專利名稱：生產(chǎn)l-谷氨酰胺的方法和生產(chǎn)l-谷氨酰胺的細菌的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及屬于棒狀桿菌的產(chǎn)L-谷氨酰胺細菌，用于產(chǎn)生L-谷氨酰胺。本發(fā)明還涉及生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法。L-谷氨酰胺是在工業(yè)上有很多用途的氨基酸，可作為調(diào)味品的成分、肝功能提升試劑、氨基酸浸劑、復(fù)合氨基酸藥物等等。
除了上述提到的基因，氨基酸雜志(Amino Acids，773-77，1963)中暗示了棒狀桿菌中存在涉及L-谷氨酰胺降解的酶。然而，銨離子和低PH可抑制此酶的活性，因此在谷氨酰胺發(fā)酵過程中存在胺離子，酶很少起作用。
谷氨酰胺酶(谷氨酰胺氨基水解酶)是已經(jīng)報道了編碼谷氨酰胺酶的基因有Pseudomonas細菌(FEMS Microbol.Lett.，178(2)，327-325，1999)、米曲霉(Appl.Microbiol.Biotechnol.，54，59 68，2000)、Rhizobium etli(Biochim.Biophys.Acta，1444(3)，451-6，1999)、大鼠(J.Biol.Chem，266(28)，18792-18796，1991)等。另外報道在大腸桿菌中也存在谷氨酰胺酶活性(J.Biol.Chem，243(5)，853-878，1968)。但是，還沒有在棒狀桿菌中分離出谷氨酰胺酶基因，關(guān)于此基因的任何有效突變對谷氨酰胺產(chǎn)量的影響也未可知。
通過修飾目的基因的起始序列來增強基因表達的方法是已知的(日本專利特開(Kokai)No.2000-818935)?，F(xiàn)在已知棒狀桿菌的編碼谷氨酰胺合成酶“glnA”)的基因(FEMS Microbiology Letters，154，81-88，1997)。而且已經(jīng)分離出包括起始位點的基因翻譯起始區(qū)域(FEMS Microbiology Letters，205，361-367，2001)。然而以前沒有修飾起始位點來增強谷氨酰胺合成酶基因的表達的描述。
在發(fā)酵生產(chǎn)L-氨基酸中經(jīng)常使用提高微生物的方法。也就是說，既然野生微生物L-氨基酸的產(chǎn)量都非常的低，那么通過突變產(chǎn)生自養(yǎng)或者類似抗性、提高代謝調(diào)節(jié)或者兩者相結(jié)合。盡管通過這些方法都可以產(chǎn)生L-谷氨酰胺，目前的現(xiàn)有技術(shù)需要提要發(fā)酵產(chǎn)量以便有效而且經(jīng)濟的生產(chǎn)L-谷氨酰胺發(fā)明概述本發(fā)明的發(fā)明人經(jīng)過刻苦的研究獲得了本發(fā)明。本發(fā)明涉及棒狀桿菌中的一個新基因，以及利用重組技術(shù)提高L-谷氨酰胺產(chǎn)量的方法。首先，分離編碼谷氨酰胺酶的基因，同時發(fā)現(xiàn)在谷氨酰胺酶活性降低的菌株中L-谷氨酰胺的產(chǎn)生能力優(yōu)于那些谷氨酰胺酶活性與野生菌相似的菌株。進一步發(fā)現(xiàn)降低谷氨酰胺酶活性的同時增強谷氨酰胺合成酶的活性更加有利于L-谷氨酰胺的產(chǎn)生。
本發(fā)明的目的是通過降低L-谷氨酰胺的降解來提高棒狀桿菌產(chǎn)L-谷氨酰胺的能力，因而提供利用這樣特性的菌株來生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法。
本發(fā)明進一步的目的是提供具有L-谷氨酰胺產(chǎn)生能力并且經(jīng)過修飾以使胞內(nèi)谷氨酰胺酶活性降低的棒狀桿菌。
本發(fā)明進一步的目的是提供上面所述的細菌，其中是通過斷裂染色體上的谷氨酰胺酶基因的方法降低胞內(nèi)谷氨酰胺酶活性。
本發(fā)明更進一步的目的是提供上面所述的細菌，其中谷氨酰胺酶活性約0.1U/mg細胞蛋白。
本發(fā)明更進一步的目的是提供上面所述的細菌，其中當測定每單位質(zhì)量細胞蛋白的酶活性時，谷氨酰胺酶活性與谷氨酰胺合成酶的活性相似或更低。
本發(fā)明更進一步的目的是提供上面所述的細菌，其中進一步修飾增強谷氨酰胺合成酶活性。
本發(fā)明更進一步的目的是提供上面所述的細菌，其中通過提高谷氨酰胺合成酶基因的表達來增強谷氨酰胺合成酶活性。
本發(fā)明更進一步的目的是提供上面所述的細菌，通過增加編碼谷氨酰胺合成酶基因的拷貝數(shù)或者修飾編碼谷氨酰胺合成酶基因的翻譯調(diào)控區(qū)來增強谷氨酰胺合成酶基因的表達，這樣增強細菌基因的表達。
本發(fā)明更進一步的目的是提供一種生產(chǎn)L-谷氨酰胺的方法，包括在培養(yǎng)基中培養(yǎng)上面所述的細菌以產(chǎn)生L-谷氨酰胺，并且從培養(yǎng)物中收集L-谷氨酰胺。
本發(fā)明更進一步的目的是提供一種棒狀桿菌的谷氨酰胺合成酶基因，其中基因的-35區(qū)(region)的序列替換成TrGCCA，-10區(qū)的序列替換成TATAAT。
根據(jù)本發(fā)明，棒狀桿菌的產(chǎn)L-谷氨酰胺的能力增強，因而有效而低成本的獲得高產(chǎn)量的L-谷氨酰胺。


圖1含谷氨酰胺酶基因的質(zhì)粒pHMKGLS5的構(gòu)建圖2在棒狀桿菌中無自我復(fù)制位點的質(zhì)粒pNEL的構(gòu)建圖3含斷裂的gls的質(zhì)粒pNELAgls的構(gòu)建圖4含增強表達的GS基因的質(zhì)粒pNELglnA14的構(gòu)建優(yōu)選實施方案詳述本發(fā)明的棒狀桿菌在本發(fā)明中，棒狀桿菌包括但不限于被劃分為短桿菌屬和棒狀桿菌屬的那些細菌(Int.J.Syst.Bacteriol.，41，255，(1981))，這兩個菌屬的關(guān)系非常接近。這樣的棒狀桿菌包括嗜乙酰乙酸棒狀桿菌，醋谷棒狀桿菌，Corynebacteriumalkanolyticum，美棒狀桿菌，谷氨酸棒狀桿菌，百合花棒狀桿菌，Corynebacteriummelassecola，Corynebacterium thermoaminogenes，力士棒狀桿菌，分支短桿菌，黃色短桿菌，Brevibacterium immariophilum，乳發(fā)酵短桿菌，玫瑰色短桿菌，解糖短桿菌，生硫短桿菌，產(chǎn)氨短桿菌，白色短桿菌，蠟狀短桿菌，嗜氨微桿菌。
具體的說，包括了以下菌株嗜乙酰乙酸棒狀桿菌ATCC13870醋谷棒狀桿菌ATCC15806Corynebacterium alkanolyticum ATCC21511美棒狀桿菌ATCC15991百合花棒狀桿菌ATCC13020，13032，13060分支短桿菌ATCC15990Corynebacterium melassecola ATCC17965CorynebacteriumthermoaminogenesAJ12340(FERMBP-1539)力士棒狀桿菌ATCC13868谷氨酸棒狀桿菌ATCC14020黃色短桿菌ATCC13826，ATCC14067，AJ12418(FERM BP-2205)
Brevibacterium immariophilum ATCC14068乳發(fā)酵短桿菌ATCC13869玫瑰色短桿菌ATCC13825解糖短桿菌ATCC14066生硫短桿菌ATCC19240產(chǎn)氨短桿菌ATCC6871，ATCC6872白色短桿菌ATCC15111蠟狀短桿菌ATCC15112嗜氨微桿菌ATCC15354。
這些菌株可從例如美國典型培養(yǎng)物保藏中心獲得。每個菌株有其指定的保藏號，根據(jù)這個保藏號可以請求提供所需的菌株。美國典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄中標明了每個菌株的保藏號。菌株AJ12340于1987年10月27日保藏于國家生命科學和人體技術(shù)研究院工業(yè)科學技術(shù)研究所(現(xiàn)在，獨立的行政機構(gòu)，國家高級工業(yè)科學和技術(shù)研究院，國際專利生物保藏中心(Tsukuba cebtral6，1-1，higashi1-chome，Tsukuba-shi，Ibaraki-ken，日本，郵編305-5466))作為根據(jù)布達佩斯條約進行的國際保藏，保藏號為FERM BP-1539。菌株AJ12418于1989年1月5日保藏于國家生命科學和人體技術(shù)研究院工業(yè)科學技術(shù)研究所，作為根據(jù)布達佩斯條約進行的國際保藏，保藏號為FERM BP-2205。
在本發(fā)明中，“產(chǎn)L-谷氨酰胺的能力”是指當在培養(yǎng)基中培養(yǎng)本發(fā)明的棒狀桿菌時該細菌在該培養(yǎng)基中積累L-谷氨酰胺的能力。這種產(chǎn)L-谷氨酰胺的能力是野生型棒狀桿菌的特性，或者可以通過增殖被給予或增強。
為了通過增殖給予或增強產(chǎn)L-谷氨酰胺的能力，可以使用以下的方法獲得6-重氮-5-氧-正亮氨酸抗性菌株的方法(日本專利特開No.3-232497)，獲得嘌呤類似物和/或甲硫氨酸亞砜抗性菌株的方法(日本專利特開No.61-202694)，獲得α-酮丙二酸抗性的方法(日本專利特開No.56-151495)，獲得對含谷氨酸的肽的抗性的方法(日本專利特開No.2-186994)等等。具有產(chǎn)L-谷氨酰胺能力的棒狀桿菌的具體實例包括但不限于黃色短桿菌AJ11573(FERMP-5492，參見日本專利特開No.56-151495)黃色短桿菌AJ12210(FERMP-8123，參見日本專利特開No.61-202694)黃色短桿菌AJ12212(FERMP-8123，參見日本專利特開No.61-202694)
黃色短桿菌AJ12418(FERM P-2205，參見日本專利特開No.2-186994)黃色短桿菌DH18(FERM P-11116，參見日本專利特開No.3-232497)Corynebacterium melassecola DH344(FERM P-11117，參見日本專利特開No.3-232497)谷氨酸棒桿菌AJ11574(FERMP-5493，參見日本專利特開No.56-151495)另外，本發(fā)明的谷氨酸棒桿菌經(jīng)過修飾以致其細胞內(nèi)谷氨酰胺酶活性降低?！肮劝滨０访富钚浴?即GLS活性)是指酶催化L-谷氨酰胺轉(zhuǎn)化成L-谷氨酸的能力。GLS活性可通過下述方法或其他已知的方法測定。
將棒狀桿菌的粗制酶溶液中加入含100mMTris-HCl(pH8.0)和75mM L-谷氨酰胺的溶液中，30℃反應(yīng)30或60分鐘，然后向反應(yīng)混合物中加入SDS至終濃度為0.5％以終止反應(yīng)，測定產(chǎn)生的L-谷氨酸的量。本發(fā)明中，在上述反應(yīng)體系中每分鐘產(chǎn)生1μmol谷氨酸的谷氨酰胺酶活力定義為1U。粗制酶溶液中的蛋白的量也可根據(jù)已知的方法例如“Bio-Rad”法測定，以牛血清蛋白作為標準品。在本文中，GLS活性/mg蛋白以“U/mg”表示。
上述的粗制酶溶液可用以下方法制備。首先，制備細胞。所用培養(yǎng)基含30g葡萄塘，1.5g KH2PO4，0.4g MgSO4·7H2O，0.01g FeSO4.7H2O，100μg VB1·HCl，，3μg生物素，200mg大豆蛋白水解物，1.5g尿素，0.02ml消泡劑GD-113，加純水至1L(用NaOH調(diào)節(jié)pH6.8)。取20ml培養(yǎng)基加入500ml搖瓶中，高壓蒸汽115℃滅菌10分鐘，然后在31.5℃，115rpm振蕩培養(yǎng)菌株細胞。培養(yǎng)基中糖類被完全利用之前結(jié)束培養(yǎng)，并立即冷卻培養(yǎng)液。冷凍離心從培養(yǎng)液中分離細胞，用100mMTris-HCL(pH8.0)洗滌，超聲波破碎細胞。15000g離心15分鐘除去未裂解的細胞，就得到粗制酶溶液。該溶液使用前置于冰上保存。
根據(jù)上述方法，測定了已知的具有產(chǎn)L-谷氨酰胺能力的細菌的GLS活性，結(jié)果列于表8。
術(shù)語“修飾以致細胞內(nèi)谷氨酰胺活性降低”是指棒狀桿菌經(jīng)過修飾使每個細胞的GLS活性低于野生型或非修飾的棒狀桿菌。實例包括每個細胞中GLS(谷氨酰胺酶)分子的數(shù)量減少或每個GLS分子的活性降低等等。術(shù)語“降低”也包括活性的完全消失。作為對照的野生型或非修飾的棒狀桿菌，例如黃色短桿菌ATCC14067，由于GLS活性降低，使培養(yǎng)基中L-谷氨酰胺的積累量增加，副產(chǎn)物L-谷氨酸的量減少。
與野生型或非修飾的棒狀桿菌相比，本發(fā)明棒狀桿菌的GLS活性顯著降低。按照前文所述的測量方法測得GLS活力水平降至0.1U/mg或更低，優(yōu)選0.02U/mg或更低，更優(yōu)選降至0.01U/mg或更低。然而，本發(fā)明中GLS活性水平并不限于0.01U/mg或更低水平。
雖然以前沒有確定棒狀桿菌中編碼GLS的基因，本發(fā)明提供了一種從黃色短桿菌中分離得到的基因。根據(jù)公開的谷氨酸棒桿菌的基因組序列，尋找其與Rhizobium bacterium中已知的GLS基因(Biochim.Biophys.Acta，1444(3)451-6，Mar.19，1999)同源的基因，該基因即為谷氨酸棒桿菌的GLS基因。根據(jù)谷氨酸棒桿菌的推定GLS基因序列，從黃色短桿菌中也分離到GLS基因，并且該基因與Rhizobium bacterium的GLS基因同源。gls基因可通過PCR方法獲得(見White，T.J.et al.，Trends Genet.5，185，(1989))，以例如SEQ ID NOS5和6所示序列為引物，棒狀桿菌染色體DNA為模板。其他微生物中編碼GLS的基因可以用類似的方法獲得。按照這種方法獲得的黃色短桿菌ATCC14067的gls基因的核酸序列如SEQ ID NO1所示，其編碼的氨基酸序列如SEQ ID NO2所示。
采用Saito和Miura的方法從作為DNA供體的細菌中制備染色體DNA(見H.Saito和K.Miura，Bioehem.Biophys.Acta，72，619(1963)，《生物工程實驗手冊》生物科學和生物工程協(xié)會主編，日本，97-98頁，Baifukan，1992)。
降低棒狀桿菌GLS活性的方法有紫外線照射或用誘變劑處理細菌，篩選突變菌株。能用于本發(fā)明的誘變劑有N-甲基-N′硝基-N-亞硝基胍(NTG)或亞硝酸。除了使用誘變劑，還可以用基因斷裂的方法獲得GLS活性降低的棒狀桿菌。即，用含有缺失了部分序列的gls基因的DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌，該gls基因的部分序列被刪除了以致GLS的功能被破壞(缺失型gls基因)。隨后發(fā)生的的缺失型gls基因與染色體gls基因的重組斷裂了染色體gls基因。這種通過同源重組發(fā)生基因取代導(dǎo)致的基因斷裂是已知的，利用線性DNA和含溫度敏感復(fù)制起始點質(zhì)粒來斷裂基因的方法也是已知的。
將表達調(diào)控序列例如gls基因啟動子替換為一個較弱的啟動子也能降低GLS的活性(日本專利特開NO.2000-818935)?？陕?lián)合使用誘變和斷裂基因的方法。
采用如下方法將宿主染色體gls基因替換為缺失型gls基因。通過插入溫度敏感復(fù)制起始點、缺失型gls基因和抗藥標記基因如抗氯霉素基因制備重組DNA，然后用該重組DNA轉(zhuǎn)化棒狀桿菌。在含藥物的培養(yǎng)基中培養(yǎng)轉(zhuǎn)化體，而此時溫度敏感復(fù)制起始點不起作用，結(jié)果獲得了染色體DNA整合了重組DNA的轉(zhuǎn)化體。
可采用任意一種已知的轉(zhuǎn)化方法將上述重組DNA導(dǎo)入棒狀桿菌中。例如用CaCL2處理受體細胞以增加細胞對DNA的通透性，這一方法已報道用于大腸桿菌K-12(Mandel，M.和Higa，A.，J.Mol.Biol.，53，159(1970))。用對數(shù)生長期細胞制備感受態(tài)細胞，將DNA導(dǎo)入其中，這一方法已報道用于枯草桿菌(Duncan，C.H.，Wilson，GA.和Young，F(xiàn).E.，基因，1，153，(1977))。或者制備易于接受重組DNA的原生質(zhì)體型DNA受體細胞，再將重組DNA轉(zhuǎn)化到該DNA受體細胞中。這種方法已應(yīng)用于枯草桿菌，放線菌和酵母中(Chang，S.和Choen，S.N.，Molec.Gen.Genet，168，111(1979)；Bibb，M.J.，Ward，J.M.和Hopwood，OA.，Nature，274，398，(1978)；Hinnen，A.，Hicks，J.B.和Fink，G.R.，Proc.Natl.Sci.，USA，75，1929(1978))。還可采用電穿孔的方法制備棒狀桿菌轉(zhuǎn)化體(Sugimoto et al.，日本專利特開No.2-207791)。
棒狀桿菌的溫度敏感質(zhì)粒包括但不限于p48K和pSFKT2(見日本專利特開No.2000-262288)，pHSC4(見法國專利
發(fā)明者中村純, 秋山嘉代, 代 申請人:味之素株式會社