專利名稱：表達載體、異源基因產(chǎn)物的制備方法以及高產(chǎn)重組細胞的選擇方法
技術領域：
本發(fā)明涉及高產(chǎn)重組細胞的選擇方法，制備異源基因產(chǎn)物和表達載體的方法，以及以其轉(zhuǎn)染的、可在這一方法中使用的宿主細胞。
發(fā)明的
背景技術：
哺乳動物細胞是用來生產(chǎn)復雜的生物藥學蛋白質(zhì)的優(yōu)選的宿主細胞，因為其在翻譯后進行的修飾，不僅在功能上也在藥物動力學上可與人類相容。在商業(yè)上相關的細胞類型是雜交瘤、骨髓瘤，CHO(中國倉鼠卵巢)細胞和BHK(幼倉鼠腎臟)細胞。越來越多地在無血清和不含蛋白質(zhì)的生產(chǎn)條件下進行宿主細胞的培養(yǎng)。其理由是與此相關的成本降低、在純化重組蛋白質(zhì)上的干擾減少，并降低導入病原(例如朊蛋白、病毒)的可能。應用CHO細胞作為宿主細胞變得更廣泛，是因為這一細胞適應在不含血清和蛋白質(zhì)的培養(yǎng)基中懸浮生長，并亦為管理當局視為和接受作為安全的生產(chǎn)細胞。
為了生產(chǎn)表達目的異源基因的穩(wěn)定哺乳動物細胞系，通常通過轉(zhuǎn)染，將異源基因連同可選擇標記基因，例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶一起，引入所需的細胞系內(nèi)。異源基因和可選擇的標記基因可與此同時或者由一個單一載體一起表達，或由共轉(zhuǎn)染的各自分開的載體表達。在轉(zhuǎn)染之后2至3天，將細胞移至含有選擇試劑，例如在使用新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶基因時為G418的培養(yǎng)基中，并在這一選擇條件下培養(yǎng)數(shù)周。然后可分離出現(xiàn)的具抗性的細胞，并研究所需的基因產(chǎn)物的表達。由于在宿主細胞基因組內(nèi)隨機且不定向的整合，得到細胞群體，所述細胞群體呈現(xiàn)異源基因的完全不同表達率。這些亦可為非表達的細胞，所述細胞雖表達選擇標記，但不表達目的基因。為了鑒定呈現(xiàn)異源目的基因極高表達的細胞克隆，因此必須檢查并測試大量的克隆，這導致高時間、勞力和成本花費。
基因擴增是在動物細胞培養(yǎng)中很普及的現(xiàn)象，用來生產(chǎn)重組的生物藥學蛋白質(zhì)。基因擴增顯著改善了許多哺乳動物細胞株原本相對低的產(chǎn)率。一種廣泛使用的擴增技術是以二氫葉酸還原酶(DHFR)為基礎的基因擴增系統(tǒng)，所述系統(tǒng)常常使用在DHFR-缺陷的中國倉鼠卵巢(CHO)細胞中，在此利用適當?shù)妮d體系統(tǒng)，所述載體系統(tǒng)編碼DHFR和目的蛋白質(zhì)，轉(zhuǎn)染DHFR-缺陷的CHO細胞，例如CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)或CHO-DG44(Urlaubet al 1983)。然后在無甘氨酸、次黃嘌呤和胸苷的培養(yǎng)基中選擇轉(zhuǎn)染子。藉著逐漸增加地加入氨甲蝶呤(MTX)，一種二氫葉酸還原酶的抑制劑(Kaufmanet al 1982；US 4,656,134)，達成擴增以及因此而達到的高產(chǎn)細胞系的建立。所獲得的高產(chǎn)細胞的后續(xù)篩選，亦服從隨機原則并以或然性為基礎，因此該篩選步驟是高度勞力密集的，并耗費時間。
為了更好和更迅速地監(jiān)視基因轉(zhuǎn)化和表達，已經(jīng)發(fā)展出各種各樣的方法。這首先包括使用報告分子，如氯霉素-乙酰轉(zhuǎn)移酶、蟲熒光素酶、β-半乳糖苷酶，或使用含有β-半乳糖苷酶或蟲熒光素酶的編碼區(qū)的融合蛋白質(zhì)?？墒沁@些相應的報告基因測定的缺點是細胞必須被固定或裂解，且必須與外源添加的物質(zhì)和輔因子一起孵育。因此，根本不可能對已分析的細胞進一步培養(yǎng)。一種新方法是以大腸桿菌酶β-半乳糖苷酶的共表達為基礎，雖然借助FACS裝置容許對活細胞進行揀選(Nolan等人，1988)但需要低滲的預先處理，以便將產(chǎn)熒光物質(zhì)裝載于細胞中。這一活性在以FACS-為基礎的分揀之前，肯定亦已經(jīng)受到抑制。
藉著得自維多利亞水母(Aequorea victoria)的綠色熒光蛋白(GFP)的引入，以及從其發(fā)展出的GFP突變體作為報告分子，使表達異源基因的細胞的鑒定變得更容易。GFP的共表達，容許在活體內(nèi)即時分析，并以其熒光為基礎，揀選轉(zhuǎn)染子，不需要額外的物質(zhì)或輔-因子。已經(jīng)在各種出版物中，描述使用GFP作為報告分子來監(jiān)視基因轉(zhuǎn)移。在美國專利5,491,084和6,146,826中，Chalfie等人描述了選擇表達目的蛋白質(zhì)的細胞的方法。該方法包括用含有目的蛋白質(zhì)的編碼序列的DNA分子，以及編碼GFP-基因的第二個DNA分子，共同轉(zhuǎn)染細胞。然后選擇表達GFP的細胞。Gubin etal(1997)研究了在缺乏選擇性生長條件下，GFP表達在CHO細胞中的穩(wěn)定性。以既含有GFP也含有新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的質(zhì)粒轉(zhuǎn)染細胞。Mosser etal(1997)使用含有雙順反子表達盒的質(zhì)粒，其編碼GFP和目標基因(亦稱為目的基因)，來鑒定和選擇表達可誘導產(chǎn)物的細胞。該目標基因是在可調(diào)節(jié)的啟動子的控制之下。使用病毒IRES(內(nèi)部核糖體進入位點)元件，達到GFP和目標基因表達的偶聯(lián)，結果編碼GFP和目的蛋白質(zhì)的雙順反子mRNA被表達。在此所使用的質(zhì)粒本身不含任何可選擇標記基因。因此，藉著第二個質(zhì)粒在共轉(zhuǎn)染或后續(xù)的轉(zhuǎn)染中將其導入。相反的，Levenson等人(1998)使用帶有雙順反子表達盒的逆轉(zhuǎn)錄病毒載體，其中可將目的基因克隆到IRES序列之前。在IRES序列之后的序列相反編碼可選擇標記基因，這或者是賦與對G418、嘌呤霉素、潮霉素B、組氨醇D或腐草霉素抗藥性的標記，或者是GFP。
業(yè)已描述含有得自小RNA病毒科的IRES元件的載體，該IRES元件被置于產(chǎn)物基因和可選擇標記基因之間(Pelletier等人，1988；Jang等人，1989；Davies等人，1992)。
亦已經(jīng)成功地將GFP與抗性標記基因融合。例如，Bennett等人(1998)描述GFP/里歐霉素(zeomycin)融合蛋白質(zhì)。成功地使用該雙重功能的選擇標記，鑒定并選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)染的哺乳動物細胞。相反Primig等人(1998)使用GFP和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的融合蛋白質(zhì)，進行其增強子的研究。
在Meng等人(2000)的公開和國際專利申請WO 01/04306中，使用一種表達系統(tǒng)，在所述表達系統(tǒng)中使目的基因與得自單一載體的可擴增選擇標記基因DHFR和GFP基因一起表達，以選擇和鑒定高度表達重組蛋白質(zhì)的細胞。將這三個基因混合在一個轉(zhuǎn)錄單位中，或分開在兩個單位中。所有三個基因在一個單一表達載體中的這一空間和轉(zhuǎn)錄上的聯(lián)系使得其在選擇壓力下共擴增的概率提高，并因此鑒定和選擇高產(chǎn)克隆。最佳克隆以最多3-4.5pg/細胞·天的數(shù)量級表達目的蛋白，所述最佳克隆通過使用可用重組選擇試劑擴增的DHFR選擇標記和以GFP為基礎的FACS揀選加以分離。在此利用貼壁細胞并在含有血清的培養(yǎng)基中進行實驗，即利用眾所周知的實質(zhì)上較強的、且其特征在于較高基礎產(chǎn)率的細胞和條件。
發(fā)明概述因此，本發(fā)明的任務是為具有提高的產(chǎn)率的重組細胞發(fā)展選擇系統(tǒng)，其滿足下列的需求(1)縮短發(fā)展高產(chǎn)細胞以制備生物藥學蛋白質(zhì)所花費的時間，同時降低發(fā)展成本；(2)以較少容量花費和以高輸出量選擇高產(chǎn)細胞；
(3)使用“發(fā)酵強健的”高產(chǎn)細胞，其例如在增加氨甲蝶呤濃度時顯示出對生長有較低的損害；(4)轉(zhuǎn)染、選擇和培養(yǎng)適應懸浮液的細胞，優(yōu)選在不含血清的培養(yǎng)基中；(5)減少所需的基因擴增步驟。
本發(fā)明更進一步的任務是提供表達載體和以其轉(zhuǎn)染的宿主細胞，其可用在該克隆選擇系統(tǒng)中，以及使用這一宿主細胞制備異源基因產(chǎn)物的方法。
根據(jù)本發(fā)明的一個方面，借助編碼目的蛋白質(zhì)的基因(在后文中亦稱為“目的基因”)的表達載體，解決了這一任務，所述基因與倉鼠泛素/S27a啟動子和編碼熒光蛋白質(zhì)的基因功能性連接。
表達載體優(yōu)選亦含有可擴增的選擇標記基因，例如二氫葉酸還原酶(DHFR)基因。優(yōu)選的表達載體亦含有其他的調(diào)節(jié)元件，例如在功能上與啟動子連接的增強子。此外，表達載體優(yōu)選亦含有內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，其容許編碼熒光蛋白質(zhì)的基因和目的基因的雙順反子表達。
本發(fā)明亦關于基礎載體，其具有多克隆位點以取代目的基因，以摻入這些基因之一，也就是說一個具有多個限制性內(nèi)切酶切割位點的序列區(qū)域。
本發(fā)明的另一方面，是關于已經(jīng)利用一種所提及的表達載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞。這些為真核宿主細胞，優(yōu)選哺乳動物細胞，其中嚙齒動物細胞，如倉鼠細胞，和尤其是CHO細胞或BHK細胞為特別優(yōu)選。
本發(fā)明的另一方面，是制備異源基因產(chǎn)物的方法，其中在容許該基因產(chǎn)物表達的條件下，培養(yǎng)以根據(jù)本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞，并從培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中分離該基因產(chǎn)物。
在本發(fā)明一個特定的具體實施例中，以根據(jù)本發(fā)明的表達載體，并額外地以一個或多個帶有編碼一個或多個其他目的蛋白質(zhì)的基因的載體，轉(zhuǎn)染，優(yōu)選是共轉(zhuǎn)染宿主細胞。
在該關系中，本發(fā)明提供制備異二聚體蛋白質(zhì)以加以利用的方法，其中在容許該異二聚體蛋白質(zhì)表達的條件下，培養(yǎng)這類型的宿主細胞，所述宿主細胞已經(jīng)利用編碼該異二聚體蛋白質(zhì)的不同亞單位的表達載體共轉(zhuǎn)染，并從培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中分離該異二聚體蛋白質(zhì)。這類方法的一個特殊應用情況是生產(chǎn)抗體及其亞單位。
本發(fā)明的另一方面是關于選擇表達目的蛋白質(zhì)的宿主細胞的方法，其中在容許該目的蛋白質(zhì)和熒光蛋白質(zhì)表達的條件下，培養(yǎng)已經(jīng)以根據(jù)本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞群體，并鑒定和選擇顯示出熒光蛋白質(zhì)的最高表達率的細胞或多個細胞。優(yōu)選是使用熒光-激活的細胞分揀器(FACS)進行選擇。
驚人的是，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用根據(jù)本發(fā)明制備的系統(tǒng)，有可能在最短的時間中分離細胞集合體，其表達超過15微微克(單鏈蛋白質(zhì))或10微微克(人源化抗體)重組蛋白質(zhì)/細胞·天的平均特異性產(chǎn)率，而不需基因擴增的步驟。藉著單一的以DHFR-為基礎的基因擴增步驟，可使該特異性產(chǎn)率增加至每個細胞每天30微微克以上。如此在細胞集合體中達到的生產(chǎn)力，比迄今已公開的最佳細胞克隆的最大產(chǎn)率還要高8至10的因數(shù)。
驚人的是，在目的蛋白質(zhì)的表達與熒光蛋白質(zhì)表達之間，亦有極佳的關連。這甚至適于共轉(zhuǎn)染，若如在表達抗體的例子中兩個免疫球蛋白鏈分別藉其自己的載體表達，并在FACS揀選中依賴于其與熒光蛋白質(zhì)在轉(zhuǎn)錄上的偶聯(lián)，可僅對一個鏈的表達進行選擇。盡管如此，熒光蛋白質(zhì)的高表達率，對于細胞的生長和活力沒有任何負面的影響。此外，與傳統(tǒng)的逐步進行的基因擴增策略相比較，亦可降低選擇高產(chǎn)細胞的發(fā)展時間至少一半，結果明顯地降低了發(fā)展效能和成本。


圖1顯示以重組細胞克隆所獲得的表達水平的比較，其中在CMV啟動子的控制之下，或在倉鼠泛素/S27a啟動子的控制之下，表達異源基因產(chǎn)物。兩個啟動子在功能上連接CMV增強子，中止序列，BGH多聚A，在每個情況中是相同的。在CMV1的情況中，表達載體是以pcDNA3-為基礎的(Invitrogen，Kalsruhe，DE)，在CMV2中，其為以pBluescript-為基礎的表達載體(Stratagene，La Jolla，CA，US)，而在CHO的情況中，其為以pAD-CMV-為基礎的表達載體(Werner等人，1998)。通過溶酶體酶的表達，所有的表達載體均含有可擴增的選擇標記二氫葉酸還原酶(DHFR)，并藉著后續(xù)的擴增步驟，利用氨蝶呤(MTX)增加異源基因的表達。為了表達抗體(Ab)的兩條鏈，利用第二個含有作為選擇標記的新霉素-抗性基因的載體進行共轉(zhuǎn)染。以相對于以CMV啟動子為基礎的表達來提供所得的效價或特異性產(chǎn)率，將其設定為1(CMV1為酶，CMV2為抗體)。
圖2顯示用來在CHO-DG44細胞中表達重組蛋白質(zhì)的基礎載體的示意性制備“P/E”為CMV增強子和倉鼠-泛素/S27a啟動子的組合，僅有“P”代表啟動子元件，而“T”為轉(zhuǎn)錄的中止信號，其為經(jīng)過轉(zhuǎn)錄的mRNA的聚腺苷酸化所必需。以箭頭指出每個轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)部轉(zhuǎn)錄起始的位置和方向。為了克隆異源基因，在啟動子元件之后插入具有多個核酸內(nèi)切限制酶的切割位點的序列區(qū)(多克隆位點-mcs)。將可擴增的選擇標記二氫葉酸還原酶縮寫為“dhfr”，并將選擇標記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶縮寫為“neo”。腦心肌炎病毒來源的IRES元件，在雙順反子轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)部擔任內(nèi)部核糖體進入位點，并容許后面的綠熒光蛋白質(zhì)“GFP”的翻譯。
圖3顯示真核生物表達載體的示意性制備，其分別編碼生物藥學蛋白質(zhì)，并被用來轉(zhuǎn)染CHO-DG44細胞。“P/E”為CMV增強子和倉鼠-泛素/S27a啟動子的組合，僅有“P”代表啟動子元件，而“T”為轉(zhuǎn)錄的中止信號，其為經(jīng)過轉(zhuǎn)錄的mRNA的聚腺苷酸化所必需。以箭頭指出每個轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)部轉(zhuǎn)錄起始的位置和方向。將可擴增的選擇標記二氫葉酸還原酶縮寫為“dhfr”，并將選擇標記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶縮寫為“neo”。腦心肌炎病毒來源的IRES元件，在雙順反子轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)部擔任內(nèi)部核糖體進入位點，并容許后面的綠熒光蛋白質(zhì)“GFP”的翻譯?！皊ICAM”編碼可溶性細胞內(nèi)粘附分子(US5,412,216)，而“F19HC”和“F19LC”分別編碼人源化抗體F19的重或輕鏈(EP953 639)。
圖4顯示在sICAM產(chǎn)率和GFP熒光之間的關連，采用細胞集合體ZB1作為實例。該細胞集合是獲自利用載體pBIDG-sICAM的轉(zhuǎn)染，其中通過雙順反子轉(zhuǎn)錄單位一起表達治療性蛋白質(zhì)sICAM和GFP。對該集合體進行連續(xù)的以GFP為基礎的FACS分揀。在每個分揀步驟(挑選)之后，藉著ELISA判定在集合體的細胞培養(yǎng)上清液中的sICAMs濃度，并計算每個細胞每天的特異性產(chǎn)率(微微克/細胞*天)。每個資料點表示至少三個培養(yǎng)傳代的平均值?？偣策M行六次挑選。
圖5顯示藉著以GFP為基礎的FACS分揀，分離高表達的sICAM細胞，采用細胞集合體ZB1作為實例。該細胞集合體是獲自利用載體pBIDG-sICAM的轉(zhuǎn)染，其中通過雙順反子轉(zhuǎn)錄單位一起表達治療性蛋白質(zhì)sICAM和GFP。對集合體進行連續(xù)的以GFP為基礎的FACS分揀。在每次挑選之后，藉著ELISA判定在集合體的細胞培養(yǎng)上清液中的sICAMs濃度，并計算每個細胞每天的特異性產(chǎn)率(微微克/細胞*天)。每個資料點代表至少三個培養(yǎng)傳代的平均值。總共進行六次挑選。
圖6顯示藉著將以GFP為基礎的選擇與MTX擴增步驟相聯(lián)合，所達成的在sICAM產(chǎn)率上的增加，采用細胞集合體ZB1作為實例。該細胞集合體，獲自利用載體pBIDG-sICAM的轉(zhuǎn)染，并進行連續(xù)的以GFP為基礎的FACS分揀。在第四次挑選或第六次挑選之后，藉著在培養(yǎng)基中加入氨甲蝶呤(MTX)(5nM，50nM，500nM或2μM MTX)，進行DHFR介導的基因擴增。藉著ELISA判定在集合體的細胞培養(yǎng)上清液中的sICAMs濃度，并計算每個細胞每天的特異性產(chǎn)率(微微克/細胞*天)。每個資料點代表至少三個培養(yǎng)傳代的平均值。
圖7顯示在培養(yǎng)基中加入不同高劑量的氨甲蝶呤之后，細胞集合體的存活模式。對藉著利用載體pBIDG-sICAM(圖3)的轉(zhuǎn)染而獲得的細胞集合體ZB1進行連續(xù)的以GFP為基礎的FACS分揀。在第四次挑選或第六次挑選之后，藉著在培養(yǎng)基中加入氨甲蝶呤(MTX)，進行DHFR介導的基因擴增。在選擇期期間，藉著以錐蟲藍染色，判定細胞數(shù)目和存活并在許多天內(nèi)監(jiān)視培養(yǎng)(dic)。
圖8顯示在抗體產(chǎn)率(單克隆抗體F19)和GFP熒光之間的關連，采用細胞集合體ZB1作為實例。該細胞集合體，獲自利用載體組合pBIDG-F19HC和pBIN-F19LC(圖3)的轉(zhuǎn)染。對該集合體進行連續(xù)的以GFP為基礎的FACS分揀。在每次挑選之后，藉著ELISA判定在集合體的細胞培養(yǎng)上清液中抗體F19的濃度，并計算每個細胞每天的特異性產(chǎn)率(微微克/細胞*天)。每個資料點代表至少三個培養(yǎng)傳代的平均值。總共進行六次挑選。
圖9顯示藉著以GFP為基礎的選擇，使用FACS，分離高表達的單克隆抗體F19細胞集合，采用細胞集合體ZB1作為實例。對藉著以載體pBIDG-F19HC和pBIN-F19LC(圖3)轉(zhuǎn)染而獲得的該細胞集合體進行連續(xù)的以GFP為基礎的FACS分揀。在每次挑選之后，藉著ELISA判定在集合體的細胞培養(yǎng)上清液中抗體F19的濃度，并計算每個細胞每天的特異性產(chǎn)率(微微克/細胞*天)。每個資料點代表至少三個培養(yǎng)傳代的平均值。
發(fā)明和優(yōu)選實施方式的具體描述根據(jù)本發(fā)明的表達載體含有編碼目的蛋白質(zhì)的基因(“目的基因”)，所述基因在功能上與倉鼠泛素/S27a啟動子、以及編碼熒光蛋白質(zhì)的基因連接。該表達載體優(yōu)選亦含有可擴增的選擇標記基因。
倉鼠-泛素/S27a啟動子倉鼠的泛素/S27a啟動子是強有力的同源啟動子，在WO 97/15664中描述。這類啟動子具有優(yōu)選至少下列的特征之一富含GC的序列區(qū)、Sp1結合位點、聚嘧啶元件、缺乏TATA盒子。特別優(yōu)選的是具有Sp1結合位點但缺乏TATA盒子的啟動子。此外優(yōu)選的組成型激活的啟動子，且特別是在含有血清、低血清和不含血清培養(yǎng)條件下同樣地具有活性的啟動子。在另一個具體實施例中，它是可誘導的啟動子，特別是由移除血清而激活的啟動子。
特別有利的實施方式是具有在WO 97/15664的圖5中所含有的核苷酸序列的啟動子。特別優(yōu)選的在此是含有得自圖5的位置-161至-45的序列的啟動子。
在本發(fā)明說明書的實例中使用的啟動子，分別含有具有從附錄的序列表的SEQ ID NO1的位置1923至2406的序列的DNA分子。該序列相當于得自WO 97/15664的圖5的片段-372至+111，并代表優(yōu)選的啟動子，即優(yōu)選啟動子應包括這一序列區(qū)。另一適當?shù)膯幼悠魏形恢?134至2406的序列(相當于WO 97/15664的圖5中的-161至+111)。僅含有位置2251至2406的序列的啟動子不再具有功能(相當于WO 97/15664的圖5中位置-45至+111)。有可能在5′方向從位置2143開始延長啟動子序列。
亦可能使用完整倉鼠泛素/S27a啟動子序列的功能亞片段，以及完整序列或其亞片段的功能性突變體變體，其藉著例如取代、插入或刪除而加以修飾。在后文中亦將相應的亞片段、突變體或變體稱為“經(jīng)過修飾的啟動子”。
經(jīng)過修飾的啟動子，所述啟動子優(yōu)選與其他調(diào)節(jié)元件組合，優(yōu)選具有轉(zhuǎn)錄活性，其相應于在SEQ ID NO1中提供的核苷酸序列位置1923至2406的啟動子片段WO 97/15664的圖5的-372至+111)。經(jīng)過修改的啟動子被發(fā)現(xiàn)在本發(fā)明的意義上是有用的，若其在比較性報告基因測定中具有轉(zhuǎn)錄活性，該活性為1923至2406片段(-372至+111片段)的至少50％，優(yōu)選的是至少80％，更佳的是至少90％，而更優(yōu)選的是至少100％。特別優(yōu)選的是經(jīng)過修飾的啟動子，其對倉鼠泛素/S27a啟動子的野生型序列SEQ ID NO1具有至少80％，優(yōu)選的是至少85％，優(yōu)選的是至少90％，再優(yōu)選的是至少95％，而特別優(yōu)選的是至少97％的最低序列同源性，并在比較性報告基因測定中具有相應的啟動子活性。
在相對應的比較性報告基因測定中，欲測試的啟動子片段包括克隆到各自位于無啟動子的報告基因之前的參考序列，該報告基因編碼例如蟲熒光素酶、分泌性堿性磷酸酶或綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)。隨后藉著轉(zhuǎn)染，將這一構建體(啟動子序列+報告基因)導入受試細胞，例如CHO-DG44內(nèi)，并藉著測量報告基因的蛋白質(zhì)內(nèi)含量，判定由各自的啟動子片段誘導的報告基因表達。在例如Ausubel等人，Current Protocols in Molecular Biology，1994，更新版中示例性的也有相應的測試。
倉鼠泛素/S27a啟動子的啟動子序列和經(jīng)過修飾的啟動子，其亦可包括例如5′非翻譯區(qū)或其從中選出的片段，以及泛素/S27a基因或其選出的片段的編碼區(qū)，可由本領域技術人員從對WO 97/15664中描述的序列的認識中使用例如在Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994中描述的各種標準方法獲得。例如，可從在WO 97/15664中描述的序列開始，選擇適當?shù)钠?，并以化學方式合成含有該片段的序列的寡核苷酸探針。例如，可使用這類探針，例如藉著雜交作用從倉鼠基因組文庫中克隆泛素/S27a基因或其5′非翻譯區(qū)或其他片段。使用上述的報告基因測定，本領域技術人員不需費很大力氣便可鑒定具有啟動子活性的片段，并用于本發(fā)明的目的。可藉著PCR擴增利用得自基因組DNA或基因組文庫的相應引物，輕易地獲得5′非翻譯區(qū)或其特異性片段。亦可藉著限制性核酸外切酶III消化，從較大的DNA片段中獲得5′非翻譯區(qū)的片段。亦可以化學方式合成這類DNA分子，或藉著連接從以化學方式合成的片段中生產(chǎn)。
可藉著“位點特異的突變生成作用”及/或“以PCR為基礎的突變生成技術”，生產(chǎn)缺失、插入和取代突變體。在例如Lottspeich和Zorbas 1998第36.1章中以及進一步的參考文件中提及相當?shù)姆椒ā?br> 藉著利用得自倉鼠泛素/S27a基因的5′非翻譯區(qū)或得自倉鼠泛素/S27a基因的S27a部分的探針的交叉-雜交作用，亦可能從其他，優(yōu)選是哺乳動物的相應的同源基因中，鑒定和分離適當?shù)膯幼有蛄?。在例如Lottspeich和Zorbas 1998第23章中描述了相應的技術。為了本發(fā)明的目的，“同源性”為這樣的基因，若基因的核苷酸序列對與該基因的核苷酸序列顯露出至少70％，優(yōu)選的是至少80％，優(yōu)選的是至少90％，再優(yōu)選的是至少95％，且特別優(yōu)選的是至少97％的一致性，則該基因是“同源的”。
目的基因在根據(jù)本發(fā)明的表達載體中所含有的目的基因，包括編碼目的產(chǎn)物的任何長度的核苷酸序列?；虍a(chǎn)物或“目的產(chǎn)物”通常是蛋白質(zhì)、多肽、肽或其片段或衍生物。然而，它亦可以是RNA或反義RNA。目的基因可以其全長、縮短的形式，作為融合基因或被標示的基因存在。它可以是基因組DNA，或優(yōu)選是cDNA或相應的片段或融合。目的基因可以是天然的基因序列，或可以是突變或以其它方式修飾的。這類修飾包括適應確定的宿主細胞的密碼子最優(yōu)化和人源化作用。目的基因，可編碼分泌性、細胞質(zhì)的、位在核中、與膜結合或與細胞表面結合的多肽。
“核苷酸序列”或“核酸序列”一詞代表寡核苷酸、核苷酸、多核苷酸及其片段，以及基因組或合成來源的DNA或RNA，其以單或雙鏈存在，并可代表基因的編碼或非編碼鏈?？墒褂脴藴始夹g，如位點特異的突變生成或PCR介導的突變生成作用(例如在Sambrook等人，1989或Ausubel等人，1994中描述的)，來修飾核酸序列。
“編碼”意指在核酸中特定序列的核苷酸的特性或性能，例如在染色體或mPNA中的基因，在生物過程中作為基質(zhì)，用來合成其他的聚合物和大分子，例如rRNA、tRNA、mRNA、其他的RNA分子、cDNA或多肽。因此，若藉著mRNA的轉(zhuǎn)錄和后續(xù)的翻譯，在細胞或其他生物系統(tǒng)中生產(chǎn)所需的蛋白質(zhì)，則基因編碼蛋白質(zhì)?？蓪⑵浜塑账嵝蛄信cmRNA序列相同，且正常亦在序列數(shù)據(jù)庫，例如EMBL或GenBank中提供的編碼鏈，還有作為轉(zhuǎn)錄基質(zhì)的基因非編碼鏈或cDNA兩者，稱為用來編碼產(chǎn)物或蛋白質(zhì)。編碼蛋白質(zhì)的核酸，亦包括以簡并遺傳密碼為基礎，具有不同核苷酸序列順序，但結果產(chǎn)生蛋白質(zhì)的相同氨基酸序列的核酸。編碼蛋白質(zhì)的核酸序列亦可含有內(nèi)含子。
“cDNA”一詞代表脫氧核糖核酸，藉著逆轉(zhuǎn)錄，并由基因產(chǎn)生的mRNA或其他RNA合成第二DNA鏈來制備。若cDNA以雙鏈DNA分子的形式出現(xiàn)，其含有編碼和非編碼鏈兩者。
“內(nèi)含子”一詞代表任何長度的非編碼核苷酸序列。它們天然出現(xiàn)在許多真核生物基因中，并藉著稱為拼接的過程，從先前轉(zhuǎn)錄的mRNA前體中移除。這需要在5′和3′端精確地切掉內(nèi)含子，并正確地連接所得的mRNA末端，而得以產(chǎn)生成熟加工的mRNA，具有可供成功地合成蛋白質(zhì)的正確的閱讀框架。許多涉及該拼接過程的拼接供體和拼接受體位點，即直接位在外顯子-內(nèi)含子或內(nèi)含子-外顯子鄰接處的序列，已經(jīng)被表征。關于總論，參見Ohshima等人，1987。
目的蛋白質(zhì)具有生物藥學重要性的蛋白質(zhì)/多肽，包括例如抗體、酶、細胞因子、淋巴因子、粘附分子、受體及其衍生物或片段，但不限于此。通常，所有作為激動劑或拮抗劑，并/或具有治療或診斷用途的多肽均是有價值的。
“多肽”一詞用于氨基酸序列或蛋白質(zhì)，并意指任何長度的氨基酸的聚合物。該詞亦包括在翻譯后，藉著像糖基化作用、磷酸化作用、乙?；饔没虻鞍踪|(zhì)加工的反應修飾的蛋白質(zhì)。可藉著例如取代、缺失或插入氨基酸，以及與其他蛋白質(zhì)融合，同時仍保留其生物活性，來修飾多肽的結構。
治療性蛋白質(zhì)的實例為胰島素、胰島素樣生長因子、人生長激素(hGH)和其他生長因子、組織纖溶酶原激活物(tPA)、紅細胞生成素(EPO)、細胞因子，例如介白素(IL)，如IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-12、IL-13、IL-14、IL-15、IL-16、IL-17、IL-18，干擾素(IFN)-α、-β、-γ、-ω或-τ、腫瘤壞死因子(TNF)，如TNF-α、β或-γ、TRAIL、G-CSF、GM-CSF、M-CSF、MCP-1和VEGF。其他的實例為單克隆、多克隆、多特異性和單鏈抗體，及其片段，像是例如Fab、Fab′、F(ab′)2、Fc和Fc′片段、輕(L)和重(H)免疫球蛋白鏈，及其恒定、可變或高變區(qū)，以及Fv和Fd片段(Chamov等人，1999)。該抗體可以是人類或非人類來源的。人源化和嵌合型抗體亦是可能的。
Fab片段(抗原結合片段＝Fab)由兩個鏈的可變區(qū)組成，其藉著相鄰的恒定區(qū)維持在一起。它們例如可藉著以蛋白酶處理，如木瓜蛋白酶，從傳統(tǒng)的抗體中或藉著DNA克隆產(chǎn)生。其他抗體片段為F(ab′)2片段，其可藉著利用胃蛋白酶的蛋白水解消化產(chǎn)生。
亦可能藉著基因克隆，制備截短的抗體片段，其僅由重(VH)和輕鏈(VL)的可變區(qū)組成。其被稱為Fv片段(可變片段＝可變部分的片段)。因為在這些Fv片段中，不可能經(jīng)由恒定鏈的半胱氨酸基團共價結合，通常藉著一些其他的方法使Fv片段穩(wěn)定。為了該目的，通常藉著大約10至30個氨基酸，特別優(yōu)選是15個氨基酸的短肽片段，將重和輕鏈的可變區(qū)連接在一起。這產(chǎn)生其中VH和VL藉著肽接頭連接在一起的單多肽鏈。亦將這類抗體片段稱為單鏈Fv片段(scFv)。scFv抗體的實例是已知并已被描述的，參照，例如Huston等人，1988。
近年來，已經(jīng)發(fā)展出各種生產(chǎn)多聚體scFv衍生物的策略。意圖是生產(chǎn)具有改良的藥物動力學特性，開增加結合的抗體親抗原性的重組抗體。為了達到scFv片段的多聚化作用(Multimerisierung)，可以帶有多聚化結構域的融合蛋白質(zhì)的形式生產(chǎn)它們。多聚作用結構域可以是例如IgG的CH3區(qū)或螺旋結構(“卷曲螺旋結構”)，如亮氨酸-拉鏈結構域。在另一策略中，使用在scFv片段的VH和VL區(qū)之間的交互作用來進行多聚化作用(例如微型雙功能抗體(diabodies)、微型三功能抗體(tribodies)和微型五功能抗體(pentabodies))。
本領域技術人員使用“微型雙功能抗體”一詞，代表二價的同型二聚體scFv衍生物。在scFv分子中將肽接頭縮短至5-10個氨基酸，結果藉著使VH/VL鏈重疊，形成同型二聚體。還可藉著插入二硫橋，使微型雙功能抗體更穩(wěn)定?？稍诶鏟erisic等人，1994的文獻中找到微型雙功能抗體的實例。
本領域技術人員使用“微抗體”(minibody)，代表二價的同型二聚體scFv衍生物。它由融合蛋白質(zhì)組成，其含有作為二聚化作用區(qū)的免疫球蛋白，優(yōu)選的是IgG，特別優(yōu)選是IgG1的CH3區(qū)。這藉著亦屬于IgG的鉸鏈區(qū)，和接頭區(qū)與scFv片段連接。由Hu等人，1996描述了這類微抗體的實例。
本領域技術人員使用“微型三功能抗體”，代表三價的同型三聚體scFv衍生物(Kortt等人，1997)。VH-VL的直接融合不需使用接頭序列，導致三聚體的形成。
本領域技術人員稱為小抗體(mini antibody)的片段，其具有二-、三-或四價的結構，亦為scFv片段的衍生物。藉著二-、三-或四聚體的“卷曲螺旋”結構，達成多聚化作用(Pack等人，1993和1995；Lovejoy等人，1993)。
編碼熒光蛋白質(zhì)的基因根據(jù)本發(fā)明的表達載體含有編碼熒光蛋白質(zhì)的基因，在功能上與目的基因連接，并在倉鼠-泛素/S27a啟動子、經(jīng)過修飾的倉鼠-泛素/S27a啟動子或其同系物的控制之下。
熒光蛋白質(zhì)可以是例如綠、藍綠色、藍色、黃色或其他顏色的熒光蛋白質(zhì)。一個特定的實例為獲自維多利亞水母或腎形水母(Renilla reniformis)的綠熒光蛋白(GFP)，以及從其中發(fā)展出的突變體，參見例如Bennet等人，1998；Chalfie等人，1994；WO 01/04306及其中提及的文獻。
在WO 00/34318、WO 00/34326、WO 00/34526和WO 01/27150中描述了其他的熒光蛋白質(zhì)和編碼它們的基因，以引用的方式并入本文中。這些熒光蛋白質(zhì)是物種珊瑚綱(Anthozoa)，例如馬哈諾珊瑚(Anemonia majano)、羽珊瑚(Clavularia sp.)、鈕扣珊瑚(Zoanthus sp.)I、鈕扣珊瑚II、?？?Discosomastriata)、香菇珊瑚(Discosoma sp.)“紅色”、香菇珊瑚“綠色”、香菇珊瑚“紫紅色”、皺摺海葵(Anemonia sulcata)的非生物發(fā)光生物體的熒光團。
除了野外型蛋白質(zhì)之外，根據(jù)本發(fā)明使用的熒光蛋白質(zhì)亦包含天然或以遺傳技術制備的突變體和變體、其片段、衍生物或已經(jīng)例如與其他的蛋白質(zhì)或肽融合的變體。所使用的突變，例如可改變該蛋白質(zhì)的激發(fā)或發(fā)射光譜、發(fā)色團的形成、消光系數(shù)或穩(wěn)定性。此外，可藉著密碼子最優(yōu)化作用，改善在哺乳動物或其他物種中的表達。根據(jù)本發(fā)明，亦可使用與可選擇標記融合的熒光蛋白質(zhì)，優(yōu)選的是可擴增的選擇標記，如二氫葉酸還原酶(DHFR)。
熒光蛋白質(zhì)放出的熒光使得以檢測到該蛋白質(zhì)，例如藉著具有熒光激活細胞分揀器(FACS)的流式細胞計或藉著熒光顯微鏡。
其他調(diào)節(jié)元件可在功能上將倉鼠-泛素/S27a啟動子與其他調(diào)節(jié)序列聯(lián)合，以便增加/調(diào)節(jié)在表達盒中的轉(zhuǎn)錄活性。
例如，可在功能上將啟動子與增強子序列連接，以便增加轉(zhuǎn)錄活性。為了這個，可使用一或多個增強子及/或增強子序列的數(shù)個拷貝，例如CMV或SV40增強子。
“增強子”一詞代表多核苷酸序列，其以順式位置作用在啟動子的活性上，并因此刺激在功能上與該啟動子連結的基因的轉(zhuǎn)錄。不像啟動子，增強子的影響與位置和方位無關，并因此可將它們放在轉(zhuǎn)錄單位之前或之后，在內(nèi)含子內(nèi)，或甚至是在編碼區(qū)內(nèi)。增強子可緊鄰轉(zhuǎn)錄單位，并離啟動子一段相當遠的距離。亦可能與啟動子有物理及功能上的重疊。本領域技術人員知曉得自各種來源的許多增強子(并保藏在數(shù)據(jù)庫中，如GenBank，例如SV40增強子、CMV增強子、多瘤病毒增強子、腺病毒增強子)，可以獨立元件或克隆到多核苷酸序列內(nèi)的元件的形式獲得(例如保藏在ATCC，獲得自商業(yè)和工業(yè)來源)。許多啟動子序列亦含有增強子序列，如經(jīng)常使用的CMV啟動子。人CMV增強子是迄今鑒定的最強的增強子之一。一個可誘導的增強子的實例為金屬硫蛋白增強子，可藉著糖皮質(zhì)激素或重金屬刺激之。
其他可能的修飾是，例如多個Sp1結合位點的導入。啟動子序列亦可與調(diào)節(jié)序列聯(lián)合，所述調(diào)節(jié)序列容許轉(zhuǎn)錄活性的控制/調(diào)節(jié)。因此，可將啟動子制成可阻抑的/可誘導的。例如，可藉著將其與正-或負調(diào)節(jié)的轉(zhuǎn)錄因子的結合位點的序列連接，來進行的。上文提及的轉(zhuǎn)錄因子Sp1，例如對轉(zhuǎn)錄活性具有正面的影響。另一個實例為激活蛋白AP-1的結合位點，其可正面和負面地作用在轉(zhuǎn)錄上?？山逯S多種類的因子來控制AP-1的活性，例如生長因子、細胞因子和血清(Faisst等人，1992及其中的參考文獻)。亦可藉著經(jīng)由一、二、三或更多個堿基的突變(取代、插入或缺失)，改變啟動子序列，來增加轉(zhuǎn)錄效率，然后在報告基因測定中判定，這是否增加了啟動子活性。
基本上，額外的調(diào)節(jié)元件包括倉鼠-泛素/S27a啟動子以外的啟動子、增強子、中止和聚腺苷酸化信號，以及其他的表達控制元件。對各種細胞類型來說已知可誘導和在組成型調(diào)節(jié)序列。“轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件”通常包括在待表達的基因序列上游的啟動子、轉(zhuǎn)錄起始和中止位點，以及聚腺苷酸化信號。
“啟動子”一詞代表多核苷酸序列，其容許并控制在功能上與其連接的基因或序列的轉(zhuǎn)錄。啟動子含有為RNA聚合酶結合提供的識別序列，以及轉(zhuǎn)錄的起始位點(轉(zhuǎn)錄起始位點)。為了在某些細胞類型或宿主細胞中表達想要的序列，必須選擇適當?shù)墓δ苄詥幼印１绢I域技術人員熟悉得自各種來源的各種啟動子，包括在組成型的、可誘導的和可阻抑的啟動子。它們被保藏在數(shù)據(jù)庫中，例如GenBank，并可以個別的元件，或克隆到得自商業(yè)或工業(yè)來源的多核苷酸序列內(nèi)的元件的形式獲得。在可誘導的啟動子中，可對信號作出反應而降低或增加啟動子的活性。一個可誘導的啟動子的實例，是四環(huán)素(tet)啟動子。該啟動子含有四環(huán)素操縱子序列(tetO)，可藉著四環(huán)素-調(diào)節(jié)的反式激活蛋白質(zhì)(tTA)誘導它。當出現(xiàn)四環(huán)素時，抑制了tTA與tetO的結合。其他可誘導的啟動子的實例為jun、fos、金屬硫蛋白和熱休克啟動子(亦參見Sambrook等人，1989；Gossen等人，1994)。特別適合在真核生物中高度表達的啟動子，例如有SV40早期啟動子、腺病毒主要晚期啟動子、小鼠金屬硫蛋白-I啟動子、勞斯肉瘤病毒的長末端重復區(qū)和人類巨細胞病毒的早期啟動子。其他異源哺乳動物啟動子的實例，是肌動蛋白、免疫球蛋白或熱休克啟動子。
“轉(zhuǎn)錄起始位點”一詞意指在構建體中的核酸，其相當于與被摻入主要轉(zhuǎn)錄物，即mRNA前體的第一個核酸。轉(zhuǎn)錄起始位點可與啟動子序列重疊。
“轉(zhuǎn)錄中止位點”一詞意指正常在目的基因或待轉(zhuǎn)錄的基因段的3′端的核苷酸序列，且其引起RNA聚合酶的轉(zhuǎn)錄的中止。
“聚腺苷酸化信號”是一信號序列，在真核生物mRNA的3′端的特定位點，引起切開，并在轉(zhuǎn)錄后在被切開的3′端摻入大約100-200個腺嘌呤核苷酸(聚腺苷酸尾)。聚腺苷酸化信號包括在切開位點的大約10-30個核苷酸上游的序列AATAAA，以及位在下游的序列。已知各種聚腺苷酸化元件，如tk聚腺苷酸、SV40晚期和早期聚腺苷酸或BGH聚腺苷酸(在例如US5,122,458中描述)。
在本發(fā)明的一個優(yōu)選具體實施例中，每個轉(zhuǎn)錄單位均具有啟動子或啟動子/增強子元件、目的基因及/或標記基因，以及轉(zhuǎn)錄中止元件。在另一個優(yōu)選的具體實施例中，轉(zhuǎn)錄單位還含有翻譯調(diào)節(jié)單位。
“翻譯調(diào)節(jié)元件”對于每個待表達的多肽而言，包括翻譯起始位點(AUG)、中止密碼和聚腺苷酸信號。對于最佳表達，移除、添加或改變待表達的核酸序列的5′-及/或3′-非翻譯區(qū)，可能是明智的，以便排除任何可能不適當?shù)念~外翻譯起始密碼，或其他可能影響轉(zhuǎn)錄或表達水平的表達的序列。為了促進表達，可將核糖體共有結合位點另行插入緊接在起始密碼子的上游。為了產(chǎn)生分泌性多肽，通常目的基因含有信號序列，其編碼信號前體肽，將已經(jīng)合成的多肽運送至并通過ER膜。信號序列通常，但并非總是位在分泌性蛋白的氨基終端，并可在已經(jīng)將該蛋白質(zhì)插入ER膜之后，藉著信號肽酶切開?；蛐蛄型ǔ５灰欢ê兴约旱男盘栃蛄?。若天然的信號序列并未出現(xiàn)，則可以已知的方式，導入異源的信號序列。本領域技術人員知道該種類的許多信號序列，并保藏在序列數(shù)據(jù)庫中，如GenBank和EMBL。
根據(jù)本發(fā)明一個特別重要的調(diào)節(jié)元件，是內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)。IRES元件包括不依賴基因上游5′-末端甲基鳥嘌呤核苷(guanosinium)帽(CAP結構)的在功能上激活翻譯起始的序列，并在動物細胞中容許從單一轉(zhuǎn)錄物中翻譯兩個順反子(開放閱讀框架)。該IRES元件為緊接在下游的開放閱讀框架的翻譯，提供了獨立的核糖體進入位點。與細菌的mRNA相反，其可以是多順反子的，即它可編碼更多不同的多肽或產(chǎn)物，藉著mRNA一個接一個翻譯，大多數(shù)得自動物細胞的mRNA是單順反子的，并僅編碼一個蛋白質(zhì)或產(chǎn)物。在真核生物細胞中的多順反子轉(zhuǎn)錄物的情況中，轉(zhuǎn)譯將從上游最接近的翻譯起始位點開始，并將由第一個中止密碼子中止，隨后將從核糖體中釋放出轉(zhuǎn)錄物。因此，在翻譯期間將僅產(chǎn)生由mRNA編碼的第一個多肽或產(chǎn)物。相反的，具有IRES元件的多順反子轉(zhuǎn)錄物，該IRES在功能上與在轉(zhuǎn)錄物中第二個或后續(xù)的開放閱讀框架連接，容許位在其下游的開放閱讀框架編閱架構的后續(xù)翻譯，而得以在真核生物細胞中，產(chǎn)生二或多個由相同轉(zhuǎn)錄物編碼的多肽或產(chǎn)物。
IRES元件可具有各種長度和各種來源，并可起源自例如腦心肌炎病毒(EMCV)或其他小核糖核酸病毒。在文獻中描述了各種IRES序列及其在建構載體上的用途，參見例如Pelletier等人，1988；Jang等人，1989；Davies等人，1992；Adam等人，1991；Morgan等人，1992；Sugimoto等人，1994；Ramesh等人，1996；Mosser等人，1997。
位在下游的基因序列在功能上與IRES元件的3′端連接，即選擇間隔距離，以致于不影響或僅稍微影響基因的表達，或為了想要的目的而有充分的表達?？山逯唵蔚膶嶒?，藉著改變間隔，并使用報告基因測定，作為間隔的函數(shù)判定表達速率，來判定在IRES元件和位在其下游的基因的起始密碼子之間，可供充分表達的最佳許可距離。
藉著所述的測量，有可能獲得最佳表達盒，其對于異源基因產(chǎn)物表達相當有價值。因此，藉著一或多個這類測量所獲得的表達盒，同樣是本發(fā)明更進一步的目標。
可擴增的選擇標記基因根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選載體，額外地含有可擴增的選擇標記基因，其容許可擴增的標記基因的擴增，且優(yōu)選是由倉鼠-泛素/S27a基因、目的基因和熒光蛋白質(zhì)的基因所組成的轉(zhuǎn)錄單位的共同擴增。關于此點，在適當?shù)倪x擇劑的存在下，培養(yǎng)以相應的表達載體轉(zhuǎn)染的宿主細胞，使得只有具有至少可擴增的選擇標記基因的許多基因副本的那些宿主細胞能夠復制(被復制)。這最好是在漸增含量的選擇劑的存在下，藉著逐步培養(yǎng)細胞而達成。
可擴增的選擇標記基因通常編碼真核生物細胞在某些培養(yǎng)條件下生長所需的酶。例如，可擴增的選擇標記基因可編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)。在該情況中，若在選擇劑氨甲蝶呤(MTX)的存在下培養(yǎng)以其轉(zhuǎn)染的宿主細胞，則擴增該基因。
下列的表1提供其他可根據(jù)本發(fā)明使用的可擴增的選擇標記基因和相關選擇劑的實例，并在Kaufman，“酶學方法”，185537-566(1990)的綜述中描述。
表1可擴增的選擇標記基因



根據(jù)本發(fā)明，作為可擴增的選擇標記基因優(yōu)選是編碼具有DHFR功能的多肽的基因，例如DHFR或來自熒光蛋白質(zhì)與DHFR的融合蛋白質(zhì)。DHFR為嘌呤的生物合成所必需的。缺乏DHFR基因的細胞不能在嘌呤-缺陷培養(yǎng)基中生長。因此DHFR是有用的可選擇標記，在培養(yǎng)在不含嘌呤的培養(yǎng)基的細胞中，用來選擇和擴增基因。與DHFR基因一起使用的選擇介質(zhì)為氨甲蝶呤(MTX)。因此，本發(fā)明包括制備高產(chǎn)的重組宿主細胞的方法，其含有下列步驟(i)以編碼至少一個目的蛋白質(zhì)、熒光蛋白質(zhì)和DHFR的基因轉(zhuǎn)染宿主細胞；(ii)在容許各種基因表達的條件下培養(yǎng)該細胞，并(iii)藉著在容許擴增至少一個可擴增的可選擇標記基因的選擇劑，如氨甲蝶呤的存在下培養(yǎng)細胞，擴增共整合的基因。優(yōu)選的是在不含次黃嘌呤/胸苷的培養(yǎng)基中，在缺乏血清下，并添加漸增濃度的MTX，來培養(yǎng)經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細胞。在第一個擴增步驟中，MTX的濃度優(yōu)選是至少200nM，而在更優(yōu)選的具體實施例中，為至少500nM，并可逐步增加至1μM。在個別的情況中，可使用超過1μM的濃度。
哺乳動物細胞，優(yōu)選是小鼠骨髓瘤和倉鼠細胞，是使用DHFR作為可擴增的選擇標記的優(yōu)選宿主細胞。細胞株CHO-DUKX(ATCC CRL-9096)和CHO-DG44(Urlaub等人，1983)是特別優(yōu)選的，因為它們由于突變的結果，本身沒有DHFR活性。為了能夠在其他具有它們自己內(nèi)源的DHFR活性的細胞類型中，使用DHFR依賴的擴增作用，可能在轉(zhuǎn)染的過程中使用突變的DHFR基因，其編碼具有降低對氨甲蝶呤的敏感性的蛋白質(zhì)(Simonson等人，1983；Wigler等人，1980；Haber等人，1982)。
根據(jù)本發(fā)明的表達載體的制備原則上，可藉著本領域技術人員常用的傳統(tǒng)方法，例如由Sambrook等人(1989)描述的，來制備根據(jù)本發(fā)明的表達載體。其中亦描述載體的功能性組分，例如適當?shù)膯幼?除了倉鼠泛素/S27a啟動子之外)、增強子、中止和聚腺苷酸化信號、抗生素抗性基因、選擇標記、復制起點和拼接信號。可使用傳統(tǒng)的克隆載體來制備它們，例如質(zhì)粒、噬菌體、噬菌粒、粘?；虿《据d體，如桿狀病毒、逆轉(zhuǎn)錄病毒、腺病毒、腺伴隨病毒和單純皰疹病毒，以及人造的染色體/小染色體。真核生物的表達載體，通常亦含有原核生物序列，例如復制起點和抗生素抗性基因，其容許載體在細菌中復制和選擇。已知許多含有用來導入多核苷酸序列的多克隆位點的真核生物表達載體，且有些可購自各種公司，如Stratagene，La Jolla，CA，USA；Invitrogen，Carlsbad，CA，USA；Promega，Madison，WI，USA或BD Biosciences Clontech，Palo Alto，CA，USA。
以本領域技術人員熟悉的方式之一，將倉鼠-泛素/S27a啟動子、目的基因、編碼熒光蛋白質(zhì)的基因，優(yōu)選還有可擴增的選擇標記基因，例如二氫葉酸還原酶，以及任選額外的調(diào)節(jié)元件，如內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)、增強子或聚腺苷酸化信號，導入表達載體內(nèi)。根據(jù)本發(fā)明的表達載體，最少含有泛素/S27a啟動子、目的基因，以及編碼熒光蛋白質(zhì)的基因。表達載體優(yōu)選亦含有可擴增的選擇標記基因。根據(jù)本發(fā)明，亦可使用經(jīng)過修飾的泛素/S27a啟動子，例如在本發(fā)明中描述的經(jīng)過修飾的泛素/S27a啟動子。特別優(yōu)選的是其中在功能上將泛素啟動子、目的基因和編碼熒光蛋白質(zhì)的基因連接在一起或處于功能性連接的表達載體。
在本說明的范圍內(nèi)，“功能性連接”或“在功能上連接”一詞意指二或多個核酸序列或部分序列，安置它們使其得以執(zhí)行其想要的功能。例如，若啟動子/增強子能夠以順向的位置，控制或調(diào)節(jié)已連接的基因序列的轉(zhuǎn)錄，則其在功能上與編碼基因序列連接。通常，但不一定，在功能上連接的DNA序列緊靠在一起，且若連接兩個編碼基因序列，或在分泌信號序列的情形中，是在相同的閱讀框架中。雖然在功能上連接的啟動子通常是位在編碼基因序列的上游，但不一定必須與其靠近。增強子同樣不必緊密靠近，只要其有利于基因序列的轉(zhuǎn)錄。為了該目的，它們可在基因序列的上游和下游，任選離它一段距離。聚腺苷酸化作用位點在功能上與基因序列連接，若將它安置在基因序列的3′端，使得經(jīng)由編碼序列至聚腺苷酸化信號進行轉(zhuǎn)錄。可根據(jù)傳統(tǒng)的重組方法進行連接，例如藉著PCR技術、藉著在適當限制性切割位點處的連接，或藉著拼接。若沒有可利用的適當切割位點，則可以已知的方式，使用合成的寡核苷酸接頭或接合體。根據(jù)本發(fā)明，最好不經(jīng)由內(nèi)含子序列進行在功能上的連接。
在所述的具體實施例之一中，在功能上將泛素/S27a啟動子或其修飾形式、目的基因和編碼熒光蛋白質(zhì)的基因連接在一起。這意指例如，從相同的泛素/S27a啟動子或其修飾形式開始，表達目的基因和編碼熒光蛋白質(zhì)的基因。在一個特別優(yōu)選的具體實施例中，經(jīng)由IRES元件進行該功能上的連接，而得以從兩個基因合成雙順反子mRNA。根據(jù)本發(fā)明的表達載體，可額外地含有增強子元件，其在功能上對一或多個啟動子發(fā)揮作用。特別優(yōu)選的是其中將泛素/S27a啟動子或其修飾形式與增強子元件，例如SV40增強子或CMV增強子元件連接的表達載體。
基本上，在表達載體內(nèi)的基因的表達，可從一或多個轉(zhuǎn)錄單位開始進行。將轉(zhuǎn)錄單位定義為含有一或多個待轉(zhuǎn)錄的基因的區(qū)域。在轉(zhuǎn)錄單位內(nèi)的基因，在功能上彼此連接，使得所有在這類單位中的基因，均在相同啟動子或啟動子/增強子的轉(zhuǎn)錄控制之下。該基因的轉(zhuǎn)錄連接的結果，是可從一個轉(zhuǎn)錄單位中轉(zhuǎn)錄一種以上的蛋白質(zhì)或產(chǎn)物，并藉此表達之。每個轉(zhuǎn)錄單位在此可含有對其中所含有的基因序列的轉(zhuǎn)錄和翻譯所必需的調(diào)節(jié)元件。每個轉(zhuǎn)錄單位可含有相同或不同的調(diào)節(jié)元件?？墒褂肐RES元件或內(nèi)含子進行在轉(zhuǎn)錄單位中的基因的功能連接。
表達載體可含有用來表達目的基因、熒光蛋白質(zhì)的基因和可擴增的選擇標記基因的單一轉(zhuǎn)錄單位。或者，亦可將這些基因排列在二或多個轉(zhuǎn)錄單位中。在此，在轉(zhuǎn)錄單位中基因的各種組合均是可能的。在本發(fā)明的另一個具體實施例中，可藉著共轉(zhuǎn)染，或在按照任何順序的連續(xù)轉(zhuǎn)染中，將一個以上，由一、二或多個轉(zhuǎn)錄單位組成的表達載體引入宿主細胞內(nèi)?？蛇x擇在每個載體上調(diào)節(jié)元件和基因的任何組合，只要確保轉(zhuǎn)錄單位的充分表達。若需要，可將其他的調(diào)節(jié)元件和基因，例如額外的目的基因或選擇標記，安置在表達載體上。
因此，根據(jù)本發(fā)明的表達載體可在一個或在兩個分開的轉(zhuǎn)錄單位中，含有編碼熒光蛋白質(zhì)的基因和可擴增的選擇標記基因。每個轉(zhuǎn)錄單位可轉(zhuǎn)錄并表達一或多個基因產(chǎn)物。若在一個轉(zhuǎn)錄單位上含有兩個基因，其在相同的啟動子或啟動子/增強子的控制之下，而優(yōu)選是使用IRES來確保所有組份的功能連接。若編碼熒光蛋白質(zhì)的基因和可擴增的選擇標記基因被包含在兩個分開的轉(zhuǎn)錄單位中，則其可在相同或不同啟動子/增強子的控制之下。然而，對于選擇標記基因而言，優(yōu)選是使用其天然或較弱的異源啟動子，例如SV40早期啟動子，且優(yōu)選不使用增強子。在本發(fā)明的范圍中，帶有兩個分開的轉(zhuǎn)錄單位的表達載體是優(yōu)選的。一個(雙順反子)轉(zhuǎn)錄單位含有目的基因和編碼熒光蛋白質(zhì)的基因，而另一個轉(zhuǎn)錄單位則含有可擴增的選擇標記基因。優(yōu)選的是藉著編碼聚腺苷酸信號，優(yōu)選是tk聚腺苷酸、BGH聚腺苷酸或SV40聚腺苷酸的序列，在3′端對每個轉(zhuǎn)錄單位進行限制。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選的還有那些周多克隆位點代替目的基因的載體，所述多克隆位點容許經(jīng)由限制性核酸內(nèi)切酶的識別序列，克隆目的基因。從現(xiàn)有技術中知道所有種類的限制性核酸內(nèi)切酶的多種識別序列，以及所屬的限制性核酸內(nèi)切酶。最好是使用由至少六個核苷酸組成的作為識別序列的序列。可在例如Sambrook等人，1989中找到適當?shù)淖R別序列的一覽表。
宿主細胞為了以根據(jù)本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)染，使用真核生物宿主細胞，優(yōu)選是哺乳動物細胞，且更特定而言是嚙齒動物細胞，如小鼠、大鼠和倉鼠細胞系。以根據(jù)本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)染相應的細胞，結果產(chǎn)生經(jīng)過轉(zhuǎn)化、在遺傳上經(jīng)過修飾、重組或轉(zhuǎn)基因的細胞，其亦為本發(fā)明的目標。
在本發(fā)明的范圍內(nèi)優(yōu)選的宿主細胞是倉鼠細胞，如BHK21、BHK TK-、CHO、CHO-K1、CHO-DUKX、CHO-DUKX B1和CHO-DG44細胞，或這些細胞系的衍生物/后代。特別優(yōu)選的是CHO-DG44、CHO-DUKX、CHO-K1和BHK21細胞，特別是CHO-DG44和CHO-DUKX細胞。小鼠的骨髓瘤細胞也同樣是適合的，優(yōu)選的是NS0和Sp2/0細胞，以及這些細胞系的衍生物/后代。
在下列的表2中提供了可根據(jù)本發(fā)明來使用的倉鼠和小鼠細胞的實例。然而，亦可使用這些細胞的衍生物和后代、其他的哺乳動物細胞，包括但不限于人類、小鼠、大鼠、猿猴、嚙齒動物的細胞株，或真核生物細胞，包括但不限于酵母、昆蟲和植物細胞，作為生產(chǎn)生物藥學蛋白質(zhì)的宿主細胞。
表2倉鼠和小鼠生產(chǎn)細胞系


藉著傳統(tǒng)的方法(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)，進行以多核苷酸或根據(jù)本發(fā)明的表達載體之一轉(zhuǎn)染真核生物宿主細胞的作用。轉(zhuǎn)染的適當方法包括例如脂質(zhì)粒介導的轉(zhuǎn)染、磷酸鈣共沉淀、電穿孔、聚陽離子(例如DEAE葡聚糖)介導的轉(zhuǎn)染、原生質(zhì)體融合、顯微注射和病毒感染。根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選進行穩(wěn)定的轉(zhuǎn)染，其中將構建體整合到宿主細胞的基因組，或人造染色體/小染色體內(nèi)，或以穩(wěn)定的方式，以附加體的形式包含在宿主細胞內(nèi)。提供最佳轉(zhuǎn)染頻率，并在各自的宿主細胞中的異源基因的表達的轉(zhuǎn)染方法在此是優(yōu)選的。按照定義，將被插入宿主細胞中的每個序列或每個基因稱為相對于宿主細胞的“異源序列”或“異源基因”。即使欲導入的序列或欲導入的基因與該宿主細胞的內(nèi)源序列或內(nèi)源基因相同，亦適用。例如，被導入倉鼠宿主細胞中的倉鼠肌動蛋白基因，按照定義亦是異源的基因。
在異源二聚體蛋白質(zhì)，例如單克隆抗體(mAb)的重組制備中，在原則上可藉著兩種不同的方法，進行適當宿主細胞的轉(zhuǎn)染。該種類的單克隆抗體由許多亞單位、重和輕鏈組成?？蓪⒕幋a這些亞單位的基因放置在在單一質(zhì)粒上的獨立的或多順反子的轉(zhuǎn)錄單位中，然后用該質(zhì)粒轉(zhuǎn)染宿主細胞。這企圖在整合至宿主細胞基因組內(nèi)之后，確?；虻幕瘜W計算上的表達。然而，在獨立轉(zhuǎn)錄單位的情況中，必須藉此確保編碼不同蛋白質(zhì)的mRNA展現(xiàn)出相同的穩(wěn)定性，以及轉(zhuǎn)錄和翻譯效率。在第二種情況中，藉著單一的啟動子，進行多順反子的轉(zhuǎn)錄單位中基因的表達，并僅形成一個轉(zhuǎn)錄物。藉著使用IRES元件，獲得在第二和后續(xù)的順反子中基因的正確有效內(nèi)部翻譯起始。然而，這些順反子的表達速率比第一個順反子的低，其藉著所謂的“帽”依賴的前起始復合物的翻譯起始，實質(zhì)上比IRES依賴的翻譯起始更有效。為了達到順反子真正等摩爾的表達，可例如導入額外的順反子間元件，其與IRES元件一起導致均一的表達速率(WO 94/05785)。
其他并根據(jù)本發(fā)明優(yōu)選的同時制備許多異源蛋白質(zhì)的可能路徑，是共轉(zhuǎn)染，其中整合分別在不同的表達載體中的基因。這具有可互相調(diào)整基因和基因產(chǎn)物的某些比例的優(yōu)點，藉此平衡在mRNA穩(wěn)定性，以及在轉(zhuǎn)錄和翻譯效率上的差異。此外，該表達載體因為它們的尺寸較小是較穩(wěn)定的，且在克隆和轉(zhuǎn)染上較容易操作。
因此，在本發(fā)明一個特殊的具體實施例中，額外地以一或多個具有編碼一或多個其他目的蛋白質(zhì)的基因的載體轉(zhuǎn)染，優(yōu)選是共轉(zhuǎn)染宿主細胞。用來共同轉(zhuǎn)染的其他載體或多個載體，在相同的啟動子/增強子組合的控制之下，編碼例如其他目的蛋白質(zhì)或多個蛋白質(zhì)，以及至少一個其他的選擇標記，例如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶。
根據(jù)本發(fā)明，優(yōu)選在不含血清的條件下建立適應和培養(yǎng)宿主細胞，任選在不含動物蛋白質(zhì)/肽的培養(yǎng)基中培養(yǎng)。可購得的培養(yǎng)基的實例，包括Ham′s F12(Sigma，Deisenhofen，DE)、RPMI-1640(Sigma)、杜貝可氏(Dulbecco′s)經(jīng)過改良的Eagle′s培養(yǎng)基(DMEM；Sigma)基本必需培養(yǎng)基(MEM；Sigma)、艾司可夫(Iscove′s)經(jīng)過改良的杜貝可氏培養(yǎng)基(IMDM；Sigma)、CD-CHO(Invitrogen.Carlsbad，CA，USA)、CHO-S-SFMII(Invitrogen)、不含血清的CHO-培養(yǎng)基(Sigma)和不含蛋白質(zhì)的CHO-培養(yǎng)基(Sigma)。任選以各種化合物補充這些培養(yǎng)基中的每一種，例如激素及/或其他的生長因子(例如胰島素、鐵傳遞蛋白、表皮生長因子、胰島素樣生長因子)、鹽類(例如氯化鈉、鈣、鎂、磷酸鹽)、緩沖溶液(例如HEPES)、核苷(例如腺苷、胸苷)、谷氨酰胺、葡萄糖或其他等價的營養(yǎng)物、抗生素及/或微量元素。雖然根據(jù)本發(fā)明，不含血清的培養(yǎng)基是優(yōu)選的，但亦可使用已經(jīng)與適量血清混合的培養(yǎng)基來培養(yǎng)宿主細胞。為了選擇表達一或多個選擇標記基因的經(jīng)過遺傳修飾的細胞，將一或多個選擇劑加至該培養(yǎng)基中。
“選擇劑”一詞意指妨礙缺乏所討論的選擇標記基因的宿主細胞生長和存活的物質(zhì)。例如，為了選擇所表達的抗生素抗性基因，如新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶的存在，最好使用抗生素Geneticin(G418)作為培養(yǎng)基添加物。若所使用的基因為可擴增的選擇標記基因(參見表1)，則選擇劑也可以是誘發(fā)選擇標記基因的擴增的物質(zhì)。例如，氨甲蝶呤是選擇介質(zhì)，其適合用來擴增DHFR基因。在表1中列舉了其他誘發(fā)擴增的選擇劑的實例。
“選擇標記基因”是藉著在培養(yǎng)基中加入相應的選擇劑，容許特異性地選擇含有該基因的細胞的基因。更明白地說，抗生素抗性基因可作為正性的選擇標記被使用。只有已經(jīng)以該基因轉(zhuǎn)化的細胞，才能夠在相應的抗生素的存在下生長，并因此被選擇。相反未經(jīng)轉(zhuǎn)化的細胞在這些選擇條件下不能生長或存活。有正性、負性和雙功能的選擇標記。正性選擇標記允許藉著相對于選擇劑的抗性，或藉著補償宿主細胞中的代謝或降解代謝缺陷，選擇和富集經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細胞。相反的，可藉著負性的選擇標記，選擇性地清除已經(jīng)接受選擇標記的基因的細胞。其實例為單純皰疹病毒的胸苷激酶基因，其在細胞中的表達通過無環(huán)鳥苷(acyclovir)和9-[1，3-二羥-2-丙氧甲基]鳥嘌呤(gancyclovir)的同時加入，導致細胞的清除。在本發(fā)明中使用的可選擇標記，包括可擴增的選擇標記，包括以遺傳方式修飾的突變體和變體、片段、功能等價物、衍生物、同系物，以及與其他蛋白質(zhì)或肽的融合，只要該選擇標記保留其選擇特性。這類衍生物在氨基酸序列中，在視為有選擇性的區(qū)域或結構域中展現(xiàn)出相當大的同源性。文獻描述了許多選擇標記基因，包括雙功能的(正性/負性的)標記(參見，例如WO 92/08796和WO94/28143)。經(jīng)常用在真核生物細胞中的選擇標記的實例，包括氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶(APH)、潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶(HYG)、二氫葉酸還原酶(DHFR)、胸苷激酶(TK)、谷氨酰胺合成酶、天冬酰胺合成酶的基因，以及介導對新霉素(G418)、嘌呤霉素、組氨醇D、博來霉素、腐草霉素和利歐辛(zeocin)的抗性的基因。
亦可能藉著熒光激活細胞分揀術(FACS)來選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細胞。關于此點，例如可使用細菌的β-半乳糖苷酶、細胞表面標記或熒光蛋白質(zhì)(例如綠色熒光蛋白質(zhì)(GFP)及其得自維多利亞水母和腎形水母或其他物種的變體、紅熒光蛋白質(zhì)和發(fā)其他顏色熒光的蛋白質(zhì)，及其得自非生物發(fā)光生物(例如香菇珊瑚、皺摺?？⒂鹕汉?、鈕扣珊瑚)的變體，來選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細胞。
在本發(fā)明中，優(yōu)選是使用DHFR基因來選擇以遺傳方式修飾的(重組的)宿主細胞，作為可擴增的選擇標記基因。在使用DHFR陰性的基礎細胞，如CHO-DG44或CHO-DUKX時，該標記特別適合用來選擇和后續(xù)的擴增，因為這些細胞不表達內(nèi)源的DHFR，并因此在不含嘌呤的培養(yǎng)基中不會生長。結果，可使用這里的DHFR基因作為優(yōu)勢選擇標記，并在不含次黃嘌呤/胸苷的培養(yǎng)基中選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細胞。為了獲得DHFR介導的基因擴增，使用氨甲蝶呤(MXT)。藉著加入MTX，決定性地影響了生長特性。隨著MTX濃度和擴增步驟的增加，觀察到細胞的發(fā)酵強健性實質(zhì)上的惡化。然而，驚人的是已經(jīng)發(fā)現(xiàn)使用根據(jù)本發(fā)明的克隆選擇系統(tǒng)，在高濃度MTX的存在下，展現(xiàn)出多很多的強健行為的重組宿主細胞增加(參見圖7)。因此，能夠在500nM MTX的存在下，優(yōu)選是在1μM MTX的存在下，培養(yǎng)并擴增已經(jīng)使用熒光-激活細胞分揀(FACS)鑒定和挑選的宿主細胞，結果明顯地增加了產(chǎn)率。
因此，一種選擇高產(chǎn)宿主細胞的方法被視為特別依據(jù)本發(fā)明，如果以根據(jù)本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)染，并至少表達目的基因、熒光蛋白質(zhì)和DHFR基因的宿主細胞藉著FACS分揀被挑選，并在至少500nM，優(yōu)選是1μM MTX的存在下經(jīng)歷基因擴增步驟。
“發(fā)酵強健性”一詞意指細胞的生長特性，例如維持某種生長速率，對“按比例放大”(“Upscaling”)(生物反應器的較大尺寸)的強健性，并在種系維持中達到高細胞計數(shù)和活力，以便在按比例放大時符合工業(yè)傳代速率。
表達表達一詞是關于異源基因序列在宿主細胞中的轉(zhuǎn)錄及/或翻譯。通常以出現(xiàn)在宿主細胞中相應的mRNA的量為基礎，或以所產(chǎn)生的由目的基因編碼的基因產(chǎn)物的量為基礎，判定表達速率。例如，藉著RNA印跡雜交、核糖核酸酶-RNA-保護、細胞RNA的原位雜交或藉著PCR法(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)，判定藉著轉(zhuǎn)錄選出的核苷酸序列所產(chǎn)生的mRNA的量。亦同樣可藉著各種方法判定由所選出的核苷酸序列編碼的蛋白質(zhì)，例如ELISA、蛋白質(zhì)印跡法、放射性免疫測定、免疫沉淀法、檢測蛋白質(zhì)的生物活性，或藉著蛋白質(zhì)的免疫染色并隨后進行FACS分析(Sambrook等人，1989；Ausubel等人，1994)。
“高表達水平(速率)”、“高表達”、“增加表達”或“高產(chǎn)率”意指持續(xù)和足夠量地高度表達或合成被導入宿主細胞內(nèi)的異源序列，例如編碼治療性蛋白質(zhì)的基因。若藉著根據(jù)在本文中描述的本發(fā)明的方法之一培養(yǎng)根據(jù)本發(fā)明的細胞，且若該細胞每天產(chǎn)生至少超過大約5微微克想要的基因產(chǎn)物(5微微克/天/細胞)，則出現(xiàn)增加或高表達，或高表達水平或速率，或高產(chǎn)率。若根據(jù)本發(fā)明的細胞每天產(chǎn)生至少超過大約10微微克想要的基因產(chǎn)物(10微微克/天/細胞，則亦出現(xiàn)增加或高表達，或高表達水平或速率，或高產(chǎn)率。特別是若根據(jù)本發(fā)明的細胞每天產(chǎn)生至少超過大約15微微克想要基因產(chǎn)物(15微微克/天/細胞)，則出現(xiàn)增加或高表達，或高表達水平或速率，或高產(chǎn)率。特別是若根據(jù)本發(fā)明的細胞每天產(chǎn)生至少超過大約20微微克想要的，基因產(chǎn)物(20微微克/天/細胞)，則出現(xiàn)增加或高表達，或高表達水平或速率或高產(chǎn)率。特別是若根據(jù)本發(fā)明的細胞每天產(chǎn)生至少超過大約30微微克想要的基因產(chǎn)物(30微微克/天/細胞)，則出現(xiàn)增加或高表達，或高表達水平或速率，或高產(chǎn)率。
可以各種方式達到本發(fā)明意義上的高度或增加的表達、高產(chǎn)率或高表達水平或速率。例如，經(jīng)由目的基因與可擴增的選擇標記基因的共表達，有可能選擇并鑒定表達異源基因達高程度的細胞。可擴增的選擇標記不僅容許選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的宿主細胞，亦容許目的異源基因的基因擴增?？蓪⒑怂岬念~外拷貝整合至宿主細胞的基因組內(nèi)，至額外的人造/小染色體內(nèi)，或至以附加體形式定位的多核苷酸內(nèi)。可將該做法與FACS支持的重組宿主細胞的選擇混合，該宿主是包含有作為額外的選擇標記的一或多個熒光蛋白質(zhì)(例如GFP)或細胞表面標記。獲得增加表達的其他方法，所述方法亦可使用不同方法的組合，是以例如使用(人造的)轉(zhuǎn)錄因子、以上調(diào)內(nèi)源或異源基因表達的天然或合成制劑來處理細胞、改善mRNA或蛋白質(zhì)的穩(wěn)定性(半衰期)、改善mRNA翻譯的起始、藉著使用附加體質(zhì)粒(以使用病毒序列作為復制起點為基礎，例如SV40、多瘤病毒、腺病毒、EBV或BPV的序列)來增加基因劑量、使用促進擴增的序列(Hemann等人，1994)，或以DNA連環(huán)為基礎的活體外擴增系統(tǒng)(Monaco等人，1996)為基礎。
根據(jù)本發(fā)明的是目的基因和編碼熒光蛋白質(zhì)的基因的偶聯(lián)轉(zhuǎn)錄。所得的雙順反子mRNA表達目的蛋白質(zhì)和熒光蛋白質(zhì)。以該目的蛋白質(zhì)和熒光蛋白質(zhì)的偶聯(lián)表達為基礎，有可能輕易地根據(jù)本發(fā)明，藉著所表達的熒光蛋白質(zhì)，例如藉著使用熒光激活細胞分揀器(FACS)挑選，選擇和分離高產(chǎn)的重組宿主細胞。
選擇展現(xiàn)出高活力，并增加想要的基因產(chǎn)物的表達速率的重組宿主細胞，是多個階段的過程。至少針對編碼熒光蛋白質(zhì)，并與目的基因偶聯(lián)的基因的表達，研究已經(jīng)以根據(jù)本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)染，或任選以其他載體例如共轉(zhuǎn)染的宿主細胞，以便鑒定和選擇展現(xiàn)出最高的熒光蛋白質(zhì)表達率的細胞/細胞群體。優(yōu)選是僅挑選出屬于具有最高熒光蛋白質(zhì)表達率的10％的細胞，并進一步培養(yǎng)。實際上，這意指挑選出最亮的10％發(fā)熒光細胞，并進一步培養(yǎng)。相應地，亦可挑選出細胞混合物中最亮的5％，優(yōu)選的是最亮的3％或甚至是最亮的1％的發(fā)熒光細胞，并復制之。在特別優(yōu)選的具體實施例中，僅挑選出最亮的0.5％或最亮的0.1％發(fā)熒光細胞，并復制之。
為了該目的，在選擇培養(yǎng)基中培養(yǎng)之前已經(jīng)以根據(jù)本發(fā)明的表達載體轉(zhuǎn)染的細胞，該培養(yǎng)基任選含有可擴增選擇標記特異性的選擇劑?？墒褂弥鸩皆黾舆x擇劑的濃度，施加逐漸增加的選擇壓力。
可在細胞集合上進行篩選步驟，或使用預先分揀的細胞集合/細胞克隆?？蛇M行一或多個，優(yōu)選是二或多個，且特別是三或多個挑選步驟，而在單個的挑選步驟之間，可培養(yǎng)和復制細胞一段特定的時間，例如在集合的情況中大約2周。
任選可使宿主細胞經(jīng)歷一或多個基因擴增步驟，以便至少增加目的基因和可擴增的選擇標記基因的拷貝數(shù)目。使用氨甲蝶呤逐步擴增基因的過程，是按照在例如美國專利第5,179,017號中的描述。根據(jù)本發(fā)明，可達到的高產(chǎn)率，并不受限于增高的基因拷貝。然而卻是高效率克隆的，增加的穩(wěn)定性和發(fā)酵強健性的特征。因此有可能降低所需的基因擴增步驟的數(shù)目，并例如僅進行單一的基因擴增。
因此，根據(jù)本發(fā)明的選擇細胞的方法包括下列步驟(i)至少以根據(jù)本發(fā)明的載體轉(zhuǎn)化適當?shù)乃拗骷毎?，其中?yōu)選將表達載體的DNA穩(wěn)定地摻入宿主細胞基因組內(nèi)，或人造的染色體/小染色體內(nèi)；(ii)在容許目的基因和熒光蛋白質(zhì)表達的條件下，培養(yǎng)經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細胞；(iii)在至少一個選擇劑的存在下，培養(yǎng)該細胞，而只有能夠在所述選擇劑的存在下生長的那些細胞得以復制；(iv)從細胞混合物中挑選展現(xiàn)出最高熒光蛋白質(zhì)表達率的細胞，其中藉著熒光激活細胞分揀器(FACS)挑選和檢測細胞；
(v)培養(yǎng)所挑選出具有最高熒光蛋白質(zhì)表達率的細胞。
任選將根據(jù)步驟v)獲得的細胞，重復步驟ii)-v)一或多次。此外，亦可任選使經(jīng)過轉(zhuǎn)化的細胞經(jīng)歷一或多個基因擴增步驟，其中將其在選擇劑存在下培養(yǎng)其導致可擴增的選擇標記基因的擴增?？衫蒙形刺暨x過的細胞，并亦可利用業(yè)已預先挑選過一或多次的細胞，進行該步驟。
本發(fā)明亦關于其中復制經(jīng)過相應分揀的細胞，并用來制備目的編碼基因產(chǎn)物的方法。優(yōu)選在不含血清的培養(yǎng)基中培養(yǎng)所選出的高產(chǎn)細胞，且優(yōu)選在懸浮培養(yǎng)基中，在容許目的基因表達的條件下。優(yōu)選是從細胞培養(yǎng)基中，以分泌性基因產(chǎn)物的形式，獲得目的蛋白質(zhì)。然而，通過表達無分泌信號的蛋白質(zhì)，亦可從細胞胞溶產(chǎn)物中分離基因產(chǎn)物。為了獲得純的均質(zhì)的產(chǎn)物，其實質(zhì)上不含其他的重組蛋白質(zhì)和宿主細胞蛋白質(zhì)，進行傳統(tǒng)的純化步驟。首先，通常從培養(yǎng)基或胞溶產(chǎn)物中移除細胞和細胞碎屑。然后可藉著例如在免疫親和力和離子交換柱上分級分離、乙醇沉淀法、在交聯(lián)葡聚糖、硅膠或陽離子交換樹脂，如DEAE上的逆相HPLC或?qū)游龇?，使想要的細胞產(chǎn)物不含污染的可溶性蛋白質(zhì)、多肽和核酸。純化由重組細胞表達的異源蛋白質(zhì)的方法，為本領域技術人員已知的，并描述在文獻中，例如Harris等人(1995)和Scopes(1988)。
在后文中，藉著非限制性的具體實施例，更詳細解釋本發(fā)明。
實施例縮寫AP堿性磷酸酶bp堿基對CHO中國倉鼠卵巢DHFR二氫葉酸還原酶ELISA酶聯(lián)免疫吸附測定FACS熒光激活細胞分揀器FAP成纖維細胞激活蛋白質(zhì)GFP綠色熒光蛋白HBSS漢克氏(Hanks)平衡鹽溶液HT次黃嘌呤/胸苷
HRPO辣根過氧化物酶IRES內(nèi)部核糖體進入位點kb千堿基MAb單克隆抗體MTX氨甲蝶呤PCR聚合酶鏈式反應sICAM可溶性細胞內(nèi)粘附分子方法1.細胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染在37℃下，在潮濕的環(huán)境和5％CO2中，在細胞培養(yǎng)瓶中，以懸浮細胞的形式，在補充有次黃嘌呤和胸苷的不含血清的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基(Invitrogen GmbH，Karlsruhe，DE)中，永久地培養(yǎng)細胞CHO-DG44/DHFR-/-(Urlaub等人，1983)。利用CASY1細胞計數(shù)器(SchaerfeSystem，DE)，或藉著錐蟲藍染色，判定細胞計數(shù)和存活力，然后以1-3×105/毫升的濃度接種，并每2-3天進行一次傳代。
使用Lipofectamine Plus試劑(Invitrogen GmbH)轉(zhuǎn)染CHO-DG44。對于每一個轉(zhuǎn)染混合物，根據(jù)制造者的說明，將總共1微克質(zhì)粒DNA、4微升Lipofectamine和6微升Plus試劑混合在一起，并以200微升的體積加至在0.8毫升補充有HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中的6×105個指數(shù)生長的CHO-DG44細胞中。在37℃下，在細胞恒溫箱中培養(yǎng)3小時之后，加入2毫升補充有HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基。至于以DNFR為基礎，選擇穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細胞，在轉(zhuǎn)染之后2天，將細胞移至未加次黃嘌呤和胸苷的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基內(nèi)，每隔3至4天更換培養(yǎng)基。在以DHFR和新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶為基礎的選擇中，在其中一個表達載體含有DHFR而另一個表達載體含有新霉素-磷酸轉(zhuǎn)移酶選擇標記的共轉(zhuǎn)染的案例中，亦以400微克/毫升的濃度，將G418(Invitrogen)加至培養(yǎng)基中。
藉著在不含HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中，加入濃度5-2000nM的選擇劑MTX(Sigma，Deisenhofen，DE)獲得經(jīng)過整合的異源基因的以DHFR-為基礎的基因擴增。
2.表達載體欲分析表達，使用真核生物表達載體，其以pAD-CMV載體(Werner等人，1998)為基礎，并藉著CMV增強子/倉鼠泛素/S27a啟動子的組合，介導異源基因的組成型表達(WO 97/15664)。而基本的載體pBID含有DHFR小基因，其擔任可擴增的選擇標記(參見，例如EP 0 393 438)，在載體pBIN中，已經(jīng)藉著新霉素抗性基因置換DHFR小基因(圖2)。為了該目的，從市售的質(zhì)粒pBK-CMV(Stratagene，La Jolla，USA)，作為1640個堿基對Bsu36I片段，分離選擇標記新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶，包括SV40早期啟動子和TK-聚腺苷酸化信號。在以Klenow-DNA-聚合酶填滿片段的末端的反應之后，將該片段與載體pBID的3750個堿基對的Bsu36I/StuI片段連接，后者亦利用Klenow-DNA-聚合酶處理。
在雙順反子的基本載體pBIDG(圖2)中，從載體pIRES2-EGFP(Clontech，Palo Alto，CA，USA)中分離IRES-GFP基因區(qū)，并在CMV增強子/啟動子的控制之下引入載體pBID，而得以保留在啟動子區(qū)和IRES元件之間的多克隆位點。使用下列的操作。在PCR突變生成作用中，其中質(zhì)粒pIRES2-EGFP作為模板，一方面藉著使用致突變的引物，將在IRES序列內(nèi)的HindIII切割位點AAGCTT轉(zhuǎn)變?yōu)樾蛄蠥TGCTT，并因此排除之。另一方面藉著與IRES序列的5′端互補的引物，插入XbaI切割位點，或藉著與GFP序列的3′端互補的引物，導入SpeI切割位點。以XbaI和SpeI消化所得的PCR片段，其含有完整的IRES和GFP序列，并克隆到在載體pBID的多克隆位點3′端的單一XbaI切割位點內(nèi)。
從pAD-sICAM中，以HindIII/SalI片段的形式，分離人類的sICAM基因(Werner等人，1998)，并克隆到載體pBIDG的相應的切割位點內(nèi)，結果為載體pBIDG-sICAM(圖3)。
為了表達單克隆人源化F19抗體，從質(zhì)粒pGlD105F19HC(NAGENESEQAAZ32786)中，以1.5kb NaeI/HindIII片段的形式，分離重鏈，并克隆到以EcoRI(以Klenow-DNA-聚合酶填滿)和HindIII消化過的載體pBIDG內(nèi)，結果產(chǎn)生載體pBIDG-F19HC(圖3)。另一方面，從質(zhì)粒pKN100F19LC(NAGENESEQAAZ32784)中，以1.3kb HindIII/EcoRI片段的形式，分離輕鏈，并克隆到載體pBIN的相應的切割位點內(nèi)，產(chǎn)生載體pBIN-F19LC(圖3)。
3.FACS利用Coulter Epics Altra裝置進行流式細胞計數(shù)分析和分揀。安裝氦-氬激光的FACS具有488毫微米的激發(fā)波長。熒光強度在與熒光蛋白質(zhì)相符的波長被吸收，并藉著隨附的軟件Coulter Expo32處理。以8000-10000個事件/秒的速度進行挑選。離心懸浮的細胞(以180×g 5分鐘)，并在HBSS中調(diào)整至1-1.5×107/毫升的細胞濃度。然后根據(jù)其熒光蛋白質(zhì)信號挑選細胞。將細胞放入業(yè)已含有培養(yǎng)基的試管中，離心，并依據(jù)所挑選的細胞的數(shù)目接種在相應的培養(yǎng)容器中。
4.ELISA穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細胞上清中的SICAM效價借助ELISA用標準操作定量(Ausubel et al.，1994，更新版)，其中使用兩個在小鼠中發(fā)展的SICAM特異性單克隆抗體(例如在US 5,284,931和US 5,475,091中描述的)。兩個抗體中的一個為HRPO共軛的抗體。使用純化的SICAM蛋白作為標準。
藉著ELISA，根據(jù)標準程序(Ausubel等人，1994，更新版)，一方面使用山羊抗人類IgG Fc片段(Dianova，Hamburg，DE)，另一方面使用AP-共軛的山羊抗人類κ輕鏈抗體(Sigma)，定量在穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的CHO-DG44細胞上清液中的F19單克隆抗體。使用經(jīng)過純化的F19抗體作為標準物。
藉著公式微微克/((Ct-Co)t/In(Ct-Co)計算產(chǎn)率(微微克/細胞/天)，其中Co和Ct分別為在接種或收獲時的細胞計數(shù)，且t為培養(yǎng)時間。
實施例1比較CMV與倉鼠-泛素/S27a-啟動子活性為了比較倉鼠-泛素/S27a-啟動子的活性與經(jīng)常用在真核生物表達載體中的CMV啟動子的活性，以各種重組載體轉(zhuǎn)染CHO-DG44細胞。在CMV-啟動子的控制之下，或在倉鼠-泛素/S27a啟動子的控制之下，表達異源基因產(chǎn)物，一方面是溶酶體酶，另一方面是IgGl-抗體。兩個啟動子均在功能上與CMV-增強子連接。使用BGH聚腺苷酸作為異源基因的中止信號。含有CMV啟動子的表達載體是以經(jīng)過修飾的pcDNA3(“CMV1”、Invitrogen)或pBluescript載體(“CMV2”，Stratagene)為基礎，并額外地編碼可擴增的選擇標記二氫葉酸還原酶。另一方面，具有倉鼠啟動子的表達載體是以pAD-CVM載體(Werner等人，1998)為基礎。為了表達抗體的重和輕鏈，以含有作為選擇標記的新霉素抗性基因的第二個載體進行共轉(zhuǎn)染。然而，亦可以SV40增強子取代CMV增強子。
藉著在轉(zhuǎn)染之后，在96孔培養(yǎng)板中的限制稀釋，在不含HT的培養(yǎng)基中選擇和分離細胞克隆(在共轉(zhuǎn)染的情況中，添加400微克/毫升G418)。藉著從5nM，經(jīng)由50nM、500nM至2μM逐步地增加氨甲蝶呤濃度，連同在每個情況中的稀釋克隆，使對于重組蛋白質(zhì)而言具有最高產(chǎn)率的細胞克隆，經(jīng)歷逐步的以DHFR-為基礎的基因擴增。在每個擴增階段，選出大約20至30個具有最高產(chǎn)率的克隆。
一般而言，發(fā)現(xiàn)倉鼠啟動子具有較高的效率。在溶酶體酶的表達以及抗體的表達兩者中，其所獲得的產(chǎn)率或效價，比利用其中在CMV啟動子的控制之下，表達異源基因的細胞所獲得的那些更高2至5倍。圖1舉例顯示，在各自的擴增階段，最佳細胞克隆的相對效價和相對特異性產(chǎn)率，將以CMV啟動子為基礎的各自異源基因的表達設定為1(CMV1為溶酶體酶，CMV2為抗體)。
實施例2藉著以GFP為基礎的FACS分揀，分離高度表達sICAM的細胞細胞間粘附分子ICAM1的可溶形式sICAM，是感冒的可能治療劑，因為它和ICAM受體競爭與鼻病毒的結合，且該方式可降低，或甚至可防止鼻病毒與ICAM受體的交互作用，該交互作用為其進入細胞內(nèi)及后續(xù)感染的先決條件(Bella等人，1999；Marlin等人，1990)。
sICAM被選作在CHO細胞中表達單鏈蛋白質(zhì)(480個氨基酸)的實例。為此，以pBIDG-sICAM轉(zhuǎn)染CHO-DG44(圖3)。GFP在pBIDG-sICAM轉(zhuǎn)染的細胞中的額外表達，使其可能使用以FACS-為基礎的選擇策略。藉著雙順反子轉(zhuǎn)錄單位，連帶地表達治療蛋白質(zhì)sICAM和GFP，并藉著分開的轉(zhuǎn)錄單位表達DHFR。在不含HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中第一次選擇之后2至3周，挑選出具有最高GFP熒光的5％細胞。在大約2周的培養(yǎng)之后，再度分離出具有最高GFP熒光的5％細胞。該連續(xù)挑選總共進行6次。可在sICAM產(chǎn)率和GFP熒光之間，顯示良好的關聯(lián)(圖4)。僅藉著FACS支持的選擇，不需任何MTX擴增步驟，在最短的時間內(nèi)分離出具有高達16微微克/細胞/天的高特異性產(chǎn)率的細胞集合(圖5)。藉著將GFP為基礎的選擇與單一后續(xù)的MTX擴增步驟加以組合，甚至有可能增加產(chǎn)率至30微微克/細胞/天以上(圖6)。在利用500nM MTX的第四次挑選之后，利用集合的擴增，以及亦在利用2μM MTX的第六次挑選之后，利用集合的擴增，皆達到這些產(chǎn)率。與通常從范圍在5-20nM MTX的極低MTX濃度開始的逐步擴增相反，其必須使用較高的MTX濃度開始，才能達到擴增的效果。因此，在得自第四次挑選的細胞中加入5或50nM MTX，或是在得自第六次挑選的細胞中加入500nM MTX，結果在產(chǎn)率上都沒有顯著的增加(圖6)。顯然在開始的集合中DHFR的水平已經(jīng)是如此地高，以致于僅可利用高劑量的MTX達成完全的DHFR的抑制。此外，盡管MTX的高起始劑量，但預先挑選的細胞集合在選擇期間的存活仍改善很多，即在比傳統(tǒng)逐步的基因擴增策略更短的時間內(nèi)，獲得高活力的細胞群體(圖7)。
實施例3藉著以GFP為基礎的FACS分揀，分離高度表達單克隆抗體F19的細胞在共轉(zhuǎn)染中，以質(zhì)粒組合pBIDG-F19HC和pBIN-F19LC(圖3)轉(zhuǎn)染CHO-DG44細胞。所表達的人源化抗體F19，直接抗表面分子FAP，其是由反應性基質(zhì)成纖維細胞合成(亦參見專利EP 0 953 639)。在所使用的載體構型中，表達由它各自自己的載體表達的抗體的兩個蛋白質(zhì)鏈，其亦額外地在分開的轉(zhuǎn)錄單位中，編碼DHFR或新霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶選擇標記。此外，另一個選擇標記GFP，則被納入載體pBIDG-F19HC內(nèi)。藉著借助IRES元件的GFP和重鏈表達的轉(zhuǎn)錄連接，以載體pBIDG-F19HC/pBIN-F19LC共轉(zhuǎn)染CHO-DG44，可僅藉著使用連續(xù)FACS分揀選擇具有高GFP內(nèi)含量的細胞，在短時間內(nèi)分離高度表達抗體F19的細胞。為此，在前2-至3-周的在添加400微克/毫升G418的不含HT的CHO-S-SFMII培養(yǎng)基中選擇經(jīng)過轉(zhuǎn)染的細胞集合之后，藉著FACS挑選出5％具有最高GFP熒光的細胞。總共進行該挑選最多6次，在每次挑選之間為大約2周的培養(yǎng)期。驚人的是，在F19產(chǎn)率和GRP熒光之間呈現(xiàn)良好的關連(圖8)，雖然兩個蛋白質(zhì)鏈從它們自己的載體表達，且在以GFP為基礎的FACS分揀中，僅可能選擇重鏈的表達，因為它與GFP一起轉(zhuǎn)錄?？墒巩a(chǎn)率增加至10微微克/細胞/天(圖9)，并在藉著單一后續(xù)的MTX擴增步驟，從第五次挑選的細胞集合開始，藉著將1000nM MTX加至選擇培養(yǎng)基中，進一步增加至平均37微微克/細胞/天。亦可藉著在功能上使倉鼠啟動子與代替CMV增強子的SV40增強子連接，獲得比較數(shù)據(jù)。同時，與傳統(tǒng)的逐步基因擴增策略相比較，傳統(tǒng)策略通常包括四個擴增階段可降低選擇高產(chǎn)細胞的發(fā)展時間一半至大約120天，并在發(fā)展效能和成本上伴隨有明顯地降低。
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1.一種表達載體，所述表達載體包含編碼目的蛋白質(zhì)的基因，所述基因與倉鼠-泛素/S27a-啟動子和編碼熒光蛋白質(zhì)的基因功能性連接。
2.根據(jù)權利要求1的表達載體，其特征在于所述載體含有可擴增的選擇標記基因。
3.根據(jù)權利要求1或2的表達載體，其特征在于所述載體包含與所述一或多個啟動子功能性連接的一個或多個增強子。
4.根據(jù)權利要求1-3任一項中的表達載體，其特征在于所述載體額外地含有內(nèi)部核糖體進入位點(IRES)，所述內(nèi)部核糖體進入位點容許編碼熒光蛋白質(zhì)的基因和編碼目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物的基因的雙順反子表達。
5.根據(jù)權利要求1-4任一項中的表達載體，其特征在于所述編碼熒光蛋白質(zhì)的基因和可擴增的選擇標記基因是位于一個或兩個分開的轉(zhuǎn)錄單位中。
6.根據(jù)權利要求1-5任一項中的表達載體，其特征在于所述功能性連接不是通過內(nèi)含子序列進行連接。
7.根據(jù)權利要求1-6任一項中的表達載體，其特征在于所述可擴增的選擇標記基因編碼二氫葉酸還原酶(DHFR)或編碼熒光蛋白質(zhì)與DHFR的融合蛋白質(zhì)。
8.根據(jù)權利要求3-7任一項中的表達載體，其特征在于所述增強子是CMV-或SV40-增強子。
9.根據(jù)權利要求1-8任一項中的表達載體，其特征在于所述載體額外地包含至少一個多腺苷酸化信號。
10.根據(jù)權利要求1-9任一項中的表達載體，其特征在于所述載體包含摻入編碼目的蛋白質(zhì)的基因時所需的多克隆位點以代替編碼目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物的基因。
11.一種真核宿主細胞，所述宿主細胞已經(jīng)用根據(jù)權利要求1-10任一項中的表達載體轉(zhuǎn)染。
12.根據(jù)權利要求11的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞是哺乳動物細胞，優(yōu)選是CHO細胞。
13.根據(jù)權利要求11或12的宿主細胞，其特征在于所述宿主細胞已經(jīng)額外地以一個或多個帶有基因的載體轉(zhuǎn)染，所述基因編碼一個或多個其他目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物，以及至少一個其他的選擇標記。
14.一種制備異源基因產(chǎn)物的方法，其中在容許所述基因產(chǎn)物表達的條件下培養(yǎng)根據(jù)權利要求11-13的宿主細胞，并從培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中分離所述基因產(chǎn)物。
15.一種制備異聚體形式的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物的方法，其中根據(jù)權利要求13的宿主細胞在容許所述異聚體形式的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物表達的條件下培養(yǎng)，并從培養(yǎng)物或培養(yǎng)基中分離所述異聚體形式的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物，所述宿主細胞已經(jīng)用編碼異聚體形式的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物的不同亞單位的多個表達載體共轉(zhuǎn)染。
16.根據(jù)權利要求15的方法，其特征在于所述異聚體形式的蛋白質(zhì)為抗體。
17.根據(jù)權利要求14-16中任一項的方法，其特征在于對所述宿主細胞進行一個或多個基因擴增步驟。
18.根據(jù)權利要求17的方法，其特征在于所述可擴增的選擇標記是DHFR，并且擴增劑為氨甲蝶呤。
19.根據(jù)權利要求18的方法，其特征在于僅對所述宿主細胞進行一個利用氨甲蝶呤擴增基因的步驟。
20.根據(jù)權利要求14-19中任一項的方法，其特征在于所述方法是在無血清培養(yǎng)基中進行。
21.根據(jù)權利要求14-20中任一項的方法，其特征在于所述宿主細胞在懸浮培養(yǎng)物中培養(yǎng)。
22.一種篩選表達目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物的宿主細胞的方法，其中在容許表達目的蛋白質(zhì)/產(chǎn)物和熒光蛋白質(zhì)的條件下，培養(yǎng)根據(jù)權利要求11-13任一項中的宿主細胞的群體，并鑒定和/或選擇顯示出熒光蛋白質(zhì)最高表達水平的一個或多個細胞。
23.根據(jù)權利要求22的方法，其特征在于所述選擇使用熒光激活細胞分揀器(FACS)來進行。
24.根據(jù)權利要求22或23的方法，其特征在于對所述被選擇的宿主細胞進行一個或多個額外的基因擴增步驟。
25.根據(jù)權利要求24的方法，其特征在于所述可擴增的選擇標記是DHFR，并且所述擴增劑為氨甲蝶呤。
全文摘要
本發(fā)明涉及真核生物細胞的表達載體，其包括編碼在功能上與倉鼠－泛素/S27a－啟動子連接的目的蛋白質(zhì)的基因，以及編碼熒光蛋白質(zhì)的基因。該表達載體優(yōu)選亦含有可擴大的可選擇標記基因。本發(fā)明亦描述宿主細胞，優(yōu)選是哺乳動物細胞，已經(jīng)利用該表達載體將其轉(zhuǎn)染，生產(chǎn)異源基因產(chǎn)物的過程，以及選擇高產(chǎn)細胞的方法。
文檔編號C12N15/69GK1717486SQ200380104426
公開日2006年1月4日 申請日期2003年11月25日 優(yōu)先權日2002年11月29日
發(fā)明者巴巴拉·埃南克爾, 于爾根·菲德, 拉爾夫·奧托, 斯蒂法諾斯·格拉馬蒂科斯 申請人:貝林格爾英格海姆法瑪兩合公司