專利名稱：由干細胞產生神經細胞的方法及培養(yǎng)干細胞的培養(yǎng)基的制作方法
技術領域：
本發(fā)明是關于由干細胞產生神經細胞的方法及培養(yǎng)干細胞的培養(yǎng)基。
背景技術：
許多臨床上常見的慢性神經退化疾病，如帕金森氏癥、阿茲海默癥、亨丁頓氏癥及肌萎縮性脊髓側索硬化癥，都是由于中樞神經系統(tǒng)(CNS)中的神經細胞退化及死亡造成的結果。神經細胞不像表皮及肝臟細胞，無法快速地再生。雖然CNS中的干細胞在正常及神經細胞受損的情況下都可復制及分化，但其復制速度相當慢，且分化成神經細胞的比例非常低。CNS中大部分的干細胞會分化成神經膠質細胞，因而無法挽救神經退化疾病。
神經細胞移植已提供一個治療神經退化疾病的方向，研究人員已試著在活體外及活體內從不同的干細胞產生神經細胞。一般相信干細胞具有某些特性，包括自我更新、多能性、增殖、長壽及分化。在臨床的應用上，胚胎、臍帶血及骨髓是最普遍的人類干細胞來源。在胚胎中可治療中樞神經系統(tǒng)病變的干細胞主要是神經干細胞及囊胚的胚胎干細胞(R.L.Rietze et al.，2001，Nature 412；736-739)。研究也指出為了修還脊髓創(chuàng)傷，以胚胎干細胞(J.W.McDonald et al.，1999，NatureMedicine 51410-1412)或神經干細胞(Q.L.Cao et al.，2001，Experimental Neurology 16748-58)移植后，這些細胞主要分化成星細胞及寡樹突細胞，極少數轉變?yōu)樯窠浖毎３巳〉美щy、移植后的生存率不高及轉變?yōu)樯窠浖毎谋壤龢O低外，胚胎組織的移植也因為宗教、法律及道德爭議而受到阻礙。
借由直接植入臍帶血中的造血干細胞以治療受損神經細胞仍有待研究。然而，活體外模式顯示，臍帶血中的造血干細胞培養(yǎng)在含有0.001％的β-巰基乙醇(BME)培養(yǎng)基中可轉型成神經細胞的前趨物，其中10％的細胞可進一步被誘導而分化成神經細胞及神經膠質細胞(J.R.Sanchez-Ramos et al.，2001，Experimental Neurology 171109-115；及Y.Ha et al.，2001，Neuroreport 12(16)3523-3527)。由于臍帶血干細胞轉變成神經細胞的比例相對地較低，因此臍帶血的應用及研究主要集中在血液疾病。
骨髓中含有造血干細胞，其提供紅血球、血小板、單核細胞、顆粒細胞及淋巴細胞前趨物的持續(xù)來源。此外，骨髓也含有達到非血液組織干細胞標準的細胞。已有報告老鼠成熟骨髓中的造血干細胞可分化成腦中的微神經膠質細胞及大神經膠質細胞(M.A.Eglitis et al.，1997，Proc.Natl.Acad.Sci.944080-4085)。骨髓基質中的非造血干細胞被稱為骨髓基質細胞(BMSC)或骨髓間葉細胞。BMSC在活體外可分化成骨生成細胞、軟骨生成細胞、脂肪生成細胞、肌纖維生成細胞及其它系統(tǒng)(M.F.Pittenger et al.，1999，Science 284143-147及B.E.Petersenet al.，1999，Science 2841168-1170)。最近，BMSC已被報告可在活體內分化成神經細胞(S.A.Azizi et al.，1998，Proc.Natl.Acad.Sci.953908-3913；及G.C.Kopen et al.，1999，Proc.Natl.Acad.Sci.9610711-10716)。
以上所有利用多效性細胞產生神經細胞的方法都有一個共通的問題這些細胞大部分都分化成神經膠質細胞(星狀細胞、寡樹突細胞等)而非神經細胞。只有在BMSC的活體外培養(yǎng)發(fā)現BME在神經分化上有顯著的效果，其可誘導80％的培養(yǎng)BMSC分化成神經細胞(D.Woodbury et al.，2000，Journal of Neuroscience Research 61364-370)。然而，BME對蛋白質具有毒性而不適用于人體(K.White et al.，1973，Journal of pharmaceutical Sciences 62237-241)。因此仍需要開發(fā)更有效率的方法將干細胞轉型成神經細胞。

發(fā)明內容
本發(fā)明是提供由干細胞產生神經細胞的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經細胞及在所產生的混合物中培養(yǎng)干細胞。
本發(fā)明也提供培養(yǎng)干細胞的培養(yǎng)基，其是借由將神經細胞培養(yǎng)于基礎培養(yǎng)基而制備。


圖1表示臍帶間葉細胞在(A)FBS-DMEM培養(yǎng)基(控制組)及(B)培養(yǎng)過神經細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后的型態(tài)。
圖2表示臍帶間葉細胞在培養(yǎng)過神經細胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)6天后，(A)NF及(B)NeuN的免疫染色結果。
圖3表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經細胞的培養(yǎng)基處理不同時間后，其表現NF的比例。
圖4表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經細胞的培養(yǎng)基處理后，GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法結果。
圖5表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)9天后，其(A)parvalbumin(PV)及(B)calbindin-D28K(CB)的免疫染色結果。
圖6表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)6天后，其GAD的(A)免疫染色及(B)西方墨點法結果。
圖7(A)表示經培養(yǎng)過神經細胞的培養(yǎng)基誘導的臍帶間葉細胞在處理后第0、3、6及9天時，其細胞密度的改變(比例尺100μm)；(B)表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經細胞的培養(yǎng)基處理后，以DAPI染色定量細胞密度。
圖8表示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經細胞的培養(yǎng)基培養(yǎng)3天(3D)及9天(9D)后，以DAPI+BrdU雙重染色及NF+BrdU雙重染色的結果。
具體實施例方式
為克服上術現有技術的缺點，本發(fā)明主要目的是借由將神經細胞培養(yǎng)于基礎培養(yǎng)基6至9天而制備的培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間葉細胞，可高度(87％)分化成功能性后分裂神經細胞。
不欲受限于理論，吾人相信培養(yǎng)的神經細胞可釋放出某種物質組合，其提供理想狀況使干細胞分化成神經細胞。
在此使用的″干細胞″乙詞是指任何未分化、多能性(pluripotent)或多效性(multipotent)的哺乳動物細胞，包括但不限于胚胎干(ES)細胞，胚胎生殖(EG)細胞，胚胎癌(EC)細胞，骨髓基質細胞，骨髓造血細胞，臍帶血細胞及臍帶間葉細胞。以上所有干細胞除了臍帶間葉細胞外，都已被報告可分化成神經細胞及/或膠質細胞。然而，經由本發(fā)明的培養(yǎng)方法，即使是臍帶間葉細胞也可高比例地分化成功能性神經細胞。
因此，任何哺乳動物干細胞皆適用于本發(fā)明的方法。較佳是使用間葉細胞如BMSC或臍帶間葉細胞。
本發(fā)明中用于制備培養(yǎng)基的神經細胞可得自哺乳動物之外圍神經系統(tǒng)及中樞神經系統(tǒng)(CNS)。較佳是得自中樞神經系統(tǒng)的神經細胞，更佳是得自腦部，最佳是得自海馬回。
本發(fā)明的培養(yǎng)基可借由將神經細胞培養(yǎng)于任何現有的培養(yǎng)基而得。本發(fā)明適用的基礎培養(yǎng)基包括但不限于添加胎牛血清的達爾克必須基本培養(yǎng)基(FBS-DMEM)。
應了解本發(fā)明所用的基礎培養(yǎng)基可添加一般用于細胞培養(yǎng)的其它添加物。
根據本發(fā)明，神經細胞以現有方法在基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)3至6天，較佳是5天。所產生的混合物可直接用于培養(yǎng)干細胞。
根據本發(fā)明，在成熟神經細胞收成的前，干細胞以現有方法培養(yǎng)于本發(fā)明培養(yǎng)基6至12天。較佳是在培養(yǎng)的第九天收成。
培養(yǎng)的神經細胞被移走后，本發(fā)明的培養(yǎng)基可分裝為小份保存以作為將來使用。
以下分析是用以定性根據本發(fā)明的方法所產生的神經細胞。
NF的免疫細胞化學神經纖維(NF)是神經細胞中的主要細胞骨骼，其負責調整神經細胞樹突的大小、外觀及直徑。只有在發(fā)育晚期及成熟期的神經細胞才會表現NF。對NF的免疫染色可用以確定神經細胞處于晚期。
NeuN的免疫細胞化學神經細胞特定核蛋白(NeuN)是脊椎動物中樞神經系統(tǒng)神經細胞細胞核中的特殊蛋白。在活體外NeuN可和DNA結合。已知在神經細胞發(fā)育中，NeuN的出現較NF早。因此對NeuN的免疫染色可用以確定神經細胞處于轉型早期。
GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法在哺乳動物的CNS中，谷胺酸是主要的刺激神經傳導物質。大部分的神經細胞都有谷胺酸受體來接收刺激信息。其中主要有二類谷胺酸受體離子型及代謝型。離子型受體可依照其不同的選擇性激動劑，進一步再分為NMDA(N-甲基-D-天門冬胺酸)受體、AMPA(α-胺基-3-羥基-5-甲基-4-異唑基丙酸)受體及KA(海人草酸)受體。KA受體是由GluR5、GluR6、GluR7、KA1及KA2等次單元形成。因此，利用西方墨點法檢測GluR5、GluR6、GluR7及KA2可確定神經細胞具有合成功能性蛋白質的能力。
Ca2+結合蛋白的免疫細胞化學Ca2+在細胞的信息傳遞途徑中扮演重要的角色。然而，在細胞中大部分的Ca2+并不是單獨作用，而是和Ca2+結合蛋白相結合。Ca2+結合蛋白可以緩沖細胞內的Ca2+濃度，進而調節(jié)Ca2+的活性。在中樞神經系統(tǒng)中存在著許多種類的Ca2+結合蛋白，分布最廣的是parvalbumin(PV)、calbindin-D28K(CB)及calretinin。PV及CB皆屬于EF-hand型Ca2+結合蛋白家族。在胚胎神經系統(tǒng)發(fā)育期間，PV及CB被認為是神經細胞特定表現的Ca2+結合蛋白。因此，對PV及CB的免疫染色可用以確定神經細胞具有合成功能性蛋白質的能力。
BrdU及DAPI的雙重標記DAPI(4′，6-二基-2-苯基 二鹽酸鹽)是一種螢光染料，可自由地通過細胞膜和核膜，并和細胞核中的DNA結合，通常用以計算細胞的數目。此外，在細胞復制過程中，細胞須合成另一組染色體，并將外加的BrdU(溴化去氧尿核，其為胸腺嘧啶核 酸的相似物)納入所合成的染色體中。因此，觀察BrdU的納入可用以確定細胞的復制。BrdU及DAPI的雙重標記可確定神經細胞的復制。
BrdU及NF的雙重標記如上所述，NF的免疫染色用以確定是否為神經細胞，BrdU則用以確定細胞的復制。因此，NF及BrdU的雙重標記可確定神經細胞的復制能力。
GAD的免疫細胞化學GABA是神經傳導物質的一，其是由谷胺酸經谷胺酸去羧基(GAD)催化而合成。因此，利用對GAD的免疫染色可確定神經細胞具有合成神經傳導物質GABA的能力。
根據本發(fā)明的方法所產生的神經細胞可用于治療神經退化疾病，如帕金森氏癥、阿茲海默癥、亨丁頓氏癥，及肌萎縮性脊髓側索硬化癥或因中風及外傷造成的神經細胞死亡。
由以下的實施例對本發(fā)明做進一步說明，但不應以此限定本發(fā)明的范圍。
實施例1人類臍帶間葉細胞的制備人類臍帶間葉細胞是從一提供接生服務的診所(蔡氏婦產科診所，臺北市北投區(qū)石牌路一段72號)取得。臍帶以無菌操作方式收集并在4℃下儲存于HBSS(Biochrom L201-10)不超過24小時。
臍帶先泡在75％的乙醇中30秒以消毒。在無菌操作臺中將消毒過的臍帶置于無鈣及無鎂離子的緩沖溶液(CMF，Gibco 14185-052)，以消毒過的器具將臍帶縱切，并將其中的血管及間葉組織(瓦頓氏凝膠)去除。將間葉組織切成0.5立方公分的小塊，以250×g離心5分鐘。去除上清液，并以適量的無血清DMEM(Gibco 12100-046)清洗沉淀物二次，再以250×g離心5分鐘。間葉組織在37℃下以膠原 處理14至18小時，清洗后，再以2.5％的胰蛋白于37℃及震蕩下處理30分鐘。加入FBS(Hyclone SH30071.03)至間葉組織以終止胰蛋白 反應。此時間葉組織已變成間葉細胞。
間葉細胞以10％FBS-DMEM使其分散并計算其數量后，便可直接用于培養(yǎng)。
實施例2培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM的制備用以制備培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM的神經細胞是取自七天大的史泊格多利(Sprague-Dawley)大鼠的腦部(中華民國臺灣省臺北市國立陽明大學動物中心)。
在以下的操作的前，先將含有24ml 10％FBS-DMEM的50ml離心管置于37℃培養(yǎng)箱內。
大鼠以i.p.注射給予0.3ml的10％水合氯化物。3至4分鐘后，完全麻醉的大鼠以75％乙醇全身消毒。在無菌操作臺中將大鼠腦取出并置于CMF中。將腦以900rpm離心5分鐘。去除上清液，添加10％FBS-DMEM至沉淀物(腦組織)。以移液器吸放15次將腦組織打散成單細胞。將打散的細胞加至的前準備的50ml離心管，與其中的FBS-DMEM充分混合。將此混合物加至24孔盤的涂覆有聚-L-離胺酸的孔中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。第二天加入最終濃度為2μM的阿糖胞(Arac)。
培養(yǎng)的第五天，此培養(yǎng)基即可取出用來培養(yǎng)臍帶間葉細胞。
實施例3臍帶間葉細胞轉型為神經細胞將由實施例1得到的臍帶間葉細胞，培養(yǎng)于由實施例2得到的培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基中，或培養(yǎng)于FBS-DMEM(控制組)中，置于37℃培養(yǎng)箱。在第3、6、9及12天收集細胞。
如圖1(A)所示，培養(yǎng)于FBS-DMEM 6天的臍帶間葉細胞(控制組)的形態(tài)為紡錘型，且因細胞增殖而互相緊密地貼附。培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基6天的臍帶間葉細胞顯現神經的表型，包括細胞體收縮、精致化歷程(process elaboration)及細胞集簇(圖1B)。
實施例4分析在實施例3中收集的細胞用以做以下的分析，其結果描述如下(1)NF的免疫染色以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PBS，pH 7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶于0.1M PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％ TritonX-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理后的細胞與初級抗體(兔子抗神經纖維200多株IgG，1∶250稀釋，Chemicon AB1982)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的的山羊抗兔子IgG，1∶1000稀釋，Sigma b-8895)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris緩沖溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠(permount)封在載玻片上并在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖2(A)所示，培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基6天的臍帶間葉細胞表現NF，顯示其已轉型成神經細胞。
本實驗也測定以培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基處理不同時間的臍帶間葉細胞表現NF的比例。如圖3所示，處理后第3天有59.4％的臍帶間葉細胞表現NF，處理后第6天NF的表現量達到最大，87.4％。處理時間延長NF表現量既不升高也不降低(n＝3，單因子變異數分析，續(xù)以LSD分析，P＜0.01)。
(II)NeuN的免疫染色以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(4％多聚甲醛溶于0.1M PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％ TritonX-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理后的細胞與初級抗體(小鼠抗神經核單株IgG，1∶100稀釋，Chemicon MAB377)在4℃下反應至少36至42小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的山羊抗老鼠IgG，1∶250稀釋，Chemicon AP124B)在室溫下反應1小時；再以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris緩沖溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上并在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖2(B)所示，培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基6天的臍帶間葉細胞表現NeuN，顯示其已轉型成神經細胞。
(III)GluR5、GluR6、GluR7及KA2的西方墨點法(a)細胞膜的制備細胞膜的制備是由以培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM處理不同時間的臍帶間葉細胞及七天齡大鼠的腦而得。以0.1M磷酸緩沖液清洗培養(yǎng)的細胞3分鐘二次。在4℃下添加Tris-HCl緩沖液(50mM，pH7.4)至細胞，以刮刀將細胞從培養(yǎng)皿上刮除。將刮除的細胞置于一15ml的鐵氟龍-玻璃均質機中磨20次以使其均質化，接著在4℃下以30000g離心30分鐘。所得到的沉淀物大部分為細胞膜，再磨沉淀物并溶解于適量的Tris-HCl緩沖溶液中，儲存于-20℃冰箱中以備將來使用。
(b)蛋白質濃度的測定為了用于西方墨點法，由以上方法得到的樣品中的蛋白質以595nm吸光值測定蛋白質濃度，此蛋白質濃度的測定是依據Bradford法實施(MM.Bradford，1976，Analytical Biochemistry 72248-254)。
(c)電泳樣品中的蛋白質以20％SDS-PAGE分離。將凝膠中分離的蛋白質轉印至PVDF膜(NEW，NEF1002)以用于西方墨點法(d)西方墨點法以TBS溶液(0.9％NaCl溶于50mM Tris-HCl中，pH7.4)清洗含有蛋白質的PVDF膜30分鐘二次。以溶有5％脫脂奶粉的TBS緩沖液進行阻斷反應60分鐘。接著將PVDF膜浸泡于阻斷液(0.05％Triton-X100、5％正常山羊血清及3％BSA)60分鐘后，以TBS緩沖液清洗，再與初級抗體(兔子抗KA2多株IgG，1∶1800稀釋，UPSTATE06-315；山羊抗GluR5多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7617；山羊抗GluR6多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7618；山羊抗GluR7多株IgG，1∶30稀釋，Santa Cruz sc-7620；及兔子抗谷胺酸去羧基 多株IgG，1∶1500稀釋，Chemicon AB108)在4℃下反應12至18小時。
反應完成之后，以TTBS(0.05％Tween-20溶于TBS中)清洗PVDF膜30分鐘二次后，將此膜浸泡于阻斷液中60分鐘，再與二級抗體(抗Glu5/6/7的生物素-抗山羊/綿羊IgG，1∶200稀釋，Sigma B-3148；及抗KAR2/GAD的生物素-抗兔子IgG，1∶250稀釋，Chemicon AP187B)在室溫下反應1小時。以TTBS清洗反應過后的PVDF膜30分鐘二次，再與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，VectorlabsPK-4000)在室溫下反應1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次，再以DAB(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris緩沖溶液中，pH7.4)顯影。
如圖4所示，臍帶間葉細胞在以培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基處理前并無表現海人草酸(Kainate)受體次單元。以培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基處理后第6天，海人草酸受體次單元，包括GluR6、GluR7及KA2，有少量地表現，處理后第12天，GluR5、GluR6、GluR7及KA2有顯著地表現。
(IV)Parvalbumin(PV)及Calbindin-D28K(CB)的免疫染色以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶于0.1M的PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理后的細胞與初級抗體(山羊抗parvalbumin的多株IgG，1∶40稀釋，Santa Cruz sc-7449及山羊抗calbindin多株IgG，1∶40稀釋，Santa Cruz sc-7691)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的小鼠抗山羊/綿羊單株IgG，1∶250稀釋，Sigma B3148)在室溫下反應1小時；再以0.1M PBS清洗5分鐘三次；接著與親和素-生物素化-辣根過氧化 還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml的50mM Tris緩沖溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上并在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖5所示，培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基9天的臍帶間葉細胞表現parvalbumin(圖5A)及calbindin-D28K(圖5B)，顯示其已轉型成神經細胞并具有合成Ca2+結合蛋白的能力。
(V)GAD的免疫染色及西方墨點法以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PBS，pH7.4)清洗生長在蓋玻片上6天的細胞5分鐘二次；再以固定液(2％多聚甲醛及7.5％piric酸溶于0.1M的PBS中)固定20分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理后的細胞與初級抗體(兔子抗谷胺酸鹽去羧基 多株IgG，1∶1500稀釋，Chemicon AB108)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1MPBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(生物素共軛的山羊抗兔子IgG，1∶300稀釋，Sigma b8895)在室溫下反應1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次。接著與親和素-生物素化-辣根過氧化還合物(ABC KIT，Vectorlabs PK-4000)在室溫下反應1小時，以0.1M PBS清洗5分鐘三次，再以3，3′-二胺基聯苯胺(5mg DAB，3.5μl的30％H2O2溶于10ml50mM的Tris緩沖溶液中)顯影。
以上得到的樣品以濃度漸增(50％、70％、80％、90％、95％及100％)的乙醇及二甲苯進行脫水反應，每一濃度5分鐘。蓋玻片以封片膠封在載玻片上并在光學顯微鏡(Olympus BH-2)下觀察。
如圖6(A)所示，培養(yǎng)于培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基6天后的臍帶間葉細胞表現GAD，顯示其已轉型成神經細胞并具有合成神經傳導物質GABA的能力。如圖6(B)所示，臍帶間葉細胞可在處理后第6天被誘導出表現GAD的能力，且在第12天GAD的表現量有顯著地增加。
(III)、(IV)及(V)的結果證明根據本發(fā)明的方法得到的神經細胞具功能性且可合成具有神經細胞特征的蛋白質及神經傳導物質。
(VI)DAPI染色以0.1M磷酸緩沖液清洗處理后的細胞5分鐘二次，然后以50μg/ml的DAPI染色30分鐘。細胞以Tris緩沖液(Tris-HCl 50mM，pH7.3)完全清洗并以包埋劑(Tris∶甘油＝1∶1)包埋，在螢光顯微鏡下觀察及計算細胞數目。
圖7(A)顯示細胞密度的顯微影像。利用DAPI標記(藍色)測定處理后第0、3、6及9天的細胞數目。圖7(B)顯示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基處理不同時間后的細胞密度。在不同的處理后時間點，利用DAPI染色測定細胞密度的改變。結果指出處理后第9天的細胞密度顯著高于第3天的細胞密度(n＝3，單因子變異數分析，續(xù)以LSD分析，P＜0.01)。
(VII)BrdU及DAPI的雙重染色給予生長在蓋玻片上的細胞最終濃度為50μM的BrdU(SigmaB5002，配制為50mM庫存溶液)，并使其繼續(xù)生長24小時。以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PBS，pH7.4)清洗細胞5分鐘二次；再以固定液(70％乙醇于50mM甘胺酸緩沖液中，pH2.0)在-20℃下固定30分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理后的細胞接著與初級抗體(小鼠抗BrdU單株IgG，ChemiconMAB3222，以0.66mM CaCl2及1mM β-巰基乙醇于66mM的Tris緩沖液中1∶100稀釋)在4℃下反應至少36至42小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(螢光素共軛的山羊抗小鼠IgG，1∶50稀釋，Chemicon AP124F)及1mg/ml DAPI(Sigma D9542)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次。蓋玻片以包埋劑(Vector H-1000)固定于在載玻片上，以指甲油密封，在螢光顯微鏡(Olympus BX50)下觀察。并計算單位面積內被BrdU標記的細胞數目。
(VIII)BrdU及NF的雙重染色給予生長在蓋玻片上的細胞最終濃度為50μM的BrdU(SigmaB5002，配置為50mM庫存溶液)，并使其繼續(xù)生長超過24小時。以0.1M磷酸緩沖液(0.1M PB，pH7.4)清洗細胞5分鐘二次；再以固定液(70％乙醇于50mM胺基乙酸緩沖液中，pH2.0)在-20℃下固定30分鐘；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再以阻斷液(0.05％Triton X-100、5％正常山羊血清及3％牛血清白蛋白)處理30分鐘以避免非專一性抗體-抗原結合。
處理后的細胞與初級抗體(小鼠抗BrdU單株IgG，ChemiconMAB3222，以0.66mM CaCl2、1mM β-巰基乙醇于66mM的Tris緩沖溶液1∶100稀釋)在4℃下反應至少12至18小時后；再與另一初級抗體(兔子抗神經纖維多株IgG，1∶250稀釋，Chemicon AB1982)在4℃下反應至少12至18小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次；再與二級抗體(螢光素共軛的山羊抗老鼠IgG，1∶50稀釋，Chemicon AP124F及若丹明(Rhodamine)共軛的山羊抗兔子IgG，1∶50稀釋，ChemiconAP132R)在室溫下反應1小時；以0.1M PBS清洗5分鐘三次。蓋玻片以包埋劑(Vector H-1000)固定于在載玻片上，以指甲油密封，在螢光顯微鏡(Olympus BX50)下觀察。并計算單位面積內被BrdU標記的細胞數目。
圖8顯示臍帶間葉細胞以培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM培養(yǎng)基處理3天后的增殖分析結果(A-F)。大部分被DAPI標記的細胞(A中的藍色)為BrdU-陽性(B中的綠色)。(C)是結果(A)及(B)的合并。處理后第3天的細胞已分化成可表現NF的細胞(D中的紅色)，郄仍被BrdU標記(E中的綠色)。(F)是結果(D)及(E)的合并。以培養(yǎng)過神經細胞的FBS-DMEM處理后第9天的細胞失去增殖能力(G-L)。所有被DAPI標記的細胞(G中的藍色)為BrdU-陰性(H中的綠色)。(I)是結果(G)及(H)的合并。處理后第9天的細胞已分化成可表現NF的細胞(J中的紅色)，但大部分無法被BrdU標記(K中的綠色)。(L)是結果(J)及(K)的合并?？偨Y來說，大部分的細胞在第9天已轉型成神經細胞并停止增殖，由此得知此神經細胞在第9天已進入后分裂階段。
(VII)及(VIII)的結果顯示，以培養(yǎng)過神經細胞的含血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)的臍帶間質細胞可增殖并分化成神經細胞。
權利要求
1.一種由干細胞產生神經細胞的方法，其特征在于，該方法包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經細胞及在所產生的混合物中培養(yǎng)干細胞。
2.根據專利申請范圍第1所述的方法，其特征在于，該神經細胞是取自腦部。
3.根據專利申請范圍第2所述的方法，其特征在于，該神經細胞是取自海馬回。
4.根據專利申請范圍第1所述的方法，其特征在于，在加入該干細胞的前，該神經細胞在該培養(yǎng)基中培養(yǎng)3至6天。
5.根據專利申請范圍第4所述的方法，其特征在于，該神經細胞培養(yǎng)5天。
6.根據專利申請范圍第1所述的方法，其特征在于，該干細胞是選自由胚胎干細胞、胚胎生殖細胞、胚胎癌細胞、骨髓基質細胞、骨髓造血細胞、臍帶血細胞及臍帶間葉細胞所組成的群。
7.根據專利申請范圍第6所述的方法，其特征在于，該干細胞是骨髓基質細胞或臍帶間葉細胞。
8.根據專利申請范圍第1所述的方法，其特征在于，用于培養(yǎng)神經細胞的培養(yǎng)基是含血清的DMEM。
9.根據專利申請范圍第1所述的方法，其特征在于，該干細胞在該混合物中培養(yǎng)6至12天。
10.根據專利申請范圍第1所述的方法，其特征在于，進一步包括從培養(yǎng)過干細胞的混合物中收集神經細胞的步驟。
11.根據專利申請范圍第10所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)第6至12天的期間收集該神經細胞。
12.根據專利申請范圍第10所述的方法，其特征在于，在培養(yǎng)第6至9天的期間收集該神經細胞。
13.一種培養(yǎng)干細胞的培養(yǎng)基，其特征在于，該培養(yǎng)基是由于基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經細胞而制備。
14.根據專利申請范圍第13所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該基礎培養(yǎng)基是含血清的DMEM。
15.根據專利申請范圍第13所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該神經細胞已從該基礎培養(yǎng)基移除。
16.根據專利申請范圍第13所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該神經細胞是取自腦部。
17.根據專利申請范圍第16所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該神經細胞是取自海馬回。
18.根據專利申請范圍第13所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該神經細胞在該基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)3至6天。
19.根據專利申請范圍第18所述的培養(yǎng)基，其特征在于，該神經細胞在該基礎培養(yǎng)基中培養(yǎng)5天。
全文摘要
本發(fā)明是關于由干細胞產生神經細胞的方法，其包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)神經細胞及在所產生的混合物中培養(yǎng)干細胞。本發(fā)明也關于培養(yǎng)干細胞的培養(yǎng)基，其是借由將神經細胞培養(yǎng)于基礎培養(yǎng)基而制備。
文檔編號C12N5/0793GK1532280SQ200310123358
公開日2004年9月29日 申請日期2003年12月15日 優(yōu)先權日2002年12月13日
發(fā)明者傅毓秀 申請人:傅毓秀