專利名稱：多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的組合物及其使用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的組合物及其使用，特別是涉及使多能干細(xì)胞在不存在喂養(yǎng)細(xì)胞或血清的培養(yǎng)基中的培養(yǎng)成為可能的組合物和含有該組合物的培養(yǎng)基、以及它們的使用。
背景技術(shù)：
多能干細(xì)胞是具有向?qū)儆谕馀邔?、中胚層、?nèi)胚層的至少每一種的分化細(xì)胞分化的能力且可以自我復(fù)制的干細(xì)胞，包括胚胎干細(xì)胞(embryonicstem cellES細(xì)胞)、胚胎生殖細(xì)胞(embryonic germ cellEG細(xì)胞)、胚胎癌細(xì)胞(embryonic carcinoma cellEC細(xì)胞)、多能成熟祖細(xì)胞(multipotent adult progenitor cellsMAP細(xì)胞)、成熟多能干細(xì)胞(adultmultipotent stem cellsAPS細(xì)胞)等。以下，以它們當(dāng)中的ES細(xì)胞為例，詳細(xì)說明本發(fā)明。
ES細(xì)胞是來源于在初期胚胎中存在的多能干細(xì)胞團(tuán)的細(xì)胞株，具有向包括生殖細(xì)胞在內(nèi)的多種細(xì)胞分化的能力，在特定的培養(yǎng)條件下維持其多能性，而且可以使其增殖。如果將在這種條件下培養(yǎng)的ES細(xì)胞注入胚泡或桑椹胚中，會產(chǎn)生嵌合體(chimera)動物(具有2種不同基因組的動物)。通過使具有來源于已進(jìn)行基因操作的ES細(xì)胞的生殖細(xì)胞的嵌合體動物交配，可以產(chǎn)生具有被操作的基因的動物個體。因此，ES細(xì)胞被廣泛應(yīng)用在包括基因敲除小鼠(特定基因的功能被改變的小鼠)在內(nèi)的轉(zhuǎn)基因動物的生成。另外，在培養(yǎng)皿內(nèi)分化誘導(dǎo)ES細(xì)胞而得到特定的分化細(xì)胞的技術(shù)也正被開發(fā)。通過把該技術(shù)應(yīng)用于人ES細(xì)胞，可以得到細(xì)胞移植治療所必需的分化細(xì)胞，所以也期待著將來在醫(yī)療領(lǐng)域的ES細(xì)胞的利用。
如上所述，在不使ES細(xì)胞分化且保持其多能性(分化能)的狀態(tài)下，增殖或建立的培養(yǎng)技術(shù)已經(jīng)被開發(fā)。即，向培養(yǎng)ES細(xì)胞的培養(yǎng)基中通常加入血清(如胎牛血清(fetal calf serumFCS)、馬血清、山羊血清)。血清抑制ES細(xì)胞的分化，并提供促進(jìn)增殖或建立的各種液體性因子，但這些因子到目前為止還沒有被確認(rèn)。另外，由于血清在批號之間的變動大，所以有必要通過需要大量勞力的預(yù)備篩選來進(jìn)行適當(dāng)?shù)姆诌x。
另外，作為另一種培養(yǎng)技術(shù)，ES細(xì)胞使用失活且使其增殖停止的胎兒性原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞或STO細(xì)胞等作為喂養(yǎng)細(xì)胞，并被培植在喂養(yǎng)細(xì)胞上而被培養(yǎng)。此時，考慮到喂養(yǎng)細(xì)胞不僅提供用于使ES細(xì)胞粘附的基質(zhì)，而且抑制ES細(xì)胞的分化、還釋放促進(jìn)增殖的各種液體性因子。作為這種液體性因子之一，已知有白血病抑制因子(leukemia inhibitory factorLIF)(美國專利第5187077號)，由于它具有對來源于各種動物的ES細(xì)胞的分化抑制能力，所以在多數(shù)情況下配合使用血清、喂養(yǎng)細(xì)胞、LIF。另外，通過向含血清培養(yǎng)基中加入大量的重組LIF蛋白質(zhì)，在涂有明膠的培養(yǎng)板上培養(yǎng)喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性ES細(xì)胞也成為可能(美國專利第5166065號)。
在要把來源于人ES細(xì)胞的分化細(xì)胞應(yīng)用于細(xì)胞移植治療時，如同上述的血清或喂養(yǎng)細(xì)胞的使用會產(chǎn)生大問題。即，人ES細(xì)胞的培養(yǎng)通常使用含有胎牛血清的培養(yǎng)基，將失活的小鼠胎兒性原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞作為喂養(yǎng)細(xì)胞兒進(jìn)行，但這些異種動物來源的生物體成份經(jīng)常會成為未知病原體的感染源。另外，在美國食品醫(yī)藥局的草案中，與異種細(xì)胞共培養(yǎng)的人細(xì)胞的移植被認(rèn)為是異種移植(xenotransplantation)，成為被移植者的生活限制。
因而，在對ES細(xì)胞這樣的多能干細(xì)胞的細(xì)胞生物學(xué)特性的分析和其醫(yī)學(xué)應(yīng)用中，對于其分離、培養(yǎng)，明確希望使用不含異種動物來源的感染源或異種細(xì)胞的培養(yǎng)基，即不含喂養(yǎng)細(xì)胞和血清的且人工可以調(diào)制的成份明確的培養(yǎng)基而進(jìn)行。
進(jìn)行了響應(yīng)這種要求的各種研究并提出了解決方案。作為其中的代表例子，有通過向含血清的培養(yǎng)基中加入大量的重組LIF蛋白質(zhì)而在涂有明膠的培養(yǎng)板上培養(yǎng)喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性的ES細(xì)胞的方法(美國專利第5166065號)。另外，提出了含有特定的替代物來代替血清的胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)用培養(yǎng)基(特開2001-508302號公報)，在喂養(yǎng)細(xì)胞存在的條件下，使通過不含血清的培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)成為可能。但是，即使向培養(yǎng)基提供大量的重組LIF蛋白質(zhì)，使用含有特定的替代物來代替血清的且成份明確的培養(yǎng)基，在涂有明膠的培養(yǎng)板上培養(yǎng)喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性的ES細(xì)胞是不可能的。即，在過去的技術(shù)中，如果使用血清替代物代替血清培養(yǎng)，即使是喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性多能干細(xì)胞，在涂有明膠的培養(yǎng)板上且在低密度接種條件下使其增殖或建立是不可能的。
另外，為了進(jìn)行ES細(xì)胞的建立或遺傳操作，甚至在低密度接種條件下也有必要使ES細(xì)胞增殖，但在上述條件下不滿足該要求。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的技術(shù)上的目的是使這種過去為不可能的，通過在不使用喂養(yǎng)細(xì)胞和血清且可以人工調(diào)制的成份明確的培養(yǎng)基培養(yǎng)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)成為可能。
本發(fā)明人等為了解決上述課題而進(jìn)行了各種研究，結(jié)果發(fā)現(xiàn)當(dāng)在維持未分化狀態(tài)的同時使多能干細(xì)胞增殖或建立時，在抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件下進(jìn)行該培養(yǎng)，由此能夠解決上述課題，并根據(jù)該想法完成了本發(fā)明。
產(chǎn)生“抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件”的最典型的具體例子，是將腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)加入或配合到多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基中。由此，在該培養(yǎng)基中即使不存在喂養(yǎng)細(xì)胞或血清，也不使多能干細(xì)胞分化、在保持其分化能的情況下使增殖或建立成為可能。
因而，本發(fā)明的主要目的是提供至少含有1種腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)的多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的組合物。另一個目的是提供含有這種組合物的多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基。還有一個目的是提供使用這樣的培養(yǎng)基的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法。還有一個目的是提供在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)的、被增殖或建立的未分化多能干細(xì)胞。對于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，會從以下記載的本發(fā)明的詳細(xì)說明中理解這些及其它目的。
本發(fā)明的一個方案提供至少含有1種腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)的多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的組合物。本發(fā)明的組合物是根據(jù)情況的培養(yǎng)基補(bǔ)充物。本發(fā)明的組合物是用于在維持多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的同時使多能干細(xì)胞增殖的組合物。優(yōu)選該腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)選擇自SQ22536(9-(四氫-2-呋喃基)-腺嘌呤)、2’，5’-二脫氧腺苷、9-環(huán)戊基腺嘌呤、2’，5’-二脫氧腺苷3’-二磷酸、2’，5’-二脫氧腺苷3’-一磷酸和MDL-12330A(順-N-(2-苯基環(huán)戊基)氮雜環(huán)十三碳-1-烯-2-胺)組成的組，或從促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、腦鈉利尿肽(BNP)和下垂體細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶活化肽(PACAP)以及實質(zhì)上具有與其相同的生理活性的肽中選擇。
本發(fā)明的其他方案提供含有上述任意組合物的多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基。優(yōu)選該培養(yǎng)基不含有喂養(yǎng)細(xì)胞和/或血清。進(jìn)一步優(yōu)選該培養(yǎng)基不含有喂養(yǎng)細(xì)胞和血清。這些培養(yǎng)基可以是細(xì)胞培養(yǎng)用的最低限量培養(yǎng)基，另外，還可以含有分化抑制因子、血清替代物和抗氧化劑。
本發(fā)明的另一個方案是提供一種方法，是用于在維持多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的同時使多能干細(xì)胞增殖或建立的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，在抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件下進(jìn)行該培養(yǎng)。優(yōu)選抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件為伴隨使用腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)的條件。另外，本培養(yǎng)方法可以在上述培養(yǎng)基中進(jìn)行。
在本發(fā)明的培養(yǎng)方法中，多能干細(xì)胞優(yōu)選為ES細(xì)胞。另外，多能干細(xì)胞可以來源于哺乳動物。進(jìn)而，多能干細(xì)胞可以來源于人。
另外，提供用上述方法增殖或建立的并保持多能性的未分化多能干細(xì)胞。
在本發(fā)明的另外一個方案提供一種未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞克隆團(tuán)的調(diào)制方法，其特征在于，在抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件下培養(yǎng)未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞。另外，還提供一種未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞克隆團(tuán)的調(diào)制方法，其特征在于，從生物體中分離未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞，在抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件下培養(yǎng)未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞。抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件優(yōu)選是伴隨使用腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)的條件。另外，用本調(diào)制方法的培養(yǎng)可以在上述培養(yǎng)基中進(jìn)行。
優(yōu)選本調(diào)制方法的特征在于，培養(yǎng)1個多能干細(xì)胞而得到其克細(xì)胞隆團(tuán)?；蛘撸菊{(diào)制方法的特征在于，將在與通過鄰近的多能干細(xì)胞之間的相互作用來誘導(dǎo)該多能干細(xì)胞的未分化增殖相比更低密度的接種條件中的多能干細(xì)胞，用上述培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)而得到其克隆團(tuán)；或?qū)⒃诓淮嬖谖桂B(yǎng)細(xì)胞和/或血清且不存在上述組合物的條件下不發(fā)生未分化增殖的多能干細(xì)胞，用上述培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)而得到其克隆團(tuán)。特別優(yōu)選的特征在于，用上述培養(yǎng)基對1個多能干細(xì)胞進(jìn)行培養(yǎng)而得到其克隆團(tuán)。
在上述調(diào)制方法中，多能干細(xì)胞優(yōu)選為ES細(xì)胞。另外，多能干細(xì)胞可以是哺乳動物來源的。進(jìn)而，多能干細(xì)胞可以是人來源的。
另外，本發(fā)明提供用上述調(diào)制方法得到的未分化多能干細(xì)胞克隆團(tuán)。
本發(fā)明的另一個方案是用于在維持多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的同時進(jìn)行培養(yǎng)并使多能干細(xì)胞增殖或建立的腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)或含有腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)的組合物的使用。
通過本發(fā)明，在不使用血清和喂養(yǎng)細(xì)胞且成份明確的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，可以使保持多分化能的未分化多能干細(xì)胞增殖或建立。其結(jié)果，已增殖或建立的多能干細(xì)胞不會被來源于血清和喂養(yǎng)細(xì)胞的病原體所污染，而且，可以避免基于與異種細(xì)胞的共培養(yǎng)的特別的限制。


圖1是表示在通過特定肽的補(bǔ)充且不存在血清和喂養(yǎng)細(xì)胞情況下的未分化ES細(xì)胞的增殖的圖(照片)。
具體實施例方式
在本說明書中，“多能性”是指能夠向?qū)儆谕馀邔?、中胚層、?nèi)胚層的任意分化細(xì)胞分化的能力和向分別屬于外胚層、中胚層、內(nèi)胚層的至少1種分化細(xì)胞分化的能力，向生殖細(xì)胞的分化能力也被包括在該定義中。
“多能干細(xì)胞”是指具有能夠向?qū)儆谕馀邔?、中胚層、?nèi)胚層的任意分化細(xì)胞分化的能力以及向?qū)儆谕馀邔?、中胚層、?nèi)胚層的至少各1種的分化細(xì)胞分化的能力(多分化能力)的可以自我復(fù)制的干細(xì)胞，包括ES細(xì)胞、EG細(xì)胞、EC細(xì)胞、MAP細(xì)胞、APS細(xì)胞等。作為其代表例子的“胚胎干細(xì)胞(ES細(xì)胞)”具有多分化能力，如果被注入其它胚泡中，能夠分化成也包括生殖細(xì)胞的各種細(xì)胞。
“喂養(yǎng)細(xì)胞”是指其自身不能增殖但具有代謝活性，通過產(chǎn)生各種代謝物質(zhì)，有助于培植于其中的其它細(xì)胞的增殖的細(xì)胞(參照村松正實等《分子細(xì)胞生物學(xué)辭典》367頁(1997)年)(株)東京化學(xué)同人發(fā)行)。例如，在是ES細(xì)胞的情況下，使用失活并使增殖停止的胎兒性原代培養(yǎng)成纖維細(xì)胞或STO細(xì)胞作為喂養(yǎng)細(xì)胞。
“喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性多能干細(xì)胞”是指在血清的存在下、在不含喂養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下可以增殖的多能干細(xì)胞。本來在這樣的培養(yǎng)條件下，未分化增殖培養(yǎng)多能干細(xì)胞是困難的，但通過繼續(xù)傳代培養(yǎng)，會獲得喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性。
由本發(fā)明提供的多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的組合物，其特征在于，含有至少一種腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)。腺苷酸環(huán)化酶是使ATP生成cAMP(環(huán)化AMP)的酶，是細(xì)胞的信號傳遞中的中心酶。該酶活性主要借助G蛋白質(zhì)偶聯(lián)型受體而由各種細(xì)胞外信號調(diào)節(jié)，產(chǎn)生的cAMP發(fā)揮作為細(xì)胞內(nèi)第2信使的作用。在哺乳動物中，到目前為止，在人、小鼠、大鼠、牛、狗、兔子等中已有報道的有共計10種腺苷酸環(huán)化酶的存在(例如，Patel，TB et al.，Molecular biological approaches to unravel adenylyl cyClasesignaling and function，Gene，269，13-25，2001)。關(guān)于人體中的9種、小鼠中的5種的基因已被分離出來，由從小鼠分離出的基因也都被排列整齊地保存在人基因中的事實，和這些分子在細(xì)胞增殖控制等基本生命現(xiàn)象中是不可缺少的事實，可以認(rèn)為多能干細(xì)胞中的腺苷酸環(huán)化酶的功能也是在這些動物種類中共有的。
作為本發(fā)明的多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的組合物而使用的腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)，既可以是在細(xì)胞內(nèi)和細(xì)胞外信號傳遞通路的任意階段發(fā)揮作用的物質(zhì)，也可以是從結(jié)果上抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性的物質(zhì)。因而，例如，能夠使用將導(dǎo)致腺苷酸環(huán)化酶的活性抑制的細(xì)胞外信號提供給受體的物質(zhì)、或直接妨礙腺苷酸環(huán)化酶的物質(zhì)，也能夠使用具有作用于對受體與腺苷酸環(huán)化酶之間的信號傳遞進(jìn)行介導(dǎo)的分子的物質(zhì)。
為了檢驗?zāi)撤N物質(zhì)是否抑制多能干細(xì)胞的腺苷酸環(huán)化酶的活性，只要將該物質(zhì)加入需要增殖或建立的細(xì)胞(如ES細(xì)胞)的培養(yǎng)培養(yǎng)基中，觀察cAMP生成的抑制程度即可。
在直接妨礙腺苷酸環(huán)化酶的物質(zhì)的例子中，可以舉出SQ22536(9-(四氫-2-呋喃基)-腺嘌呤)、2’，5’-二脫氧腺苷、9-環(huán)戊基腺嘌呤、2’，5’-二脫氧腺苷3’-二磷酸、2’，5’-二脫氧腺苷3’-一磷酸、MDL-12330A(順-N-(2-苯基環(huán)戊基)氮雜環(huán)十三碳-1-烯-2-胺)等的化合物，這些被CALBIOCHEM-NOVABIOCHEMCORPORATION(California，USA)等在市場上出售，能夠容易地得到。這些物質(zhì)的使用量可根據(jù)其種類而適當(dāng)?shù)卮_定。例如，在使用SQ22536的情況下，對其培養(yǎng)基中的終濃度沒有特別限制，一般以1μM～10mM、優(yōu)選10μM～1mM的終濃度的量使用。
作為在多能干細(xì)胞中抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性的物質(zhì)的其他例子，可以舉出如下所示的肽促腎上腺皮質(zhì)激素(corticotropin，adrenocorticotropichormoneACTH)、腦鈉利尿肽(brain natriuretic peptideBNP)、下垂體細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶活化肽(pituitary adenylate cyClase activatingpolypeptidePACAP)等。
另外，也可使用實質(zhì)上具有與這些肽相同的生理活性的肽，即在組成上述ACTH、BNP、PACAP等肽的氨基酸序列中缺失、取代和/或添加一個或其以上的氨基酸其具有與相應(yīng)全長肽相同的生理活性的肽。例如，已知ACTH是由39個氨基酸組成的肽(ACTH(1-39))，N末端1～24的氨基酸是各動物共通的，25～33的氨基酸根據(jù)物種而不同，而在N末端1～18具有促腎上腺皮質(zhì)作用，但本發(fā)明中除了ACTH(1-39)之外，還可以使用作為其片段的ACTH(1-24)、ACTH(11-24)等。這些肽一般以1nM～100μM、優(yōu)選1～10μM的終濃度的量使用。
上述的ACTH、BNP、PACAP等及其片段自身被記載在任何文獻(xiàn)中(例如，美國專利公報第4415546號；今崛和友等生化學(xué)辭典(第3版)1178～1179頁、721頁和286～287頁(1998)(株)東京化學(xué)同人)，或者作為試劑被出售，或者可以按照文獻(xiàn)記載的方法進(jìn)行制造。例如，這些肽可以用本領(lǐng)域的技術(shù)人員所周知的用于組建所需的氨基酸序列的合成方法生成。另外，也能夠通過如下所示的基因操作來制造這些肽，即將編碼這些肽的基因?qū)氪竽c桿菌等宿主細(xì)胞中，表達(dá)蛋白并將其分離、純化。
本發(fā)明的組合物既可以含有單一的腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)，也可以以任意組合含有多個腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)。因而，可以使用含有多種化合物的組合物、含有多種肽的組合物和含有化合物和肽兩者的組合物等。或者，本發(fā)明的組合物也可以只由單一的腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)構(gòu)成。
根據(jù)本發(fā)明，提供添加了上述組合物的多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)培養(yǎng)基。由于該組合物是源于喂養(yǎng)細(xì)胞或血清的液體性因子的取代物，所以即使在培養(yǎng)培養(yǎng)基中存在喂養(yǎng)細(xì)胞或血清也不會給多能干細(xì)胞的培養(yǎng)帶來影響，但如果存在喂養(yǎng)細(xì)胞或血清，則不能避免由源于它們的病原體造成的污染和作為異種抑制的特別的限制。因而，作為培養(yǎng)培養(yǎng)基優(yōu)選使用不含喂養(yǎng)細(xì)胞和/或血清的培養(yǎng)基，作為培養(yǎng)基更優(yōu)選使用不含喂養(yǎng)細(xì)胞和血清的培養(yǎng)基。
即，本發(fā)明的培養(yǎng)培養(yǎng)基，是優(yōu)選將細(xì)胞培養(yǎng)用最低限量培養(yǎng)基(cellculture minimum mediumCCMM)作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基，使其中含有分化抑制因子、血清替代物、抗氧化劑(例如，2-巰基乙醇(2-ME)、二硫蘇糖醇、抗壞血酸)和上述的本發(fā)明的組合物(即，腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì))的培養(yǎng)基；是不含喂養(yǎng)細(xì)胞或血清的培養(yǎng)基。如同以下說明的，這些CCMM、分化抑制因子、血清替代物、抗氧化劑和上述的本發(fā)明的組合物，由于都是可以人工調(diào)制的已知物質(zhì)，所以由它們構(gòu)成的本發(fā)明的培養(yǎng)培養(yǎng)基能夠避免以生物體成份的使用為起因的未知病原體所引起的污染。
用作基礎(chǔ)培養(yǎng)基用的“細(xì)胞培養(yǎng)用最低限量培養(yǎng)基(CCMM)”，是指在其中含有分化抑制因子、血清替代物、抗氧化劑和本發(fā)明的組合物的情況下，使多能干細(xì)胞的未分化增殖成為可能的任意培養(yǎng)基。
在CCMM中，通常添加標(biāo)準(zhǔn)無機(jī)鹽(鋅、鐵、鎂、鈣、鉀等)、維生素、葡萄糖、緩沖系、必需氨基酸等。作為其具體例子可以舉出Delbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)、最低必需培養(yǎng)基(MEM)，Basal essential Eagle(BME)、RPMI1640、F-10、F-12、α-最低必需培養(yǎng)基(αMEM)、Glasgow’s Minimal essential Eagle(GMEM)、Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium等，也可使用出售的培養(yǎng)基。
最優(yōu)選的CCMM是表1的組成的GMEM。
表1

優(yōu)選向CCMM中加入0.1mM非必需氨基酸和1mM丙酮酸鈉。非必需氨基酸是L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、甘氨酸、L-脯氨酸、L-絲氨酸的混合物，例如，使用市售的非必需氨基酸作為MEM非必需氨基酸溶液10mM液體(non-essential amino acidssolution 10mM liquid)(Invitrogen)。丙酮酸鈉使用例如作為MEM丙酮酸鈉溶液100mM液體(Sodium pyruvate solution 100mM liquid)(Invitrogen)而被出售的物質(zhì)。
分化抑制因子是喂養(yǎng)細(xì)胞和多能干細(xì)胞自身釋放的液體性因子，抑制未分化細(xì)胞的分化。作為代表性分化抑制因子，可以舉出白血病抑制因子(LIF)。分化抑制因子是原本存在于生物體中的物質(zhì)，所以從生物體中的提取也是可能的，但也為了防止病原體的污染，另外也為了節(jié)約，優(yōu)選使用人工合成的分化抑制因子。例如，在LIF這樣的蛋白質(zhì)性的分化抑制因子的情況下，優(yōu)選使用通過基因操作制造的重組分化抑制因子蛋白質(zhì)。
作為抗氧化劑，可以使用2-巰基乙醇、二硫蘇糖醇、抗壞血酸等，通常使用2-巰基乙醇。這些物質(zhì)是市售的，能夠容易得到。
血清替代物是指通過將其加入到無血清培養(yǎng)培養(yǎng)基中而可以喂養(yǎng)多能干細(xì)胞增殖的物質(zhì)。血清替代物既可以是單一物質(zhì)，也可以是混合物，具體地講，是含有從如下所示的物質(zhì)中選擇的1種或其以上的成份的物質(zhì)，即白蛋白(如牛血清白蛋白)或白蛋白替代物(例如，牛下垂體提取物、米水解物、胎牛白蛋白、卵清蛋白、人血清白蛋白、牛胚提取物、AlbuMAXI(注冊商標(biāo)))、氨基酸(例如甘氨酸、L-丙氨酸、L-天冬酰胺、L-半胱氨酸、L-天冬氨酸、L-谷氨酸、L-苯丙氨酸、L-組氨酸、L-異亮氨酸、L-賴氨酸、L-亮氨酸、L-谷氨酰胺、L-精氨酸、L-蛋氨酸、L-脯氨酸、L-羥(基)脯氨酸、L-絲氨酸、L-蘇氨酸、L-色氨酸、L-酪氨酸、L-纈氨酸)、維生素、運鐵蛋白或運鐵蛋白替代物(例如乙二胺四乙酸、乙二醇-雙(β-氨基乙基醚)-N，N，N’，N’-四乙酸、甲磺酸去鐵胺、二巰基丙醇、二亞乙基三胺五乙酸、反-1，2-二胺基環(huán)己烷-N，N，N’，N’-四乙酸這樣的鐵螯合物，檸檬酸鐵螯合物，硫酸亞鐵螯合物等鐵螯合物)、抗氧化劑(例如還原型谷胱甘肽、抗壞血酸-2-磷酸鹽)、胰島素或胰島素替代物(例如氯化鋅、硝酸鋅、溴化鋅、硫酸鋅等含鋅化合物)、膠原前體(例如L-脯氨酸、L-羥(基)脯氨酸、抗壞血酸)和微量元素(例如Ag+、Al3+、Ba2+、Cd2+、Co2+、Cr3+、Ge4+、Se4+、Br-、I-、Mn2+、F-、Si4+、V5+、Mo6+、Ni2+、Rb+、Sn2+、Zr4+)。
其中，血清替代物的一個例子，在特表2001-508302號公報中作為“無血清真核生物體細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基補(bǔ)充物”而被詳述，可以參考該公報的記載而適當(dāng)確定血清替代物的組成。代表性的血清替代物作為胚胎干細(xì)胞血清替代(KSR)而由Invitrogen公司出售，可以容易地得到。
上述LIF、2-ME和KSR在培養(yǎng)培養(yǎng)基中，分別以1～10000單位/ml、1～1000μm和0.5～90％(v/v)的終濃度、優(yōu)選100～1000單位/ml、10～100μm和5～20％(v/v)的終濃度的量使用。本發(fā)明的組合物和這些各加入成份，相對培養(yǎng)基既可以從最開始以成為目標(biāo)終濃度的量進(jìn)行添加，也可以分2次或其以上的次數(shù)進(jìn)行添加而使用最終成為目標(biāo)濃度的量。培養(yǎng)培養(yǎng)基通常用碳酸氫鹽將pH調(diào)節(jié)為7.0～8.2、優(yōu)選為7.3～7.9而被使用。
本發(fā)明的組合物和培養(yǎng)培養(yǎng)基可以被分別調(diào)制成溶液形式或干燥形式。在溶液形式的情況下，可以作為濃縮組合物(例如1×～1000×)提供，在使用時也可以被適當(dāng)稀釋。在稀釋或者溶解溶液形式或干燥形式的組合物或培養(yǎng)培養(yǎng)基中使用的液體的種類，有水、緩沖水溶液、生理鹽水等，可以根據(jù)需要容易地選擇。
優(yōu)選對本發(fā)明的組合物或培養(yǎng)培養(yǎng)基進(jìn)行滅菌以防止污染。滅菌方法有紫外線照射、加熱滅菌、放射線照射和過濾等。
根據(jù)本發(fā)明，在培養(yǎng)多能干細(xì)胞且持續(xù)保持分化能的同時，進(jìn)行未分化增殖，由此可以使用在上述的本發(fā)明的培養(yǎng)培養(yǎng)基、優(yōu)選細(xì)胞培養(yǎng)用最低限量培養(yǎng)基中含有白血病抑制因子、抗氧化劑、血清替代物和本發(fā)明組合物而產(chǎn)生的培養(yǎng)基，在該領(lǐng)域所采用的通常的培養(yǎng)條件下培養(yǎng)多能干細(xì)胞。
多能干細(xì)胞可以使用來源于包括人、猴、小鼠、大鼠、倉鼠、兔、豚鼠、牛、豬、狗、貓、山羊、羊的哺乳類、鳥類、爬行類等多種動物的多能干細(xì)胞，但通常是來源于哺乳動物的多能干細(xì)胞。作為多能干細(xì)胞的具體例子，可以列舉ES細(xì)胞、EG細(xì)胞、EC細(xì)胞、APS細(xì)胞、MAP等。被頻繁使用的典型例子是小鼠的ES細(xì)胞。對培養(yǎng)的多能干細(xì)胞的數(shù)目沒有特別的限制，但本發(fā)明的培養(yǎng)方法，特別在可以培養(yǎng)1個多能干細(xì)胞而使之增殖并形成克隆細(xì)胞團(tuán)成這一點上是有利的。
應(yīng)該培養(yǎng)的多能干細(xì)胞其自身可以是喂養(yǎng)細(xì)胞依賴性的細(xì)胞，但優(yōu)選喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性的細(xì)胞。為了使喂養(yǎng)細(xì)胞依賴性多能干細(xì)胞變?yōu)槲桂B(yǎng)細(xì)胞非依賴性，可以進(jìn)行如下處理。即，在不使用喂養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)條件下，進(jìn)行幾次傳代培養(yǎng)，選擇適合這樣的條件的細(xì)胞。
在本發(fā)明的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法中的具體操作，包括培養(yǎng)條件，能夠按照該技術(shù)領(lǐng)域中常規(guī)操作和條件而進(jìn)行?？梢詤⒖祭缰修y憲夫?qū)嶒炨t(yī)學(xué)分冊后基因組時代的實驗講座4“干細(xì)胞、克隆研究方案”、羊土社(2001年)、Hogan，G.等編小鼠胚的操作A Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY(1994)、Robertson，E.J.編畸胎瘤和胚胎干細(xì)胞、A Practical Approach，IRL Press Oxford，UK(1987)等的記載并適當(dāng)確定。
如果舉出代表性的傳代操作和培養(yǎng)條件，有如下所示。即，為了傳代培養(yǎng)ES細(xì)胞，首先用磷酸緩沖化生理鹽水(phosphate buffered salinePBS)對發(fā)育的ES細(xì)胞集落沖洗1～2次，然后加入足量的胰蛋白酶-EDTA溶液(0.25％胰蛋白酶-1mM EDTA、PBS中)直至覆蓋細(xì)胞層，放置5分鐘。然后，加入含有胰蛋白酶抑制劑的PBS或含有血清的ES細(xì)胞培養(yǎng)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液(CCMM+LIF+2-ME)，通過移液操作分離細(xì)胞團(tuán)。通過普通離心分離從該細(xì)胞懸液沉淀出細(xì)胞。除去上清后，用含有血清或血清替代物的ES細(xì)胞培養(yǎng)用基礎(chǔ)培養(yǎng)液使沉淀的細(xì)胞再次懸浮，將其中的一部分接種到喂養(yǎng)細(xì)胞層或明膠化的塑料培養(yǎng)板內(nèi)，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。
作為本發(fā)明方法的一個實施方式，用0.1％(w/v)明膠溶液處理，在明膠化的塑料培養(yǎng)板內(nèi)放入加熱至37℃的本發(fā)明的培養(yǎng)培養(yǎng)基，向其中每1cm2培養(yǎng)板面積中接種10～1000個多能干細(xì)胞。將培養(yǎng)板放置到CO2孵葙內(nèi)，在37℃、5％CO2的條件下培養(yǎng)。如果集落發(fā)育(例如E14tg2a細(xì)胞是在7日以內(nèi))，換新的培養(yǎng)基，傳代。在傳代時，優(yōu)選使用含有胰蛋白酶抑制劑的PBS。
與通過鄰近的多能干細(xì)胞之間的相互作用來誘導(dǎo)該多能干細(xì)胞的未分化增殖相比，更低密度的接種條件是，具體地講，將1個細(xì)胞/mm2以下的接種條件等作為適當(dāng)?shù)睦颖硎尽．?dāng)建立均勻的多能干細(xì)胞和使進(jìn)行遺傳操作的多能干細(xì)胞增殖時，從1個多能干細(xì)胞得到其克隆細(xì)胞團(tuán)的工序等當(dāng)然適合在該條件下進(jìn)行。
由于在本發(fā)明的優(yōu)選實施方式中不使用喂養(yǎng)細(xì)胞或血清，可以省去在通常的培養(yǎng)方法中進(jìn)行的血清批號篩選、喂養(yǎng)細(xì)胞的選擇和培養(yǎng)。另外，當(dāng)使用通過本發(fā)明的成份明確的培養(yǎng)培養(yǎng)基時，在涂有明膠的培養(yǎng)板上且在低密度接種條件下，可以以未分化狀態(tài)使單一的喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性多能干細(xì)胞增殖。
而且，本發(fā)明還提供通過添加到不含喂養(yǎng)細(xì)胞和血清的細(xì)胞培養(yǎng)培養(yǎng)基中而可以使多能干細(xì)胞未分化增殖的物質(zhì)的篩選方法。即，使用向細(xì)胞培養(yǎng)用最低限量培養(yǎng)基中添加自血病抑制因子、血清替代物、抗氧化劑和候補(bǔ)物質(zhì)而產(chǎn)生的培養(yǎng)培養(yǎng)基，培養(yǎng)喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性的多能干細(xì)胞(例如，小鼠的ES細(xì)胞)，確認(rèn)是否產(chǎn)生該多能干細(xì)胞的未分化集落，通過本發(fā)明選擇顯示顯著陽性的物質(zhì)。
未分化集落的形成可以使用例如含有Leischman染色的蛋白質(zhì)染色來進(jìn)行形態(tài)學(xué)確認(rèn)。另外，也可以用抗體確認(rèn)堿性磷酸梅、SSEA-1，3，4抗原等未分化細(xì)胞標(biāo)記的存在。另外，由于Oct-3/4基因和Rex-1基因的表達(dá)對于未分化細(xì)胞也是特征性的，所以也可以作為確認(rèn)手段被采用。通常，多個組合這些方法來確認(rèn)未分化狀態(tài)。
實施上述篩選法時的標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成和培養(yǎng)條件如下所述。
標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)培養(yǎng)基的組成GMEM、10％KSR、10μM2-ME、1000U/ml LIF、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉接種到培養(yǎng)基中的多能干細(xì)胞的數(shù)目每1cm2培養(yǎng)面積中使用1ml培養(yǎng)液，接種100個。
培養(yǎng)條件37℃、5％CO2確認(rèn)和觀察方法7日后觀察培養(yǎng)基，通過多能干細(xì)胞的未分化集落的數(shù)目(/1cm2)，進(jìn)行如下所述的判斷

通過本發(fā)明的培養(yǎng)方法，可以培養(yǎng)1個多能干細(xì)胞使之增殖并形成克隆細(xì)胞團(tuán)。這在需要已改變基因組的多能干細(xì)胞的團(tuán)的情況下，例如生成轉(zhuǎn)基因動物的情況下是有利的。
作為用于培養(yǎng)是多能干細(xì)胞的代表例子即ES細(xì)胞的培養(yǎng)基，過去使用的是在細(xì)胞培養(yǎng)用最低限量培養(yǎng)基中添加(1)白血病抑制因子、(2)血清、(3)2-巰基乙醇、(4)喂養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基。但是，在含有(1)～(3)的情況下，(4)的存在不是必須的，在涂有明膠的培養(yǎng)板上直接附著喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性ES細(xì)胞而培養(yǎng)也是可能的。另外，在以(4)的存在為前提的情況下，可以用(5)血清替代物代替(2)，不使用血清本身培養(yǎng)ES細(xì)胞成為可能。對于這樣的不使用血清的培養(yǎng)基，本發(fā)明通過進(jìn)一步添加(6)腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)，在不存在(4)喂養(yǎng)細(xì)胞的條件下使培養(yǎng)ES細(xì)胞成為可能。
以上是本發(fā)明對“抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件”，以向培養(yǎng)基添加或配合腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)的情況為例進(jìn)行了說明，但也可以用其它適當(dāng)?shù)姆椒ㄖ圃爝@樣的條件。例如，也可以采用抑制多能干細(xì)胞中的腺苷酸環(huán)化酶基因的表達(dá)的方法(例如使用mRNA和RNAi)和用基因操作使抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的分子表達(dá)的方法(例如使用拮抗型變異體)。
本發(fā)明的另一個方案提供了至少含有1種腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)的多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基補(bǔ)充物。腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)優(yōu)選從SQ22536(9-(四氫-2-呋喃基)-腺嘌呤)、2’，5’-二脫氧腺苷、9-環(huán)戊基腺嘌呤、2’，5’-二脫氧腺苷3’-二磷酸、2’，5’-二脫氧腺苷3’-一磷酸和MDL-12330A(順-N-(2-苯基環(huán)戊基)氮雜環(huán)十三碳-1-烯-2-胺)組成的組中選擇，或從促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、腦鈉利尿肽(BNP)和下垂體細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶活化肽(PACAP)及實質(zhì)上具有與它們相同的生理活性的肽中進(jìn)行選擇。
本發(fā)明的另外一個方案提供了含有上述培養(yǎng)基補(bǔ)充物的多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基優(yōu)選不含有喂養(yǎng)細(xì)胞和/或血清，更優(yōu)選不含有喂養(yǎng)細(xì)胞和血清。該培養(yǎng)基可以將細(xì)胞培養(yǎng)用最低限量培養(yǎng)基作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基。該培養(yǎng)基還可以含有分化抑制因子、血清替代物和抗氧化劑。
本發(fā)明的另一個方案提供一種多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，當(dāng)培養(yǎng)多能干細(xì)胞使未分化多能干細(xì)胞增殖時，在抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件下進(jìn)行該培養(yǎng)。本方法中抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件可以是伴隨使用腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)。另外，該培養(yǎng)可以在上述培養(yǎng)基中進(jìn)行。在本方法中，可以培養(yǎng)1個多能于細(xì)胞得到其克隆細(xì)胞團(tuán)，另外，可以在沒有喂養(yǎng)細(xì)胞和/或血清且沒有上述培養(yǎng)基補(bǔ)充物的條件下，在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)未出現(xiàn)未分化增殖的多能干細(xì)胞并得到其克隆團(tuán)。優(yōu)選通過本方法在上述培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個多能干細(xì)胞而得到其克隆團(tuán)。在本方法中，多能干細(xì)胞可以為ES細(xì)胞，另外，多能干細(xì)胞可以源于哺乳動物。進(jìn)而，多能干細(xì)胞也可以源于人。
本發(fā)明的另外一個方案提供用上述培養(yǎng)方法使之增殖并保持多能性的未分化多能干細(xì)胞。
本發(fā)明的另一個方案一種多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，在培養(yǎng)多能干細(xì)胞建立未分化多能干細(xì)胞時，在抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件下進(jìn)行該培養(yǎng)。本方法中抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件可以是伴隨使用腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)。另外，該培養(yǎng)可以在上述培養(yǎng)基中進(jìn)行。本方法中多能干細(xì)胞可以為ES細(xì)胞，另外，多能干細(xì)胞可以源于哺乳動物。進(jìn)而，多能干細(xì)胞也可以源于人。
本發(fā)明的另外一個方案提供用上述培養(yǎng)方法建立的保持多能性的未分化多能干細(xì)胞。
以下的實施例證明通過不使用這樣的血清和喂養(yǎng)培養(yǎng)基且全部用明確的成份調(diào)制而成的培養(yǎng)基來培養(yǎng)ES細(xì)胞是可能的。本發(fā)明并不限于這些實施例。
實施例1
作為細(xì)胞培養(yǎng)最低限量培養(yǎng)基，使用Glasgow最低必需培養(yǎng)基(Glasgow minimum essential mediumGMEM；Sigma公司)，通過在其中添加了(1)1×103U/ml LIF(ESGRO，Invitrogen公司)、(3)0.1μM2-巰基乙醇(ナカライテスク社)、(5)10％(v/v)KSR(Invitrogen公司)的培養(yǎng)液1ml，在用0.1％(w/v)明膠溶液處理后明膠化的12孔板的1孔內(nèi)，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)100個喂養(yǎng)細(xì)胞非依賴性ES細(xì)胞(E14tg2a(Hooper，M.et al.，Nature，325，292(1987))、CGR8(Mountford，P.et al.，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91，4303(1994)和從這些細(xì)胞衍生的ES細(xì)胞。
培養(yǎng)5天以后，吸出培養(yǎng)液后添加覆蓋板面的量的Leischman染色液(1.5g Leischman染色Sigma公司/L甲醇)，室溫下保持10分鐘，水洗(Leischman染色)。用肉眼或光學(xué)顯微鏡觀察染藍(lán)的集落，結(jié)果完全沒有看到形態(tài)上維持未分化狀態(tài)的集落的形成(圖1(g))。如果在該組成的培養(yǎng)液中進(jìn)一步添加(2)0.3％(v/v)FCS進(jìn)行培養(yǎng)，就會看到平均17個的未分化集落的形成(圖1(d))。從這些結(jié)果考慮到，通過(1)+(3)+(5)的組成，缺乏(2)FCS中含有的未分化集落形成所必需的成份。另外，如果用同樣的培養(yǎng)液組成((1)+(3)+(5))培養(yǎng)每孔1000個以上的ES細(xì)胞，就會看到未分化集落的形成。如果以終濃度10％(v/v)向培養(yǎng)液添加該高密度培養(yǎng)上清(conditioned mediumCM)培養(yǎng)每孔100個ES細(xì)胞，就會看到平均7個的未分化集落的形成(圖1(f))。這表明ES細(xì)胞本身分泌未分化集落形成所必需的成份。
然后，將從各種已知生長因子、細(xì)胞因子、肽激素等選擇的候補(bǔ)肽添加到含(1)+(3)+(5)的培養(yǎng)基中，在37℃、5％CO2條件下培養(yǎng)ES細(xì)胞，觀察其未分化集落形成能力。其結(jié)果，在添加了1μM促腎上腺皮質(zhì)激素、1μM腦鈉利尿肽和1μM下垂體細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶活化肽的培養(yǎng)基中，看到形態(tài)上清楚的ES細(xì)胞的未分化集落的形成(圖1(e)；使用ACTH作為肽)。其中，圖1(a)～(c)表示向GMEM、LIF和2-ME構(gòu)成的培養(yǎng)基中分別添加FCS+喂養(yǎng)細(xì)胞、KSR+喂養(yǎng)細(xì)胞和FCS的情況。
通過這些肽激素的補(bǔ)充形成未分化集落的ES細(xì)胞，在作為未分化狀態(tài)標(biāo)記的堿性磷酸梅活性染色試驗中為陽性(圖1)，通過采用相同基因重組法導(dǎo)入的報告基因的活性，也可以確認(rèn)未分化細(xì)胞特異表達(dá)的轉(zhuǎn)錄因子Oct-3/4的表達(dá)。因而，這些肽被認(rèn)為像FCS和CM那樣具有未分化集落形成喂養(yǎng)能力。
實施例2在上述實施例1中，使用在試驗的候補(bǔ)肽當(dāng)中以最低濃度顯示活性的ACTH和其片段，驗證了其顯著性。同上述一樣，在向細(xì)胞培養(yǎng)最低限量培養(yǎng)基中已添加(1)LIF、(3)2-ME和(5)KSR的培養(yǎng)培養(yǎng)基中，當(dāng)以終濃度1μM添加ACTH或其片段時，ACTH(1-39)、ACTH(1-24)、ACTH(11-24)顯示了活性，而ACTH(18-39)沒有顯示活性。另外，在顯示活性的ACTH或其片段中，ACTH(1-24)顯示的活性最強(qiáng)，即使用以終濃度0.1μM也喂養(yǎng)未分化集落形成。另外，在已添加10μM的ACTH(1-24)的條件下的未分化集落形成率與細(xì)胞增殖速度，與添加0.3％FCS或10％CM時是同等的。
從以上結(jié)果可以認(rèn)為，向作為基礎(chǔ)培養(yǎng)基的細(xì)胞培養(yǎng)最低限量培養(yǎng)基中添加(1)LIF、(3)2-ME、(5)KSR+(6)ACTH等的肽激素得到的培養(yǎng)基，即使不含血清或喂養(yǎng)細(xì)胞，也可以在維持多能性的未分化狀態(tài)下使ES細(xì)胞增殖。
實施例3為了弄清ACTH在細(xì)胞內(nèi)傳遞哪個信號的結(jié)果是否使ES細(xì)胞在沒有血清或喂養(yǎng)細(xì)胞的存在下且維持多能性的未分化狀態(tài)下增殖，向培養(yǎng)基添加各種信號傳遞抑制因子，觀察ES細(xì)胞的增殖。
已知ACTH使屬于G蛋白質(zhì)偶聯(lián)受體家族的ACTH受體活化，ACTH受體借助含有Gαs亞單位的三聚體G蛋白質(zhì)的活化而使腺苷酸環(huán)化酶活化。因此，向已添加了(1)1×103U/ml LIF、(3)0.1μM 2-ME、(5)10％(v/v)KSR和(6)10μM ACTH的細(xì)胞培養(yǎng)最低限量培養(yǎng)基中，進(jìn)一步添加作為腺苷酸環(huán)化酶抑制劑的(7)SQ22536(9-(四氫-2-呋喃基)-腺嘌呤)(Sigma)100μM，使用該培養(yǎng)基與實施例1同樣地培養(yǎng)ES細(xì)胞。其結(jié)果，與預(yù)想相反，培養(yǎng)第7天的未分化集落的形成完全不被抑制，各個集落反而顯著變大。
為了檢驗SQ22536單獨的效果，使用已添加了(1)1×103U/ml LIF、(3)0.1μM 2-ME、(5)10％(v/v)KSR和(7)SQ22536 100μM的細(xì)胞培養(yǎng)最低限量培養(yǎng)基，與實施例1同樣地培養(yǎng)ES細(xì)胞。其結(jié)果，與加入了ACTH的情況一樣，看到了平均9個未分化集落的形成。另外，即使使用已添加了其它作為腺苷酸環(huán)化酶抑制劑的2’，5’-二脫氧腺苷(Sigma)500μM來代替SQ22536的培養(yǎng)基，也會看到平均8個未分化集落的形成。這些結(jié)果表明了腺苷酸環(huán)化酶活性的抑制導(dǎo)致未分化集落的形成。
通過G蛋白質(zhì)偶聯(lián)型受體的腺苷酸環(huán)化酶的抑制，通常是借助含有Gαi亞單位的三聚體G蛋白質(zhì)的活化而引起的。為了確認(rèn)ACTH的效果是否是借助該信號傳遞通路產(chǎn)生的，在含有(1)1×103U/ml LIF、(3)0.1μM2-ME、(5)10％(v/v)KSR和(6)10μM ACTH的細(xì)胞培養(yǎng)最低限量培養(yǎng)基中，以終濃度為100ng/ml添加作為Gαi抑制劑的百日咳毒素，使用該培養(yǎng)基，與實施例1同樣地培養(yǎng)ES細(xì)胞。其結(jié)果，ACTH的效果被抑制，未分化集落的大小顯著減小。這些結(jié)果表明，ACTH的未分化集落形成喂養(yǎng)效果借助Gαi的活化。另外，由于ACTH受體與Gαs偶聯(lián)，所以暗示了在ES細(xì)胞中，ACTH是與和其特異性受體不同的G蛋白質(zhì)偶聯(lián)型受體結(jié)合。
從以上結(jié)果可判斷，通過ACTH的未分化集落形成喂養(yǎng)作用是通過以下的信號傳遞通路引起的。①在與Gαi偶聯(lián)的G蛋白質(zhì)偶聯(lián)型受體上結(jié)合ACTH，②活化Gαi，接著③抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性。因而，為了在不含血清和喂養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中使ES細(xì)胞在未分化的狀態(tài)下增殖，只要是抑制腺苷酸環(huán)化酶的活性的方法，可以采用任何方法。
實施例4在上述實施例1中，將使用1nM促腎上腺皮質(zhì)激素進(jìn)行培養(yǎng)得到的源于未分化集落的ES細(xì)胞，再傳代2次之后，將它們注入小鼠的胚泡中并移植到假妊娠雌小鼠的子宮中。其結(jié)果，從100個移植胚得到33只出生鼠，30只在生后3周以后仍存活，而其中有17只是顯示出在毛色上70％以上的ES細(xì)胞供給率(contribution ratio)的良好嵌合體小鼠。另外，在17只中有14只是公鼠，所謂的雄性畸變(male distortion)得到確認(rèn)，通過它們的交配實驗，ES細(xì)胞向生殖細(xì)胞系的供給得到確認(rèn)。這些事實證明了本培養(yǎng)條件對于維持ES細(xì)胞的多能性是足夠的。
實施例5提取C57BL/6純系小鼠受精后3.5天的胚泡期的胚30個，在分別涂有粘連蛋白的培養(yǎng)板內(nèi)，用由CCMM、(1)1×103U/ml LIF、(3)0.1μM 2-ME、0.1mM非必需氨基酸、1mM丙酮酸鈉、(5)10％(v/v)KSR和(6)10μM ACTH構(gòu)成的培養(yǎng)液，培養(yǎng)通過免疫手術(shù)法從上述胚中分離出的內(nèi)細(xì)胞團(tuán)。其結(jié)果，至少2個內(nèi)細(xì)胞團(tuán)開始增殖，并最終達(dá)到作為ES細(xì)胞株而建立。由此證明了該培養(yǎng)法不僅對已經(jīng)建立的ES細(xì)胞的培養(yǎng)，而且對新的ES細(xì)胞株的建立都是有用的。
權(quán)利要求
1.一種多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的組合物，其特征在于，至少含有1種腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)。
2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的組合物，其特征在于，是培養(yǎng)基補(bǔ)充物。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或者2所述的組合物，其特征在于，其用于在維持多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的同時使多能干細(xì)胞增殖。
4.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任意一項所述的組合物，其特征在于，腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)是從由SQ22536(9-(四氫-2-呋喃基)-腺嘌呤)、2’，5’-二脫氧腺苷、9-環(huán)戊基腺嘌呤、2’，5’-二脫氧腺苷3’-二磷酸、2’，5’-二脫氧腺苷3’-一磷酸和MDL-12330A(順-N-(2-苯基環(huán)戊基)氮雜環(huán)十三碳-1-烯-2-胺)組成的組中進(jìn)行選擇。
5.根據(jù)權(quán)利要求1～3中任意一項所述的組合物，其特征在于，腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)是從促腎上腺皮質(zhì)激素(ACTH)、腦鈉利尿肽(BNP)和下垂體細(xì)胞腺苷酸環(huán)化酶活化肽(PACAP)及實質(zhì)上具有與它們相同的生理活性的肽中進(jìn)行選擇。
6.一種多能干細(xì)胞培養(yǎng)用的培養(yǎng)基，其特征在于，含有權(quán)利要求1～5中任意一項所述的組合物。
7.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基，其特征在于，不含有喂養(yǎng)細(xì)胞和/或血清。
8.根據(jù)權(quán)利要求6所述的培養(yǎng)基，其特征在于，不含有喂養(yǎng)細(xì)胞和血清。
9.根據(jù)權(quán)利要求6～8中任意一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，是細(xì)胞培養(yǎng)用最低限量培養(yǎng)基。
10.根據(jù)權(quán)利要求6～9中任意一項所述的培養(yǎng)基，其特征在于，還含有分化抑制因子、血清替代物和抗氧化劑。
11.一種多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，是用于在維持多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的同時使多能干細(xì)胞增殖或建立的多能干細(xì)胞的培養(yǎng)方法，其特征在于，在抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件下進(jìn)行該培養(yǎng)。
12.根據(jù)權(quán)利要求11所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件伴隨使用腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)。
13.根據(jù)權(quán)利要求11或者12所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，在權(quán)利要求6～10中任意一項所述的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
14.根據(jù)權(quán)利要求11～13中任意一項所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，多能干細(xì)胞為ES細(xì)胞。
15.根據(jù)權(quán)利要求11～14中任意一項所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，多能干細(xì)胞源于哺乳動物。
16.根據(jù)權(quán)利要求15所述的培養(yǎng)方法，其特征在于，多能干細(xì)胞源于人。
17.一種未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞克隆團(tuán)的調(diào)制方法，其特征在于，在抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件下，培養(yǎng)未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞。
18.一種未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞克隆團(tuán)的調(diào)制方法，其特征在于，從生物體中分離未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞，在抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件下，培養(yǎng)未分化狀態(tài)的多能干細(xì)胞。
19.根據(jù)權(quán)利要求17或者18所述的調(diào)制方法，其特征在于，抑制腺苷酸環(huán)化酶活性的條件伴隨使用腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)。
20.根據(jù)權(quán)利要求17～19中任意一項所述的調(diào)制方法，其特征在于，在權(quán)利要求6～10中任意一項所述的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
21.根據(jù)權(quán)利要求17～20中任意一項所述的調(diào)制方法，其特征在于，培養(yǎng)1個多能干細(xì)胞而得到其克隆團(tuán)。
22.根據(jù)權(quán)利要求17～21中任意一項所述的調(diào)制方法，其特征在于，將在比通過鄰近的多能干細(xì)胞之間的相互作用誘導(dǎo)該多能干細(xì)胞的未分化增殖更低密度的接種條件中的多能干細(xì)胞，在權(quán)利要求7或8所述的培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)。
23.根據(jù)權(quán)利要求17～22中任意一項所述的調(diào)制方法，其特征在于，在權(quán)利要求7或8所述的培養(yǎng)基中培養(yǎng)1個多能干細(xì)胞而得到其克隆團(tuán)。
24.根據(jù)權(quán)利要求17～23中任意一項所述的調(diào)制方法，其特征在于，多能干細(xì)胞為ES細(xì)胞。
25.根據(jù)權(quán)利要求17～24中任意一項所述的調(diào)制方法，其特征在于，多能干細(xì)胞源于哺乳動物。
26.根據(jù)權(quán)利要求17～25中任意一項所述的調(diào)制方法，其特征在于，多能干細(xì)胞源于人。
27.一種未分化多能干細(xì)胞克隆團(tuán)，其特征在于，通過權(quán)利要求17～26中任意一項所述的調(diào)制方法而得到。
28.腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)的使用，其特征在于，用于在維持多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的同時進(jìn)行培養(yǎng)，使多能干細(xì)胞增殖或建立。
29.含有腺苷酸環(huán)化酶活性抑制物質(zhì)的組合物的使用，其特征在于，用于在維持多能干細(xì)胞的未分化狀態(tài)的同時進(jìn)行培養(yǎng)，使多能干細(xì)胞增殖或建立。
全文摘要
本發(fā)明的目的是在未使用血清或喂養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基中培養(yǎng)多能干細(xì)胞，而使保持分化能的未分化多能干細(xì)胞增殖、建立。本發(fā)明通過只由補(bǔ)充了腺苷酸環(huán)化酶抑制基的明確的成分構(gòu)成培養(yǎng)多能干細(xì)胞的培養(yǎng)基而達(dá)到上述目的。
文檔編號C12N5/02GK1708582SQ20038010240
公開日2005年12月14日 申請日期2003年10月31日 優(yōu)先權(quán)日2002年10月31日
發(fā)明者丹羽仁史, 小川和也 申請人:獨立行政法人理化學(xué)研究所, 丹羽仁史