-DMEM使其分散并計算其數(shù)量后，便可直接用于培養(yǎng)。
實施例2利用β-巰基乙醇(BME)將臍帶間葉細胞轉(zhuǎn)形為神經(jīng)細胞將由實施例1得來的臍帶間葉細胞培養(yǎng)于10％FBS-DMEM中72小時。于培養(yǎng)物中加入2mM的βME繼續(xù)培養(yǎng)72小時。結(jié)果顯示于圖1。
如圖1(A1及A2)所示，臍帶間葉細胞培養(yǎng)于2mMβME72小時后可表現(xiàn)NF，顯示臍帶間葉細胞已轉(zhuǎn)形為神經(jīng)細胞。
如圖1(B1及B2)所示，臍帶間葉細胞培養(yǎng)于2mMβME72小時后可表現(xiàn)NeuN，顯示臍帶間葉細胞已轉(zhuǎn)形為神經(jīng)細胞。
實施例3利用培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的10％FBS-DMEM將臍帶間葉細胞轉(zhuǎn)形成神經(jīng)細胞(a)培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的10％FBS-DMEM的制備用以制備培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM的神經(jīng)細胞是取自七天大的史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠的腦部(中華民國臺灣省臺北市國立陽明大學(xué)動物中心)。
在以下的操作的前，先將含有24ml10％FBS-DMEM的50ml離心管置于37℃培養(yǎng)箱內(nèi)。
大鼠以i.p.注射給予0.3ml的10％水合氯化物。3至4分鐘后，完全麻醉的大鼠以75％乙醇全身消毒。在無菌操作臺中將大鼠腦取出并置于CMF中。將腦以900rpm離心5分鐘。去除上清液，添加10％FBS-DMEM至沉淀物(腦組織)。以移液器吸放15次將腦組織打散成單細胞。將打散的細胞加至的前準備的50ml離心管，與其中的FBS-DMEM充分混合。將此混合物加至24孔盤的涂覆有聚-L-離胺酸的孔中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天加入最終濃度為2μM的阿糖胞(Arac)。
培養(yǎng)的第五天，此培養(yǎng)基即可取出用來培養(yǎng)臍帶間葉細胞。
(b)臍帶間葉細胞轉(zhuǎn)形為神經(jīng)細胞將由實施例1得到的臍帶間葉細胞，培養(yǎng)于由實施例2得到的培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基中，或培養(yǎng)于FBS-DMEM(控制組)中，置于37℃培養(yǎng)箱。在第3、6、9及12天收集細胞。
如圖2(A)所示，培養(yǎng)于FBS-DMEM 6天的臍帶間葉細胞(控制組)的形態(tài)為紡錘型，且因細胞增殖而互相緊密地貼附。培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基6天的臍帶間葉細胞顯現(xiàn)神經(jīng)的表型，包括細胞體收縮、細胞突起的延伸(process elaboration)及細胞集簇(圖1B)。
實施例4神經(jīng)細胞分化的定性分析在實施例3中收集的細胞用做以下的分析，其結(jié)果描述如下(1)NF的免疫染色以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶于0.1M PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％TritonX-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結(jié)合。
處理后的細胞與初級抗體(兔子抗神經(jīng)纖維200多株IgG，1∶250稀釋，Chemicon AB1982)在4℃下反應(yīng)至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的的山羊抗兔子IgG，1∶1000稀釋，Sigma b-8895)在室溫下反應(yīng)1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應(yīng)1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯(lián)苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris緩沖溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應(yīng)，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠(permount)封在載玻片上并在光學(xué)顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖3(A)所示，培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基6天的臍帶間葉細胞表現(xiàn)NF，顯示其已轉(zhuǎn)型成神經(jīng)細胞。
本實驗也測定以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基處理不同時間的臍帶間葉細胞表現(xiàn)NF的比例。如圖4所示，處理后第3天有59.4％的臍帶間葉細胞表現(xiàn)NF，處理后第6天NF的表現(xiàn)量達到最大，87.4％。處理時間延長NF表現(xiàn)量既不升高也不降低(n＝3，單因子變異數(shù)分析，續(xù)以LSD分析，P＜0.01)。
(II)NeuN的免疫染色以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶于0.1M PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％TritonX-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結(jié)合。
處理后的細胞與初級抗體(小鼠抗神經(jīng)核單株IgG，1∶100稀釋，Chemicon MAB377)在4℃下反應(yīng)至少36至42小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的山羊抗老鼠IgG，1∶250稀釋，Chemicon AP124B)在室溫下反應(yīng)1小時；再以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應(yīng)1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯(lián)苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris緩沖溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應(yīng)，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上并在光學(xué)顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖3(B)所示，培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基6天的臍帶間葉細胞表現(xiàn)NeuN，顯示其已轉(zhuǎn)型成神經(jīng)細胞。
(III)GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法(a)細胞膜的制備細胞膜的制備是由以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM處理不同時間的臍帶間葉細胞及七天齡大鼠的腦而得。以0.1M磷酸緩沖液清洗培養(yǎng)的細胞3分鐘二次。在4℃下添加Tris-HCl緩沖液(50mM，pH 7.4)至細胞，以刮刀將細胞從培養(yǎng)皿上刮除。將刮除的細胞置于一15ml的鐵氟龍-玻璃均質(zhì)機中磨20次以使其均質(zhì)化，接著在4℃下以30000g離心30分鐘。所得到的沉淀物大部分為細胞膜，再磨沉淀物并溶解于適量的Tris-HCl緩沖溶液中，儲存于-20℃冰箱中以備將來使用。
(b)蛋白質(zhì)濃度的測定為了用于西方墨點法，由以上方法得到的樣品中的蛋白質(zhì)以595nm吸光值測定蛋白質(zhì)濃度，此蛋白質(zhì)濃度的測定是依據(jù)Bradford法實施(MM.Bradford，1976，Analytical Biochemistry 72248-254)。
(c)電泳樣品中的蛋白質(zhì)以20％SDS-PAGE分離。將凝膠中分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印至PVDF膜(NEW，NEF1002)以用于西方墨點法。
(d)西方墨點法以TBS溶液(0.9％NaCl溶于50mM Tris-HCl中，pH7.4)清洗含有蛋白質(zhì)的PVDF膜30分鐘二次。以溶有5％脫脂奶粉的TBS緩沖液進行阻斷反應(yīng)60分鐘。接著將PVDF膜浸泡于阻斷液(0.05％Triton-X100、5％正常山羊血清及3％BSA)60分鐘后，以TBS緩沖液清洗，再與初級抗體(兔子抗KA2多株IgG，1∶1800稀釋，UPSTATE06-315；山羊抗GluR5多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7617；山羊抗GluR6多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7618；山羊抗GluR7多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7620；及兔子抗谷胺酸去羧基多株IgG，1∶1500稀釋，Chemicon AB108)在4℃下反應(yīng)12至18小時。
反應(yīng)完成之后，以TTBS(0.05％Tween-20溶于TBS中)清洗PVDF膜30分鐘二次后，將此膜浸泡于阻斷液中60分鐘，再與二級抗體(抗Glu5/6/7的生物素-抗山羊/綿羊IgG，1∶200稀釋，Sigma B-3148；及抗KAR2/GAD的生物素-抗兔子IgG，1∶250稀釋，ChemiconAP187B)在室溫下反應(yīng)1小時。以TTBS清洗反應(yīng)過后的PVDF膜30分鐘二次，再與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，VectorlabsPK-4000)在室溫下反應(yīng)1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次，再以DAB(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris緩沖溶液中，pH7.4)顯影。
如圖5所示，臍帶間葉細胞在以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基處理前并無表現(xiàn)海人草酸(Kainate)受體次單元。以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基處理后第6天，海人草酸受體次單元，包括GluR6、GluR7及KA2，有少量地表現(xiàn)，處理后第12天，GluR5、GluR6、GluR7及KA2有顯著地表現(xiàn)。
(IV)Parvalbumin(PV)及Calbindin-D28K(CB)的免疫染色以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶于0.1M的PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結(jié)合。
處理后的細胞與初級抗體(山羊抗parvalbumin的多株IgG，1∶40稀釋，Santa Cruz sc-7449及山羊抗calbindin多株IgG，1∶40稀釋，Santa Cruz sc-7691)在4℃下反應(yīng)至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的小鼠抗山羊/綿羊單株IgG，1∶250稀釋，Sigma B3148)在室溫下反應(yīng)1小時；再以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應(yīng)1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯(lián)苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris緩沖溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應(yīng)，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上并在光學(xué)顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖6所示，培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基9天的臍帶間葉細胞表現(xiàn)parvalbumin(圖5A)及calbindin-D28K(圖5B)，顯示其已轉(zhuǎn)型成神經(jīng)細胞并具有合成Ca2+結(jié)合蛋白的能力。
(V)GAD的免疫染色及西方墨點法以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶于0.1M的PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結(jié)合。
處理后的細胞與初級抗體(兔子抗谷胺酸鹽去羧基 多株IgG，1∶1500稀釋，Chemicon AB108)在4℃下反應(yīng)至少12至18小時；以0.1MPBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的山羊抗兔子IgG，1∶300稀釋，Sigma b8895)在室溫下反應(yīng)1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次。接著與親和素-生物素化-辣根過氧化酵素還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應(yīng)1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次，再以3，3′-二胺基聯(lián)苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml50mM的Tris緩沖溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應(yīng)，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上并在光學(xué)顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖7(A)所示，培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基6天后的臍帶間葉細胞表現(xiàn)GAD，顯示其已轉(zhuǎn)型成神經(jīng)細胞并具有合成神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)GABA的能力。如圖7(B)所示，臍帶間葉細胞可在處理后第6天被誘導(dǎo)出表現(xiàn)GAD的能力，且在第12天GAD的表現(xiàn)量有顯著地增加。
(III)、(IV)及(V)的結(jié)果證明根據(jù)本發(fā)明的方法得到的神經(jīng)細胞具功能性且可合成具有神經(jīng)細胞特征的蛋白質(zhì)及神經(jīng)傳導(dǎo)物質(zhì)。
(VI)DAPI染色以0.1M磷酸緩沖液清洗處理后的細胞5分鐘二次，然后以50μg/ml的DAPI染色30分鐘。細胞以Tris緩沖液(Tris-HCl 50mM，pH 7.3)完全清洗并以包埋劑(Tris∶甘油＝1∶1)包埋，在螢光顯微鏡下觀察及計算細胞數(shù)目。
圖8(A)顯示細胞密度的顯微影像。利用DAPI標記(藍色)測定處理后第0、3、6及9天的細胞數(shù)目。圖8(B)顯示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基處理不同時間后的細胞密度。在不同的處理后時間點，利用DAPI染色測定細胞密度的改變。結(jié)果指出處理后第9天的細胞密度顯著高于第3天的細胞密度(n＝3，單因子變異數(shù)分析，續(xù)以LSD分析，P＜0.01)。
(VII)BrdU及DAPI的雙重染色給予生長在蓋玻片上的細胞最終濃度為50μM的BrdU(SigmaB5002，配制為50mM庫存溶液)，并使其繼續(xù)生長24小時。以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PBS，pH 7.4)清洗細胞5分鐘二次；再以固定液(70％乙醇于50mM甘胺酸緩沖液中，pH 2.0)在-20℃下固定30分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結(jié)合。
處理后的細胞接著與初級抗體(小鼠抗BrdU單株IgG，ChemiconMAB3222，以0.66mM CaCl2及1mMβ-巰基乙醇于66mM的Tris緩沖液中1∶100稀釋)在4℃下反應(yīng)至少36至42小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(螢光素共軛的山羊抗小鼠IgG，1∶50稀釋，Chemicon AP124F)及1mg/ml DAPI(Sigma D9542)在室溫下反應(yīng)1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次。蓋玻片以包埋劑(Vector H-1000)固定于在載玻片上，以指甲油密封，在螢光顯微鏡(Olympus BX50)下觀察。并計算單位面積內(nèi)被BrdU標記的細胞數(shù)目。
(VIII)BrdU及NF的雙重染色給予生長在蓋玻片上的細胞最終濃度為50μM的BrdU(SigmaB5002，配置為50mM庫存溶液)，并使其繼續(xù)生長超過24小時。以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PB，pH7.4)清洗細胞5分鐘二次；再以固定液(70％乙醇于50mM胺基乙酸緩沖液中，pH 2.0)在-20℃下固定30分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結(jié)合。
處理后的細胞與初級抗體(小鼠抗BrdU單株IgG，ChemiconMAB3222，以0.66mM CaCl2、1mMβ-巰基乙醇于66mM的Tris緩沖溶液1∶100稀釋)在4℃下反應(yīng)至少12至18小時后；再與另一初級抗體(兔子抗神經(jīng)纖維多株IgG，1∶250稀釋，Chemicon AB1982)在4℃下反應(yīng)至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(螢光素共軛的山羊抗老鼠IgG，1∶50稀釋，Chemicon AP124F及若丹明(Rhodamine)共軛的山羊抗兔子IgG，1∶50稀釋，ChemiconAP132R)在室溫下反應(yīng)1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次。蓋玻片以包埋劑(Vector H-1000)固定于在載玻片上，以指甲油密封，在螢光顯微鏡(Olympus BX50)下觀察。并計算單位面積內(nèi)被BrdU標記的細胞數(shù)目。
圖9顯示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基處理3天后的增殖分析結(jié)果(A-F)。大部分被DAPI標記的細胞(A中的藍色)為BrdU-陽性(B中的綠色)。(C)是結(jié)果(A)及(B)的合并。處理后第3天的細胞已分化成可表現(xiàn)NF的細胞(D中的紅色)，郄仍被BrdU標記(E中的綠色)。(F)是結(jié)果(D)及(E)的合并。以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM處理后第9天的細胞失去增殖能力(G-L)。所有被DAPI標記的細胞(G中的藍色)為BrdU-陰性(H中的綠色)。(I)是結(jié)果(G)及(H)的合并。處理后第9天的細胞已分化成可表現(xiàn)NF的細胞(J中的紅色)，但大部分無法被BrdU標記(K中的綠色)。(L)是結(jié)果(J)及(K)的合并。總結(jié)來說，大部分的細胞在第9天已轉(zhuǎn)型成神經(jīng)細胞并停止增殖，由此得知此神經(jīng)細胞在第9天已進入后分裂階段。
(VII)及(VIII)的結(jié)果顯示，以培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間質(zhì)細胞可增殖并分化成神經(jīng)細胞。
實施例5臍帶間葉細胞轉(zhuǎn)形成心肌細胞及心血管細胞將由實施例1得來的臍帶間葉細胞培養(yǎng)于添加有約4.5g/l的葡萄糖及約10％FBS的DMEM細胞生長培養(yǎng)基中，待細胞貼附于培養(yǎng)皿底部后，將細胞生長培養(yǎng)基置換成細胞分化培養(yǎng)基，其制備方法為將3μM的5-疊氮胞作為細胞分化因子添加于細胞生長培養(yǎng)基?；蛘?，該細胞分化因子可直接加入培養(yǎng)物中。
臍帶間葉細胞在細胞分化培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時，然后將細胞分化培養(yǎng)基置換成細胞生長培養(yǎng)基以避免細胞長期曝露于5-疊氮胞 中造成的毒害。分化的細胞持續(xù)在細胞生長培養(yǎng)基中培養(yǎng)1-3周以確保細胞的存活及最佳的分化。培養(yǎng)基每三天更換為新鮮的培養(yǎng)基。
實施例6心臟分化的定性分析延續(xù)實施例5的步驟，將培養(yǎng)在蓋玻片上的細胞以固定劑(如多聚甲醛)固定以維持細胞在存活狀態(tài)。以等張生理食鹽水清洗固定在蓋玻片上的細胞，然后以含有細胞穿孔劑(如0.1％Triton X-100)的阻斷劑在室溫下處理15分鐘以阻斷細胞分化及使細胞穿孔。接著添加以1∶100稀釋的對心肌特殊C-肌鈣蛋白I表位及F-肌動蛋白絲有專一性辨認及結(jié)合的單株抗體(以肌鈣蛋白I-C親和性純化的山羊多株抗體，由SantaCruz Biotechnology公司提供；及F-肌動蛋白以FITC共軛的鬼筆環(huán)(Phalloidin)染色，由Molecular Probe公司提供)(初級抗體)至固定在蓋玻片上的已分化的細胞。培養(yǎng)1小時后，以生理食鹽水洗去任何初級抗體的非專一性結(jié)合。
接著，與螢光或任何可以光學(xué)設(shè)備(如相位差雷射掃描顯微鏡、螢光顯微鏡或光學(xué)顯微鏡)輕易檢測的可見染料共軛的二級抗體，羅丹明(Rhodamine)(TRITC)共軛的AffmiPure驢子抗山羊IgG(由Jackson免疫研究實驗室公司提供)，以1∶100稀釋加入與初級抗體的宿主種類結(jié)合。培養(yǎng)1小時后，以生理食鹽水洗去任何二級抗體的非專一性結(jié)合。接著，標記的細胞以封片劑固定在蓋玻片上，并以相位差雷射掃描顯微鏡觀察。
如圖10(A)及10(B)所示，該分化的細胞相較于未以分化因子處理的細胞，展現(xiàn)C-肌鈣蛋白I的顯著表現(xiàn)，顯示該臍帶間葉細胞已成功地分化成人類心肌細胞或心血管細胞。且該分化的細胞的F-肌動蛋白表現(xiàn)進一步確定該分化的細胞展現(xiàn)與心肌細胞或心血管細胞相似的特定細胞附著型式。
權(quán)利要求
1.一種產(chǎn)生體細胞的細胞系統(tǒng)，其特征在于，該細胞系統(tǒng)包括臍帶間葉細胞。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞系統(tǒng)，其特征在于，該臍帶間葉細胞是哺乳動物臍帶間葉細胞。
3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的細胞系統(tǒng)，其特征在于，該臍帶間葉細胞是人類臍帶間葉細胞。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞系統(tǒng)，其特征在于，該體細胞是衍生自內(nèi)胚層、中胚層或外胚層。
5.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞系統(tǒng)，其特征在于，該體細胞是神經(jīng)細胞。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞系統(tǒng)，其特征在于，該體細胞是心肌細胞。
7.根據(jù)權(quán)利要求1所述的細胞系統(tǒng)，其特征在于，該體細胞是心血管細胞。
8.一種產(chǎn)生體細胞的方法，其特征在于，該方法包括培養(yǎng)臍帶間葉細胞及誘導(dǎo)該培養(yǎng)的臍帶間葉細胞細胞分化的步驟。
9.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該臍帶間葉細胞是哺乳動物臍帶間葉細胞。
10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的方法，其特征在于，該臍帶間葉細胞是人類臍帶間葉細胞。
11.據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該體細胞是衍生自內(nèi)胚層、中胚層或外胚層。
12.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該臍帶間葉細胞是以β-巰基乙醇處理，以誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該臍帶間葉細胞是培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經(jīng)細胞的10％ FBS-DMEM中，以誘導(dǎo)分化成神經(jīng)細胞。
14.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該臍帶間葉細胞是以5-疊氮胞處理，以誘導(dǎo)分化成心肌細胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求8所述的方法，其特征在于，該臍帶間葉細胞是以5-疊氮胞處理，以誘導(dǎo)分化成心血管細胞。
全文摘要
本發(fā)明提供產(chǎn)生體細胞的細胞系統(tǒng)。特別地，本發(fā)明的細胞系統(tǒng)包括臍帶間葉細胞，另一方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生體細胞的方法，其包括培養(yǎng)臍帶間葉細胞及誘導(dǎo)培養(yǎng)的臍帶間葉細胞細胞分化的步驟。在一具體實施例中，此培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由外胚層衍生的細胞。在另一具體實施例中，此培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由中胚層衍生的細胞。在更另一具體實施例中，此培養(yǎng)的臍帶間葉細胞可增殖及分化成由內(nèi)胚層衍生的細胞。
文檔編號C12N5/074GK1548531SQ20031012335
公開日2004年11月24日 申請日期2003年12月15日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月13日
發(fā)明者傅毓秀, 王懷詩 申請人:傅毓秀, 王懷詩