專利名稱：倍半萜烯合成酶及其使用方法
本申請(qǐng)要求2002年10月4日提交的申請(qǐng)?zhí)枮镹o.60/415,765美國臨時(shí)申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該文獻(xiàn)內(nèi)容在此引入作為參考。本申請(qǐng)還要求2002年12月2日提交的申請(qǐng)?zhí)枮镻CT/IB02/05070的國際申請(qǐng)的優(yōu)先權(quán)，該文獻(xiàn)內(nèi)容在此引入作為參考。
本申請(qǐng)涉及倍半萜烯合成酶及其制備和使用方法。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有本申請(qǐng)所述核苷酸序列的核酸，該核苷酸序列編碼至少一種倍半萜烯合成酶。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了倍半萜烯合成酶及其制備和使用方法。例如，本發(fā)明的倍半萜烯合成酶可用于將法呢基焦磷酸酯轉(zhuǎn)化為各種氧化的和脂肪族倍半萜烯，包括朱欒倍半萜、二環(huán)-吉馬烯、蓽澄茄醇和δ-杜松烯。
背景技術(shù)：
萜烯化合物是一大類結(jié)構(gòu)差異很大的天然分子。植物界中有最為多樣性的單萜和倍半萜烯。通常它們?cè)谥参锏挚共∠x害及草食動(dòng)物以及吸引授粉昆蟲方面發(fā)揮作用。
萜烯的生物合成已經(jīng)在很多種生物體內(nèi)進(jìn)行了廣泛的研究。萜烯的常見前體為焦磷酸異戊烯酯(IPP)，催化產(chǎn)生IPP步驟的酶大多數(shù)已經(jīng)研究清楚。IPP生物合成的兩個(gè)不同途徑現(xiàn)已清楚(

圖1)。甲羥戊酸酯途徑發(fā)現(xiàn)于植物細(xì)胞液和酵母中，而非-甲羥戊酸酯途徑(或脫氧木酮糖-5-磷酸(DXP)途徑發(fā)現(xiàn)于植物質(zhì)體和大腸桿菌中。
例如，IPP在IPP異構(gòu)酶作用下異構(gòu)化為二甲基烯丙基二磷酸酯，可用異戊烯基轉(zhuǎn)移酶將這兩種C5化合物縮合生成每一類萜烯的脂肪族焦磷酸酯萜烯前體，即對(duì)于單萜而言是牻牛兒基焦磷酸酯(GPP)，對(duì)于倍半萜烯而言是法呢基焦磷酸酯(FPP)，對(duì)于二萜烯為牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸酯(GGPP)(圖2)。催化脂肪族前體環(huán)化步驟的酶命名為萜烯環(huán)化酶或萜烯合成酶，在本申請(qǐng)中稱之為萜烯合成酶。
這些酶還能夠催化復(fù)合體多步驟環(huán)化形成萜烯或倍半萜烯化合物的碳骨架。例如，催化環(huán)化的起始步驟可以是二磷酸酯基團(tuán)的離子化形成烯丙基陽離子。然后，該底物進(jìn)行異構(gòu)和重排，這些反應(yīng)可以通過酶活性位點(diǎn)控制。產(chǎn)物可以是，例如非環(huán)、單、二或三-環(huán)。然后，質(zhì)子從碳正離子釋放出來或者碳正離子與水分子反應(yīng)，釋放出萜烯烴或醇。一些萜烯合成酶產(chǎn)生單一產(chǎn)物，但是大部分產(chǎn)生多種產(chǎn)物。
自然界中發(fā)現(xiàn)了很多種的萜烯結(jié)構(gòu)和倍半萜烯合成酶?，F(xiàn)已從不同的植物來源克隆和定性了幾種編碼cDNA或基因的倍半萜烯合成酶，例如，源自煙草(Facchini，P.J.and Chappell，J.(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.89，11088-11092.)和辣椒(Back，K.，et al.(1998)Plant CellPhysio.39(9)，899-904.)的5-表-馬兜鈴烯(aristolochene)合成酶，源自Hyoscyamus muticus的yetispiradiene合成酶(Back，K.and Chappell，J.(1995)J.Biol.Chem.270(13)，7375-7381.)，源自歐薄荷的(E)-β-金合歡烯合成酶(Crock，J.，et al.(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94(24)，12833-12838.)，源自北美冷杉的δ-芹子烯合成酶和γ-葎草烯合成酶(Steele，C.L.，et al.(1998)J.Biol.Chem.273(4)，2078-2089.)，源自亞洲棉的δ-杜松烯合成酶(Chen，X.Y.，et al.(1995)Arch.Biochem.Biophys.324(2)，255-266；Chen，X.Y.，et al.(1996)J.Nat Prod.59，944-951.)，源自北美冷杉的E-α-沒藥烯合成酶(Bohlmann，J.，et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(12)，6756-6761.)，源自番茄的吉馬烯C合成酶(Colby，S.M.，et al.(1998)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.95(5)，2216-2221.)，源自黃花蒿的表-雪松醇合成酶和紫穗槐-4，11-二烯合成酶(Mercke，P.，et al.(1999)Arch.Biochem.Biophys.369(2)，213-222；Mercke，P.，etal.(2000)Arch.Biochem.Biophys.381(2)，173-180.)，以及源自萵苣、菊苣和加拿大一枝黃花的吉馬烯A合成酶(Bennett，M.H.，etal.(2002)Phytochem.60，255-261；Bouwmeester，H.J.，et al.(2002)Plant Physiol.129(1)，134-144；Prosser I，et al.(2002)Phytochem.60，691-702)。
很多倍半萜烯化合物被用于香料(例如，廣藿香醇(patchoulol)，諾卡酮，檀香醇，韋惕酮，甜橙醛)，且很多提取自植物。因此，它們的產(chǎn)量和價(jià)格取決于植物來源的波動(dòng)以及主產(chǎn)國的穩(wěn)定性。因此，人們希望獲得非植物依賴性的倍半萜烯生產(chǎn)系統(tǒng)。由于一些倍半萜烯結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性，所以其化學(xué)合成的造價(jià)往往讓人難以接受。
發(fā)明概述一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及編碼倍半萜烯合成酶的分離的核酸。本申請(qǐng)中的倍半萜烯合成酶還可以根據(jù)該酶與脂肪族焦磷酸酯萜烯前體例如法呢基焦磷酸酯接觸時(shí)產(chǎn)生的至少一種化合物來命名。例如，能生成二環(huán)吉馬烯作為其一種產(chǎn)物的倍半萜烯合成酶可稱為二環(huán)吉馬烯合成酶。按照這一慣例，本發(fā)明核酸的實(shí)例包括編碼蓽澄茄醇合成酶(GFTpsC)(SEQ ID NO1)；δ-杜松烯合成酶(GFTpsE)(SEQ ID NO2)；二環(huán)吉馬烯合成酶(GFTpsB)(SEQ IDNO3)；朱欒倍半萜合成酶(GFTpsD1 & GFTpsD2)(SEQ ID NO4 &SEQ ID NO5)的cDNA。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的核酸，該核酸選自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，定義的條件為中度嚴(yán)謹(jǐn)條件，另一個(gè)實(shí)施方案中為高度嚴(yán)謹(jǐn)條件。其他實(shí)施方案包括本發(fā)明核酸編碼的多肽；含有本發(fā)明核酸的宿主細(xì)胞；經(jīng)修飾含有本發(fā)明核酸的非人生物體；以及制備多肽的方法，其中包括培養(yǎng)本發(fā)明的宿主細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的多肽，其含有基本如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ IDNO4或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種含有至少一種核酸的載體，該核酸選自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶。其他實(shí)施方案包括，制備重組宿主細(xì)胞的方法，其中包括將本發(fā)明載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備至少一種倍半萜烯合成酶的方法，該方法包括將經(jīng)修飾以含有至少一種核酸序列的宿主在能夠產(chǎn)生所述至少一種倍半萜烯合成酶的條件下培養(yǎng)。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的至少一種核酸選自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶。所述宿主可選自，例如，植物、微生物、菌體細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備至少一種萜類化合物的方法，該方法包括1)讓至少一種脂肪族焦磷酸酯萜烯前體與由核酸編碼的至少一種多肽接觸，在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸選自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶，2)分離(1)中制備的至少一種萜類化合物。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種萜類化合物選自倍半萜烯。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述至少一種脂肪族焦磷酸酯萜烯前體為法呢基焦磷酸酯。本發(fā)明方法制備的倍半萜烯包括，但不限于，二環(huán)吉馬烯、蓽澄茄醇、朱欒倍半萜、α-蓽澄茄油烯、吉馬烯D和δ-杜松烯(圖3)。
應(yīng)該理解的是上面的概述和下面的詳述都只是例舉和解釋性的，而并不是對(duì)本發(fā)明的限制。現(xiàn)在對(duì)本發(fā)明的范例性實(shí)施方案進(jìn)行詳述。
附圖簡(jiǎn)述圖1焦磷酸異戊烯酯生物合成途徑的實(shí)例(甲羥戊酸酯途徑(A)和脫氧木酮糖途徑(B))。
圖2由焦磷酸異戊烯酯生物合成萜烯的實(shí)例。
圖3倍半萜烯化合物實(shí)例的結(jié)構(gòu)。
圖4兩組倍半萜烯合成酶的氨基酸序列比對(duì)的中間部分(番茄的吉馬烯Cδ-杜松烯合成酶(SEQ ID NO11)；歐薄荷的(E)-β-金合歡烯(SEQ ID NO12)；北美冷杉的δ-芹子烯(SEQ ID NO13)；香橙(citrus junos)的倍半萜烯合成酶(SEQ ID NO14)；煙草的5-表-馬兜鈴烯(SEQ ID NO15)；辣椒的5-表-馬兜鈴烯(SEQ ID NO16)；馬鈴薯的Vetispiradiene(SEQ ID NO17)；H.muticus的Vetispiradiene(SEQ ID NO18)；亞洲棉的δ-杜松烯(SEQ ID NO19)；黃花蒿的紫穗槐-4，11-二烯(SEQ ID NO20)；黃花蒿的表-雪松醇(SEQ ID NO21)；北美冷杉的δ-葎草烯(SEQ ID NO22))以及推導(dǎo)的簡(jiǎn)并引物的序列(TpsVF1(SEQ ID NO23)、TpsVF2(SEQ IDNO24)、TpsVR3(SEQ ID NO25)；TpsCF1(SEQ ID NO26)、TpsCF2(SEQ ID NO27)、TpsCR3(SEQ ID NO28))。每一比對(duì)列下面的箭頭表示用于設(shè)計(jì)簡(jiǎn)并引物及其方向的比對(duì)區(qū)域。
圖5柚子總RNA RT-PCR擴(kuò)增產(chǎn)物推導(dǎo)出的氨基酸序列比對(duì)(GFTpsA(SEQ ID NO29)、GFTpsB(SEQ ID NO30)和GFTpsC(SEQID NO31))。
圖6源自葡萄柚的倍半萜烯合成酶GFTpsA(部分克隆)(SEQ IDNO32)，GFTpsB(SEQ ID NO3)，GFTbsC(SEQ ID NO1)，GFTpsD1(SEQ ID NO4)，GFTpsD2(SEQ ID NO5)和GFTpsE(SEQ ID NO2)的氨基酸序列比對(duì)。
圖7由重組柚子倍半萜烯合成酶制備的倍半萜烯的GC譜。
圖8(a)GFTpsA(SEQ ID NO32和SEQ ID NO33)、(b)GFTpsB(SEQ ID NO3和SEQ ID NO8)、(c)GFTbsC(SEQ ID NO1和SEQID NO6)、(d)GFTpsD1(SEQ ID NO4和SEQ ID NO9)、(e)GFTpsD2(SEQ ID NO5和SEQ ID NO10)以及(f)GFTpsE(SEQ IDNO2和SEQ ID NO7)的氨基酸及核苷酸序列。
發(fā)明描述萜烯是含有異戊二烯單元(C5H8)的不飽和烴，可以是脂肪族或環(huán)狀。萜烯衍生物，包括但不限于樟腦、薄荷醇、萜品醇和莰醇、香葉醇。本申請(qǐng)中的萜烯或萜類化合物包括萜烯和萜烯衍生物，包括經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)步驟功能化的化合物，例如羥基化、異構(gòu)化、氧化-還原或?；饔谩Ｔ诒旧暾?qǐng)中，倍半萜烯是具有C15結(jié)構(gòu)的萜烯，包括倍半萜烯和倍半萜烯衍生物，包括經(jīng)過一個(gè)或多個(gè)步驟功能化的化合物，例如羥基化、異構(gòu)化、氧化-還原或酰化作用。
本申請(qǐng)中，衍生物是指獲自已知或假定化合物且含有親體結(jié)構(gòu)基本單元的任一化合物。
本申請(qǐng)中，倍半萜烯合成酶是任一種能催化倍半萜烯合成的酶。
“等同”、“基本上等同”或“基本如所示”這些詞是指相關(guān)序列與給定序列之間具有至少70％、75％、80％、85％、90％、92％、95％、96％、97％、98％或99％的同一性。例如，所述序列可以是等位變體、來自不同物種的序列，或者它們可以是從給定序列通過截短、缺失、氨基酸取代或添加得到的。就多肽而言，比對(duì)序列的長(zhǎng)度通常為至少20、30、50、100或更多個(gè)氨基酸。就核酸而言，比對(duì)序列的長(zhǎng)度通常為至少50、100、150、300或更多個(gè)核苷酸。兩序列之間的同一性百分比可以通過常規(guī)對(duì)齊算法得到，例如，Altschul et al.(1990)J.Mol.Biol.，215403-410中所述的BasicLocal Alignment Tool(BLAST)、Needleman et al.(1970)J.Mol.Biol.，48444-453中的算法、或者M(jìn)eyers et al.(1988)Comput.Appl.Biosci.，411-17中的算法。
因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種分離的核酸，該核酸選自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ IDNO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶。在一個(gè)實(shí)施方案中，定義的條件為中度嚴(yán)謹(jǐn)條件，另一個(gè)實(shí)施方案中為高度嚴(yán)謹(jǐn)條件。
本申請(qǐng)中，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以利用本申請(qǐng)實(shí)施例中描述的酶特性試驗(yàn)(enzyme characterization assay)測(cè)定本發(fā)明核酸編碼的多肽是否是倍半萜烯合成酶。
本申請(qǐng)中，雜交或在特定條件下雜交是用來描述雜交條件，在該條件下相互基本等同或同源的核苷酸序列在洗滌后仍然保持彼此結(jié)合。所述條件可以是具有至少約70％，例如至少約80％，以及例如至少約85-90％同一性的序列仍然保持彼此結(jié)合。本發(fā)明中提供了低度、中度和高度嚴(yán)謹(jǐn)條件的定義。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以根據(jù)Ausubel et al.(1995)，Current Protocols inMolecular Biology，John Wiley & Sons，一書第2、4和6章中例舉的最小限度試驗(yàn)(minimal experimentation)選擇合適的雜交條件。另外，還有Sambrook et al.(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Press，第7、9和11章中描述的嚴(yán)謹(jǐn)條件。本申請(qǐng)中的低度嚴(yán)謹(jǐn)條件如下所述。將含有DNA的濾膜40℃下在含下列物質(zhì)的溶液中預(yù)處理6小時(shí)35％甲酰胺，5×SSC，50mMTris-HCI(pH7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA，和500μg/ml變性的鮭魚精子DNA。雜交在相同溶液中進(jìn)行，除下列改動(dòng)外0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鮭魚精子DNA，10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯，使用5-20×10632P-標(biāo)記探針。將濾膜在雜交混合液中40℃下孵育18-20小時(shí)，然后55℃下用含有2×SSC，25mM Tris-HCI(pH7.4)，5mM EDTA和0.1％SDS的溶液洗滌1.5小時(shí)。用新鮮溶液取代洗滌溶液，60℃下再孵育1.5小時(shí)。濾膜進(jìn)行印跡干燥并進(jìn)行放射自顯影。
本申請(qǐng)中定義的中度嚴(yán)謹(jǐn)條件如下所述。將含有DNA的濾膜50℃下在含下列物質(zhì)的溶液中預(yù)處理7小時(shí)35％甲酰胺，5×SSC，50mM Tris-HCI(pH7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％Ficoll，1％BSA，和500μg/ml變性的鮭魚精子DNA。雜交在相同溶液中進(jìn)行，除下列改動(dòng)外0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.2％BSA，100μg/ml鮭魚精子DNA，10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯，使用5-20×10632P-標(biāo)記探針。將濾膜在雜交混合液中50℃下孵育30小時(shí)，然后55℃下用含有2×SSC，25mM Tris-HCI(pH7.4)，5mM EDTA和0.1％SDS的溶液洗滌1.5小時(shí)。用新鮮溶液取代洗滌溶液，60℃下再孵育1.5小時(shí)。濾膜進(jìn)行印跡干燥并進(jìn)行放射自顯影。
本申請(qǐng)中定義的高度嚴(yán)謹(jǐn)條件如下所述。將含有DNA的濾膜65℃下在由下列物質(zhì)組成的緩沖液中預(yù)雜交8小時(shí)至過夜6×SSC，50mM Tris-HCI(pH7.5)，1mM EDTA，0.02％PVP，0.02％Ficoll，0.02％BSA和500μg/ml變性的鮭魚精子DNA。將濾膜在65℃下在含100μg/ml變性鮭魚精子DNA和5-20×10632P-標(biāo)記探針的預(yù)雜交混合液中預(yù)雜交48小時(shí)。將濾膜在37℃下用含有2×SSC，0.01％PVP，0.01％Ficoll和0.01％BSA的溶液洗滌1小時(shí)。然后再用0.1×SSC在50℃下洗滌45分鐘。
如果上面給出的條件不合適(例如，當(dāng)用于種間雜交時(shí))，還可以選用本領(lǐng)域已知的其他低度、中度和高度嚴(yán)謹(jǐn)條件(例如，當(dāng)用于種間雜交時(shí))。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核酸和/或多肽分離自柑桔類植物，例如柚子或橙子。在一個(gè)具體實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及特定的分離的核苷酸序列，包括那些基本上不含內(nèi)源性污染物質(zhì)的核苷酸序列。術(shù)語“核酸”或“核酸分子”是指單鏈或雙鏈形式的脫氧核糖核酸或核糖核酸多聚體，除另有說明外，其中還包括與天然生成核苷酸具有類似功能的天然核苷酸的已知類似物?！昂塑账嵝蛄小边€指以單個(gè)片段或作為更大核酸組分形式存在的多核苷酸分子或寡核苷酸分子。所述核苷酸序列或分子還被稱為“核苷酸探針”。本發(fā)明中的一些核酸分子源自分離的DNA或RNA，這些分離的DNA或RNA至少一度曾以基本純化形式存在，其量或濃度足以保證能夠用常規(guī)生化方法對(duì)其組分核苷酸序列進(jìn)行鑒定、擴(kuò)增和回收。這些方法的實(shí)例，包括本申請(qǐng)中PCR方案所使用的方法，參見Sambrook et al.，Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY(1989)，CurrentProtocols in Molecular Biology edited by F.A.Ausubel et al.，John Wiley andSons，Inc.(1987)，和Innis，M.et al.，eds.，PCR ProtocolsA Guide to Methodsand Applications，Academic Press(1990)。
在本申請(qǐng)中，本發(fā)明所述核酸分子包括單鏈和雙鏈形式的DNA及其RNA互補(bǔ)鏈。DNA包括，例如，cDNA、基因組DNA、化學(xué)合成DNA、PCR擴(kuò)增的DNA及其組合?；蚪MDNA包括翻譯區(qū)、非翻譯區(qū)及調(diào)控區(qū)，可以用常規(guī)技術(shù)來分離，例如使用本發(fā)明的任一種cDNA或其合適的片段作為探針對(duì)一段基因組DNA進(jìn)行鑒定，然后可以使用本領(lǐng)域常規(guī)方法克隆該基因組DNA。通常，本發(fā)明范圍內(nèi)的核酸分子包括在上述雜交和洗滌條件下能夠與本發(fā)明所述序列雜交的序列，比本發(fā)明所述序列DNA雙螺旋熔融溫度低5℃、10℃、15℃、20℃、25℃或30℃的序列，包括被這些范圍囊括在內(nèi)的任意范圍的條件。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核酸包括基本如SEQ IDNO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9，或SEQ IDNO10所示的序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸與SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸之間具有至少85％、至少90％或至少95％的同一性。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸包含SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示的核苷酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述核酸編碼一種蛋白質(zhì)，該蛋白質(zhì)是一種倍半萜烯合成酶，如實(shí)施例部分酶測(cè)定中所述。本發(fā)明還提供了含有不同物種間保守區(qū)域的核酸。
在另一實(shí)施方案中，所述核酸包含由SEQ ID NO6、SEQ IDNO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10中的至少50、100、250、500或750個(gè)連續(xù)核苷酸組成的連續(xù)片段。所述的這些核苷酸的連續(xù)片段還包括至少1處突變，只要突變體序列仍然保留原序列的功能，仍然能夠與這些核苷酸在低或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下雜交，例如，中度或高度嚴(yán)謹(jǐn)條件。所述片段可以源自，例如，SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10中的第200-1600位核苷酸(nt)、第800-1600位nt、第1000-1600位nt、第200-1000位nt、第200-800位nt、第400-1600位nt或第400-1000位nt。
如上所述，由本發(fā)明所述核酸編碼的多肽也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本發(fā)明所述的分離的核酸可選自編碼基本如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5之間具有至少85％、至少90％或至少95％的序列同一性。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的多肽含有SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示的氨基酸序列。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽含有基本如SEQ IDNO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ IDNO5所示的氨基酸序列。另一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽含有與SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示氨基酸序列間具有至少85％、至少90％或至少95％序列同一性的氨基酸序列。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述多肽是一種倍半萜烯合成酶，如下面實(shí)施例部分酶測(cè)定中所述。
由于遺傳密碼子的簡(jiǎn)并性，能夠編碼同一氨基酸的密碼子不止一個(gè)，所以多個(gè)DNA序列能編碼同一多肽。這些變體DNA序列可以獲自遺傳漂變或人工操作(例如，發(fā)生于PCR擴(kuò)增過程中或者作為天然序列目的誘變(deliberate mutagenesis)的產(chǎn)物)。因此，本發(fā)明包括能夠編碼源自SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ IDNO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10蛋白質(zhì)的任一核酸或其變體。
天然序列的目的誘變可以用本領(lǐng)域已知的許多種技術(shù)完成。例如，可以使用寡核苷酸-定點(diǎn)-特異性誘變方法，特別是在期望使基因突變從而通過取代、缺失或插入使預(yù)定限制性位點(diǎn)的核苷酸或密碼子變化的情況下。進(jìn)行所述變化的方法的實(shí)例見Walder etal.(Gene 42133，1986)；Bauer et al.(Gene 3773，1985)；Craik(BioTechniques，January 12-19，1985)；Smith et al.(Genetic EngineeringPrinciples and Methods，Plenum Press，1981)；Kunkel(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488，1985)；Kunkelet al.(Methods in Enzymol.154367，1987)；和美國專利US4,518,584和US4,737,462。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了分離的多肽。本申請(qǐng)中的“多肽”是指一類多肽或肽片段，其中含有本申請(qǐng)鑒定出的氨基酸序列，以及更小的片段。替代地，可以根據(jù)多肽與本發(fā)明核酸序列編碼的任一肽之間的抗原性相關(guān)程度來對(duì)該多肽進(jìn)行定義。因此，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明范圍內(nèi)的多肽定義為其中含有與本發(fā)明核酸序列編碼的任一肽相同線性或三維表位的氨基酸序列。替代地，本發(fā)明范圍內(nèi)的多肽是能夠被具有下述特性的抗體識(shí)別的，即該抗體能夠特異性識(shí)別本發(fā)明核酸序列編碼的任意一種肽。如果抗體與本發(fā)明多肽結(jié)合時(shí)的Ka值大于或等于約107M-1，例如大于或等于108M-1，那么就將該抗體定義為特異性結(jié)合。
本申請(qǐng)中的多肽“變體”是指基本上與天然多肽同源的多肽，但是其氨基酸序列因?yàn)橐惶幓蚨嗵幦笔?、插入或取代而不同于本發(fā)明任一核酸所編碼的多肽。
變體可以包括保守取代序列，即一特定氨基酸殘基被一具有類似理化特性的殘基所取代。保守取代的實(shí)例包括用一個(gè)脂肪族殘基取代另一個(gè)脂肪族殘基，例如，Ile、Val、Leu或Ala之間相互取代，或者用一個(gè)極性殘基取代另一個(gè)極性殘基，例如在Lys和Arg；Glu和Asp；或Gln和Asn之間相互取代。參見，Zubay，Biochemistry，Addison-Wesley Pub.Co.，(1983)。這類取代的效果可以用取代打分矩陣(substitution score matrices)來計(jì)算，如Altschul，(J.Mol.Biol.219555-65，1991)中所述的PAM-120、PAM-200和PAM-250。其他這類保守取代，例如具有近似疏水特性的完整區(qū)域的取代，已為本領(lǐng)域熟知。
天然生成的肽變體也在本發(fā)明范圍之內(nèi)。這種變體的實(shí)例是本申請(qǐng)所述多肽由于改變mRNA剪接事件或者蛋白水解切割得到的蛋白質(zhì)。蛋白水解引起的變化包括，例如，在不同類型宿主細(xì)胞中表達(dá)時(shí)，本發(fā)明序列編碼的多肽由于蛋白水解除去了一個(gè)或多個(gè)末端氨基酸而導(dǎo)致N-或C-末端的差異。
本發(fā)明倍半萜烯合成酶的變體可以用于實(shí)現(xiàn)酶促活性的增強(qiáng)或減弱，區(qū)域化學(xué)(regiochemistry)或立體化學(xué)的變化，或者底物利用或者產(chǎn)物分配的改變。可以用本領(lǐng)域已知的任一方法得到變體或?qū)崿F(xiàn)定點(diǎn)誘變。
如上所述，本發(fā)明提供了重組及非重組、分離且純化的多肽，例如從柑桔類植物。天然多肽的變體及衍生物可以通過下列方法得到從其他或同一植物品系或品種中分離天然生成的變體或變體的核苷酸序列，或者對(duì)編碼天然柑桔多肽的核苷酸序列的突變進(jìn)行人工設(shè)計(jì)。改變天然氨基酸序列可以用許多種常規(guī)方法中的任一種來完成?？梢酝ㄟ^下述方法將突變導(dǎo)入特定位置合成含有突變序列的寡核苷酸，與限制性酶切位點(diǎn)側(cè)接以能夠與天然序列的片段連接。連接后，得到的重構(gòu)序列編碼含有預(yù)期的氨基酸插入、取代或缺失的類似物。替代地，可以使用寡核苷酸-定點(diǎn)-特異性誘變方法提供一種經(jīng)過改變的基因，其中預(yù)定的密碼子因取代、缺失或插入而改變。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明涉及含有本發(fā)明所述核酸的載體。例如，含有至少一種選自下列核酸的載體(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶。
本發(fā)明使用的載體包括任一種重組載體，包括但不限于病毒載體、噬菌體及質(zhì)粒。
含有本發(fā)明所述核酸序列的重組載體可以用熟知的方法制備。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述表達(dá)載體中含有編碼多肽的cDNA序列，該cDNA序列可操作地連接有合適的轉(zhuǎn)錄或翻譯調(diào)控核苷酸序列，例如源自哺乳動(dòng)物、細(xì)菌、病毒或昆蟲基因的調(diào)控序列。調(diào)控序列的實(shí)例包括轉(zhuǎn)錄啟動(dòng)子、操縱子、或增強(qiáng)子，mRNA核糖體結(jié)合位點(diǎn)、以及調(diào)控轉(zhuǎn)錄及翻譯起始和終止的合適序列。當(dāng)調(diào)控序列與本發(fā)明的cDNA序列功能性相連時(shí)那么核苷酸序列就是“可操作地連接”。因此，如果一啟動(dòng)子核苷酸序列能夠調(diào)控cDNA序列的轉(zhuǎn)錄，那么該啟動(dòng)子序列就是可操作地連接于該cDNA序列。此外還可以向表達(dá)載體中引入在預(yù)期宿主細(xì)胞中的復(fù)制能力和選擇基因，所述復(fù)制能力通常由復(fù)制起點(diǎn)賦予，選擇基因可以是轉(zhuǎn)化株得以通過其鑒定的那些。
此外，還可以向表達(dá)載體引入信號(hào)肽編碼序列，天然狀態(tài)下該信號(hào)肽與本發(fā)明多肽并不相連。例如，可以將編碼信號(hào)肽(分泌前導(dǎo)肽)的DNA序列與本發(fā)明的核苷酸序列融合在同一閱讀框內(nèi)從而使得本發(fā)明的多肽最初翻譯為含有信號(hào)肽的融合蛋白。在預(yù)期宿主細(xì)胞中發(fā)揮作用的信號(hào)肽可以增進(jìn)所表達(dá)多肽的胞外分泌。可在分泌離開細(xì)胞時(shí)將信號(hào)肽從多肽上切除。
可以在本發(fā)明多肽的氨基及羧基端融合其他的肽序列，用以提高多肽的表達(dá)或者促進(jìn)蛋白質(zhì)的純化。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明包括含有本發(fā)明所述核酸的宿主細(xì)胞。本發(fā)明的另一實(shí)施方案是一種制備重組宿主細(xì)胞的方法，該方法包括將本發(fā)明載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。在另一個(gè)實(shí)施方案中，提供了制備多肽的方法，該方法包括將本發(fā)明宿主細(xì)胞培養(yǎng)于能夠產(chǎn)生多肽的條件下。一個(gè)實(shí)施方案中，對(duì)所述多肽進(jìn)行回收。本發(fā)明所述方法包括制備至少一種本發(fā)明所述倍半萜烯合成酶的方法，該方法包括培養(yǎng)含有本發(fā)明所述核酸的宿主細(xì)胞，然后回收積聚的倍半萜烯合成酶。
適于表達(dá)本發(fā)明多肽的宿主細(xì)胞包括原核細(xì)胞、酵母或高等真核細(xì)胞。適用于細(xì)菌、真菌、酵母及哺乳動(dòng)物細(xì)胞宿主的克隆和表達(dá)載體的描述參見，例如，Pouwels et al.，Cloning VectorsALaboratory Manual，Elsevier，New York，(1985)。另外還可以采用無細(xì)胞翻譯系統(tǒng)，用源自本發(fā)明所述DNA構(gòu)建體的RNA制備公開的多肽。
原核細(xì)胞包括革蘭氏陰性或革蘭氏陽性生物體，例如，大腸桿菌或桿菌。適于轉(zhuǎn)化的原核細(xì)胞包括，例如，大腸桿菌、枯草桿菌、鼠傷寒沙門氏菌和假單胞屬的其他菌種、鏈霉菌、以及葡萄球菌。原核宿主細(xì)胞中，例如大腸桿菌中，所述多肽可以含有有助于重組多肽在原核細(xì)胞中表達(dá)的N-末端甲硫氨酸殘基?？梢詫-末端甲硫氨酸殘基從表達(dá)的重組多肽上切除。
適用于原核宿主細(xì)胞的表達(dá)載體的實(shí)例包括從可商購的質(zhì)粒如克隆載體pET質(zhì)粒(Novagen，Madison，WI，USA)或pBR322(ATCC37017)得到的載體。pBR322中含有氨芐青霉素及四環(huán)素抗性基因，因而提供了鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞的便捷方法。就使用pBR322構(gòu)建表達(dá)載體而言，可以將合適的啟動(dòng)子和編碼一種或多種本發(fā)明所述多肽的DNA序列插入pBR322載體。其他可商購的載體包括，例如，pKK223-3(Pharmacia Fine Chemicals，Uppsala，Sweden)和pGEM-1(PromegaBiotec，Madison，WI，USA)。其他可商購的載體包括為蛋白表達(dá)專門設(shè)計(jì)的載體；這些載體包括用于與麥芽糖結(jié)合蛋白融合的蛋白質(zhì)表達(dá)的pMAL-p2和pMAL-c2載體(New England Biolabs，Beverly，MA，USA)。
重組原核宿主細(xì)胞表達(dá)載體常用的啟動(dòng)子序列包括細(xì)菌噬菌體T7啟動(dòng)子(Studier F.W.and Moffatt B.A.，J.Mol.Biol.189113，1986)、β-內(nèi)酰胺酶(青霉素酶)、乳糖啟動(dòng)子系統(tǒng)(Chang et al.，Nature 275615，1978；和Goeddel et al.，Nature 281544，1979)、色氨酸(trp)啟動(dòng)子系統(tǒng)(Goeddel et al.，Nucl.Acids Res.84057，1980；和EP-A-36776)、以及tac啟動(dòng)子(Maniatis，MoLecular CloningA Laboratory Manual，Cold SpringHarbor Laboratory，p.412，1982)。一種特別有用的原核宿主細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)使用λ噬菌體PL啟動(dòng)子和cl857ts熱敏感抑制序列(thermolabilerepressor sequence)?？蓮拿绹湫团囵B(yǎng)物保藏中心(″ATCC″)獲得的其中引入PL啟動(dòng)子衍生物的質(zhì)粒載體，包括質(zhì)粒pHUB2(存在于大腸桿菌JMB9菌株(ATCC 37092))和pPLc28(存在于大腸桿菌RR1菌株(ATCC 53082))。
另外還可以將本發(fā)明所述多肽表達(dá)于酵母宿主細(xì)胞、優(yōu)選來自酵母屬(例如，釀酒酵母)。其他酵母屬也可使用，例如畢赤酵母屬或克魯維酵母屬(例如，乳酸克魯維酵母)。酵母載體通常含有來自2μ酵母質(zhì)粒復(fù)制序列起點(diǎn)、自主復(fù)制序列(ARS)、啟動(dòng)子區(qū)域、聚腺苷酸化用序列、轉(zhuǎn)錄終止序列和可篩選標(biāo)志基因。其中適于酵母載體的合適啟動(dòng)子包括，例如，金屬硫蛋白、3-磷酸甘油酸激酶(Hitzeman et al.，J.Biol.Chem.2552073，1980)的啟動(dòng)子，或其它糖酵解酶的啟動(dòng)子(Hess et al.，J.Adv.Enzyme Reg.7149，1968；和Holland etal.，Biochem.174900，1978)，例如烯醇化酶，甘油酸-3-磷酸脫氫酶、己糖激酶、丙酮酸脫羧酶、果糖磷酸激酶、葡糖-6-磷酸異構(gòu)酶、3-磷酸甘油酸變位酶、丙酮酸激酶、丙糖磷酸異構(gòu)酶、葡糖磷酸異構(gòu)酶和葡糖激酶。其他適于酵母表達(dá)的載體和啟動(dòng)子的描述參見Hitzeman，EPA-73,657或Fleer et.al.，Gene，107285-195(1991)；和vanden Berg et.al.，Bio/Technology，8135-139(1990)。另一種替代方案是葡萄糖-抑制ADH2啟動(dòng)子，其描述見Russell et al.(J.Biol.Chem.2582674，1982)和Beier et al.(Nature 300724，1982)。通過將來自pBR322中在大腸桿菌中負(fù)責(zé)篩選和復(fù)制的DNA(Ampr基因和復(fù)制起始位點(diǎn))插入上述酵母載體，可以構(gòu)建出在大腸桿菌和酵母中均可復(fù)制的穿梭載體。
本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案是經(jīng)過修飾以含有本發(fā)明所述核酸的非人生物體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域已知的任一種基因轉(zhuǎn)移方法對(duì)所屬非人生物體和/或宿主細(xì)胞進(jìn)行修飾，包括，例如，使用遞送載體，如脂質(zhì)及病毒載體、裸露DNA、電穿孔及微粒介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述非人生物體是植物、昆蟲或微生物。
例如，在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了一種制備至少一種倍半萜烯合成酶的方法，該方法包括將經(jīng)修飾以含有至少一種核酸的宿主培養(yǎng)在利于所述至少一種倍半萜烯合成酶產(chǎn)生的條件下，其中所述的至少一種核酸選自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQ ID NO1、SEQID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶。
在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述宿主是一種植物(如煙草)、動(dòng)物或微生物，還包括但不限于菌體細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。在本申請(qǐng)中，植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞包括用植物和動(dòng)物作為宿主。例如，在本方明的一些實(shí)施方案中，表達(dá)是在經(jīng)過基因修飾后的非人生物體中進(jìn)行。
在一個(gè)實(shí)施方案中，使用哺乳動(dòng)物或昆蟲宿主細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)表達(dá)本發(fā)明的重組多肽。用于在昆蟲細(xì)胞中制備異源蛋白的桿狀病毒系統(tǒng)的綜述見Luckow and Summers，Bio/Technology 647(1988)。另外還可以使用從哺乳動(dòng)物來源建立的細(xì)胞系。合適的宿主細(xì)胞系的實(shí)例包括COS-7猴腎細(xì)胞系(ATCC CRL 1651)(Gluzman et al.，Cell23175，1981)，L細(xì)胞、C127細(xì)胞、3T3細(xì)胞(ATCC CCL 163)、中華倉鼠卵巢(CHO)細(xì)胞、HeLa細(xì)胞和BHK(ATCC CRL 10)細(xì)胞系，以及源自非洲綠猴腎細(xì)胞系CVI(ATCC CCL 70)的細(xì)胞系CV-1/EBNA-1(ATCC CRL 10478)，描述見McMahan et al.(EMBO J.102821，1991)。
為將DNA導(dǎo)入哺乳動(dòng)物細(xì)胞而建立的方法現(xiàn)已公開(Kaufman，R.J.，Large Scale Mammalian Cell Culture，1990，pp.15-69)。其他使用可商購的試劑例如Lipofectamine(Gibco/BRL)或Lipofectamine-Plus的方法，也可用于轉(zhuǎn)染細(xì)胞(Felgner et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 847413-7417，1987)。此外，可以使用常規(guī)方法通過電穿孔轉(zhuǎn)染哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如Sambrook et al.Molecular CloningA Laboratory Manual，2ed.Vol.1-3，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1989)中所描述的方法?？梢杂眉?xì)胞毒性物質(zhì)抗性作為篩選方法篩選得到穩(wěn)定的轉(zhuǎn)化體。Kaufman et al.，Meth.In Enzymology 185487-511，1990中描述了幾種篩選方案，例如二氫葉酸還原酶(DHFR)抗性。適于DHFR篩選的宿主細(xì)胞株有CHO細(xì)胞株DX-B11，該細(xì)胞株是DHFR缺陷型的(Urlaub and Chasin，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 774216-4220，1980)?？梢詫⒛鼙磉_(dá)DHFR cDNA的質(zhì)粒導(dǎo)入細(xì)胞株DX-B11，這時(shí)只有那些含有該質(zhì)粒的細(xì)胞才能在合適的篩選培養(yǎng)基中生長(zhǎng)。
哺乳動(dòng)物細(xì)胞表達(dá)載體用的轉(zhuǎn)錄及翻譯調(diào)控序列可以從病毒基因組切取。常用的啟動(dòng)子序列和增強(qiáng)子序列源自多瘤病毒、腺病毒2、猴病毒40(SV40)和人巨細(xì)胞病毒。源自SV40病毒基因組的DNA序列，例如SV40起點(diǎn)、早期和晚期啟動(dòng)子、增強(qiáng)子、剪接(位點(diǎn))以及聚腺苷酸化位點(diǎn)，可用于提供哺乳動(dòng)物宿主細(xì)胞表達(dá)用的其他基因元件。病毒早期和晚期啟動(dòng)子特別有用，因?yàn)樗鼈內(nèi)菀滓云涡问綇牟《净蚪M獲得，片段中還含有病毒復(fù)制起點(diǎn)(Fiers et al.，Nature 273113，1978；Kaufman，Meth.in Enzymology，1990)。
現(xiàn)已有數(shù)種本領(lǐng)域已知的用于制備轉(zhuǎn)基因植物的方法。這些方法包括，但不限于植物原生質(zhì)體電穿孔、脂質(zhì)體介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、聚乙二醇介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化、植物細(xì)胞的微注射以及使用病毒進(jìn)行的轉(zhuǎn)化。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用的是粒子轟擊定向基因轉(zhuǎn)移。
粒子轟擊定向基因轉(zhuǎn)移為轉(zhuǎn)化植物組織提供了一個(gè)實(shí)例。該技術(shù)中，包被了DNA的粒子或微拋射體被射出穿越細(xì)胞的物理屏障。粒子轟擊可用于將DNA導(dǎo)入DNA包被粒子可穿透的任一靶組織，但是為了穩(wěn)定轉(zhuǎn)化，必須使用可再生的細(xì)胞。通常，粒子由金或鎢制成?？梢允褂肅aCl2或乙醇沉淀的方法將DNA包被在粒子上，這些方法都是本領(lǐng)域已知的常規(guī)方法。
DNA包被粒子用粒子槍射出。合適的粒子槍可從Bio-RadLaboratories(Hercules，CA)購買。粒子的穿透由改變參數(shù)來控制，例如爆裂強(qiáng)度、粒子大小或者粒子到達(dá)靶組織必須行經(jīng)的距離。
包被粒子用的DNA包括適于驅(qū)動(dòng)目的基因表達(dá)的表達(dá)框，其中含有與目的基因可操作連接的啟動(dòng)子。
粒子轟擊定向基因轉(zhuǎn)移方法的描述參見Tomes等人的美國專利US5,990,387。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明的cDNA可用產(chǎn)生正義或反義RNA的方法表達(dá)。反義RNA就是與基因編碼mRNA(正義RNA)反向互補(bǔ)的RNA。驅(qū)動(dòng)反義RNA表達(dá)的載體是這樣一種載體，cDNA以相對(duì)于啟動(dòng)子而言“相反方向”放入其中從而使得非編碼鏈(而不是編碼鏈)被轉(zhuǎn)錄。反義RNA的表達(dá)被用于下調(diào)該反義RNA互補(bǔ)mRNA編碼的蛋白質(zhì)的表達(dá)量。產(chǎn)生反義RNA的載體可用于制備轉(zhuǎn)基因植物，如上所述。
在一個(gè)實(shí)施方案中，轉(zhuǎn)染后的DNA整合入非人生物體的染色體從而得到穩(wěn)定的重組系統(tǒng)。本領(lǐng)域已知的任一染色體整合方法都可用于實(shí)施本發(fā)明，包括但不限于，重組酶介導(dǎo)的表達(dá)框置換(recombinase-mediated cassette exchange)(RMCE)、病毒位點(diǎn)特異性染色體插入、腺病毒以及原核注射。
本發(fā)明的另一實(shí)施方案是制備萜類化合物和倍半萜烯化合物的方法，例如，使用本發(fā)明所述核苷酸及多肽。實(shí)施例包括用于制備至少一種萜類化合物的方法，該方法包括讓至少一種脂肪族焦磷酸酯萜烯前體與核酸編碼的至少一種多肽接觸，該核酸選自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶，然后將制備得到的至少一種萜類化合物分離出來。另一實(shí)施例是制備至少一種萜類化合物的方法，該方法包括讓至少一種脂肪族焦磷酸酯萜烯前體與至少一種基本如SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5所示多肽接觸，然后將制備得到的至少一種萜類化合物分離出來。
本申請(qǐng)中使用的脂肪族焦磷酸酯萜烯前體是任意的脂肪族焦磷酸酯化合物，其是用于制備至少一種萜烯的前體，包括但不限于，牻牛兒基焦磷酸酯(GPP)，法呢基焦磷酸酯(FPP)和牻牛兒基牻牛兒基焦磷酸酯(GGPP)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的至少一種萜類化合物選自倍半萜烯。在一個(gè)實(shí)施方案中，所述的脂肪族焦磷酸酯萜烯前體是法呢基焦磷酸酯。在另一個(gè)實(shí)施方案中，所述的至少一種倍半萜烯選自二環(huán)吉馬烯((E，E)-3，7，11，11-四甲基-二環(huán)[8.1.0]十一-2，6-二烯)、蓽澄茄醇((1R，4S，5R，6R，7S，10R)-7-異丙基-4，10-二甲基-三環(huán)[4.4.0.0(1，5)]癸-4-醇，朱欒倍半萜((+)-(1R)-1，2，3，5，6，7，8，8A-八氫-7-異丙烯基-1@，8A@-二甲基萘)、α-蓽澄茄油烯、吉馬烯D和δ-杜松烯(rel-(1R，8AS)-1，2，3，5，6，8A-六氫-1-異丙基-4，7-二甲基萘)(圖2)。本發(fā)明的萜類化合物可以用本領(lǐng)域使用的任一方法分離，包括但不限于層析、提取及蒸餾。
在一個(gè)實(shí)施方案中，可以通過改變合成酶與脂肪族焦磷酸酯萜烯前體(例如法呢基焦磷酸酯)接觸時(shí)的pH值來調(diào)整產(chǎn)物分配或形成的實(shí)際產(chǎn)物。在一個(gè)實(shí)施方案中，pH為7。另一實(shí)施方案中，pH小于7，例如，6、5、4和3。
另外，本發(fā)明還提供了一種生物體(例如，微生物或植物)，該生物體用于構(gòu)建一種平臺(tái)，用于以高水平生產(chǎn)倍半萜烯合成酶底物(例如，F(xiàn)PP)以及將本發(fā)明核酸導(dǎo)入該生物體。例如，將至少一種編碼倍半萜烯合成酶的本發(fā)明所述核酸引入制備FPP的非人生物體，從而完成FPP向倍半萜烯的轉(zhuǎn)化以及隨后的倍半萜烯的代謝產(chǎn)生。在一個(gè)實(shí)施方案中，這樣就得到一種用于高水平生產(chǎn)倍半萜烯的平臺(tái)。
在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明所述核酸可用于制備編碼倍半萜烯合成酶的其他核酸。例如，本發(fā)明提供了一種鑒定倍半萜烯合成酶的方法，該方法包括用本發(fā)明所述核酸構(gòu)建DNA文庫，從該文庫中篩選出編碼至少一種倍半萜烯合成酶的核酸。本發(fā)明所述核酸的文庫可以用本領(lǐng)域已知的任一方法構(gòu)建，其中用本發(fā)明核酸作為起始位點(diǎn)制備DNA序列，包括但不限于DNA重構(gòu)(DNA shuffling)。在該方法中，用功能試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)編碼倍半萜烯合成酶的目標(biāo)核酸從而從所述文庫中篩選倍半萜烯合成酶。倍半萜烯合成酶的活性可以用例如本申請(qǐng)所述方法測(cè)定。在一個(gè)實(shí)施方案中，使用高通量篩選分析編碼多肽的活性。
本申請(qǐng)中的“核苷酸探針”是指能夠通過形成一種或多種化學(xué)鍵、通過互補(bǔ)堿基配對(duì)或者通過形成氫鍵，與互補(bǔ)序列的目標(biāo)核酸結(jié)合的寡核苷酸或多核苷酸。如上所述，所述寡核苷酸探針可以含有天然(即A，G，C或T)或者修飾堿基(7-脫氮鳥嘌呤、次黃嘌呤核苷等)。此外，核苷酸探針中的堿基可以通過磷酸二酯鍵以外的鍵連接，只要其不妨礙雜交即可。因此，寡核苷酸探針中可以含有通過磷酸二酯鍵以外的肽鍵連接的連續(xù)堿基。
本申請(qǐng)中的“目標(biāo)核酸”是指能夠與所述核苷酸探針或分子特異性雜交的核酸?？梢栽O(shè)計(jì)探針測(cè)定目標(biāo)核酸的存在與否以及目標(biāo)核酸的含量。目標(biāo)核酸的序列與將相應(yīng)探針中導(dǎo)向目標(biāo)的核酸序列互補(bǔ)。正如本領(lǐng)域技術(shù)人員理解的那樣，所述探針還可以含有與目標(biāo)不能特異性雜交的其他核酸或其他部分，例如標(biāo)記物。術(shù)語目標(biāo)核酸可以是探針指向的較大核酸中的特定的核苷酸序列也可以是全序列(例如，基因或mRNA)。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以認(rèn)識(shí)到各種條件下的所有用途。
除操作實(shí)施例或者另有說明之外，所有表示組分含量、反應(yīng)條件的數(shù)值以及說明書和權(quán)利要求中使用的數(shù)值應(yīng)理解為全部用“約”進(jìn)行了限定。因此，除有相反說明外，說明書和權(quán)利要求中的所有數(shù)值參數(shù)都是近似值，可以根據(jù)本發(fā)明期望獲得的理想特性來變動(dòng)。絕對(duì)無意限制等同原則在權(quán)利要求范圍上的應(yīng)用，所以每一個(gè)數(shù)字參數(shù)都應(yīng)該是根據(jù)有效數(shù)字的數(shù)目和常規(guī)舍入法得到的。
盡管表示本發(fā)明較寬范圍時(shí)使用的數(shù)值范圍和參數(shù)是近似值，但是特定實(shí)施例中列出的數(shù)值卻是盡可能精確的。但是，任一數(shù)值中都必然含有因各自測(cè)量存在的標(biāo)準(zhǔn)差所不可避免帶來的一定誤差。下列實(shí)施例是為了闡述本發(fā)明但決不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。百分比是根據(jù)重量計(jì)算出的。
下列實(shí)施例是為了闡述本發(fā)明但決不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成限制。
實(shí)施例材料用柚子(葡萄柚)皮作為本申請(qǐng)所述試驗(yàn)的起始原材料。皮(果皮外部有顏色的部分)內(nèi)含有油腺，油腺是萜烯生物合成的部位。用新鮮采摘的成熟果實(shí)在Simone Gatto(Sicily)制得新鮮的柚子皮。將皮(3-4mm厚)剝離后，立即冷凍，而且在運(yùn)輸過程和隨后的所有步驟中都保持冷凍以防降解。
實(shí)施例1用RT-PCR分離倍半萜烯合成酶cDNA。
將植物倍半萜烯合成酶的推導(dǎo)氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，鑒定保守區(qū)并設(shè)計(jì)植物倍半萜烯合成酶-特異性寡核苷酸。為了獲得較高的序列同源性，將序列分成兩組(圖4)。第一組包括下列酶的序列源自蕃茄(Lycopersicon esculentum)cv.VFNT cherry(Colby et al，1998)的吉馬烯C合成酶、源自歐薄荷(Mentha x piperita)(Crock et al，1997)的(E)-β-金合歡烯合成酶、源自北美冷杉(Steele et al，1998)的δ-芹子烯合成酶、源自香橙(GenBank登記號(hào)AF288465)的倍半萜烯合成酶、源自煙草(Facchini和Chappell，1992)和辣椒(Back et al，1998)的5-表-馬兜鈴烯合成酶、源自馬鈴薯和Hyoscyamus muticus(Back and Chappel，1995)的vetispiradiene合成酶。第二組包括下列酶的序列源自亞洲棉(Chenet al.1995)的(+)-δ-杜松烯合成酶，源自黃花蒿的紫穗槐-4，11-二烯合成酶(Mercke et al，2000)和表-雪松醇合成酶(Merck et al，1999)以及源自北美冷杉(Steele et al，1998)的γ-葎草烯合成酶。最高序列同源性發(fā)現(xiàn)于序列的中間部分。選擇三個(gè)含有足夠保守氨基酸的區(qū)域，設(shè)計(jì)這些區(qū)域的特異性簡(jiǎn)并寡核苷酸(即，從每一比對(duì)組得到兩個(gè)正向和一個(gè)反向引物)(圖4)。
用從Hot Borate技術(shù)制備柚子皮得到的總RNA以及正向和反向簡(jiǎn)并引物的不同組合，進(jìn)行RT-PCR。提取總RNA用的Hot Borate方法是由Wan and Wilkins(Wan et al.(1994)Anal.Biochem.223，7-12.)改進(jìn)得到的。在液氮中將這些組織用研缽和杵研磨成細(xì)粉。將得到的細(xì)粉加入5ml提取緩沖液(200mM硼酸鹽、30mM EGTA，10mMDTT，1％SDS，1％脫氧膽酸鈉、2％PVP，0.5％乙基苯基聚乙二醇(NP40))80℃預(yù)熱。將上述混合物用UltraturaxTM勻漿器均質(zhì)化，然后用兩層MiraclothTM濾膜(Calbiochem)過濾。將混合物在0.5mg/ml蛋白酶K(用于蛋白質(zhì)/核糖核酸酶消化)存在條件下42℃孵育90分鐘。然后加入KCl至1M終濃度，置于冰上孵育1小時(shí)，將混合物置于4℃離心機(jī)中10000g離心10分鐘?；厥丈锨?，加入1/3體積的8M LiCl。將混合物4℃孵育過夜，然后4℃下10000g離心20分鐘。棄上清，用2M LiCl洗滌沉淀，用上述條件再次離心。然后，將沉淀重懸于無RNase的蒸餾水，然后加入0.15倍體積的2M乙酸鉀溶液和2.5倍體積的無水乙醇。-20℃下孵育2小時(shí)沉淀RNA，然后照前述條件離心。用80％乙醇洗滌RNA沉淀，然后重懸于無RNase的蒸餾水。
RNA濃度由260nm處的OD值估測(cè)。用瓊脂糖凝膠通過查證核糖體RNA條帶的整齊度測(cè)定RNA純度。
用Qiagen OneStep RT-PCR試劑盒和Eppendorf Mastercycler梯度熱循環(huán)儀進(jìn)行RT-PCR。常用反應(yīng)混合物50μl終體積中含有10μl 5cQiagen OneStep RT-PCR緩沖液、400μM每一dNTP、400nM每一引物、2μl Qiagen OneStep RT-PCR Enzyme Mix、1μl RNasin核糖核酸酶抑制劑(Promega Co.)和1μg總RNA。熱循環(huán)儀條件為50℃、30分鐘(反轉(zhuǎn)錄)；95℃、15分鐘(DNA聚合酶活化)；94℃、45秒，42-45℃、10秒(根據(jù)使用引物而定)，72℃、45-90秒(根據(jù)待擴(kuò)增DNA片段長(zhǎng)度而定)共40個(gè)循環(huán)；然后72℃、10分鐘。
用1％瓊脂糖凝膠測(cè)算PCR產(chǎn)物的大小。將出現(xiàn)在預(yù)期大小對(duì)應(yīng)位置上的條帶從凝膠上切割下來，用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)純化，然后用TOPO TA克隆試劑盒(Invitrogen)克隆入pCR2.1-TOPO載體。然后對(duì)插入的cDNA進(jìn)行DNA測(cè)序，將該序列用BLASTX算法(Altschul et al 1990)與GenBank非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(non redundant protein database)(NCBI)進(jìn)行比對(duì)。
對(duì)預(yù)期長(zhǎng)度(80-240bp大小)PCR產(chǎn)物進(jìn)行DNA測(cè)序和Blast搜索表明有三種倍半萜烯合成酶片段，命名為GFTpsA、GFtpsB和GFTpsC。180-bp的GFTpsA片段用引物TpsVF1和TpsVR3擴(kuò)增，115-bp的GFtpsB片段用TpsVF2和TpsVR3擴(kuò)增，115-bp的GFTpsA片段用TpsVF1和TpsVR3擴(kuò)增。推導(dǎo)的氨基酸序列表明這三種片段之間差異顯著(圖5)。
實(shí)施例2用5′/3′-RACE分離倍半萜烯合成酶cDNA為了分離倍半萜烯合成酶的全長(zhǎng)序列，首先使用5′/3′-RACE方法，用MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech)，從純化自Hot Borate技術(shù)制備總RNA的1μg mRNA起始。合成cDNA的質(zhì)量較差，基本上都是很小的cDNA(平均大小為0.5Kb)。但是，用該cDNA，通過基因特異性引物得到了GFTpsB和GFTpsC的3’末端，GFTpsB使用GFTpsBRF1和GFTpsBRF2，GFTpsC使用GFTpsCRF1和GFTpsCRF2(參見表1)。用硫氰酸胍/苯酚提取方法制備的mRNA得到了較高質(zhì)量的cDNA，平均大小為2Kb，從而可以用基因特異性引物GFTpsCRR1和GFTpsRR2(參見表1)分離GFTpsC的5′-末端序列，從而完成該克隆的全長(zhǎng)序列。GFTpsB的5′-末端和GFTpsA的5′-末端及3′-末端用該方法不能獲得。
硫氰酸胍/苯酚提取法采用Chomczynski和Sacchi所述技術(shù)，使用ThermoHybaid的RNACleanTM溶液(Chomczynski，P.，and Sacchi，N.，(1987)Anal.Biochem.162，156-159.)。簡(jiǎn)而言之，在液氮中將2g冷凍組織用研缽和杵研磨成細(xì)粉。將得到的細(xì)粉轉(zhuǎn)移到20mlRNACleanTM溶液，將懸液用UltraturaxTM勻漿器均質(zhì)化，然后用MiraclothTM濾膜(Calbiochem)過濾。加入0.1倍體積的氯仿后，將試管置于冰上，然后4℃下12000g離心20分鐘?；厥丈蠈铀啵尤?倍體積的異丙醇。-20℃孵育20分鐘后，將樣品在4℃下12000g離心20分鐘。將得到的白色沉淀大塊用70％乙醇洗滌，室溫干燥。將這種含有總RNA的沉淀立即用FastTrack2.0mRNA分離試劑盒(Invitrogen)通過oligodT-纖維素親和層析進(jìn)行mRNA純化。按照廠商推薦方法進(jìn)行，除下述改動(dòng)外在將總RNA重懸于裂解緩沖液后，將樣品由65℃改為100℃下加熱。
cDNA 3′和5′末端快速擴(kuò)增(RACE)用MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech)完成。該方法從合成第一鏈cDNA開始，用oligo(dT)引物從mRNA起始。第二鏈合成后，將特異性銜接子連接于雙鏈cDNA(ds cDNA)末端。該方法提供了一種銜接子連接的ds cDNA的非克隆文庫。用純化的柚子mRNA(1μg)作為起始材料。用瓊脂糖凝膠測(cè)算cDNA的質(zhì)和量。
使用Advantage2聚合酶Mix，用基因特異性和銜接子特異性寡核苷酸的組合擴(kuò)增cDNA的3’-或5’-末端。常規(guī)RACE反應(yīng)混合物50μl終體積中含有5μl 10×cDNA PCR反應(yīng)緩沖液(clontech)、200nM每一dNTP、1μl Advantage2聚合酶Mix、200μM銜接子特異性引物(Clontech)、200μM基因特異性引物(參見表1)和5μl經(jīng)50-250倍稀釋后的銜接子連接的cDNA。擴(kuò)增在Eppendorf Mastercycler梯度熱循環(huán)儀中進(jìn)行。熱循環(huán)儀條件為94℃、1分鐘；94℃、30秒，72℃、2-4分鐘，共5個(gè)循環(huán)；94℃、30秒，70℃、2-4分鐘，共5個(gè)循環(huán)；94℃、30秒，68℃、2-4分鐘，共20個(gè)循環(huán)。必要時(shí)用巢式銜接子特異性引物(Clontech)和巢式基因特異性引物進(jìn)行第二輪擴(kuò)增。
按照上文RT-PCR產(chǎn)物使用的方法，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行評(píng)定、亞克隆及序列分析。
表13′/5′-RACE試驗(yàn)中使用的引物
發(fā)現(xiàn)用3′-RACE得到的部分GFTpsB cDNA與公共數(shù)據(jù)庫(GeneBank登記號(hào)AF288465)中的及分離自香橙的推定萜烯合成酶cDNA之間具有高度序列同一性。這種萜烯合成酶的特異性引物設(shè)計(jì)為根據(jù)香橙(C.junos)萜烯合成酶非編碼區(qū)設(shè)計(jì)一個(gè)正向和反向引物對(duì)(junosF1和junosR1)，根據(jù)含有起始和終止密碼子在內(nèi)的編碼區(qū)設(shè)計(jì)一正向和反向引物對(duì)(junosF2和junosR2)。用引物對(duì)junosF1和junosR1對(duì)柚子MarathonTMcDNA文庫進(jìn)行PCR擴(kuò)增沒有得到任何擴(kuò)增子。用引物對(duì)junosF2和junosR2擴(kuò)增出了一1.6Kb的片段。DNA測(cè)序證實(shí)該P(yáng)CR產(chǎn)物是GFTpsB克隆的1669-bp全長(zhǎng)倍半萜烯合成酶(圖6)。
實(shí)施例3cDNA文庫篩選和EST測(cè)序?yàn)榱说玫絇CR方法獲得的部分克隆的全長(zhǎng)cDNA，構(gòu)建了從柚子皮mRNA制備的cDNA文庫。
用Uni-ZAPXR文庫構(gòu)建試劑盒(Stratagene)，按照廠商推薦方法，從7.5μg柚子皮mRNA(用硫氰酸胍/苯酚法制得)起始進(jìn)行cDNA合成和文庫構(gòu)建。文庫的初始滴度為2×107PFU(噬斑形成單位)，插入片段的平均長(zhǎng)度為1.1Kb。
使用兩種方法從上述cDNA文庫分離編碼cDNA的倍半萜烯合成酶EST測(cè)序以及用DNA探針篩選。就EST(已表達(dá)序列標(biāo)志)測(cè)序而言，使用文庫的一部分，用Stratagene的大量切除法(massexcision protocol)切除Uni-ZAP XR載體中的pBluescript噬菌粒。隨機(jī)挑取得到的轉(zhuǎn)化菌落(576)，純化質(zhì)粒。對(duì)于每一克隆都用T3引物進(jìn)行一測(cè)序反應(yīng)。首先對(duì)序列進(jìn)行編輯除去載體序列，然后用BLASTX算法(Altschul et al 1990)與GenBank非冗余蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫(NCBI)進(jìn)行比對(duì)。
用地高辛(DIG)標(biāo)記的DNA探針對(duì)文庫進(jìn)行篩選。該探針是用PCR DIG(地高辛)探針合成試劑盒(Roche Diagnostics)通過PCR擴(kuò)增將D1G-dUTP摻入DNA片段而合成的。從一等份文庫中擴(kuò)增出149-bp的GFTpsA-來源DNA探針，使用的引物為正向引物GFTpsAproF(SEQ ID NO51)(5′-ACGATTTAGGCTTCCCTAAAAAGG-3′)和反向引物GFTpsAproR(SEQ ID NO52)(5′-TATTATGGAATATTATGCACACCAC-3′)。從pET-GFTpsB2-2質(zhì)粒中擴(kuò)增出1036-bp的GFTpsB-來源探針，使用的引物為正向引物junosF2(SEQ ID NO53)(5′-AAATGTCCGCTCAAGTTCTAGCAACGG-3′)和反向引物GFTpsBRR2(SEQ ID NO54)(5′-GTTTGAGCTCTTCAAAGAAACC-3′)。從pET-GFTpsC質(zhì)粒中擴(kuò)增出1008-bp的GFTpsC-來源DNA探針，使用的是正向引物GFTpsCpetF1(SEQ IDNO55)(5′-ATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCC-3′)和反向引物GFTpsCRR1(SEQ ID NO56)(5′-GTTGCTAATATCCCACCTTTTGATAGC-3′)。
探針在40℃下在Dig Easy Hyb雜交溶液(Roche Diagnostics)中雜交出噬斑挑取物(plaques lifts)，噬斑挑取物制備自含有5,000-25,000PFU的平板。通過化學(xué)發(fā)光檢測(cè)膜上的探針-目標(biāo)雜合體，使用抗-地高辛-堿性磷酸酶(Roche Diagnostics)和CDP-Star堿性磷酸酶底物(Roche Diagnostics)，用VersaDoc Imaging System(BioRad)顯色。
從瓊脂糖平板上挖髓取出陽性信號(hào)的噬菌體，進(jìn)行第二輪篩選，如果必要在進(jìn)行第三輪篩選，直至獲得單一噬斑陽性信號(hào)。體內(nèi)切割陽性分離物，按照上述方法對(duì)插入片段測(cè)序。
用從GFTpsA、GFTpsB和GFTpsC制備的DNA探針對(duì)文庫進(jìn)行篩選。該方法生產(chǎn)出三種不同倍半萜烯合成酶cDNA。其中兩種此前已有克隆一種克隆名為GF2-30-1，是GFTpsC cDNA的5’-末端300-bp截短形式；第二種名為9-13-6，是GFtpsA的部分克隆，與其他倍半萜烯合成酶相比5’-末端截短了大約168-bp。與上述通過RT-PCR得到的部分GFTpsA克隆相比，9-13-6克隆提供了618-bp 5’-末端附加序列的信息。在其3’-末端，9-13-6克隆也是不完整的。大約丟失了680個(gè)核苷酸，取而代之的是一功能未知的600-bp片段。篩選獲得的第三種編碼cDNA的倍半萜烯合成酶，GF2-5-11，其編碼出一種新的名為GFTpsD的倍半萜烯合成酶。該克隆5’-末端截短，但是用表1中的引物通過5′-RACE回收到了所丟失的414-bp。然后，從MarathonTMcDNA文庫擴(kuò)增出全長(zhǎng)GFTpsD，并將其克隆入上述細(xì)菌表達(dá)載體。幾種全長(zhǎng)GFTpsDcDNA的DNA序列分析發(fā)現(xiàn)有兩種倍半萜烯合成酶密切相關(guān)，只有極小的序列差異，將其命名為GFTpsD1和GFTpsD2(圖6)。這兩種變體的推導(dǎo)氨基酸序列彼此間相差4個(gè)堿基。
就EST測(cè)序方法而言，對(duì)576個(gè)克隆進(jìn)行了測(cè)序。其中只有3個(gè)克隆編碼推定萜烯合成酶-樣蛋白，更確切地說，是兩種不同的倍半萜烯合成酶-樣蛋白和一種單萜合成酶-樣蛋白。兩個(gè)倍半萜烯合成酶-樣克隆中的一個(gè)(克隆GF002-G3)此前被鑒定為克隆GFTpsD1。第二個(gè)克隆(克隆GF006-G7)是一種截短的cDNA，其編碼一種新的名為GFTpsE的倍半萜烯合成酶。該克隆在5’-末端也是截短的(大約800bp)，但是該丟失的片段可以按照下述兩個(gè)步驟通過5′-RACE擴(kuò)增得到。第一個(gè)5′-RACE使用引物GFTpsERR1和GFTpsERR2(參見表1)提供了500個(gè)附加的5’-末端核苷酸，第二個(gè)5′RACE使用引物GFTpsERR3和GFTpsERR4(參見表1)提供了丟失的5’-末端DNA序列，重構(gòu)得到了全長(zhǎng)GFTpsE cDNA(圖6)。
實(shí)施例4質(zhì)粒構(gòu)建和酶表達(dá)表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建將cDNA亞克隆入pET11a表達(dá)質(zhì)粒(Novagen)，進(jìn)行倍半萜烯合成酶的功能表達(dá)。就GFTpsB，GFtpsD和GFTpsE而言，通過PCR擴(kuò)增全長(zhǎng)cDNA，以向5’-末端導(dǎo)入其中含有起始密碼子的Nde1位點(diǎn)，在3’-末端緊接終止密碼子之后導(dǎo)入BamH1位點(diǎn)。就GFTpsB而言，使用正向引物GFTpsBNde1(SEQ ID NO57)5′-GCATGTTCCATATGTCCGCTCAAGTTCTAGCAACGGTTTCC-3′(Nde1位點(diǎn)用斜體表示，起始密碼子用下劃線標(biāo)出)和反向引物GFTpsBBam(SEQ ID NO58)5′-CGCGGATCCTCAGATGGTAACAGGGTCTCTGAGCACTGC-3′(BamH1位點(diǎn)用斜體表示，起始密碼子用下劃線標(biāo)出)。同樣，正向引物GFTpsDNde1(SEQ ID NO59)5′-GCATGTTCCATATGTCGTCTGGAGAAACATTTCGTCC-3′和反向引物GFTpsDBam(SEQ ID NO60)5′-CGCGGATCCTCAAAATGGAACGTGGTCTCCTAG-3′用于GFTpsD；以及正向引物GFTpsENde1(SEQ ID NO61)5′-GCATGTTCCATATGTCTTTGGAAGTTTCAGCCTCTCCTG-3′和反向引物GFTpsEBam(SEQ ID NO62)5′-CGCGGATCCTCATATCGGCACAGGATTAATAAACAAAGAAGC-3′用于GFTpsE。
擴(kuò)增反應(yīng)是使用Pfu DNA聚合酶(Promega)在含下列物質(zhì)的50μl終體積中進(jìn)行的5μl Pfu DNA聚合酶10×緩沖液、每一種dNTP各200μM、正向和反向引物各0.4μM、2.9單位Pfu DNA聚合酶以及5μl經(jīng)100倍稀釋的cDNA(按照上述方法用MarathonTMcDNA擴(kuò)增試劑盒(Clontech)制備)。熱循環(huán)條件為95℃、2分鐘；95℃、30秒，55℃、30秒，72℃、4分鐘，共25個(gè)循環(huán)；然后72℃、10分鐘。PCR產(chǎn)物在瓊脂糖凝膠上純化，用QIAquick凝膠提取試劑盒(Qiagen)洗脫，接著用Nde1和BamH1消化，然后將其連接入經(jīng)同樣消化后的pET11a質(zhì)粒。
就GFTpsC-pET11a表達(dá)載體的構(gòu)建而言，分別進(jìn)行兩次PCR擴(kuò)增，使插入片段與Nde1和BamHI粘性末端側(cè)接。第一次PCR在同上所述條件下進(jìn)行，使用正向引物GFTpsCpETF1(SEQ ID NO63)5′-TAATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCCTC-3′和反向引物GFTpsCpETR1(SEQ ID NO64)5′-AAAAGGGAACAGGCTTCTCAAGCAATG-3′，第二次PCR使用正向引物GFTpsCpETF2(與GFTpsCpETF1相比5’-末端少了AT)(SEQ ID NO65)5′-ATGGCACTTCAAGATTCAGAAGTTCCTC-3′和反向引物GFTpsCpETR2(與GFTpsCpETR1相比5’-末端多出了GATC)(SEQ ID NO66)5′-GATCAAAAGGGAACAGGCTTCTCAAGCAATG-3′。將兩次PCR產(chǎn)物用上述方法純化后合并，通過下述操作變性煮沸5分鐘然后冰上冷卻5分鐘。將得到的cDNA直接連接入pET11a質(zhì)粒。
起初將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化入JM109大腸桿菌細(xì)胞，通過限制性酶切消化和DNA測(cè)序驗(yàn)證構(gòu)建體。
倍半萜烯合成酶表達(dá)就蛋白表達(dá)而言，將含倍半萜烯合成酶cDNA的pET11a質(zhì)粒和pET11a空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入BL21(DE3)大腸桿菌細(xì)胞(Novagen)。將得到的單菌落接種5ml LB培養(yǎng)基。37℃孵育5-6小時(shí)后，將培養(yǎng)物轉(zhuǎn)移到20℃孵箱，放置1小時(shí)平衡。加入0.5mM IPTG誘導(dǎo)蛋白質(zhì)的表達(dá)，然后將培養(yǎng)物在20℃孵育過夜。
第二天，離心收集細(xì)胞，重懸于0.5ml提取緩沖液(50mMMOPSO pH7，5mM EDTA，5mM EDTA，10％甘油)，然后超聲處理3次，每次30秒。18,000g離心30分鐘沉淀細(xì)胞碎片，回收含可溶蛋白的上清液。通過下述操作對(duì)倍半萜烯合成酶的表達(dá)進(jìn)行評(píng)估將蛋白提取物用SDS-PAGE(SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳)分離，然后用考馬氏亮藍(lán)染色，然后與用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化細(xì)胞得到的蛋白提取物進(jìn)行比較。
所有構(gòu)建體都觀察到了一具有預(yù)期計(jì)算分子量的明顯條帶，但是用空質(zhì)粒轉(zhuǎn)化的大腸桿菌得到的可溶性蛋白中沒有出現(xiàn)該條帶。
實(shí)施例4酶功能測(cè)定酶促試驗(yàn)在密封的玻璃試管中進(jìn)行，使用終體積中含50-100μl蛋白提取物的提取緩沖液，該提取緩沖液補(bǔ)加了15mM MgCl2和100-250μM FPP(Sigma)。培養(yǎng)基上層用1ml戊烷覆蓋，試管置于30℃孵育過夜?；厥蘸斜栋胼葡┑奈焱橄?，用第二體積的戊烷提取培養(yǎng)基。將合并后的戊烷級(jí)分在氮中濃縮，用Hewlett-Packard6890Series GC系統(tǒng)的氣相色譜分析，使用內(nèi)徑0.25mm長(zhǎng)30m的SPB-1(Supelco)毛細(xì)管層析柱。載氣為恒定流速1.6ml/min的He氣。注射按2∶1的比例分開進(jìn)行，注射器溫度設(shè)定為200℃，烤箱(oven)程序設(shè)定為從80℃(保持0分鐘)開始以7.5℃/分鐘的速率升至200℃(保持0分鐘)，接著以20℃/分鐘的速率升至280℃(保持2分鐘)。檢測(cè)使用火焰離子化檢測(cè)器。在權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)能夠獲得的情況下，化合物識(shí)別是根據(jù)與權(quán)威標(biāo)準(zhǔn)具有相同保留時(shí)間進(jìn)行的。為了證實(shí)產(chǎn)物身份(identities)，使用Hewlett-Packard6890GC-四極質(zhì)譜檢測(cè)器，用安裝有內(nèi)徑0.25mm長(zhǎng)30m的SPB-1(Supelco)毛細(xì)層析柱的組合毛細(xì)(combined capillary)GC-MS對(duì)樣本進(jìn)行分析。烤箱程序設(shè)定為從80℃(保持0分鐘)以7.5℃速率升至200℃，He氣流的恒定流速為1.5ml/min。用2200V電壓的電子倍增器記錄70eV時(shí)的光譜。
用該試驗(yàn)測(cè)定不同重組酶的酶活性，使用可溶性蛋白級(jí)分，以法呢基-二磷酸酯作為底物。從所測(cè)的所有克隆獲得倍半萜烯合成酶活性，生成的產(chǎn)物用保留時(shí)間以及氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)(GC-MS)(圖7)來定性。GFTpsB cDNA編碼出的倍半萜烯合成酶，產(chǎn)生主產(chǎn)物二環(huán)-吉馬烯(圖3)和至少15種次要的倍半萜烯鏈烯烴或氧化的倍半萜烯例如δ-杜松烯(圖3)(由二環(huán)-吉馬烯熱重排得到的二環(huán)-欖香烯(圖3)，也出現(xiàn)在了GC圖中)。GFTpsC cDNA編碼出一種生成多產(chǎn)物的倍半萜烯合成酶，主產(chǎn)物鑒定為蓽澄茄醇(圖3)。該酶還生產(chǎn)出了占相當(dāng)大比例的3種其他倍半萜烯-(-)-α-蓽澄茄油烯和2種氧化后的倍半萜烯，以及少量的至少11種倍半萜烯鏈烯烴或氧化后的倍半萜烯。GFtpsD編碼出的倍半萜烯合成酶，可以生產(chǎn)出主產(chǎn)物朱欒倍半萜。10個(gè)其他的小峰也被鑒定為倍半萜烯鏈烯烴或醇。其中，β-欖香烯是吉馬烯A的熱降解產(chǎn)物。GFTpsE編碼出的倍半萜烯合成酶，生產(chǎn)出的是倍半萜烯化合物與δ-杜松烯(圖3)的復(fù)合混合物，其中δ-杜松烯以微弱優(yōu)勢(shì)成為含量最豐富的組分。另外，從GFTpsE生成的產(chǎn)物中還鑒定出了蓽澄茄醇和吉馬烯D(圖3)。
上述試驗(yàn)中，分離的倍半萜烯合成酶表現(xiàn)出生成多產(chǎn)物的特性。例如，蓽澄茄醇合成酶和δ-杜松烯可以生成占相對(duì)較大比例的3或5種產(chǎn)物。二環(huán)吉馬烯合成酶產(chǎn)生了主產(chǎn)物倍半萜烯和幾種微量的次產(chǎn)物。
權(quán)利要求
1.一種分離的核酸，其選自(a)含有基本上如SEQ ID NO6或SEQ ID NO7所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQID NO1或SEQ ID NO2所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶。
2.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸含有基本上如SEQ ID NO6或SEQ ID NO7所示核苷酸序列的核酸。
3.權(quán)利要求2所述的分離的核酸，其中所述核苷酸序列與SEQID NO6或SEQ ID NO7之間具有至少85％的同一性。
4.權(quán)利要求3所述的分離的核酸，其中所述核苷酸序列與SEQID NO6或SEQ ID NO7之間具有至少90％的同一性。
5.權(quán)利要求4所述的分離的核酸，其中所述核苷酸序列與SEQID NO6或SEQ ID NO7之間具有至少95％的同一性。
6.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸含有SEQ IDNO6的核苷酸序列。
7.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸含有SEQ IDNO7的核苷酸序列。
8.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸編碼基本上如SEQ ID NO1或SEQ ID NO2所示的多肽。
9.權(quán)利要求8所述的分離的核酸，其中所述多肽與SEQ ID NO1或SEQ ID NO2之間具有至少85％的同一性。
10.權(quán)利要求9所述的分離的核酸，其中所述多肽與SEQ IDNO1或SEQ ID NO2之間具有至少90％的同一性。
11.權(quán)利要求10所述的分離的核酸，其中所述多肽與SEQ IDNO1或SEQ ID NO2之間具有至少95％的同一性。
12.權(quán)利要求11所述的分離的核酸，其中所述核酸編碼SEQ IDNO1或SEQ ID NO2的多肽。
13.一種由權(quán)利要求1所述核酸編碼的多肽。
14.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸能夠在中度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交。
15.權(quán)利要求14所述的分離的核酸，其中所述核酸能夠在高度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交。
16.權(quán)利要求1所述的分離的核酸，其中所述核酸分離自柑桔類植物。
17.權(quán)利要求16所述的分離的核酸，其中所述柑桔類植物是柚子或橙子。
18.一種載體，含有權(quán)利要求1所述的核酸。
19.權(quán)利要求18所述的載體，其中所述載體是病毒載體或質(zhì)粒。
20.一種宿主細(xì)胞，含有權(quán)利要求1所述的核酸。
21.一種經(jīng)修飾以含有權(quán)利要求1所述核酸的非人生物體。
22.權(quán)利要求21所述的非人生物體，其中所述非人生物體是采用電穿孔或粒子介導(dǎo)基因轉(zhuǎn)移修飾的。
23.權(quán)利要求21所述的非人生物體，其中所述生物體是植物或微生物。
24.一種制備重組宿主細(xì)胞的方法，該方法包括將權(quán)利要求18所述載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。
25.一種制備多肽的方法，該方法包括將權(quán)利要求20所述宿主細(xì)胞培養(yǎng)于能夠產(chǎn)生所述多肽的條件下。
26.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自菌體細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。
27.權(quán)利要求25所述的方法，其中所述宿主細(xì)胞選自大腸桿菌細(xì)胞和微生物細(xì)胞。
28.一種分離的多肽，含有基本如SEQ ID NO1或SEQ IDNO2所示的氨基酸序列。
29.權(quán)利要求28所述的多肽，其中所述的氨基酸序列與SEQ IDNO1或SEQ ID NO2之間具有至少85％的同一性。
30.權(quán)利要求29所述的多肽，其中所述的氨基酸序列與SEQ IDNO1或SEQ ID NO2之間具有至少90％的同一性。
31.權(quán)利要求30所述的多肽，其中所述的氨基酸序列與SEQ IDNO1或SEQ ID NO2之間具有至少95％的同一性。
32.一種制備至少一種倍半萜烯合成酶的方法，該方法包括將經(jīng)修飾以含有至少一種核酸序列的宿主在能夠產(chǎn)生所述至少一種倍半萜烯合成酶的條件下培養(yǎng)，其中所述的至少一種核酸選自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶。
33.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述核酸含有基本上如SEQID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQID NO10所示的核苷酸序列。
34.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述核酸含有SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10的核苷酸序列。
35.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述核酸編碼基本上如SEQID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQID NO5所示的多肽。
36.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述核酸編碼SEQ ID NO1、SEQ ID NO2、SEQ ID NO3、SEQ ID NO4或SEQ ID NO5的多肽。
37.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的宿主是植物或微生物。
38.權(quán)利要求32所述的方法，其中所述的宿主選自菌體細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。
39.一種制備至少一種萜類化合物的方法，該方法包括A)讓至少一種脂肪族焦磷酸酯萜烯前體與由核酸編碼的至少一種多肽接觸，該核酸選自(a)含有基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ IDNO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示核苷酸序列的核酸；(b)編碼基本上如SEQ ID NO6、SEQ ID NO7、SEQ IDNO8、SEQ ID NO9或SEQ ID NO10所示多肽的核酸；以及(c)能夠在低度嚴(yán)謹(jǐn)條件下與(a)或(b)中核酸雜交的核酸，其中由所述核酸編碼的多肽是倍半萜烯合成酶；B)分離A)中制得的至少一種萜類化合物。
40.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述至少一種萜類化合物選自倍半萜烯。
41.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述至少一種脂肪族焦磷酸酯萜烯前體是法呢基焦磷酸酯。
42.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述至少一種倍半萜烯選自二環(huán)吉馬烯、蓽澄茄醇、朱欒倍半萜、α-蓽澄茄油烯、吉馬烯D和δ-杜松烯。
43.權(quán)利要求41所述的方法，其中所述至少一種倍半萜烯選自二環(huán)吉馬烯、蓽澄茄醇、朱欒倍半萜和δ-杜松烯。
44.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述核酸含有基本上如SEQID NO6、SEQ ID NO7、SEQ ID NO8、SEQ ID NO9或SEQID NO10所示的核苷酸序列。
45.權(quán)利要求39所述的方法，其中接觸時(shí)的pH值為7。
46.權(quán)利要求39所述的方法，其中接觸時(shí)的pH值小于7。
47.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述至少一種萜類化合物是通過選自提取和蒸餾的至少一種方法分離的。
48.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述至少一種多肽是通過培養(yǎng)含有所述核酸的宿主細(xì)胞制備的，其中所述宿主細(xì)胞選自菌體細(xì)胞、酵母細(xì)胞、植物細(xì)胞和動(dòng)物細(xì)胞。
49.權(quán)利要求39所述的方法，其中所述至少一種多肽是通過培養(yǎng)含有所述核酸的宿主細(xì)胞制備的，其中所述宿主細(xì)胞選自大腸桿菌細(xì)胞和微生物細(xì)胞。
全文摘要
本發(fā)明涉及倍半萜烯合成酶及其制備和使用方法。一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供了含有文中所述核苷酸序列的核酸，該核苷酸序列編碼至少一種倍半萜烯合成酶。另一實(shí)施方案中，本發(fā)明還提供了倍半萜烯合成酶及其制備和使用方法。例如，本發(fā)明的倍半萜烯合成酶可用于將法呢基焦磷酸酯轉(zhuǎn)化為各種氧化的和脂肪族倍半萜烯，包括朱欒倍半萜、二環(huán)－吉馬烯、蓽澄茄醇和δ－杜松烯。
文檔編號(hào)C12N9/00GK1703507SQ200380100941
公開日2005年11月30日 申請(qǐng)日期2003年10月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月4日
發(fā)明者米歇爾·沙爾克, 安東尼·克拉克 申請(qǐng)人:弗門尼舍有限公司