專利名稱：用于多步反應(yīng)的pcr擴(kuò)增管的制作方法
專利說明
一、技術(shù)領(lǐng)域本實(shí)用新型涉及一種可用于完成多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，用于基因擴(kuò)增及其相關(guān)基因檢測。
二背景技術(shù)：
本實(shí)用新型涉及一種用于基因擴(kuò)增和直接檢測的PCR擴(kuò)增管(PCR是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的技術(shù)名詞)，尤其是指一種可直接檢測擴(kuò)增產(chǎn)物的免沖洗PCR擴(kuò)增器。
目前，在分子生物學(xué)研究和醫(yī)學(xué)臨床診斷過程中，聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)是不可缺少的。PCR通常是在一個(gè)封閉的管腔內(nèi)進(jìn)行，它可以將被檢測的靶基因放大數(shù)萬至數(shù)百萬倍。但是，基因擴(kuò)增之后，一般需要用電泳等方法對擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行檢測。由于PCR方法靈敏度極高，其擴(kuò)增產(chǎn)物在檢測過程中不可避免的會進(jìn)入空氣中。當(dāng)進(jìn)行下一次試驗(yàn)時(shí)，這些飄浮在空中的產(chǎn)物將可能又被擴(kuò)增出來，這就是PCR檢測容易獲得所謂“假陽性”的原因。為此，國際上一些生物技術(shù)公司發(fā)展了封閉式的基因擴(kuò)增和檢測技術(shù)。如熒光定量PCR技術(shù)。但是，該技術(shù)需要有十分復(fù)雜的動態(tài)光學(xué)檢測裝置，檢測儀器十分復(fù)雜，在我國很難推廣。同時(shí)，該技術(shù)每次試驗(yàn)只能檢測一個(gè)基因的信息，不能滿足生物信息時(shí)代人們需要對大量基因信息的檢測的要求。
基因芯片技術(shù)為人們同時(shí)檢測大量基因信息提供了有力的工具。基因芯片把許多不同的核酸探針(單鏈寡核苷酸)固定于玻片上，把樣品中基因的擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記熒光，并與芯片上的核酸探針進(jìn)行雜交，通過熒光掃描儀進(jìn)行檢測。雖然基因芯片獲得的信息量大，但是目前大部分基因芯片主要用于細(xì)胞的mRNA表達(dá)檢測等實(shí)驗(yàn)室研究應(yīng)用。在重要病原微生物檢測方面，至今很少有成熟的應(yīng)用實(shí)例和過硬的產(chǎn)品問世。就其原因主要在于樣品的處理、擴(kuò)增標(biāo)記、雜交、檢測等操作過程都是分開來單獨(dú)進(jìn)行的，從而使整個(gè)檢測過程操作繁瑣、復(fù)雜，并因此而增加了污染的機(jī)會，降低了所得結(jié)果的可靠性。盡管目前已將基因擴(kuò)增技術(shù)與芯片檢測方法合為一體，但其特點(diǎn)是整個(gè)基因擴(kuò)增過程在一個(gè)微反應(yīng)池中進(jìn)行，因而，需要對器件的同一部位反復(fù)地升溫降溫，這將無法對結(jié)果進(jìn)行動態(tài)跟蹤和實(shí)時(shí)定量分析。為此，國內(nèi)外一些研究者提出把基因芯片與微流體技術(shù)相結(jié)合，來實(shí)現(xiàn)所有操作過程的一體化。申請人對此也進(jìn)行了研究，并已提出了基因擴(kuò)增微陣列探針循環(huán)檢測型生物芯片等。然而，由于這種芯片制備困難，并需要研制專門的反應(yīng)器與之配套，故其成本很高。同時(shí)，基因芯片要求靶基因的擴(kuò)增產(chǎn)物標(biāo)記熒光，通過熒光信號來檢測核酸探針的雜交狀態(tài)。這就要求在樣品處理過程中要摻入熒光，這不僅提高了樣品處理的成本，增加了難度和不確定因素。而且，在這個(gè)過程中因標(biāo)記效率問題，影響檢測的可靠性。同時(shí)，由于整個(gè)操作過程的復(fù)雜性提高，如樣品處理過程的條件控制和雜交后非特異探針的反復(fù)清洗等，不利于集成化檢測。因此，發(fā)展可以對被檢測的基因序列進(jìn)行非標(biāo)記檢測的低成本的生物芯片技術(shù)是實(shí)現(xiàn)生物芯片在醫(yī)學(xué)和生命科學(xué)等領(lǐng)域中大量實(shí)際應(yīng)用的關(guān)鍵之一。
三、技術(shù)內(nèi)容技術(shù)問題本實(shí)用新型提供一種用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增管，可使多步反應(yīng)在封閉狀態(tài)下在同一PCR擴(kuò)增管中完成。
技術(shù)方案本實(shí)用新型是一種用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，包括擴(kuò)增管組件，擴(kuò)增管組件由管蓋和擴(kuò)增管組成，在擴(kuò)增管組件上設(shè)有開口向上的溶液池和溶液流道，溶液池位于擴(kuò)增管內(nèi)。
技術(shù)效果①由于本實(shí)用新型將貯液池設(shè)置于反應(yīng)管內(nèi)，反應(yīng)管自身能夠構(gòu)成一個(gè)相對封閉的空間，使基因擴(kuò)增及擴(kuò)增后操作能在上述相對封閉的空間內(nèi)完成A)將制備好的待擴(kuò)增基因提取物、擴(kuò)增液(包括相應(yīng)的引物和酶等)加入反應(yīng)管本體中，再在貯液池中加入基因擴(kuò)增后反應(yīng)體系，密封PCR反應(yīng)管；B)把封閉好的反應(yīng)管放置于相應(yīng)的基因擴(kuò)增儀中進(jìn)行擴(kuò)增；基因擴(kuò)增儀可以使用各種流行的儀器，也可以是通過改進(jìn)的專用的擴(kuò)增雜交和檢測一體化儀器；C)將管內(nèi)擴(kuò)增后的溶液流倒后，使兩種液體混合，再將混合后液體用力甩到PCR反應(yīng)管底部；D)在溶液混合后，再進(jìn)行下一步的基因擴(kuò)增反應(yīng)。因此，本實(shí)用新型可以使基因擴(kuò)增或相關(guān)基因檢測等多步反應(yīng)能在封閉狀態(tài)下在同一PCR擴(kuò)增管中完成。
②由于本實(shí)用新型能使二步法的RT-PCR(反轉(zhuǎn)錄基因擴(kuò)增)在單PCR管中實(shí)現(xiàn)。在PCR管中的反應(yīng)試劑進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄過程，以使溶液中產(chǎn)生DNA片斷，再如前所述的方法進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄體系與貯液池中的溶液進(jìn)行混合，再進(jìn)行PCR反應(yīng)。在封閉體系中進(jìn)行二步法的RT-PCR，有著反應(yīng)產(chǎn)率高、不易產(chǎn)生污染、靈敏度高等優(yōu)點(diǎn)。
③本實(shí)用新型采用封閉體系中貯存兩種反應(yīng)體系，可在不受外界干擾的狀態(tài)下進(jìn)行兩步基因擴(kuò)增反應(yīng)，如在巢式PCR反應(yīng)中可大大減少實(shí)驗(yàn)的操作步驟，提高實(shí)驗(yàn)的重復(fù)性和精密性。
④本實(shí)用新型采用封閉體系中貯存兩種反應(yīng)體系，其中一種為基因擴(kuò)增混合體系，而在貯液池中貯存雜交緩沖液，可在PCR反應(yīng)結(jié)束后，與雜交緩沖液進(jìn)行混合，最后與固定在PCR管內(nèi)壁上的核酸探針進(jìn)行雜交。以檢測基因被擴(kuò)增結(jié)果，如果有明確的雜交信號，可確認(rèn)為在基因擴(kuò)增前存在被檢測的基因。
四

圖1是本實(shí)用新型實(shí)施例1的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖2是本實(shí)用新型實(shí)施例2的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖3是本實(shí)用新型實(shí)施例3的結(jié)構(gòu)示意圖。
圖4是本實(shí)用新型實(shí)施例4的結(jié)構(gòu)示意圖。
其中1管蓋，2普通PCR管，3液體通道，4溶液池五、具體實(shí)施方案實(shí)施例1一種可用于完成多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，使用方法為1、芯片的制備根據(jù)所要檢測的每一靶基因序列，設(shè)計(jì)一條能與之負(fù)鏈(即與正鏈相同)有效雜交的20-50個(gè)堿基的寡核苷酸探針，其一端標(biāo)記一個(gè)氨基，通過點(diǎn)樣法將這些探針按照一定的陣列固定到處理過的管蓋內(nèi)面，制備管蓋芯片。
2、因擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)根據(jù)所要檢測的每一靶基因序列，在兩端設(shè)計(jì)一對20個(gè)堿基左右的擴(kuò)增引物，在其中一條與正鏈互補(bǔ)的引物5’端標(biāo)記一個(gè)熒光分子(如FAM、CY3、CY5等)。
3、因擴(kuò)增事先在普通的PCR擴(kuò)增管內(nèi)加入混合好的PCR或RT-PCR反應(yīng)體系、引物及處理好的DNA或RNA模板。然后塞入溶液池，在溶液池加入30ul的雜交緩沖液。最后蓋上制備好的管蓋。在PCR擴(kuò)增儀上按照一定程序進(jìn)行擴(kuò)增反應(yīng)。
4、雜交檢測PCR擴(kuò)增結(jié)束后，將擴(kuò)增管倒置并用力使PCR反應(yīng)液和雜交液混合并甩至管蓋端，置于37℃雜交1小時(shí)。
5、芯片檢測將管蓋芯片置于熒光掃描顯微鏡下進(jìn)行雜交結(jié)果檢測。
實(shí)施例2一種用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增管，包括反應(yīng)管且該反應(yīng)管由PCR管和管中的貯存液體的貯液池組成。分別用于檢測非典型性肺炎相關(guān)的冠狀病毒的特定引物(一參見WHO公開引物)，在PCR管中加入反轉(zhuǎn)錄體系，同時(shí)在貯液池中加入基因擴(kuò)增體系，并加入適量的SYBGREEN。使用WHO推薦的基因擴(kuò)增條件，在PCR儀上設(shè)置后，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄后，將PCR管倒置使得兩種溶液相混合，再進(jìn)行PCR擴(kuò)增。擴(kuò)增前后，可在紫外燈下直接觀察，如果出現(xiàn)熒光，則基因被擴(kuò)增，被測體系中含有被檢測的非典型性肺炎相關(guān)的冠狀病毒。
實(shí)施例3一種可用于完成多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，使用方法為1、芯片的制備根據(jù)所要檢測的每一靶基因序列，設(shè)計(jì)一條能與之負(fù)鏈(即與正鏈相同)有效雜交的20-50個(gè)堿基的寡核苷酸探針，用Beacon designer2.1軟件將該探針設(shè)計(jì)成分子信標(biāo)，然后通過點(diǎn)樣法將這些探針按照一定的陣列固定到處理過的管蓋內(nèi)面，制備管蓋芯片。
2、因擴(kuò)增的引物設(shè)計(jì)根據(jù)所要檢測的每一靶基因序列，在兩端設(shè)計(jì)一對20個(gè)堿基左右的擴(kuò)增引物。
3、PCR的擴(kuò)增、雜交及檢測PCR的擴(kuò)增、雜交及檢測同方案1實(shí)施例4一種用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，包括擴(kuò)增管組件，擴(kuò)增管組件由管蓋1和擴(kuò)增管2組成，在擴(kuò)增管組件上設(shè)有開口向上的溶液池和溶液流道3，溶液池位于擴(kuò)增管2內(nèi)，溶液池吊設(shè)在管蓋1上，溶液池的外底面為傾斜底面。
實(shí)施例5一種用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，包括擴(kuò)增管組件，擴(kuò)增管組件由管蓋1和擴(kuò)增管2組成，在擴(kuò)增管組件上設(shè)有開口向上的溶液池和溶液流道3，溶液池位于擴(kuò)增管2內(nèi)，溶液池為環(huán)形溶液4，溶液流道3位于環(huán)形溶液池41的內(nèi)周壁內(nèi)，溶液池設(shè)在擴(kuò)增管2內(nèi)，溶液池的外壁與擴(kuò)增管內(nèi)壁相吻合。
實(shí)施例6溶液池為圓缺形溶液池42，其橫截面為圓缺形，溶液流道3為圓缺形溶液池42與擴(kuò)增管2內(nèi)壁之間的間隙，圓缺形溶液池42的橫截面為中心角大于180°的圓缺形，并設(shè)在擴(kuò)增管2內(nèi)，圓缺形溶液池42的外壁與擴(kuò)增管2的內(nèi)壁相吻合，圓缺形溶液池42的頂面為傾斜面。
實(shí)施例7一種用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，包括擴(kuò)增管組件，擴(kuò)增管組件由管蓋1和擴(kuò)增管2組成，在擴(kuò)增管組件上設(shè)有開口向上的溶液池和溶液流道3，溶液池位于擴(kuò)增管2內(nèi)，溶液池由支架5固定于擴(kuò)增管2內(nèi)。
權(quán)利要求1.一種用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，包括擴(kuò)增管組件，擴(kuò)增管組件由管蓋(1)和擴(kuò)增管(2)組成，其特征在于在擴(kuò)增管組件上設(shè)有開口向上的溶液池和溶液流道(3)，溶液池位于擴(kuò)增管(2)內(nèi)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，其特征在于溶液池吊設(shè)在管蓋(1)上。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2所述的用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，其特征在于溶液池的外底面為傾斜底面。
4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，其特征在于溶液池為環(huán)形溶液池(41)，溶液流道(3)位于環(huán)形溶液池(41)的內(nèi)周壁內(nèi)。
5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，其特征在于溶液池設(shè)在擴(kuò)增管(2)內(nèi)，溶液池的外壁與擴(kuò)增管內(nèi)壁相吻合。
6.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，其特征在于溶液池為圓缺形溶液池(42)，其橫截面為圓缺形，溶液流道(3)為圓缺形溶液池(42)與擴(kuò)增管(2)內(nèi)壁之間的間隙。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，其特征在于圓缺形溶液池(42)的橫截面為中心角大于180°的圓缺形，并設(shè)在擴(kuò)增管(2)內(nèi)，圓缺形溶液池(42)的外壁與擴(kuò)增管(2)的內(nèi)壁相吻合。
8.根據(jù)權(quán)利要求7所述的用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，其特征在于圓缺形溶液池(42)的頂面為傾斜面。
9.根據(jù)權(quán)利要求1所述的用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，其特征在于溶液池由支架(5)固定于擴(kuò)增管(2)內(nèi)。
專利摘要本實(shí)用新型公開了一種用于多步反應(yīng)的PCR擴(kuò)增器，包括擴(kuò)增管組件，擴(kuò)增管組件由管蓋和擴(kuò)增管組成，在擴(kuò)增管組件上設(shè)有開口向上的溶液池和溶液流道，溶液池位于擴(kuò)增管內(nèi)。由于本實(shí)用新型將貯液池設(shè)置于反應(yīng)管內(nèi)，反應(yīng)管自身能夠構(gòu)成一個(gè)相對封閉的空間，使基因擴(kuò)增及擴(kuò)增后操作可在上述相對封閉的空間內(nèi)完成。故使基因擴(kuò)增或相關(guān)基因檢測等多步反應(yīng)能在封閉狀態(tài)下在同一PCR擴(kuò)增管中完成。
文檔編號C12P19/34GK2649597SQ200320110590

公開日2004年10月20日 申請日期2003年11月3日 優(yōu)先權(quán)日2003年11月3日
發(fā)明者劉全俊, 白云飛, 葛芹玉, 溫恬, 陸祖宏 申請人:東南大學(xué)