專利名稱：枯草桿菌酶變體的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及在一種或多種特性上與親本枯草桿菌酶不同的新枯草桿菌酶(subtilase)變體，所述特性包括洗滌性能、熱穩(wěn)定性、儲藏穩(wěn)定性或催化活性。本發(fā)明的變體適用于例如清潔或洗滌劑組合物，如洗衣洗滌劑組合物和洗盤組合物，包括自動洗盤組合物中。本發(fā)明還涉及編碼所述變體的經(jīng)分離DNA序列、表達(dá)載體、宿主細(xì)胞，以及產(chǎn)生和使用本發(fā)明變體的方法。而且，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明變體的清潔和洗滌劑組合物。
背景技術(shù)：
在洗滌劑工業(yè)中，酶已在洗滌制劑中使用了30年以上。用于這些制劑的酶包括蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶、纖維素酶和其它酶或它們的混合物。商業(yè)上最為重要的酶是蛋白酶。
數(shù)量不斷增長的商用蛋白酶是天然存在的野生型蛋白酶的蛋白質(zhì)工程化變體，如Durazym_、Relase_、Alcalase_、Savinase_、Primase_、Duralase_、Esperase_、Ovozyme_和Kannase_(Novozymes A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、PurafectOxPTM、FN2TM、FN3TM和FN4TM(Genencor International，Inc.)。而且，本領(lǐng)域描述了許多蛋白酶變體。WO 99/27082中給出了現(xiàn)有技術(shù)中蛋白酶變體的完整列表。
雖然已描述了大量有用的蛋白酶變體，但是對于許多工業(yè)應(yīng)用，例如洗衣或硬表面清潔而言，仍需要新的改進(jìn)的蛋白酶或蛋白酶變體。因此，本發(fā)明的一個目的是提供改進(jìn)的枯草桿菌酶變體用于此類目的。
發(fā)明概述因此，在第一方面，本發(fā)明涉及如下的枯草桿菌酶變體a)其至少包含在62位、68位、97位、98位、99位、106位、131位、170位、245位、252位的一處或多處對氨基酸殘基K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、T之一的插入、替代或缺失與至少一個下列修飾的組合*0AQSVPWG；A1T，V；Q2L；S3T，A，L；V4L，A；I8V，T；S9G，D，R，K，L，V；R10H，K；V11A；Q12D；A13V；P14S，T，D，A，M，V，K，Q，L，H，R，I；A15M，T；A16P；H17R；N18S，H；R19W，K，L，F(xiàn)，G，I；G20*，R，A；L21 F，LP，LW，LA，LG；T22S，A，K，TV，TG，TL，TW，TV，G，L，TY；G23S；S24P；K27R，V28I；V30I；I35T，V；T38S；P40L；N43D；R45H，K；G46D；A48T；S49N；F50S；V51A，I，D；P52V，A；P55S，A；S57P；G61E，D，S，R，GP；N62D，ND，NE，DE，NG，E，S；V68A，S，L，I；T71A；I72V；L75I；N76S，D；N77S；S78T；V81A；A85T；S87C；A88V，T；E89G；K94N；V95C，T；L96LA，LG；G97E，D，W，A，GG，GA，GV，N，GS；A98S，D，E，T，AS，AD，AV，AE，AH，Q，N，M，L，G，R，V，S；S99D，L，A，AD，SD，SM，SG，DA，P，G，N，C，M，V，I；G100S，GE，C；S101 SA，SK；G102D，S；S103D，E，Y，L，Q，H，T；V104T，S，R，I，N，M，L，D；S106D，E，T，M，G，A，L，F(xiàn)，I；I107T，V，M；A108V，T，S；L111I，V；A114V；N116S，D；G118D；M119L，I，V，A，S；H120N，D，Q，K，E，Y，S；V121A；L124C；L126I；G127E；S128N，I，G，C；P129PSN，T，E，D，S，N，A；S130P，T，C，*；P131M，F(xiàn)，W，L，A，H，T，*，PA，S，Q，R，E，G，D，C；S132G，T；A133ASA；T134A；Q137H，E，D；A138G，V；V139L，I；N140D，K；T143A；S144D，N，P；R145G；V150I；A151V，G；A152P；A158T，V，C，E，L，D，M；G160A，D；S163G，C，N，A；Y167K，A，I；A168G；A169G；R170C，S，H，L；Y171C；A172V；N173D；A174V；M175L，I，V，A，S，T；N183D；N184D，S；N185S，D；R186L，C，H；S188G；S190A；Y192H；G195F，E；V203S，A，L，Q，M，F(xiàn)，I；N204T，D，S；Q206L；Y209C，H；G211D；S212N，L；T213A；Y214C，H；A21 5D，T；N218D，S；M222L，I，V，A，S；A223G；T224A，S；A228T；A230V；A232S，L，T，P；V234I；Q236A，L，D，T，C，M，F(xiàn)，S；K237R；N238D；P239T，S；S240F；S242T；V244I，M，A；Q245R，K，E，D，T，F(xiàn)，N，V，W，G，I，S，C，L，A，M；N248P，D，S；K251 E，R；N252G，H，D，V，M，S，T，E，Y，S，Q，K，A，L；A254S；T255A，S；S256N，R，G；L257G；G258K，S259A，N，G；T260A，R；N261D；L262S，Q，V；Y263H，F(xiàn)；G264E；S265G，R，N；V268L，I；N269T；N296K；E271A；T274S，L，A，R或
b)其至少包含一個下列組合變體A108T+L111V；L124I+S125A；P129S+S130AT；L96LA+A151G+V203A；S49N+V203L+N218D；S3T+A16P+R45C+G100S+A230V；I8V+R19K+V139I；N76D+A174AL+A194P+A230V；N185R；N62NE；H120Q+Q137E，G61GE，G61GS，G100L，A133D，V68A，N123D，L111F+Y263H，V11A+G61GE+V227A+S240F，A133E+S144K+N218D，S128A+P129S+S130SP，S9R+A15T+T22TQ+S101P，S9R+A15T+H120R+Q137D+N173S，G97E，Q245W，S9R+A15T+L96LG+Q137E+Y209H，S9R+A15T+L111V+Q137E+G211D，S9R+A15T+L111I+Q137E，S9R+A15T+L111I+H120N+Q137E，S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E，S9R+A15T+T260M，S9R+A15T，Q245I，S9R+A15T+H120G+Q137E+N218D，S9R+A15T+S130P，Q245F，S9R+A15T+N218D，G63E+N76D+A194P+A230V，S9R+A15T+T224A，G100S，S9R+A15T+D60DG，A138V+V139I+A194P+N218D+A230V，A108V+A169G+R170A+Y171H，I8V+P14L+R19L+V30I+I35V+S57P+P129S+Q137D+S144D+S256N，A133D+T134S+Q137A，Q137D，A98AH，V51D，Q12E+P14L+A15T，G63E+N76D+A194P+A230V，Q12E+P14L+A15T，G97GS或c)其至少包含在位置68處的一種或多種修飾，其中所述修飾包含對選自K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S和T的氨基酸殘基進(jìn)行缺失、插入和/或替代。
第二方面，本發(fā)明涉及如下的枯草桿菌酶變體a)其包含對一個或多個下列修飾X62D，XD，XE，XG，DEX68A，S，L，IX97E，D，W，A，N，XG，XA，XV，XSX98S，D，E，T，XS，XD，XVX99D，L，A，P，G，N，AD，XD，XM，XG，DAX106D，E，T，M，G，A，L，F(xiàn)，IX131 M，F(xiàn)，W，L，A，H，T，*，S，Q，R，E，G，XAX170C，S，HX245R，K，E，D，T，F(xiàn)，N，V，W，G，I，S，C，L，AX252G，H，D，V，M，S，T，E，Y，S，Q，K
與至少一個下列修飾*0AQSVPWG；A1T，V；Q2L；S3T，A，L；V4L，A；I8V，T；S9G，D，R，K，L，V；R10H，K；V11A；Q12D；A13V；P14S，T，D，A，M，V，K，Q，LH，R，I；A15M，T；A16P；H17R；N18S，H；R19W，K，L，F(xiàn)，G，I；G20*，R，A；L21F，LP，LW，LA，LG；T22S，A，K，TV，TG，TL，TW，TV，G，L，TY；G23S；S24P；K27R，V28I；V30I；I35T，V；T38S；P40L；N43D；R45H，K；G46D；A48T；S49N；F50S；V51A，I，D；P52V，A；P55S，A；S57P；G61E，D，S，R，GP；N62D，ND，NE，DE，NG，E，S；V68A，S，L，I；T71A；I72V；L75I；N76S，D；N77S；S78T；V81A；A85T；S87C；A88V，T；E89G；K94N；V95C，T；L96LA，LG；G97E，D，W，A，GG，GA，GV，N，GS；A98S，D，E，T，AS，AD，AV，AE，AH，Q，N，M，L，G，R，V，S；S99D，L，A，AD，SD，SM，SG，DA，P，G，N，C，M，V，I；G100S，GE，C；S101 SA，SK；G102D，S；S103D，E，Y，L，Q，H，T；V104T，S，R，I，N，M，L，D；S106D，E，T，M，G，A，L，F(xiàn)，I；I107T，V，M；A108V，T，S；L111I，V；A114V；N116S，D；G118D；M119 L，I，V，A，S；H120N，D，Q，K，E，Y，S；V121A；L124C；L126I；G127E；S128N，I，G，C；P129PSN，T，E，D，S，N，A；S130P，T，C，*；P131M，F(xiàn)，W，L，A，H，T，*，PA，S，Q，R，E，G，D，C；S132G，T；A133ASA；T134A；Q137H，E，D；A138G，V；V139L，I；N140D，K；T143A；S144D，N，P；R145G；V150I；A151V，G；A152P；A158T，V，C，E，L，D，M；G160A，D；S163G，C，N，A；Y167K，A，I；A168G；A169G；R170C，S，H，L；Y171C；A172V；N173D；A174V；M175L，I，V，A，S，T；N183D；N184D，S；N185S，D；R186L，C，H；S188G；S190A；Y192H；G195F，E；V203S，A，L，Q，M，F(xiàn)，I；N204T，D，S；Q206L；Y209C，H；G211D；S212N，L；T213A；Y214C，H；A215D，T；N218D，S；M222L，I，V，A，S；A223G；T224A，S；A228T；A230V；A232S，L，T，P；V234I；Q236A，L，D，T，C，M，F(xiàn)，S；K237R；N238D；P239T，S；S240F；S242T；V244I，M，A；Q245R，K，E，D，T，F(xiàn)，N，V，W，G，I，S，C，L，A，M；N248P，D，S；K251E，R；N252G，H，D，V，M，S，T，E，Y，S，Q，K，A，L；A254S；T255A，S；S256N，R，G；L257G；G258K，S259A，N，G；T260A，R；N261 D；L262S，Q，V；Y263H，F(xiàn)；G264E；S265G，R，N；V268L，I；N269T；N296K；E271A；T274S，L，A，R.
進(jìn)行的組合。
第三方面，本發(fā)明涉及包含下面表I中公開的至少一處改變的枯草桿菌酶變體
表I具有一處或多處改變的本發(fā)明枯草桿菌酶變體












其中(a)表I的變體顯示蛋白酶活性，且(b)每一位置都對應(yīng)于

圖1和SEQ ID NO1所示的枯草桿菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的位置。
第四方面，本發(fā)明涉及編碼本發(fā)明枯草桿菌酶變體的經(jīng)分離多核苷酸。
第五方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的經(jīng)分離多核苷酸的表達(dá)載體。
第六方面，本發(fā)明涉及用本發(fā)明的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞。
第七方面，本發(fā)明涉及用于產(chǎn)生本發(fā)明枯草桿菌酶變體的方法，其中在有利于該變體表達(dá)和分泌的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的宿主，并回收該變體。
第八方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明變體的清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選地為包含本發(fā)明變體的洗衣或洗盤組合物。
第九方面，本發(fā)明涉及包含下面表II中公開的至少一處改變的枯草桿菌酶變體表II具有一處或多處改變的本發(fā)明枯草桿菌酶變體




其中(a)表II的變體顯示蛋白酶活性，且(b)每一位置都對應(yīng)于圖1和SEQ ID NO1所示的枯草桿菌蛋白酶BPN’氨基酸序列的位置。
第十方面，本發(fā)明涉及包含N252D和N252M中的一種改變的枯草桿菌酶變體。
第十一方面，本發(fā)明涉及這樣的枯草桿菌酶變體，其包含M119L、I、V、A、S；M175L、I、V、A、S和M222L、I、V、A、S中的一個或多個改變與上述表I和II所列的枯草桿菌酶變體的組合。
關(guān)于序列比對和編號參考圖1，該圖顯示在枯草桿菌蛋白酶BPN′(a)(BASBPN)和枯草桿菌蛋白酶309(b)(BLSAVI)之間的序列比對。在本專利申請中此序列比對(alignment)用作對殘基進(jìn)行編號的參照。
定義在更詳細(xì)地討論本發(fā)明之前，首先定義以下的術(shù)語和約定。
對氨基酸和核酸命名法的詳細(xì)描述，我們參照WO 00/71691的始于第5頁的部分，此處引用作為參考。
變體名稱的命名法和約定在描述本發(fā)明產(chǎn)生的或考慮的多種枯草桿菌酶變體時，采用以下的命名法和約定以易于參照首先通過將分離的酶或親本酶與枯草桿菌蛋白酶BPN′(BASBPN)比對來定義參考框。
可以由GCG軟件包9.1版的GAP程序?qū)ψ凅w進(jìn)行編號而獲得序列比對，其間使用了以下參數(shù)缺口(gap)創(chuàng)建罰分＝8，缺口延伸罰分＝8，且所有的其它參數(shù)保持為它們的默認(rèn)值。
另一種方法是使用枯草桿菌酶之間的已知公認(rèn)比對，如在WO91/00345中所示的序列比對。在大部分情況下，這些差異并不重要。
由此，可以相對BASBPN(SEQ ID NO1)定義許多缺失和插入。在圖1中，枯草桿菌蛋白酶309(SEQ ID NO2)與BASBPN相比，在位置36、58、158、162、163和164位有6處缺失。這些缺失在圖1中用星號(*)表示。
對于通過遺傳操作而導(dǎo)入多肽中的修飾的命名法的詳細(xì)描述，我們參照WO 00/71691的第7-12頁，此處引用作為參考。
蛋白酶斷裂蛋白質(zhì)底物中的酰胺鍵的酶歸類為蛋白酶，或(可互換地)肽酶(見Walsh，1979，酶反應(yīng)機(jī)理(Enzymatic Reaction Mechanisms).W.H.Freeman and Company，San Francisco，第3章)。
氨基酸位置/殘基的編號如果沒有另外指出，本文所用的氨基酸編號對應(yīng)于枯草桿菌酶BPN′(BASBPN)序列的氨基酸編號。對BPN′序列的詳細(xì)描述，參見圖1或Siezen等人，蛋白質(zhì)工程(Protein Engng.)4(1991)719-737。
絲氨酸蛋白酶絲氨酸蛋白酶是一種催化肽鍵水解的酶，其中在活性位點(diǎn)存在必需的絲氨酸殘基(White，Handler和Smith，1973“生物化學(xué)原理(Principles of Biochemistry)，”第五版，McGraw-Hill Book公司，紐約，第271-272頁)。細(xì)菌絲氨酸蛋白酶的分子量在20,000-45,000道爾頓的范圍內(nèi)。它們被二異丙基氟磷酸酯抑制。它們水解簡單末端脂類，且其活性與真核生物糜蛋白酶(也是一種絲氨酸蛋白酶)相似。一個更為狹義的術(shù)語，堿性蛋白酶(包括一個亞組)反映某些絲氨酸蛋白酶的高pH最適值，為pH 9.0-11.0(綜述參見Priest(1977)細(xì)菌學(xué)評論(Bacteriological Rev.)41711-753)。
枯草桿菌酶Siezen等人，蛋白質(zhì)工程，4(1991)719-737和Siezen等人，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)6(1997)501-523提出絲氨酸蛋白酶的一個亞組，其暫稱為枯草桿菌酶(subtilase)。它們是通過對170多個先前稱為枯草桿菌蛋白酶樣蛋白酶的絲氨酸蛋白酶的氨基酸序列進(jìn)行同源性分析而定義的?？莶輻U菌蛋白酶以前通常被定義為由革蘭氏陽性細(xì)菌或真菌產(chǎn)生的絲氨酸蛋白酶，而現(xiàn)在根據(jù)Siezen等人則為枯草桿菌酶的一個亞組。已鑒定了大量的枯草桿菌酶，并已測定了許多枯草桿菌酶的氨基酸序列。對此類枯草桿菌酶及其氨基酸序列的更詳細(xì)描述參見Siezen等人(1997)。
枯草桿菌酶的一個亞組，I-S1或″真″枯草桿菌蛋白酶，包含“經(jīng)典的”枯草桿菌蛋白酶，如枯草桿菌蛋白酶168(BSS168)、枯草桿菌蛋白酶BPN′、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg(ALCALASE_，NOVOZYMES A/S)和枯草桿菌蛋白酶DY(BSSDY)。
Siezen等人(引文同上)識別了枯草桿菌酶的另一亞組，I-S2或強(qiáng)堿性枯草桿菌蛋白酶。亞組I-S2蛋白酶被描述為強(qiáng)堿性枯草桿菌蛋白酶并包括例如枯草桿菌蛋白酶PB92(BAALKP)(MAXACAL_，Gist-Brocades NV)、枯草桿菌蛋白酶309(SAVINASE_，NOVOZYMESA/S)、枯草桿菌蛋白酶147(BLS147)(ESPERASE_，NOVOZYMES A/S)和堿性彈性蛋白酶YaB(BSEYAB)。
″SAVINASE_″SAVINASE_由NOVOZYMES A/S銷售。它是來自遲緩芽孢桿菌(B.Lentus)的枯草桿菌蛋白酶309，并且只在一個位置處(N87S)不同于BAALKP。SAVINASE_具有在圖1和SEQ ID NO2中稱為b)的氨基酸序列。
親本枯草桿菌酶術(shù)語“親本枯草桿菌酶”描述根據(jù)Siezen等人(1991和1997)定義的枯草桿菌酶。關(guān)于進(jìn)一步的細(xì)節(jié)，參見以上“枯草桿菌酶”的描述。親本枯草桿菌酶也可以是從天然來源分離的、并隨后在保留枯草桿菌酶特征的情況下經(jīng)過修飾的枯草桿菌酶。而且，親本枯草桿菌酶還可以是通過如以下文獻(xiàn)所述的DNA改組技術(shù)制備的枯草桿菌酶J.E.Ness等人，自然生物技術(shù)(Nature Biotechnology)，17，893-896(1999)。術(shù)語“親本枯草桿菌酶”可另外稱為“野生型枯草桿菌酶”。
作為參考下表提供了此處所述多種枯草桿菌酶的簡稱，對于其它簡稱，參見Siezen等，蛋白質(zhì)工程(Protein Engng.)4(1991)719-737和Siezen等，蛋白質(zhì)科學(xué)(Protein Science)6(1997)501-523。
表III

枯草桿菌酶變體的修飾本文所用的術(shù)語“修飾”定義為包括枯草桿菌酶的化學(xué)修飾以及對編碼枯草桿菌酶的DNA所進(jìn)行的遺傳操作。修飾可以是氨基酸側(cè)鏈的置換、目標(biāo)氨基酸處的替換、缺失和/或插入。
枯草桿菌酶變體在本發(fā)明的上下文中，術(shù)語枯草桿菌酶變體或突變的枯草桿菌酶指由表達(dá)突變基因的生物體產(chǎn)生的枯草桿菌酶，該突變基因來源于含原始或親本基因并產(chǎn)生相應(yīng)親本酶的親本微生物，其中為產(chǎn)生在適宜的宿主中表達(dá)時能產(chǎn)生所述的突變枯草桿菌酶的此突變基因，已經(jīng)對所述親本基因進(jìn)行了突變。
同源枯草桿菌酶序列在本上下文中，兩種氨基酸序列之間的同源性用參數(shù)“同一性”描述。
為了確定兩種枯草桿菌酶之間的同一性程度，可以應(yīng)用(下文)GCG軟件包9.1版的GAP程序以及相同的設(shè)定值。此程序的計算結(jié)果除了氨基酸序列比對外，還有兩個序列之間的“同一性百分率”的計算結(jié)果。
根據(jù)此說明書，本領(lǐng)域技術(shù)人員可常規(guī)地鑒定可以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)行修飾的適宜同源性枯草桿菌酶。
分離的多核苷酸術(shù)語“分離的”當(dāng)應(yīng)用于多核苷酸時是指該多核苷酸已經(jīng)從其天然遺傳環(huán)境中移出并因此不含其他外來或不需要的編碼序列，并且該多核苷酸的存在形式適于在遺傳工程化蛋白質(zhì)生產(chǎn)系統(tǒng)中應(yīng)用。此分離分子為那些從其天然環(huán)境中分離的分子并包括cDNA和基因組克隆。本發(fā)明的分離的DNA分子不含通常與之關(guān)聯(lián)的其他基因，但可包含天然存在的5′和3′非翻譯區(qū)如啟動子和終止子。關(guān)聯(lián)區(qū)域的鑒定對本領(lǐng)域內(nèi)的普通技術(shù)人員而言是顯而易見的(參見例如，Dynan和Tijan，自然(Nature)316774-78，1985)。術(shù)語“分離的多核苷酸”另外可稱為“克隆的多核苷酸”。
分離的蛋白質(zhì)術(shù)語“分離的”在應(yīng)用于蛋白質(zhì)時指此蛋白質(zhì)已從其自然環(huán)境中移出。
在優(yōu)選的形式中，分離的蛋白質(zhì)基本上不含其它蛋白質(zhì)，特別是不含其它同源蛋白質(zhì)(即“同源雜質(zhì)”(參見以下))。
通過SDS-PAGE測定，分離的蛋白質(zhì)的純度大于10％，優(yōu)選大于20％，更優(yōu)選大于30％。還優(yōu)選提供高度純化形式的蛋白質(zhì)，即通過SDS-PAGE測定純度大于40％，大于60％，大于80％，更優(yōu)選大于95％，并最優(yōu)選大于99％。
術(shù)語“分離的蛋白質(zhì)”另外可稱為“純化的蛋白質(zhì)”。
同源雜質(zhì)術(shù)語“同源雜質(zhì)”意指任何來源于最初獲得本發(fā)明枯草桿菌酶的同源細(xì)胞的雜質(zhì)(如非本發(fā)明枯草桿菌酶的另一多肽)。
自……獲得本文所用與特定的微生物來源相關(guān)的術(shù)語“自……獲得”意指該多核苷酸和/或枯草桿菌酶是由此特定來源或由已插入了來自于該來源的基因的細(xì)胞產(chǎn)生的。
底物與蛋白酶的底物相關(guān)的術(shù)語“底物”應(yīng)以其最廣義的形式解釋為包括含有至少一個易于被枯草桿菌蛋白酶水解的肽鍵(酰胺鍵)的化合物。
產(chǎn)物與來自蛋白酶酶促反應(yīng)的產(chǎn)物有關(guān)的術(shù)語“產(chǎn)物”在本發(fā)明的上下文中應(yīng)解釋為包括涉及蛋白酶枯草桿菌酶的水解反應(yīng)的產(chǎn)物。產(chǎn)物可以是隨后的水解反應(yīng)的底物。
洗滌性能在本發(fā)明上下文中，術(shù)語“洗滌性能”用以表示酶在例如洗滌或硬表面清潔過程中除去存在于待清潔物體上的蛋白質(zhì)性污漬或有機(jī)污漬的能力。也參見本文實施例3中的洗滌性能試驗。
附圖簡述圖1顯示使用上述的GAP程序進(jìn)行的枯草桿菌蛋白酶BPN′(a)和Savinase_(b)之間的序列比對。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及在一種或多種特性上與親本枯草桿菌酶不同的新枯草桿菌酶變體，所述特性包括洗滌性能、熱穩(wěn)定性、儲藏穩(wěn)定性或催化活性。
作為本發(fā)明的一部分考慮的變體是與野生型枯草桿菌酶相比已對一個或多個氨基酸殘基進(jìn)行了替代、缺失或插入的變體，所述變體a)至少包含在62位、68位、97位、98位、99位、106位、131位、170位、245位、252位的一處或多處對氨基酸殘基K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、T之一的插入、替代或缺失與至少一個下列修飾的組合*0AQSVPWG；A1T，V；Q2L；S3T，A，L；V4L，A；I8V，T；S9G，D，R，K，L，V；R10H，K；V11A；Q12D；A13V；P14S，T，D，A，M，V，K，Q，L，H，R，I；A15M，T；A16P；H17R；N18S，H；R19W，K，L，F(xiàn)，G，I；G20*，R，A；L21F，LP，LW，LA，LG；T22S，A，K，TV，TG，TL，TW，TV，G，L，TY；G23S；S24P；K27R，V28I；V30I；I35T，V；T38S；P40L；N43D；R45H，K；G46D；A48T；S49N；F50S；V51A，I，D；P52V，A；P55S，A；S57P；G61E，D，S，R，GP；N62D，ND，NE，DE，NG，E，S；V68A，S，L，I；T71A；I72V；L75I；N76S，D；N77S；S78T；V81A；A85T；S87C；A88V，T；E89G；K94N；V95C，T；L96LA，LG；G97E，D，W，A，GG，GA，GV，N，GS；A98S，D，E，T，AS，AD，AV，AE，AH，Q，N，M，L，G，R，V，S；S99D，L，A，AD，SD，SM，SG，DA，P，G，N，C，M，V，I；G1 00S，GE，C；S1 01 SA，SK；G1 02D，S；S103D，E，Y，L，Q，H，T；V104T，S，R，I，N，M，L，D；S106D，E，T，M，G，A，L，F(xiàn)，I；I107T，V，M；A108V，T，S；L111I，V；A114V；N116S，D；G118D；M119L，I，V，A，S；H120N，D，Q，K，E，Y，S；V121A；L124C；L126I；G127E；S128N，I，G，C；P129PSN，T，E，D，S，N，A；S130P，T，C，*；P131M，F(xiàn)，W，L，A，H，T，*，PA，S，Q，R，E，G，D，C；S132G，T；A133ASA；T134A；Q137H，E，D；A138G，V；V139L，I；N140D，K；T143A；S144D，N，P；R145G；V150I；A151V，G；A152P；A158T，V，C，E，L，D，M；G160A，D；S163G，C，N，A；Y167K，A，I；A168G；A169G；R170C，S，H，L；Y171C；A172V；N173D；A174V；M175L，I，V，A，S，T；N183D；N184D，S；N185S，D；R186 L，C，H；S188G；S190A；Y192H；G195F，E；V203S，A，L，Q，M，F(xiàn)，I；N204T，D，S；Q206L；Y209C，H；G211D；S212N，L；T213A；Y214C，H；A215D，T；N218D，S；M222L，I，V，A，S；A223G；T224A，S；A228T；A230V；A232S，L，T，P；V234I；Q236A，L，D，T，C，M，F(xiàn)，S；K237R；N238D；P239T，S；S240F；S242T；V244I，M，A；Q245R，K，E，D，T，F(xiàn)，N，V，W，G，I，S，C，L，A，M；N248P，D，S；K251E，R；N252G，H，D，V，M，S，T，E，Y，S，Q，K，A，L；A254S；T255A，S；S256N，R，G；L257G；G258K，S259A，N，G；T260A，R；N261D；L262S，Q，V；Y263H，F(xiàn)；G264E；S265G，R，N；V268L，I；N269T；N296K；E271A；T274S，L，A，R或b)至少包含一個下列組合變體A108T+L111V；L124I+S125A；P129S+S130AT；L96LA+A151G+V203A；S49N+V203L+N218D；S3T+A16P+R45C+G100S+A230V；I8V+R19K+V139I；N76D+A174AL+A194P+A230V；N185R；N62NE；H120Q+Q137E，G61GE，G61GS，G100L，A133D，V68A，N123D，L111F+Y263H，V11A+G61GE+V227A+S240F，A133E+S144K+N218D，S128A+P129S+S130SP，S9R+A15T+T22TQ+S101P，S9R+A15T+H120R+Q137D+N173S，G97E，Q245W，S9R+A15T+L96LG+Q137E+Y209H，S9R+A15T+L111V+Q137E+G211D，S9R+A15T+L111I+Q137E，S9R+A15T+L111I+H120N+Q137E，S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E，S9R+A15T+T260M，S9R+A15T，Q245I，S9R+A15T+H120G+Q137E+N218D，S9R+A15T+S130P，Q245F，S9R+A15T+N218D，G63E+N76D+A194P+A230V，S9R+A15T+T224A，G100S，S9R+A15T+D60DG，A138V+V139I+A194P+N218D+A230V，A108V+A169G+R170A+Y171H，I8V+P14L+R19L+V30I+I35V+S57P+P129S+Q137D+S144D+S256N，A133D+T134S+Q137A，Q137D，A98AH，V51D，Q12E+P14L+A15T，G63E+N76D+A194P+A230V，Q12E+P14L+A15T，G97GS或c)至少包含在位置68處的一種或多種修飾，其中所述修飾包含對選自K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S和T的氨基酸殘基進(jìn)行缺失、插入和/或替代。
進(jìn)一步地，本發(fā)明的變體包含至少一個或多個在表I和II中所示的改變，其中(a)表I和II的變體具有蛋白酶活性，且(b)每一位置都對應(yīng)于枯草桿菌蛋白酶BPN’(SEQ ID NO1)氨基酸序列的位置。
本發(fā)明第一方面的枯草桿菌酶變體可以是從自然界中鑒定和分離的親本或野生型枯草桿菌酶。此親本野生型枯草桿菌酶可以通過本領(lǐng)域已知的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)特異地篩選。
進(jìn)行此篩選的一個優(yōu)選方式可以是從多種不同微生物，優(yōu)選從不同芽孢桿菌菌株的枯草桿菌酶，特異地PCR擴(kuò)增目的保守DNA區(qū)域。
由于枯草桿菌酶的DNA和氨基酸序列具有同源性，故在此意義上該酶是一組保守酶。因此，可以構(gòu)建位于目的多核苷酸序列側(cè)翼的相對特異引物。
使用此PCR引物從多種不同的微生物(優(yōu)選從不同的芽孢桿菌菌株)擴(kuò)增DNA，然后對所述的擴(kuò)增PCR片段進(jìn)行DNA測序，可以鑒定出產(chǎn)生本發(fā)明枯草桿菌酶變體的菌株。在鑒定到此菌株和目的枯草桿菌酶的部分DNA序列后，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以常規(guī)地完成該枯草桿菌酶的克隆、表達(dá)和純化。然而，可以想到的是，本發(fā)明枯草桿菌酶變體主要是親本枯草桿菌酶的變體。
適于本文所述用途的枯草桿菌酶變體可以通過本領(lǐng)域已知標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，例如定點(diǎn)/隨機(jī)誘變或不同枯草桿菌酶序列的DNA改組來構(gòu)建。參見文中“材料和方法”部分和實施例1(見下文)的更詳細(xì)描述。
本領(lǐng)域技術(shù)人員知道，此處描述的變體可以包含一個或多個其它的改變，尤其是一個或多個其它的替換。而且，此處描述的變體可以在不僅一個位置上包含突變。例如，本發(fā)明的變體可以在一個位置、兩個位置或兩個以上位置，如3個、4個或5個位置上含有突變。
不論是從自然界或人工的多樣性創(chuàng)建體中分離酶，還是從親本枯草桿菌酶設(shè)計并產(chǎn)生變體，均優(yōu)選親本枯草桿菌酶屬于亞組I-S1和I-S2，尤其是亞組I-S2。
對于來自亞組I-S1的變體，親本枯草桿菌酶優(yōu)選地選自BSS168(BSSAS、BSAPRJ、BSAPRN、BMSAMP)、BASBPN、BSSDY、BLSCAR(BLKERA、BLSCA1、BLSCA2、BLSCA3)、BSSPRC和BSSPRD，或它們的保留了亞組I-S1特征的功能性變體。
對于來自亞組I-S2的變體，親本枯草桿菌酶優(yōu)選地選自BSAPRQ、BLS147(BSAPRM、BAH101)、BLSAVI(BSKSMK、BAALKP、BLSUBL)、BYSYAB、BAPB92、TVTHER和BSAPRS，或它們的保留了亞組I-S2特征的功能性變體。尤其是，親本枯草桿菌酶是BLSAVI(Savinase_，NOVOZYMES A/S)，并且本發(fā)明優(yōu)選的枯草桿菌酶變體因此為Savinase_的變體。
本發(fā)明也包括其氨基酸序列中組合有任何其它修飾的任一上述枯草桿菌酶變體。特別是可以想到與本領(lǐng)域公知的能為該酶提供改良性質(zhì)的其它修飾進(jìn)行組合。現(xiàn)有技術(shù)描述了大量具有不同改良性質(zhì)的枯草桿菌酶變體，其中的一些在本文的“發(fā)明背景”部分中已有提及(見上)。這些參考文獻(xiàn)在此處公開作為參考，用來鑒定可有利地與此處描述的枯草桿菌酶變體組合的枯草桿菌酶變體。此類組合包括位置222(提高氧化穩(wěn)定性)、218(提高熱穩(wěn)定性)、在穩(wěn)定酶的Ca2+-結(jié)合位點(diǎn)如位置76處的替換、以及根據(jù)現(xiàn)有技術(shù)顯而易見的許多其它位置。
在進(jìn)一步的實施方案中，此處描述的枯草桿菌酶變體可有利地與任一下列位置處的一個或多個修飾組合27，36，56，76，87，95，96，97，98，99，100，101，102，103，104，120，123，159，167，170，206，218，222，224，232，235，236，245，248，252和274。
尤其是，如下BLSAVI、BLSUBL、BSKSMK和BAALKP修飾被認(rèn)為適于組合K27R，*36D，S56P，N62D，V68A，N76D，S87N，G97N，S99SE，S101G，S103A，V104A，V104I，V104N，V104Y，S106A，H120D，H120N，N123S，G159D，Y167A，R170S，R170L，A194P，N204D，V205I，Q206E，L217D，N218S，N218D，M222S，M222A，T224S，A232V，K235L，Q236H，Q245R，N248D，N252K和T274A.
而且包含任一以下修飾的變體顯示出改進(jìn)的特性S101G+V104N，S87N+S101G+V104N，K27R+V104Y+N123S+T274A，N76D+S103A+V104I，S99D+S101R+S103A+V104I+G160S，S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V199M+V205I+L217D，S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217D，S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V205I或N76D+V104A，或者包含以下修飾與任意一種或多種上述修飾組合產(chǎn)生的其它組合的變體顯示出改進(jìn)的特性K27R，*36D，S56P，N62D，V68A，N76D，S87N，G97N，S99SE，S101 G，S103A，V104A，V104I，V104N，V104Y，S106A，H120D，H120N，N123S，G159D，Y167A，R170S，R170L，A194P，N204D，V205I，Q206E，L217D，N218S，N218D，M222S，M222A，T224S，A232V，K235L，Q236H，Q245R，N248D，N252K和T274A特別令人感興趣的變體為這樣的變體，其中除了根據(jù)本發(fā)明的修飾外，還包含下列替換S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K。
而且，本發(fā)明主要方面的枯草桿菌酶變體優(yōu)選與一個或多個在位置129、131和194之任一處的修飾組合，所述修飾優(yōu)選地為129K、131H和194P修飾，且最優(yōu)選地為P129K、P131H和A194P修飾。在產(chǎn)生枯草桿菌酶變體時，預(yù)期所有這些修飾都可以提供更高的枯草桿菌酶變體表達(dá)水平。
所選擇的本發(fā)明變體的洗滌性能可用本文實施例3中所公開的洗滌性能試驗進(jìn)行測試?？梢杂孟礈煨阅茉囼炘u估變體在摻入標(biāo)準(zhǔn)的或市售的洗滌劑組合物后與參照體系，即親本枯草桿菌酶或顯示更好洗滌性能的類似枯草桿菌酶進(jìn)行比較(將它們摻入同樣的洗滌劑體系并在相同的條件下測試)，除去標(biāo)準(zhǔn)紡織物上的蛋白質(zhì)性污漬的能力。本發(fā)明的酶變體使用自動機(jī)械應(yīng)力試驗(AMSA)測試。使用AMSA試驗可快速檢查大量的小體積酶洗滌劑溶液的洗滌性能。利用這種試驗，可以初步研究所選擇的變體的洗滌性能，其原理是如果所選擇的變體在試驗中沒有表現(xiàn)出相對于親本枯草桿菌酶的明顯改進(jìn)，則一般不需要進(jìn)行進(jìn)一步的試驗。
因此，對于此處描述的目的而言，尤其令人感興趣的變體為這樣的變體當(dāng)如洗滌性能試驗(實施例3)所述測試其在市售洗滌劑組合物如美國型洗滌劑、亞洲型洗滌劑、歐洲型洗滌劑或拉丁美洲型洗滌劑中時，與在相同條件下測試的親本枯草桿菌酶相比表現(xiàn)出改進(jìn)的洗滌性能。
洗滌性能的改進(jìn)可通過計算本文實施例3中所定義的強(qiáng)度值(Int)而量化。
在本發(fā)明的一個非常令人感興趣的實施方案中，當(dāng)在洗滌性能試驗中測試時，本發(fā)明的變體具有的性能分值(Performance Score；S)至少為1，優(yōu)選地性能分值為2，其中S(2)＝在所有三個酶濃度(5、10和30nM)下變體表現(xiàn)出優(yōu)于參照物，S(1)＝在一個或兩個濃度下變體表現(xiàn)出優(yōu)于參照物。
明顯地，優(yōu)選本發(fā)明的變體至少在所述的最低水平上，更優(yōu)選在所述的最高水平上符合上述標(biāo)準(zhǔn)。
產(chǎn)生枯草桿菌酶變體用于克隆枯草桿菌酶的許多方法和用于將替換、缺失或插入導(dǎo)入基因(如枯草桿菌酶基因)的許多方法在本領(lǐng)域是熟知的。
通常，可以采用用于克隆基因和向該基因中引入突變(隨機(jī)和/或定點(diǎn))的標(biāo)準(zhǔn)方法以獲得本發(fā)明的枯草桿菌酶變體。對于適宜的技術(shù)的進(jìn)一步描述，參照本文的實施例(見下文)和(Sambrook等人，(1989)，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Ausubel，F(xiàn).M.等人(編輯)“分子生物學(xué)最新方法”(“Current protocols in Molecular Biology”)，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(編輯)“用于芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”(“Molecular Biological Methods forBacillus”)，John Wiley和Sons，1990)；和WO 96/34946。
而且，枯草桿菌酶變體可以通過用于人工產(chǎn)生多樣性的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)構(gòu)建，如通過不同枯草桿菌酶基因的DNA改組構(gòu)建(參見WO 95/22625；Stemmer WPC，自然370389-91(1994))。例如，將編碼Savinase_的基因與本質(zhì)上經(jīng)過鑒定的一個或多個部分枯草桿菌酶序列進(jìn)行DNA改組，在隨后對具有改進(jìn)洗滌性能的變體進(jìn)行篩選后，即可提供適用于此處所述目的的枯草桿菌酶變體。
表達(dá)載體包含編碼本發(fā)明酶的DNA構(gòu)建體的重組表達(dá)載體可以是任何可方便地進(jìn)行重組DNA操作的載體。載體的選擇一般取決于它將被導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制載體，即作為染色體外實體而存在的載體，這種載體的復(fù)制獨(dú)立于染色體的復(fù)制，如質(zhì)粒。
另外，所述載體可以在導(dǎo)入宿主細(xì)胞后部分或全部整合入宿主細(xì)胞基因組中，并與其整合的染色體一起復(fù)制。
所述載體優(yōu)選為這樣的表達(dá)載體，其中編碼本發(fā)明酶的DNA序列可操作地與此DNA轉(zhuǎn)錄所需的其它片段相連接。一般來說，表達(dá)載體來自質(zhì)?；虿《綝NA，或可以含有兩者的元件。術(shù)語“可操作地連接”指將諸片段以使其能按它們的預(yù)期目的協(xié)同發(fā)揮功能的方式排列，如轉(zhuǎn)錄在啟動子中引發(fā)并前行通過編碼此酶的DNA序列。
所述的啟動子可以是在所選擇的宿主細(xì)胞內(nèi)表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并可以得自編碼與宿主細(xì)胞同源或異源的蛋白質(zhì)的基因。
用于細(xì)菌宿主細(xì)胞的適宜啟動子的實例包括以下基因的啟動子嗜熱脂肪芽孢桿菌(Bacillus stearothermophilus)生麥芽糖淀粉酶基因、地衣芽孢桿菌(Bacillus licheniformis)α-淀粉酶基因、解淀粉芽孢桿菌(Bacillus amyloliquefaciens)α-淀粉酶基因、枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)堿性蛋白酶基因或短小芽孢桿菌(Bacillus pumilus)木糖苷酶基因，或為λ噬菌體的PR或PL啟動子或大腸桿菌的lac、trp或tac啟動子。
如果需要，編碼本發(fā)明酶的DNA序列還可以可操作地連接到適宜的終止子上。
本發(fā)明的重組載體還可包含能夠使所述載體在所討論的宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。所述載體還可以包含可選擇的標(biāo)記，例如其產(chǎn)物彌補(bǔ)宿主細(xì)胞缺陷的基因，或編碼如對抗生素像卡那霉素、氯霉素、紅霉素、四環(huán)素、壯觀霉素等的抗性，或?qū)χ亟饘倩虺輨┑目剐缘幕颉?br> 為了指導(dǎo)本發(fā)明的酶進(jìn)入宿主細(xì)胞的分泌途徑，可以在重組載體中提供分泌信號序列(也稱為前導(dǎo)序列、前原序列或前序列)。可以將分泌信號序列以正確的讀框連接編碼酶的DNA序列。分泌信號序列一般位于編碼此酶的DNA序列的5’端。所述分泌信號序列可以通常與該酶相關(guān)或可以來自編碼另一種分泌蛋白質(zhì)的基因。
用于分別連接編碼本發(fā)明酶的DNA序列、啟動子和任選地終止子和/或分泌信號序列，或通過適宜的PCR擴(kuò)增方案組裝這些序列和將它們插入含有復(fù)制或整合所需信息的適宜載體中的方法對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的(參見例如，Sambrook等人，前引書)。
宿主細(xì)胞導(dǎo)入宿主細(xì)胞中的編碼本發(fā)明酶的DNA序列可以與此宿主同源或異源。如果與所述宿主細(xì)胞同源，即由該宿主細(xì)胞天然產(chǎn)生，則該DNA序列一般可操作地與非其天然環(huán)境中的另一啟動子序列相連接，或者適當(dāng)時與另一分泌信號序列和/或終止子序列相連接。術(shù)語″同源″旨在包括編碼天然存在于所討論的宿主生物體中的酶的DNA序列。術(shù)語“異源的”旨在包括所述宿主細(xì)胞本身不表達(dá)的DNA序列。因此該DNA序列可以來源于另一生物體或者是合成的序列。
可導(dǎo)入本發(fā)明的DNA構(gòu)建體或重組載體的宿主細(xì)胞可以是任何能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)胞，包括細(xì)菌、酵母、真菌和高等真核細(xì)胞，包括植物。
通過培養(yǎng)能夠產(chǎn)生本發(fā)明的酶的細(xì)菌宿主細(xì)胞的實例是革蘭氏陽性細(xì)菌，如芽孢桿菌菌株，如枯草芽孢桿菌(B.subtilis)、地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)、遲緩芽孢桿菌(B.lentus)、短芽孢桿菌(B.brevis)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(B.stearothermophilus)、嗜堿芽孢桿菌(B.alkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)、凝結(jié)芽孢桿菌(B.coagulans)、環(huán)狀芽孢桿菌(B.circulans)、燦爛芽孢桿菌(B.lautus)、巨大芽孢桿菌(B.megaterium)或蘇云金芽孢桿菌(B.thuringiensis)菌株，或鏈霉菌(streptomyces)菌株，如變鉛青鏈霉菌(S.lividans)或鼠灰鏈霉菌(S.murinus)，或革蘭氏陰性細(xì)菌如大腸桿菌(Echerichiacoli)。
細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過本身已知的方式用原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化、電穿孔、接合或使用感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行(參見Sambrook等人，見上)。
當(dāng)在細(xì)菌如大腸桿菌中表達(dá)酶時，該酶一般可以以不溶性顆粒形式駐留于細(xì)胞質(zhì)中(稱作包涵體)，或可以由細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到周質(zhì)間隙。在前一種情況下，將細(xì)胞裂解，回收所述顆粒，變性，其后通過稀釋變性試劑使酶重新折疊。后一種情況下，該酶可以通過以下操作從周質(zhì)間隙中回收如利用超聲或滲透壓休克破壞細(xì)胞，使所述的周質(zhì)間隙的內(nèi)容物釋放，再回收該酶。
當(dāng)在革蘭氏陽性細(xì)菌如芽孢桿菌屬或鏈霉菌屬菌株中表達(dá)該酶時，該酶可以駐留于細(xì)胞質(zhì)中，或由細(xì)菌分泌序列引導(dǎo)到胞外培養(yǎng)基中。在后一種情況下，該酶可按下述方法從培養(yǎng)基中回收。
產(chǎn)生枯草桿菌酶變體的方法本發(fā)明提供了產(chǎn)生本發(fā)明的分離酶的方法，其中在允許該酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)已用編碼該酶的DNA序列轉(zhuǎn)化的合適宿主細(xì)胞，以及從培養(yǎng)物中回收所得的酶。
當(dāng)將含有編碼該酶的DNA序列的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化入異源宿主細(xì)胞中時，即可使本發(fā)明的酶異源重組產(chǎn)生。由此可以產(chǎn)生以不含同源雜質(zhì)為特征的高度純化的枯草桿菌酶組合物。
用于培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適合于所討論的宿主細(xì)胞生長的常規(guī)培養(yǎng)基。所表達(dá)的枯草桿菌酶可方便地分泌到培養(yǎng)基中，然后可以通過已知的方法回收，所述方法包括通過離心或過濾從培養(yǎng)基中分離細(xì)胞，再利用鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分，接下來進(jìn)行層析，如離子交換層析、親和層析等。
清潔和洗滌劑組合物本發(fā)明的酶可以添加到洗滌劑組合物中而成為其中的組分。一般來說，清潔和洗滌劑組合物已在本領(lǐng)域中有充分描述，對合適的清潔和洗滌劑組合物的進(jìn)一步描述可以參見WO 96/34946；WO 97/07202；WO95/30011。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以制成手洗或機(jī)洗洗衣洗滌劑組合物，包括適用于預(yù)處理污染織物的洗衣添加劑組合物和漂洗時添加的織物柔軟劑組合物，或制成用于普通家庭硬表面清潔操作的洗滌劑組合物，或配制以用于手洗或機(jī)洗洗盤操作。
在一特定的方面，本發(fā)明提供包含本發(fā)明枯草桿菌酶的洗滌添加劑。所述的洗滌添加劑和洗滌劑組合物可以包含一種或多種其它的酶如蛋白酶、脂肪酶、角質(zhì)酶、淀粉酶、糖酶、纖維素酶、果膠酶、甘露聚糖酶、阿拉伯糖酶、半乳聚糖酶、木聚糖酶、氧化酶、例如漆酶，和/或過氧化物酶。
一般來說，所選擇的酶的性質(zhì)應(yīng)當(dāng)與所選擇的洗滌劑相適應(yīng)(即最適pH，與其它酶和非酶組分具相容性等)，且所述的酶應(yīng)以有效量存在。
蛋白酶合適的蛋白酶包括來自動物、植物或微生物的蛋白酶。來源于微生物的蛋白酶是優(yōu)選的。也包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。所述的蛋白酶可以是絲氨酸蛋白酶或金屬蛋白酶，優(yōu)選堿性微生物蛋白酶或胰蛋白酶樣蛋白酶。堿性蛋白酶的實例為枯草桿菌蛋白酶，特別是來自芽孢桿菌的枯草桿菌蛋白酶，例如，枯草桿菌蛋白酶Novo、枯草桿菌蛋白酶Carlsberg、枯草桿菌蛋白酶309、枯草桿菌蛋白酶147和枯草桿菌蛋白酶168(WO 89/06279中描述)。胰蛋白酶樣蛋白酶的實例為胰蛋白酶(例如來自豬或牛的)和如WO 89/06270和WO 94/25583中所公開的鐮孢霉屬(Fusarium)的蛋白酶。
有用的蛋白酶的實例是如WO 92/19729，WO 98/20115，WO98/20116和WO 98/34946所描述的變體，特別是在一個或多個下述位置發(fā)生替換的變體27，36，57，76，87，97，101，104，120，123，167，170，194，206，21 8，222，224，235和274。
優(yōu)選的可商購的蛋白酶包括Durazym_、Relase_、Alcalase_、Savinase_、Primase_、Duralase_、Esperase_、Ovozyme_和Kannase_(Novozymes A/S)、MaxataseTM、MaxacalTM、MaxapemTM、ProperaseTM、PurafectTM、Purafect OxPTM、FN2TM、FN3TM和FN4TM(Genencor International，Inc.)。
脂肪酶合適的脂肪酶包括那些來源于細(xì)菌或真菌的脂肪酶。也包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的脂肪酶的實例包括來自腐質(zhì)霉屬(Humicola)(Thermomyces與之同物異名)，如EP 258 068和EP 305 216中所述的來自H.lanuginosa(T.lanuginosus)的脂肪酶或如WO 96/13580中所述的來自H.insolens的脂肪酶；假單胞菌(Pseudomonas)脂肪酶，例如來自產(chǎn)堿假單胞菌(P.alcaligenes)或類產(chǎn)堿假單胞菌(P.pseudoalcaligenes)(EP 218 272)，洋蔥假單胞菌(P.cepacia)(EP 331 376)，施氏假單胞菌(P.stutzeri)(GB 1,372,034)，熒光假單胞菌(P.fluorescens)，假單胞菌菌株SD 705(WO 95/06720和WO 96/27002)，P.wisconsinensis(WO 96/12012)的脂肪酶；芽孢桿菌脂肪酶，例如來自枯草芽孢桿菌(Dartois等人(1993)，生物化學(xué)與生物物理學(xué)學(xué)報(Biochemica et Biophysica Acta)，1131，253-360)，嗜熱脂肪芽孢桿菌(JP 64/744992)或短小芽孢桿菌(B.Pumilus)(WO91/16422)的脂肪酶。
其它的實例為如WO 92/05249，WO 94/01541，EP 407 225，EP 260105，WO 95/35381，WO 96/00292，WO 95/30744，WO 94/25578，WO95/14783，WO 95/22615，WO 97/04079和WO 97/07202中所述的脂肪酶變體。
優(yōu)選的可商購的脂肪酶包括Lipex_、Lipolase_和Lipolase Ultra_(Novozymes A/S)。
淀粉酶合適的淀粉酶(α和/或β)包括那些來源于細(xì)菌或真菌的淀粉酶。也包括經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。淀粉酶包括例如來源于芽孢桿菌的α-淀粉酶，例如來自地衣芽孢桿菌的特定菌株，詳細(xì)內(nèi)容參見GB 1,296,839。
有用的淀粉酶的實例是如WO 94/02597，WO 94/18314，WO96/23873和WO 97/43424中所描述的變體，尤其是那些在一個或多個下列位置發(fā)生替換的變體15，23，105，106，124，128，133，154，156，181，188，190，197，202，208，209，243，264，304，305，391，408和444。
可商購的淀粉酶是Duramyl_，Termamyl_，F(xiàn)ungamyl_和BAN_(Novozymes A/S)，RapidaseTM和PurastarTM(來自GenencorInternational Inc.)。
纖維素酶合適的纖維素酶包括來源于細(xì)菌或真菌的纖維素酶。也包括其經(jīng)化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。合適的纖維素酶包括來自芽孢桿菌屬、假單胞菌屬、腐質(zhì)霉屬(Humicola)、鐮孢霉屬(Fusarium)、草根霉屬(Thielavia)、枝頂孢霉屬(Acremonium)的纖維素酶，例如在US 4,435,307，US 5,648,263，US 5,691，178，US 5,776,757和WO89/09259中公開的由Humicola insolens、嗜熱毀絲霉(Myceliophthorathermophila)和尖孢鐮孢(Fusarium oxysporum)產(chǎn)生的真菌纖維素酶。
特別合適的纖維素酶是具有顏色保護(hù)優(yōu)勢的堿性或中性纖維素酶。這樣的纖維素酶的實例為如EP 0 495 257，EP 0 531 372，WO 96/11262，WO 96/29397，WO 98/08940中所公開的纖維素酶。其它的實例為如那些在WO 94/07998，EP 0 531 315，US 5,457,046，US 5,686,593，US5,763,254，WO 95/24471，WO 98/12307和PCT/DK98/00299中所公開的纖維素酶變體。
可商購的纖維素酶包括Celluzyme_和Carezyme_(NovozymesA/S)，ClazinaseTM和Puradax HATM(Genencor International Inc.)和KAC-500(B)TM(Kao Corporation)。
過氧化物酶/氧化酶合適的過氧化物酶/氧化酶包括那些來源干植物、細(xì)菌或真菌的過氧化物酶/氧化酶。也包括化學(xué)修飾或蛋白質(zhì)工程化的突變體。有用的過氧化物酶的實例包括來自鬼傘屬(Coprinus)(例如來自灰蓋鬼傘(C.cinereus))的過氧化物酶和其變體，如WO93/24618，WO 95/10602和WO 98/15257所述的那些。可商購的過氧化物酶包括Guardzyme_(Novozymes A/S)。
這些洗滌劑酶可以通過添加含一種或多種酶的獨(dú)立添加劑，或通過添加含所有這些酶的組合添加劑而被包含于洗滌劑組合物中。本發(fā)明的洗滌劑添加劑，也就是獨(dú)立添加劑或組合添加劑可以制成例如顆粒狀、液體、漿狀等等。優(yōu)選的洗滌劑添加劑制劑為顆粒(特別是無粉塵顆粒)、液體(特別是被穩(wěn)定化的液體)或漿。
無粉塵顆?？梢勒绽鏤S 4,106,991和4,661,452所述進(jìn)行生產(chǎn)并可任選地用本領(lǐng)域已知的方法加包衣。蠟質(zhì)包衣材料的實例是平均分子量為1000到20000的聚(環(huán)氧乙烷)產(chǎn)物(聚乙二醇，PEG)；含有16到50個環(huán)氧乙烷單位的乙氧基化的壬基酚；乙氧基化脂肪醇，其中，醇含12到20個碳原子且其中存在15到80個環(huán)氧乙烷單位；脂肪醇；脂肪酸；和脂肪酸的單-、二-和三酸甘油酯。GB 1483591中給出了適合于通過流化床技術(shù)應(yīng)用的成膜包衣材料的實例。液體酶制劑可以例如依照現(xiàn)成的方法通過添加多元醇如丙二醇、糖或糖醇、乳酸或硼酸得以穩(wěn)定。受保護(hù)的酶可依照EP 238,216中所公開的方法進(jìn)行制備。
本發(fā)明的洗滌劑組合物可以是任何方便的形式，例如棒狀、片狀、粉末、顆粒、糊或液體。液體洗滌劑可以是含水的，一般含高達(dá)70％的水和0-30％的有機(jī)溶劑，或是不含水的。
所述的洗滌劑組合物一般包含一種或多種表面活性劑，它們可以是非離子(包括半極性的)和/或陰離子和/或陽離子和/或兩性離子表面活性劑。所述的表面活性劑一般占到0.1％到60％的重量。當(dāng)包含在所述洗滌劑中時，洗滌劑通常包含約1％到約40％的陰離子表面活性劑，如直鏈烷基苯磺酸鹽、α-烯屬磺酸鹽、烷基硫酸鹽(脂肪醇硫酸鹽)、醇乙氧化硫酸鹽、仲鏈烷磺酸鹽、α-磺基脂肪酸甲酯、烷基-或鏈烯基琥珀酸或皂。
當(dāng)包含在所述洗滌劑中時，通常含有約0.2％到約40％的非離子表面活性劑，例如醇乙氧基化物、壬基酚乙氧基化物、烷基多苷、烷基二甲基胺氧化物、乙氧基化脂肪酸單乙醇酰胺、脂肪酸單乙醇酰胺、多羥基烷基脂肪酰胺或葡糖胺的N-?；鵑-烷基衍生物(“葡糖酰胺”)。
所述的洗滌劑可以包含0-65％的洗滌劑助洗劑或絡(luò)合劑例如沸石、二磷酸鹽、三磷酸鹽、膦酸酯、碳酸鹽、檸檬酸鹽、次氮基三乙酸、乙二胺四乙酸、二亞乙基三胺五乙酸、烷基-或鏈烯基琥珀酸、可溶性硅酸鹽或?qū)盈B式硅酸鹽(例如購自Hoechst的SKS-6)。
所述的洗滌劑可以包含一種或多種聚合物。實例為羧甲基纖維素、聚(乙烯吡咯烷酮)、聚(乙二醇)、聚(乙烯醇)、聚(乙烯基吡啶-N-氧化物)、聚(乙烯基咪唑)、聚羧酸酯如聚丙烯酸酯、馬來酸/丙烯酸共聚物和甲基丙烯酸月桂醇酯/丙烯酸共聚物。
所述的洗滌劑可以含有漂白體系，所述漂白體系可以包含H2O2來源如過硼酸鹽或過碳酸鹽，其可以與形成過酸的漂白活化劑如四乙?；叶坊蛉甚Ｑ趸交撬猁}相結(jié)合?？蛇x擇地，所述的漂白體系可以包含例如酰胺、二酰亞胺或砜類的過氧酸。
所述的洗滌劑還可以包含其它的常規(guī)洗滌劑成分，例如織物調(diào)理劑包括粘土、發(fā)泡劑、泡沫抑制劑、防腐蝕劑、污垢懸浮劑、抗污物再沉淀劑、染料、殺菌劑、光學(xué)增白劑、增溶劑、晦暗抑制劑或香料。
由于局部和區(qū)域條件如水硬度和洗滌溫度的不同而需要區(qū)域洗滌劑組合物。洗滌劑例子1和2分別提供了典型的拉丁美洲洗滌劑組合物和典型的歐洲粉狀洗滌劑組合物的成分。
洗滌劑例子1.典型的拉丁美洲洗滌劑組合物

洗滌劑例子2.典型的歐洲粉末洗滌劑組合物

本發(fā)明的洗滌劑組合物中的酶可以通過諸如以下的常規(guī)穩(wěn)定劑穩(wěn)定多元醇如丙二醇或丙三醇、糖或糖醇、乳酸、硼酸或硼酸衍生物如芳香硼酸酯或苯基硼酸衍生物如4-甲酰基苯基硼酸，且所述的組合物可以按例如WO 92/19709和WO 92/19708中所述配制。
目前認(rèn)為在所述洗滌劑組合物中任何單一的酶，特別是本發(fā)明的酶可以以相當(dāng)于每升洗滌液中具有0.01-200mg酶蛋白質(zhì)，優(yōu)選每升洗滌液0.05-50mg酶蛋白質(zhì)，特別優(yōu)選每升洗滌液中具有0.1-10mg酶蛋白質(zhì)的量加入。
此外，本發(fā)明的酶可以額外地添加到如WO 97/07202所公開的洗滌劑制劑中，該文獻(xiàn)引入本文作為參考。
材料和方法織物標(biāo)準(zhǔn)織物片獲得自瑞士的EMPA St.Gallen，Lerchfeldstrasse 5，CH-9014 St.Gallen。尤其是類型EMPA116(具有血液、奶和墨水污漬的棉織物)和EMPA117(具有血液、奶和墨水污漬的聚酯/棉織物)。
菌株和質(zhì)粒遲緩芽孢桿菌309保藏在NCIB且保藏號為NCIB 10309，在美國專利號3,723,250(此處引用作為參考)中進(jìn)行了描述。親本枯草桿菌酶309或Savinase_可獲自菌株309。表達(dá)所用的宿主菌為枯草芽孢桿菌。
質(zhì)粒pSX222用作大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體和枯草芽孢桿菌表達(dá)載體(描述見WO 96/34946)。
常規(guī)的分子生物學(xué)方法除非另外指出，DNA操作和轉(zhuǎn)化使用分子生物學(xué)標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行(Sambrook等人，(1989)，分子克隆，實驗室手冊，冷泉港實驗室，冷泉港，紐約；Ausubel，F(xiàn).M.等人(編輯)“分子生物學(xué)最新方法”(“Currentprotocols in Molecular Biology”)，John Wiley和Sons，1995；Harwood，C.R.和Cutting，S.M.(編輯)“用于芽孢桿菌的分子生物學(xué)方法”(“Molecular Biological Methods for Bacillus”)，John Wiley和Sons，1990)。
用于DNA操作的酶除非另外指出，所有用于DNA操作的酶如限制性內(nèi)切酶、連接酶等均來自New England Biolabs，Inc。DNA操作中使用的酶按照供應(yīng)商的說明書進(jìn)行操作。
發(fā)酵產(chǎn)生枯草桿菌酶的發(fā)酵是通過將含有15ml雙TY培養(yǎng)基的50ml試管在回轉(zhuǎn)式搖床上(225轉(zhuǎn)/分鐘)于37℃，pH 7.3培養(yǎng)2-3天而進(jìn)行的。
TY培養(yǎng)基的描述見Harwood，C.R.和Cutting，S.M.編輯的″Currentprotocols in Molecular Biology″(John Wiley and Sons，1995)一書中的1.1.3頁，培養(yǎng)基的制備和細(xì)菌學(xué)方法。
純化自宿主細(xì)胞分泌的枯草桿菌酶變體可通過熟知的方法自培養(yǎng)基中常規(guī)回收，包括通過離心或過濾自培養(yǎng)基分離細(xì)胞，通過鹽如硫酸銨沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)組分，然后應(yīng)用層析法如離子交換層析、親和層析等。
洗滌性能試驗為評估所選擇的枯草桿菌酶變體在洗滌劑組合物中的洗滌性能，進(jìn)行了洗滌實驗。本發(fā)明的酶變體使用自動機(jī)械應(yīng)力試驗(AMSA)測試。使用AMSA試驗可快速檢查大量的小體積酶洗滌劑溶液的洗滌性能。所述AMSA板具有許多裝受試溶液的槽和將織物小條緊緊擠壓以使之在槽穴中洗滌的蓋子。在洗滌期間，將板、受試溶液、織物和蓋子劇烈搖動，以使受試溶液與織物接觸并施加機(jī)械應(yīng)力。進(jìn)一步的描述見WO02/42740，尤其見23-24頁“特定方法的實施方案”。
洗滌劑用于本發(fā)明枯草桿菌酶洗滌性能試驗的洗滌劑可通過在市場上購買完全制劑好的市售洗滌劑并接下來通過熱處理(在水溶液中于85℃加熱5分鐘)滅活酶成分而獲得。而且不含酶的市售洗滌劑基礎(chǔ)可直接自供應(yīng)商處購買。進(jìn)一步地，合適的模型(model)洗滌劑可根據(jù)文中19-24頁的教導(dǎo)而組成并用于洗滌性能試驗。
實施例1酶變體的構(gòu)建和表達(dá)定點(diǎn)誘變
包含特定插入/缺失/替換的本發(fā)明枯草桿菌酶309(savinase_)定點(diǎn)變體通過DNA片段的常規(guī)克隆(Sambrook等人，分子克隆實驗室手冊，第二版，冷泉港，1989)制備，其中所述DNA片段通過用包含所需突變的寡聚物進(jìn)行PCR而產(chǎn)生。
模板質(zhì)粒DNA可以為pSX222，或為其包含枯草桿菌酶309的變體的類似物。通過寡聚物定向誘變導(dǎo)入突變來構(gòu)建變體。
將枯草桿菌酶309變體轉(zhuǎn)化入大腸桿菌。從這些轉(zhuǎn)化體的過夜培養(yǎng)物中純化的DNA通過限制性內(nèi)切酶消化、DNA片段的純化、連接、枯草芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化，從而轉(zhuǎn)化入枯草芽孢桿菌?？莶菅挎邨U菌的轉(zhuǎn)化如Dubnau等人，1971，分子生物學(xué)雜志，56，209-221頁中所述進(jìn)行。
定點(diǎn)誘變以在特定區(qū)域?qū)胪蛔冇糜谶M(jìn)行定點(diǎn)誘變的總體策略是合成誘變引物(寡核苷酸)，該引物對應(yīng)于被限定插入/缺失/替換的DNA堿基對分隔開的突變位點(diǎn)兩翼的DNA序列。
接下來，所得的誘變引物與改變了的質(zhì)粒pSX222用于PCR反應(yīng)。純化得到的PCR片段，并在第二輪PCR反應(yīng)中延伸，純化所得的PCR產(chǎn)物并在第三輪PCR反應(yīng)中延伸，然后用核酸內(nèi)切酶消化，并克隆入大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體。PCR反應(yīng)在通常條件下進(jìn)行。利用熟知技術(shù)將質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化至大腸桿菌中，并測序一個大腸桿菌菌落以驗證所設(shè)計的突變。
可如上所述構(gòu)建每一在文中第2頁表I所列出的變體。
為了純化本發(fā)明的枯草桿菌酶變體，將包含本發(fā)明變體的pSX222表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化入感受態(tài)枯草芽孢桿菌菌株，并如上所述發(fā)酵。
實施例2純化及酶濃度的評估發(fā)酵后使用疏水電荷感應(yīng)層析(HCIC)和接下來使用真空過濾純化枯草桿菌蛋白酶變體。為了捕獲酶，HCIC使用的纖維素基質(zhì)結(jié)合有4-巰基-乙基-吡啶(4-MEP)。
將大小為80-100μm的纖維素基質(zhì)珠與含酵母提取物的培養(yǎng)基和可分泌枯草桿菌蛋白酶變體的經(jīng)轉(zhuǎn)化枯草芽孢桿菌混合，并在Unifilter_微孔板中于pH9.5孵育。
由于4-MEP在pH＞7時疏水，且枯草桿菌蛋白酶變體在pH9.5時疏水，所以所分泌的酶和在珠上的4-MEP之間存在疏水相互作用。孵育后，通過真空過濾除去培養(yǎng)基和細(xì)胞碎片，而珠子和酶位于濾器上。
為了將酶自珠子上洗脫，通過用洗脫緩沖液(pH5)洗濾器而降低pH。由此將酶與珠子分離，并可從緩沖液中回收。
經(jīng)純化的枯草桿菌蛋白酶變體的濃度通過活性部位滴定(AST)評估。將經(jīng)純化酶與不同濃度的高親和力抑制劑CI-2A孵育，以抑制不同量的活性位點(diǎn)。所述蛋白酶與抑制劑以1∶1的比例相互結(jié)合，因此酶濃度可直接與抑制劑濃度相關(guān)，在抑制劑濃度下，所有的蛋白酶是失活的。為了測定殘余蛋白酶活性，在與抑制劑孵育后加入底物(在Tris/HCl緩沖液中的0.6mM Suc-Ala-Ala-Pro-Phe-pNA)，接下來的4分鐘降解產(chǎn)物pNA(對硝基酚)的顯色使用Elisa讀數(shù)儀定時于405nm處測定。
在文中第2頁表I所列出的每一本發(fā)明變體根據(jù)上述方法純化并隨后測定酶濃度。
對已知濃度的表I變體如下所述測試在洗滌劑中的洗滌性能。
實施例3SAVINASE變體的洗滌性能為了評估所選擇的枯草桿菌酶變體在市售洗滌劑基礎(chǔ)組合物中的洗滌性能，進(jìn)行了洗滌實驗。本發(fā)明的酶變體使用自動機(jī)械應(yīng)力試驗(AMSA)測試。使用AMSA試驗可快速檢查大量的小體積酶洗滌劑溶液的洗滌性能。所述AMSA板具有許多裝受試溶液的槽和將織物小條緊緊擠壓以使之在槽穴中洗滌的蓋子。在洗滌期間，將板、受試溶液、織物和蓋子劇烈搖動，以使受試溶液與織物接觸并施加機(jī)械應(yīng)力。進(jìn)一步的描述見WO02/42740，尤其見23-24頁“特定方法的實施方案”。
在下述實驗條件下進(jìn)行了兩種測試
測試A

拉丁美洲型洗滌劑根據(jù)文中24頁洗滌劑實施例1的教導(dǎo)組成。通過向測試系統(tǒng)中添加CaCl2和MgCl2(Ca2+∶Mg2+＝4∶1)將水硬度調(diào)節(jié)到6-9°dH。洗滌后織物片用自來水沖洗并于空氣中干燥。
測試B

歐洲粉末型洗滌劑根據(jù)文中24頁洗滌劑實施例2的教導(dǎo)組成。通過向測試系統(tǒng)中添加CaCl2·2H2O；MgCl2·6H2O；NaHCO3(Ca2+∶Mg2+∶HCO3-＝4∶1∶10)將水硬度調(diào)節(jié)到15°dH。洗滌后織物片用自來水沖洗并于空氣中干燥。
酶變體的洗滌性能測定為用特定酶變體洗滌的織物樣本顏色的亮度。亮度可表示為當(dāng)用白色光照射時自織物樣本反射的光強(qiáng)度。當(dāng)織物有污漬時，反射光的強(qiáng)度較干凈的織物低。因此反射光的強(qiáng)度可用于測定酶變體的洗滌性能。
顏色測定用專門的平臺掃描儀(PFU DL2400pro)進(jìn)行，該儀器用于捕捉經(jīng)洗滌織物樣本的成像。使用分辨率200dpi和輸出色濃度24比特進(jìn)行掃描。為了獲得準(zhǔn)確的結(jié)果，將掃描儀經(jīng)常用柯達(dá)反射性IT8靶標(biāo)校正。
為了從掃描圖像獲得光強(qiáng)度的值，使用了專門設(shè)計的軟件(NovozymesColor Vector Analyzer)。該程序自圖像獲取24比特象素值，并將它們轉(zhuǎn)化為紅、綠和蘭(RGB)的值。通過將作為向量的RGB值相加然后得到向量長度而計算強(qiáng)度值(Int)Int=r2+g2+b2]]>變體的洗滌性能(P)根據(jù)下式計算P＝Int(v)-Int(r)其中Int(v)為用酶變體洗滌的織物表面的光強(qiáng)度值，且Int(r)為用參照酶枯草桿菌蛋白酶309(BLSAVI)洗滌的織物表面的光強(qiáng)度值。
在下面的表IV和V中給出的結(jié)果為性能分值(S)，其如下概括了受試酶變體的性能(P)S(2)表明在所有三個酶濃度(5、10和30nM)下變體表現(xiàn)出優(yōu)于參照物，且S(1)表明在一個或兩個濃度下變體表現(xiàn)出優(yōu)于參照物。
表IV 測試A的洗滌性能試驗結(jié)果




表V 測試B的洗滌性能試驗結(jié)果









測試C

歐洲粉末型洗滌劑根據(jù)文中24頁洗滌劑實施例2的教導(dǎo)組成。通過向測試系統(tǒng)中添加CaCl2·2H2O；MgCl2·6 H2O；NaHCO3(Ca2+∶Mg2+∶HCO3-＝4∶1∶10)將水硬度調(diào)節(jié)到15°dH。洗滌后織物片用自來水沖洗并于空氣中干燥。
表VI 測試C的洗滌性能試驗結(jié)果



測試D

歐洲粉末型洗滌劑根據(jù)文中24頁洗滌劑實施例2的教導(dǎo)組成。通過向測試系統(tǒng)中添加CaCl2·2H2O；MgCl2·6 H2O；NaHCO3(Ca2+∶Mg2+∶HCO3-＝4∶1∶10)將水硬度調(diào)節(jié)到15°dH。洗滌后織物片用自來水沖洗并于空氣中干燥。
表VII 測試D的洗滌性能試驗結(jié)果




序列表<110>諾和酶股份有限公司<120>枯草桿菌酶變體<130>10308.204-WO<160>2<170>PatentIn版本3.2<210>1<211>275<212>PRT<213>解淀粉芽孢桿菌(B.amyloliquefaciens)(枯草桿菌蛋白酶BPN’)<400>1Ala Gln Ser Val Pro Tyr Gly Val Ser Gln Ile Lys Ala Pro Ala Leu1 5 10 15His Ser Gln Gly Tyr Thr Gly Ser Asn Val Lys Val Ala Val Ile Asp20 25 30Ser Gly Ile Asp Ser Ser His Pro Asp Leu Lys Val Ala Gly Gly Ala35 40 45Ser Met Val Pro Ser Glu Thr Asn Pro Phe Gln Asp Asn Asn Ser His50 55 60Gly Thr His Val Ala Gly Thr Val Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly65 70 75 80Val Leu Gly Val Ala Pro Ser Ala Ser Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu85 90 95
Gly Ala Asp Gly Ser Gly Gln Tyr Ser Trp Ile Ile Asn Gly Ile Glu100 105 110Trp Ala Ile Ala Asn Asn Met Asp Val Ile Asn Met Ser Leu Gly Gly115 120 125Pro Ser Gly Ser Ala Ala Leu Lys Ala Ala Val Asp Lys Ala Val Ala130 135 140Ser Gly Val Val Val Val Ala Ala Ala Gly Asn Glu Gly Thr Ser Gly145 150 155 160Ser Ser Ser Thr Val Gly Tyr Pro Gly Lys Tyr Pro Ser Val Ile Ala165 170 175Val Gly Ala Val Asp Ser Ser Asn Gln Arg Ala Ser Phe Ser Ser Val180 185 190Gly Pro Glu Leu Asp Val Met Ala Pro Gly Val Ser Ile Gln Ser Thr195 200 205Leu Pro Gly Asn Lys Tyr Gly Ala Tyr Asn Gly Thr Ser Met Ala Ser210 215 220Pro His Val Ala Gly Ala Ala Ala Leu Ile Leu Ser Lys His Pro Asn225 230 235 240Trp Thr Asn Thr Gln Val Arg Ser Ser Leu Glu Asn Thr Thr Thr Lys245 250 255Leu Gly Asp Ser Phe Tyr Tyr Gly Lys Gly Leu Ile Asn Val Gln Ala260 265 270
Ala Ala Gln275<210>2<211>269<212>PRT<213>遲緩芽孢桿菌(枯草桿菌蛋白酶309)<400>2Ala Gln Ser Val Pro Trp Gly Ile Ser Arg Val Gln Ala Pro Ala Ala1 5 10 15His Asn Arg Gly Leu Thr Gly Ser Gly Val Lys Val Ala Val Leu Asp20 25 30Thr Gly Ile Ser Thr His Pro Asp Leu Asn Ile Arg Gly Gly Ala Ser35 40 45Phe Val Pro Gly Glu Pro Ser Thr Gln Asp Gly Asn Gly His Gly Thr50 55 60His Val Ala Gly Thr Ile Ala Ala Leu Asn Asn Ser Ile Gly Val Leu65 70 75 80Gly Val Ala Pro Ser Ala Glu Leu Tyr Ala Val Lys Val Leu Gly Ala85 90 95Ser Gly Ser Gly Ser Val Ser Ser Ile Ala Gln Gly Leu Glu Trp Ala100 105 110Gly Asn Asn Gly Met His Val Ala Asn Leu Ser Leu Gly Ser Pro Ser115 120 125Pro Ser Ala Thr Leu Glu Gln Ala Val Asn Ser Ala Thr Ser Arg Gly
130 135 140Val Leu Val Val Ala Ala Ser Gly Asn Ser Gly Ala Gly Ser Ile Ser145 150 155 160Tyr Pro Ala Arg Tyr Ala Asn Ala Met Ala Val Gly Ala Thr Asp Gln165 170 175Asn Asn Asn Arg Ala Ser Phe Ser Gln Tyr Gly Ala Gly Leu Asp Ile180 185 190Val Ala Pro Gly Val Asn Val Gln Ser Thr Tyr Pro Gly Ser Thr Tyr195 200 205Ala Ser Leu Asn Gly Thr Ser Met Ala Thr Pro His Val Ala Gly Ala210 215 220Ala Ala Leu Val Lys Gln Lys Asn Pro Ser Trp Ser Asn Val Gln Ile225 230 235 240Arg Asn His Leu Lys Asn Thr Ala Thr Ser Leu Gly Ser Thr Asn Leu245 250 255Tyr Gly Ser Gly Leu Val Asn Ala Glu Ala Ala Thr Arg260 26510308.204-W010308.204-WO
權(quán)利要求
1.蛋白酶變體，a)其包含在62位、68位、97位、98位、99位、106位、131位、170位、245位、252位的一處或多處對氨基酸殘基K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S、T之一的插入、替代或缺失與至少一個下列修飾的組合*OAQSVPWG；A1T，V；Q2L；S3T，A，L；V4L，A；I8V，T；S9G，D，R，K，L，V；R10H，K；V11A；Q12D；A13V；P14S，T，D，A，M，V，K，Q，L，H，R，I；A15M，T；A16P；H17R；N18S，H；R19W，K，L，F(xiàn)，G，I；G20*，R，A；L21F，LP，LW，LA，LG；T22S，A，K，TV，TG，TL，TW，TV，G，L，TY；G23S；S24P；K27R，V28I；V30I；I35T，V；T38S；P40L；N43D；R45H，K；G46D；A48T；S49N；F50S；V51A，I，D；P52V，A；P55S，A；S57P；G61E，D，S，R，GP；N62D，ND，NE，DE，NG，E，S；V68A，S，L，I；T71A；I72V；L75I；N76S，D；N77S；S78T；V81A；A85T；S87C；A88V，T；E89G；K94N；V95C，T；L96LA，LG；G97E，D，W，A，GG，GA，GV，N，GS；A98S，D，E，T，AS，AD，AV，AE，AH，Q，N，M，L，G，R，V，S；S99D，L，A，AD，SD，SM，SG，DA，P，G，N，C，M，V，I；G100S，GE，C；S101SA，SK；G102D，S；S103D，E，Y，L，Q，H，T；V104T，S，R，I，N，M，L，D；S106D，E，T，M，G，A，L，F(xiàn)，I；I107T，V，M；A108V，T，S；L111I，V；A114V；N116S，D；G118D；M119L，I，V，A，S；H120N，D，Q，K，E，Y，S；V121A；L124C；L126I；G127E；S128N，I，G，C；P129PSN，T，E，D，S，N，A；S130P，T，C，*；P131M，F(xiàn)，W，L，A，H，T，*，PA，S，Q，R，E，G，D，C；S132G，T；A133ASA；T134A；Q137H，E，D；A138G，V；V139L，I；N140D，K；T143A；S144D，N，P；R145G；V150I；A151V，G；A152P；A158T，V，C，E，L，D，M；G160A，D；S163G，C，N，A；Y167K，A，I；A168G；A169G；R170C，S，H，L；Y171C；A172V；N173D；A174V；M175L，I，V，A，S，T；N183D；N184D，S；N185S，D；R186L，C，H；S188G；S190A；Y192H；G195F，E；V203S，A，L，Q，M，F(xiàn)，I；N204T，D，S；Q206L；Y209C，H；G211D；S212N，L；T213A；Y214C，H；A215D，T；N218D，S；M222L，I，V，A，S；A223G；T224A，S；A228T；A230V；A232S，L，T，P；V234I；Q236A，L，D，T，C，M，F(xiàn)，S；K237R；N238D；P239T，S；S240F；S242T；V244I，M，A；Q245R，K，E，D，T，F(xiàn)，N，V，W，G，I，S，C，L，A，M；N248P，D，S；K251E，R；N252G，H，D，V，M，S，T，E，Y，S，Q，K，A，L；A254S；T255A，S；S256N，R，G；L257G；G258K，S259A，N，G；T260A，R；N261D；L262S，Q，V；Y263H，F(xiàn)；G264E；S265G，R，N；V268L，I；N269T；N296K；E271A；T274S，L，A，R，或b)其包含下列組合變體之一A108T+L111V；L124I+S125A；P129S+S130AT；L96LA+A151G+V203A；S49N+V203L+N218D；S3T+A16P+R45C+G100S+A230V；I8V+R19K+V139I；N76D+A174AL+A194P+A230V；N185R；N62NE；H120Q+Q137E，G61GE，G61GS，G100L，A133D，V68A，N123D，L111F+Y263H，V11A+G61GE+V227A+S240F，A133E+S144K+N218D，S128A+P129S+S130SP，S9R+A15T+T22TQ+S101P，S9R+A15T+H120R+Q137D+N173S，G97E，Q245W，S9R+A15T+L96LG+Q137E+Y209H，S9R+A15T+L111V+Q137E+G211D，S9R+A15T+L111I+Q137E，S9R+A15T+L111I+H120N+Q137E，S9R+A15T+L96LG+H120Q+Q137E，S9R+A15T+T260M，S9R+A15T，Q245I，S9R+A15T+H120G+Q137E+N218D，S9R+A15T+S130P，Q245F，S9R+A15T+N218D，G63E+N76D+A194P+A230V，S9R+A15T+T224A，G100S，S9R+A15T+D60DG，A138V+V139I+A194P+N218D+A230V，A108V+A169G+R170A+Y171H，I8V+P14L+R19L+V30I+I35V+S57P+P129S+Q137D+S144D+S256N，A133D+T134S+Q137A，Q137D，A98AH，V51D，Q12E+P14L+A15T，G63E+N76D+A194P+A230V，Q12E+P14L+A15T，G97GS，V51A+S163T；V139I+A151G；S9R+A15T+L96LG+S130*；A169G+R170H或c)其包含在位置68處的一種或多種修飾，其中所述修飾包含對選自K、H、R、E、D、Q、N、C、V、L、I、P、M、F、W、Y、G、A、S和T的氨基酸殘基進(jìn)行缺失、插入和/或替代。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的蛋白酶變體，其包含對一個或多個下列修飾X62D，E，S，XD，XE，XG，DEX68A，S，L，IX97E，D，W，A，N，XG，XA，XV，XSX98S，D，E，T，N，M，L，G，R，V，XS，XD，XVX99D，L，A，P，G，N，C，M，V，I，AD，XD，XM，XG，DAX106D，E，T，M，G，A，L，F(xiàn)，IX131M，F(xiàn)，W，L，A，H，T，*，S，Q，R，E，G，D，C，XAX170C，S，H，LX245R，K，E，D，T，F(xiàn)，N，V，W，G，I，S，C，L，A，MX252G，H，D，V，M，S，T，E，Y，S，Q，K，A，L與至少一個下列修飾*OAQSVPWG；A1T，V；Q2L；S3T，A，L；V4L，A；I8V，T；S9G，D，R，K，L，V；R10H，K；V11A；Q12D；A13V；P14S，T，D，A，M，V，K，Q，L，H，R，I；A15M，T；A16P；H17R；N18S，H；R19W，K，L，F(xiàn)，G，I；G20*，R，A；L21F，LP，LW，LA，LG；T22S，A，K，TV，TG，TL，TW，TV，G，L，TY；G23S；S24P；K27R，V28I；V30I；I35T，V；T38S；P40L；N43D；R45H，K；G46D；A48T；S49N；F50S；V51A，I，D；P52V，A；P55S，A；S57P；G61E，D，S，R，GP；N62D，ND，NE，DE，NG，E，S；V68A，S，L，I；T71A；I72V；L75I；N76S，D；N77S；S78T；V81A；A85T；S87C；A88V，T；E89G；K94N；V95C，T；L96LA，LG；G97E，D，W，A，GG，GA，GV，N，GS；A98S，D，E，T，AS，AD，AV，AE，AH，Q，N，M，L，G，R，V，S；S99D，L，A，AD，SD，SM，SG，DA，P，G，N，C，M，V，I；G100S，GE，C；S101SA，SK；G102D，S；S103D，E，Y，L，Q，H，T；V104T，S，R，I，N，M，L，D；S106D，E，T，M，G，A，L，F(xiàn)，I；I107T，V，M；A108V，T，S；L111I，V；A114V；N116S，D；G118D；M119L，I，V，A，S；H120N，D，Q，K，E，Y，S；V121A；L124C；L126I；G127E；S128N，I，G，C；P129PSN，T，E，D，S，N，A；S130P，T，C，*；P131M，F(xiàn)，W，L，A，H，T，*，PA，S，Q，R，E，G，D，C；S132G，T；A133ASA；T134A；Q137H，E，D；A138G，V；V139L，I；N140D，K；T143A；S144D，N，P；R145G；V150I；A151V，G；A152P；A158T，V，C，E，L，D，M；G160A，D；S163G，C，N，A；Y167K，A，I；A168G；A169G；R170C，S，H，L；Y171C；A172V；N173D；A174V；M175L，I，V，A，S，T；N183D；N184D，S；N185S，D；R186L，C，H；S188G；S190A；Y192H；G195F，E；V203S，A，L，Q，M，F(xiàn)，I；N204T，D，S；Q206L；Y209C，H；G211D；S212N，L；T213A；Y214C，H；A215D，T；N218D，S；M222L，I，V，A，S；A223G；T224A，S；A228T；A230V；A232S，L，T，P；V234I；Q236A，L，D，T，C，M，F(xiàn)，S；K237R；N238D；P239T，S；S240F；S242T；V244I，M，A；Q245R，K，E，D，T，F(xiàn)，N，V，W，G，I，S，C，L，A，M；N248P，D，S；K251E，R；N252G，H，D，V，M，S，T，E，Y，S，Q，K，A，L；A254S；T255A，S；S256N，R，G；L257G；G258K，S259A，N，G；T260A，R；N261D；L262S，Q，V；Y263H，F(xiàn)；G264E；S265G，R，N；V268L，I；N269T；N296K；E271A；T274S，L，A，R.進(jìn)行的組合。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的枯草桿菌酶變體，其包含一個或多個下述改變
其中(a)變體具有蛋白酶活性，且(b)每一位置都對應(yīng)于SEQ ID NO1所示枯草桿菌蛋白酶BPN’的氨基酸序列的位置。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的變體，其中親本枯草桿菌酶屬于I-S1亞組。
5.根據(jù)權(quán)利要求1-3中任意一項所述的變體，其中親本枯草桿菌酶屬于I-S2亞組，且其中親本優(yōu)選地為BLSAVI(Savinase_)。
6.編碼如權(quán)利要求1-5之任一項所定義的枯草桿菌酶變體的經(jīng)分離DNA序列。
7.包含權(quán)利要求6的經(jīng)分離DNA序列的表達(dá)載體。
8.用權(quán)利要求7的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化的微生物宿主細(xì)胞。
9.根據(jù)權(quán)利要求8的微生物宿主細(xì)胞，其為細(xì)菌，優(yōu)選地為芽孢桿菌，尤其為遲緩芽孢桿菌。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的微生物宿主細(xì)胞，其為真菌或酵母，優(yōu)選地為絲狀真菌，尤其為曲霉。
11.產(chǎn)生如權(quán)利要求1-5之任一項所定義的枯草桿菌酶變體的方法，其中將權(quán)利要求8-10之任一項的宿主在利于該變體表達(dá)和分泌的條件下培養(yǎng)，并回收該變體。
12.清潔或洗滌劑組合物，優(yōu)選地洗衣或洗盤組合物，其包含如權(quán)利要求1-5之任一項所定義的變體。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的組合物，其還包含纖維素酶、脂肪酶、淀粉酶、角質(zhì)酶、蛋白酶、半纖維素酶、酯酶、乳糖酶、糖淀粉酶(glycoamylase)、聚半乳糖醛酸酶、β-半乳糖苷酶、木素酶(ligninase)或它們的混合物。
14.如權(quán)利要求1-5之任一項定義的變體在洗衣和/或洗盤洗滌劑中的用途。
15.根據(jù)權(quán)利要求3的枯草桿菌酶變體，其中所述變體還包含一個或多個下列修飾K27R，*36D，S56P，N62D，V68A，N76D，S87N，G97N，S99SE，S101G，S103A，V104A，V104I，V104N，V104Y，S106A，H120D，H120N，N123S，G159D，Y167A，R170S，R170L，A194P，N204D，V205I，Q206E，L217D，N218S，N218D，M222S，M222A，T224S，A232V，K235L，Q236H，Q245R，N248D，N252K，T274A，S101G+V104N，S87N+S101G+V104N，K27R+V104Y+N123S+T274A，N76D+S103A+V104I，S99D+S101R+S103A+V104I+G160S，S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V199M+V205I+L217D，S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+A194P+V199M+V205I+L217D，S3T+V4I+S99D+S101R+S103A+V104I+G160S+V205I和N76D+V104A.
16.根據(jù)權(quán)利要求3的枯草桿菌酶變體，其包含下列替代S101G+S103A+V104I+G159D+A232V+Q236H+Q245R+N248D+N252K.
全文摘要
本發(fā)明涉及在一種或多種特性上與親本枯草桿菌酶不同的新枯草桿菌酶變體，所述特性包括洗滌性能、熱穩(wěn)定性、儲藏穩(wěn)定性或催化活性。本發(fā)明的變體適用于例如清潔或洗滌劑組合物，如洗衣洗滌劑組合物和洗盤組合物，包括自動洗盤組合物中。
文檔編號C12N9/54GK1711354SQ200380102792
公開日2005年12月21日 申請日期2003年11月5日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月6日
發(fā)明者H·德萊格伯格, P·K·漢森, M·E·約恩瓦德, M·內(nèi)勒高-馬森, M·米克爾森 申請人:諾和酶股份有限公司