專利名稱：通過pcr檢測人乳頭瘤狀病毒不同基因型的通用引物和方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及用于檢測和/或診斷樣本中人乳頭瘤狀病毒(HPV)存在或不存在的PCR引物以及使用所述引物檢測和/或分析樣本中HPV存在或不存在的方法，更特別地，涉及含有寡核苷酸的PCR引物，該寡核苷酸與不同類型的HPV核酸互補結(jié)合并由此獲得擴增產(chǎn)物，以及使用所述引物檢測和/或分析樣本中不同類型HPV存在或不存在的方法。
背景技術(shù)：
目前已發(fā)現(xiàn)人乳頭瘤狀病毒(HPV)涉及包括宮頸癌的多種腫瘤類別以及近120種不同的HPV基因型。HPV為環(huán)狀雙鏈DNA病毒，其基因組大小約為8kb。在感染宿主細(xì)胞后，在HPV基因組中E1至E7基因與早期步驟有關(guān)，而L1和L2基因與晚期步驟有關(guān)。特別地，E6和E7的每種蛋白，其為HPV感染宿主上皮細(xì)胞后被表達的致癌蛋白，特異結(jié)合宿主細(xì)胞的致癌抑制蛋白p53和pRB，并由此消除這些宿主蛋白的致癌抑制功能。因此該HPV的E6和E7蛋白引起所述感染細(xì)胞轉(zhuǎn)化并發(fā)展為腫瘤形式。
目前，根據(jù)E6、E7和L1基因的ORF(開放閱讀框架)序列的不同，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)超過120種不同的HPV基因型。當(dāng)其ORF的核苷酸序列差異分別為超過10％、2％至10％、以及低于2％時，其被定義為新基因型、新的亞型和新的變體。特別地，HPV 2、3、6、7、10、11、13、16、18、26、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、66、67、68、69及70型為已知的引起宮頸癌的原病毒。
據(jù)WHO統(tǒng)計，每年世界上有約450,000例新發(fā)宮頸癌患者，除乳腺癌之外，其為婦女癌癥的第一位。特別是，宮頸癌為最常見的婦女癌癥并且其在發(fā)展中國家可導(dǎo)致約300,000患者死亡。
HPV感染宮頸上皮基底細(xì)胞后，它們發(fā)展為諸如低度鱗狀上皮內(nèi)病變(LSIL)、高度鱗狀上皮內(nèi)病變(HSIL)和上皮內(nèi)瘤形成的先兆綜合癥，并最終發(fā)展為侵襲性癌癥。因有發(fā)展為癌前的先兆階段，在早期對這些先兆綜合癥進行診斷并由此預(yù)防宮頸癌是可能的。以色列已經(jīng)建立了對宮頸癌和其前期病癥的早期醫(yī)療體檢，其宮頸癌的發(fā)病率為每十萬個人中3.8例。另一方面，諸如哥倫比亞的發(fā)展中國家宮頸癌的發(fā)病率為每十萬個人中48.2例。
從二十世紀(jì)四十年代起，普遍實行用來篩選原發(fā)宮頸癌和其前期病變的基于細(xì)胞形態(tài)學(xué)的細(xì)胞涂片試驗。然而，諸如Pap涂片試驗的細(xì)胞學(xué)試驗并不真實且有高達30％-40％的假陽性。
再者，HPV雜交捕獲II型，其通過抗體酶顯色來檢測宮頸癌涂片DNA與RNA探針間的液體狀態(tài)互補雜交化合物，已經(jīng)用于輔助篩選或跟蹤宮頸癌及其前期病變。然而，這種試驗因其高成本而不能廣泛使用。因此，仍然需要開發(fā)在早期階段對宮頸癌和其前期病癥進行常規(guī)診斷的方法。
因此，為了檢測樣本中不同類型的HPV，已經(jīng)開展了利用PCR方法檢測早期通常的HPV型的廣泛研究，PCR可簡單快速地擴增特異核苷酸序列的DNA片段。
PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))方法，參見如美國專利第4,683,195和第4,683,202號，在此引用作為本發(fā)明的參考，該方法為通過加入與靶序列互補的核酸片段(寡引物)，并利用溫度的變化進行變性步驟、退火步驟和聚合步驟的重復(fù)步驟來擴增所述靶序列的較小的單元，可對特異有機體的靶核酸序列進行檢測的技術(shù)。通過使用PCR方法可以容易地檢測樣本DNA是否被HPV感染。
鑒于實際的臨床檢驗，因其真實并可大規(guī)模檢測HPV感染，所述的PCR方法比諸如Pap涂片的細(xì)胞學(xué)試驗有優(yōu)勢。另外，在試驗成本、處理時間、檢測敏感性、檢測特異性等等方面，PCR方法優(yōu)于細(xì)胞學(xué)試驗或液體狀態(tài)雜交捕獲方法。
因此，利用PCR方法檢測和/或診斷樣本中HPV型具有極大潛力。例如，美國專利第5,484,699號(Bouma Stanley等)，其在此引用作為本發(fā)明的參考，公開了用于擴增與宮頸癌特異相關(guān)的高風(fēng)險HPV型的DNA片段的核苷酸及利用該核苷酸檢測高風(fēng)險HPV型的方法。然而，美國專利第5,484,699號公開了產(chǎn)生針對特異HPV型DNA擴增產(chǎn)物的核苷酸，因此其不能檢測非高風(fēng)險HPV型。
此外，美國專利第6,352,825號，其在此引用作為本發(fā)明的參考，公開了擴增相當(dāng)不同的HPV型核酸的引物。但這些引物只能擴增諸如HPV16、18、31、33、35、39、45、51、52、54、55、56、57、58的高風(fēng)險組核酸。因此這種引物不能檢測低風(fēng)險HPV型和其它類型核酸。
目前，在世界范圍的臨床檢驗中已使用了用于診斷是否有HPV感染的通用引物。例如，主要在北美洲、南美洲和亞洲使用的MY09/MY11引物組，廣泛在歐洲使用的GP5+/GP6+引物組，以及廣泛使用的諸如FAP59/FAP64、PGMY09/PGMY11的新開發(fā)的其它引物組。
然而，因為與分類超過120種類型的不同HPV型比較這些引物組只能檢測有限的HPV型，并對HPV型缺乏敏感性，所以這些世界范圍廣泛使用的引物組也有缺陷。因此雖然它們有其它的價值和用途，這些通用引物組在臨床領(lǐng)域中的使用是有限的。
因此，目前仍需要開發(fā)通用引物，不僅用來產(chǎn)生不同致癌HPV型記分的DNA擴增產(chǎn)物并由此檢測樣本中致癌HPV型，而且通過增強對HPV型的敏感性，在早期階段篩選宮頸癌和其前期病變。

發(fā)明內(nèi)容
因此，本發(fā)明涉及同時檢測不同類別HPV型DNA的通用引物，該引物基本上排除了本領(lǐng)域的限制和缺陷所產(chǎn)生的一個或多個問題。
本發(fā)明的優(yōu)點是提供能夠與宮頸癌或其前期病變有關(guān)的致癌HPV型互補結(jié)合的通用引物，并檢測樣本中所述致癌HPV型的存在與否。
本發(fā)明的另一優(yōu)點是提供利用所述引物檢測所述致癌HPV型存在與否的方法。
本發(fā)明另外的特征和優(yōu)點將在以下的說明書中給出，部分可從說明書中顯而易見并從本發(fā)明的實踐中習(xí)得。從本發(fā)明的公開說明書、其權(quán)利要求書以及附圖中特別給出的組成部分可實現(xiàn)和達到本發(fā)明的上述和其它優(yōu)點。
為實現(xiàn)根據(jù)本發(fā)明的上述和其它優(yōu)點并依照本發(fā)明目的，作為具體和廣泛的描述，本發(fā)明提供用于檢測HPV基因型的通用引物，其中所述引物為選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO14。
另一方面，本發(fā)明提供擴增HPV基因型的核酸擴增步驟中使用的通用引物對，其中第一引物為選自SEQ ID NO1至SEQ ID NO7的寡核苷酸以及第二引物為選自SEQ ID NO8至SEQ ID NO14的寡苷核酸。
另一方面，本發(fā)明的用于擴增人乳頭瘤狀病毒基因型DNA的方法包括利用選自所述通用引物對的至少一對引物來進行核酸的擴增步驟。
另一方面，本發(fā)明提供用于分析樣本中人乳頭瘤狀病毒基因型存在分析樣本的方法，其包括如下步驟(a)通過使用選自通用引物的至少一對引物進行核酸擴增步驟來擴增所述樣本中人乳頭瘤狀病毒DNA；及(b)檢測擴增產(chǎn)物，其中所述擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)表明所述樣本中存在人乳頭瘤狀病毒基因型。
此外，在另一方面，本發(fā)明提供PCR試劑盒，其包括所述的通用引物對、用于擴增核酸的聚合酶、緩沖液、四種核苷酸。
應(yīng)理解，上述一般性描述及以下的詳細(xì)描述為示例性和解釋性的，意在提供對權(quán)利要求書的進一步的解釋。
附圖的簡要說明

圖1A至1C分別顯示當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案產(chǎn)生的引物對來擴增HPV-16感染Caski細(xì)胞株、HPV-18感染HeLa細(xì)胞株及HPV非感染K562細(xì)胞株時的PCR結(jié)果的凝膠電泳照片；圖2A至2H分別顯示當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的另一實施方案產(chǎn)生的引物對來擴增HPV-16感染Caski細(xì)胞株、HPV-18感染HeLa細(xì)胞株及HPV非感染K562細(xì)胞株時的PCR結(jié)果的凝膠電泳照片；圖3A至3C分別顯示當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明一個實施方案產(chǎn)生的3對引物來擴增挑選的含HPV DNA的質(zhì)粒時的PCR結(jié)果的凝膠電泳照片；圖4A至4G分別顯示當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案產(chǎn)生的7對引物來擴增挑選的含HPV DNA的質(zhì)粒時的PCR結(jié)果的凝膠電泳照片；
圖5顯示當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明另一個實施方案產(chǎn)生的引物對來擴增挑選的含HPV DNA的質(zhì)粒時的PCR結(jié)果的凝膠電泳照片；圖6A至6T分別為當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的一個實施方案產(chǎn)生的3對引物，以及常規(guī)用來擴增HPV DNA的引物對，通過常規(guī)檢測來擴增從宮頸癌相關(guān)個體中獲得的DNA時的PCR結(jié)果的凝膠電泳照片；圖7A至7J分別顯示當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明一個實施方案產(chǎn)生的3對引物，以及常規(guī)用來擴增HPV DNA的引物對，通過常規(guī)檢測來擴增從宮頸癌非相關(guān)個體中獲得的DNA時的PCR結(jié)果的凝膠電泳照片；圖8A至8T分別顯示當(dāng)使用根據(jù)本發(fā)明的另一個實施方案產(chǎn)生的7對引物，通過常規(guī)檢測來擴增從宮頸癌相關(guān)個體中獲得的DNA時的PCR結(jié)果凝膠電泳照片；及圖9A至9J分別顯示當(dāng)使用據(jù)本發(fā)明另一個實施方案產(chǎn)生的7對引物，通過常規(guī)檢測來擴增從宮頸癌非相關(guān)個體中獲得的DNA時的PCR結(jié)果凝膠電泳照片。
實施本發(fā)明的最佳方式如上所述，常規(guī)的通過PCR能夠與不同類型的HPV DNA雜交的寡核苷酸通用引物，只能檢測存在的HPV類型中相對有限的類型，并缺乏對HPV類型的敏感性。本發(fā)明設(shè)計的引物對與常規(guī)的通用PCR引物對比較能夠與更多HPV類型雜交，并由此通過使用本發(fā)明的引物對進行核酸擴增步驟來檢測更多不同的HPV類型。
首先，根據(jù)72種HPV類型的全長核苷酸序列，利用計算機程序，本發(fā)明設(shè)計具有代表性的通用PCR引物。本發(fā)明所設(shè)計的PCR引物能夠與宮頸癌相關(guān)的所有類型的HPV的核酸序列互補結(jié)合，其不僅包括高風(fēng)險組而且包括低風(fēng)險組并形成所述HPV類型的擴增產(chǎn)物。
根據(jù)本發(fā)明所設(shè)計的引物為具有約30bp的有限序列長度的寡核苷酸，并產(chǎn)生200-400bp的擴增產(chǎn)物。在有限的條件下，本發(fā)明人設(shè)計14條寡核苷酸序列。在此14條寡核苷酸序列中，7條核苷酸設(shè)計成5’引物(正向引物)以及另外7條核苷酸設(shè)計成3’引物(反向引物)。
然后，本發(fā)明人在所設(shè)計的5’引物中挑選至少1條核苷酸以及在所設(shè)計的3’引物中挑選至少1條核苷酸來組成引物對，并驗證其擴增結(jié)果。
本發(fā)明所設(shè)計的5’引物和3’引物中的任何一條寡核苷酸序列都能夠與包括宮頸癌相關(guān)HPV類型的不同類型HPV核酸序列互補結(jié)合。然而，特別的引物對，包括特異的選自組成所述5’引物的特異寡核苷酸序列以及選自組成所述3’引物的特異寡核苷酸序列，能夠擴增更多不同類型的HPV。
通過上述方法，用挑選的11對引物來擴增更多的不同類型的HPV的核酸。通過自動核酸序列儀(ExpediteTM8909合成儀，ABI公司)來合成所挑選的引物。在PCR步驟中使用這些合成的引物來擴增代表性HPV感染細(xì)胞株的DNA，并通過電泳來驗證所產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物。
而且，在PCR中利用合成的11對引物來擴增含有HPV DNA的不同質(zhì)粒，并根據(jù)其設(shè)想的擴增實驗利用電泳步驟來驗證擴增產(chǎn)物。
此外，通過使用合成的11對引物來擴增所述樣本并驗證擴增產(chǎn)物的存在與否而進行的PCR步驟能夠診斷HPV類型是否感染獲得自個體宮頸涂片的樣本。
為在臨床檢驗中使用合成的引物對，本發(fā)明人通過諸如陰道鏡的臨床病理試驗檢驗個體宮頸涂片獲得的樣本，并將所述個體分為與宮頸癌相關(guān)的異常個體和與宮頸癌無關(guān)的正常個體。然后，通過擴增雜交捕獲II型(DIGENE Corp.)和DNA芯片試驗(BIOMDERAB Co.Ltd.)檢測一些異常和正常的個體來更特異地驗證HPV感染。
因此，使用本發(fā)明的通用引物和已知的代表性通用引物對MY09/MY11來擴增獲得自所述異常個體或正常個體的每種DNA樣本。本發(fā)明人證實了本發(fā)明的通用引物對可產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，這與細(xì)胞學(xué)試驗、雜交捕獲II型和DNA芯片試驗的結(jié)果一致，并且其能夠準(zhǔn)確和早期地用于診斷樣本是否被HPV感染。也就是本發(fā)明所述引物對針對獲得自被檢驗為宮頸癌相關(guān)個體的DNA樣本產(chǎn)生擴增產(chǎn)物，而針對獲得自被檢驗為宮頸癌無關(guān)個體的DNA樣本不產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。
以下的實施例是為了更詳細(xì)地說明本發(fā)明而進行的示例性說明，但是本發(fā)明并不限于以下的實施例。
實施例實施例1PCR引物設(shè)計與合成(1)PCR引物設(shè)計根據(jù)本發(fā)明的目的，設(shè)計能夠與不同類型HPV互補結(jié)合并由此擴增全部HPV類型DNA的作為PCR通用引物的核苷酸序列。
首先，從美國NCBI(國家生物技術(shù)信息中心)和Los Alamos的國家HPV數(shù)據(jù)庫導(dǎo)出諸如HPV 1a、2a、3、4、5、6b、7、8、9、10、11、12、13、15、16、16r、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35h、36、37、38、39、40、41、42、44、45、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、63、65、66、67、68、70、72、73、74、75、76、77及80型的72種HPV類型的全長核酸序列。
利用Clustal W計算機程序(DNSSTAR，MegAlignTM5，DNASTARInc.)進行導(dǎo)出的DNA序列的DNA序列同源性研究，該程序通過成對對齊、多序列對齊和種系發(fā)生樹來篩選組中代表性堿基序列。隨后利用另一計算機程序(primer premier 6，PREMIER Biosoft International Co.)設(shè)計基于篩選的堿基序列的PCR通用引物。所述引物設(shè)置成約27±3bp或約31±2bp長度的核酸序列，且其擴增產(chǎn)物約為200-500bp，并設(shè)計出30對PCR通用引物對。
(2)實際擴增和PCR引物合成所設(shè)計的30對引物的每一對用于擴增實際的72種HPV類型，其是利用另一種計算機程序(Amplify 1.2，Wisconsin大學(xué))的引物設(shè)計步驟中被導(dǎo)出。利用所設(shè)計的PCR通用引物對來驗證擴增不同HPV類型的DNA的寡核苷酸序列，特別是諸如HPV 2a、3、6b、7、10、11、13、16、18、26、30、31、32、33、34、35、39、40、42、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、61、66、67、68、70、73及74型的與宮頸癌相關(guān)的36種HPV類型。一些驗證的寡核苷酸序列用作5’引物(正向引物)而另一些用作3’引物(反向引物)。
將所挑選的5’引物和3’引物任意組合來進行實際的擴增。隨后，確定了擴增不同HPV類型DNA的三對引物。在下文中，為便于本發(fā)明的描述，根據(jù)實施例1的三對組合引物中的每一對分別稱為AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3。表1顯示了核苷酸序列、SEQ ID No、擴增HPV類型、擴增產(chǎn)物大小以及所述確定引物對的擴增區(qū)域的實際擴增結(jié)果。
表1HPV DNA擴增的探針或通用引物

*5’引物(正向引物)；**3’引物(反向引物)
而且，表2顯示了通過AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3對代表性宮頸癌相關(guān)HPV類型的實際擴增產(chǎn)物大小。
表2.通用引物的預(yù)期擴增產(chǎn)物大小

*沒有擴增(3)挑選的通用PCR引物的合成合成上述挑選的三對PCR通用引物AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3。通過ExpediteTM8909合成儀(ABI inc.)來合成上述引物對，其中使用基于寡核苷酸亞磷酰胺合成化學(xué)的固相合成方法合成。開始時，在固定了位于寡核苷酸3’端的核苷酸的CPG柱上進行合成反應(yīng)。通過重復(fù)基本的脫三苯甲基反應(yīng)、耦合反應(yīng)、加帽反應(yīng)和氧化反應(yīng)來使核苷酸聚合形成挑選的PCR引物的寡核苷酸。在終止合成后，在CGP柱中加入30％的氨水溶液來去除寡聚物，并隨后使用速度真空(Speed Vacuum)在55℃將所述的寡聚物干燥濃縮12小時使其脫保護。利用反向液相色譜和陰離子交換色譜來純化該濃縮的寡聚物。通過檢測在260nm波長的吸光度來定量分析該純化的最終寡聚物。
實施例2PCR引物設(shè)計與合成除將所設(shè)計的通用PCR引物設(shè)置為約24±3bp和約33±2bp的核苷酸序列且其擴增產(chǎn)物約為170～550bp外，以與實施例1相同的條件與步驟完成實施例2。
在上述條件下，挑選最終的8對通用引物。在下文中為便于表述，根據(jù)本發(fā)明實施例所述的8對組合引物的每一對分別稱為AlbioGP3、AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9、AlbioGP10及AlbioGP11。表3顯示了核酸序列、SEQ ID No、擴增HPV類型、擴增產(chǎn)物大小以及所述確定引物對的擴增區(qū)域的實際擴增結(jié)果。而且表4顯示了通過利用AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9、AlbioGP10及AlbioGP11對代表性宮頸癌相關(guān)HPV類型的實際擴增產(chǎn)物大小。
以與實施例1的相同條件和步驟合成挑選的8對通用引物對(AlbioGP4至AlbioGP11)。
表3用于HPV DNA擴增的探針與通用引物

*與AlbioGP1基本相同；**與AlbioGP2基本相同；***5’引物(正向引物)；****3’引物(反向引物)；
表4.通用引物預(yù)期的擴增產(chǎn)物大小

實施例3利用通用引物的PCR擴增利用實施例1合成的3對引物(AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3)通過PCR來擴增作為靶標(biāo)的HPV 16感染Caski細(xì)胞株(ATCC CRL-1550)、HPV 18感染HeLa細(xì)胞株(ATCC CCL-2)及非HPV感染K-562細(xì)胞株(KCLB-10243，韓國細(xì)胞株庫)。
根據(jù)制備者說明書來培養(yǎng)每一種Caski、HeLa及K-562細(xì)胞并隨后向Caski和HeLa細(xì)胞中加入0.25％胰蛋白酶溶液，離心來自培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)細(xì)胞株。用Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(Gibco Inc.)洗滌每一種培養(yǎng)的Caski、HeLa及K-562細(xì)胞株一次，在顯微鏡下檢測細(xì)胞數(shù)量。隨后將來自培養(yǎng)細(xì)胞株的2×104個細(xì)胞懸浮在230μL(微升)的D.W中，在100℃(攝氏)下加熱15分鐘來提取細(xì)胞DNA。在室溫下冷卻提取的細(xì)胞DNA并在12,000rpm下離心5分鐘。從所述離心中獲得的上清液用作模板DNA溶液。
利用所述的DNA溶液和PCR反應(yīng)溶液(TaKaRa Co.，LTD.，日本)完成PCR反應(yīng)。PCR溶液由2.5μL的10×緩沖液，3.75μL的10mM MgCl2，0.5μL的10mM dNTPs，0.5μL(5單位)的Taq聚合酶，1μL(50pM)實施例1合成的每一對通用引物對及11.5μL每一種DNA模板構(gòu)成。該PCR溶液在94℃預(yù)熱5分鐘后，在94℃變性1分鐘，42℃退火1分鐘，及72℃延伸1分鐘下進行49個循環(huán)，并最終72℃加熱5分鐘來進行擴增。對于HPV檢測，將5μL每一種最終擴增反應(yīng)產(chǎn)物與DNA分子大小標(biāo)準(zhǔn)標(biāo)志轉(zhuǎn)移到用0.00005％溴化乙啶溶液標(biāo)記的2％瓊脂糖凝膠上，用于電泳。通過將顯示在凝膠中每一泳道的條帶大小與實施例1的表1所列期望擴增大小比較，能夠確認(rèn)正確的條帶。
圖1A至1C分別為當(dāng)使用實施例1合成的AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3擴增每一種HPV 16感染Caski細(xì)胞株、HPV 18感染HeLa細(xì)胞株及非HPV感染K-562細(xì)胞株時，顯示PCR結(jié)果的溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠電泳照片。在圖中，M帶為標(biāo)準(zhǔn)大小標(biāo)志，其旁邊的數(shù)字表示標(biāo)志的大小，在底部的泳道1、泳道2及泳道3分別為利用AlbioGP1、AlbioGP2及AlbioGP3引物的擴增。
如圖所示，每一AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3對于HPV 16感染Caski細(xì)胞株(圖1A)、HPV 18感染HeLa細(xì)胞株(圖1B)產(chǎn)生的擴增產(chǎn)物與表2期望結(jié)果相同，但對于非HPV感染K-562細(xì)胞株(圖1C)不產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。
實施例4利用通用引物對的PCR擴增利用實施例2合成的8對引物(AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9、AlbioGP10及AlbioGP3)通過PCR來擴增作為靶標(biāo)的HPV 16感染Caski細(xì)胞株(ATCC CRL-1550)、HPV 18感染HeLa細(xì)胞株(ATCC CCL-2)及非HPV感染K-562細(xì)胞株(KCLB-10243，韓國細(xì)胞株庫)。
利用Dulbecco’s磷酸鹽緩沖鹽水(Gibco Inc.)洗滌根據(jù)制備者說明書來培養(yǎng)的每一種Caski、HeLa及K-562細(xì)胞一次，在顯微鏡下檢測細(xì)胞數(shù)量。隨后分離來自培養(yǎng)細(xì)胞株的2×106個細(xì)胞并利用“基因組分離試劑盒(Cat.No.K-3032，Bioneer Inc.)”進行純化，并溶于200μL(微升)D.W中獲得最終的模板DNA溶液。
除在總的25μL PCR反應(yīng)溶液中含有8.0μL的每種模板DNA外，以與實施例3相同的條件和步驟進行PCR反應(yīng)。
圖2A至2H分別為當(dāng)使用實施例1合成的AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9、AlbioGP10和AlbioGP11擴增每一種HPV 16感染Caski細(xì)胞株、HPV 18感染HeLa細(xì)胞株及非HPV感染K-562細(xì)胞株時，顯示PCR結(jié)果的溴化乙啶染色的瓊脂糖凝膠電泳照片。在圖中，M帶為標(biāo)準(zhǔn)大小標(biāo)志，其旁邊的數(shù)據(jù)顯示擴增產(chǎn)物的大小，而且在底部的泳道1、泳道2及泳道3分別為靶細(xì)胞株CaSki、HeLa和K562的結(jié)果。
圖2A至2H顯示的條帶與表4中對于靶標(biāo)HPV 16感染Caski細(xì)胞株(泳道1)、HPV 18感染HeLa細(xì)胞株(泳道2)的預(yù)期結(jié)果相同，即圖2A中AlbioGP4為398bp；圖2B中AlbioGP5為320bp；圖2C中AlbioGP6為530bp；圖2D中AlbioGP7為210bp；圖2E中AlbioGP8為430bp；圖2F中AlbioGP9為298bp；圖2G AlbioGP10為300bp；以及圖2H中AlbioGP11為172bp。但是，對于非HPV感染K562細(xì)胞株(泳道3)每一對通用引物不產(chǎn)生擴增產(chǎn)物。
實施例5利用含HPV不同質(zhì)粒的PCR擴增在此實施例中，利用實施例1合成的引物對AlbioGP1、AlbioGP2及AlbioGP3來擴增作為靶標(biāo)的含有不同HPV類型的質(zhì)粒DNA的大腸桿菌菌株。這些菌株為ATCC 45021(HPV 1a)、ATCC(HPV 2a)、ATCC 45150(HPV 6b)、ATCC 45151(HPV 11)、ATCC 45113(HPV 16)、ATCC 45152(HPV 18)、ATCC 65446(HPV 31)及ATCC 40338(ATCC 43)。
每種大腸桿菌菌株含有每種HPV類型的DNA插入質(zhì)粒，將該菌株搖動培養(yǎng)在37 LB液體培養(yǎng)基中，并利用“Qiafilter Plasmid Maxi試劑盒(Cat.No.12263，QIAGEN Corp.)”來分離和純化，調(diào)節(jié)濃度到10pg/μL。該調(diào)節(jié)濃度的菌株作為模板DNA溶液使用。
利用每一種通用引物對，以與實施例3相同的反應(yīng)組合和步驟完成每一種模板DNA的PCR擴增反應(yīng)。將顯示在凝膠中每一泳道的條帶大小與實施例1中表2的期望擴增大小比較，確定正確的條帶。
圖3A至3C分別為當(dāng)使用實施例1合成的AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3擴增含有特異HPV類型的質(zhì)粒DNA的大腸桿菌菌株時，顯示PCR結(jié)果的凝膠電泳照片。在圖中，M帶為標(biāo)準(zhǔn)大小標(biāo)志，其旁邊的數(shù)據(jù)顯示擴增產(chǎn)物的大小，而在底部的數(shù)據(jù)顯示插入所述菌株的HPV類型。
圖3A至3C顯示的條帶與表2對于含特異HPV DNA的大腸桿菌的預(yù)測結(jié)果相同，即，對每一目標(biāo)菌株AlbioGP1約為300～320bp(圖3A)；對每一目標(biāo)菌株AlbioGP2約為300～320bp(圖3B)；及對每一目標(biāo)菌株AlbioGP3約為200～220bp，含有HPV 1a質(zhì)粒DNA菌株(圖3C)除外。
實施例6利用含HPV的不同質(zhì)粒的PCR擴增在此實施例中，利用實施例2合成的AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9、AlbioGP10及AlbioGP10的7對通用引物對來擴增作為靶標(biāo)的含有不同HPV類型的質(zhì)粒DNA的大腸桿菌菌株。除不使用含有HPV 1a DNA的ATCC 45021菌株外，靶標(biāo)菌株與實施例5相同。
每種大腸桿菌菌株含有每種HPV類型的DNA插入質(zhì)粒，將該菌株搖動培養(yǎng)在37LB液體培養(yǎng)基中，并利用“Qiafilter Plasmid Maxi試劑盒(Cat.No.12263，QIAGEN Corp.)”來分離和純化，調(diào)節(jié)濃度到100ng/μL。這些調(diào)節(jié)了濃度的菌株作為模板DNA溶液使用。
利用每一種通用引物對，以與實施例4相同的反應(yīng)組合和步驟完成每一種模板DNA的PCR擴增反應(yīng)。將顯示在凝膠中每一泳道的條帶大小與實施例2中表4的期望擴增大小比較，確定正確的條帶。
圖4A至4G分別為當(dāng)使用實施例2合成的AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9及AlbioGP10擴增含有16型(ATCC 45113菌株)、18型(ATCC 45142菌株)、31型(ATCC 65446菌株)、43型(ATCC 40338菌株)、2a型(ATCC45202菌株)、6b型(ATCC 45140菌株)及11型(ATCC 45152菌株)的HPVDNA的每種大腸桿菌菌株時，顯示PCR結(jié)果的凝膠電泳照片。在圖中，M帶為標(biāo)準(zhǔn)大小標(biāo)志，其旁邊的數(shù)據(jù)顯示標(biāo)志大小，及在底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5、泳道6及泳道7分別顯示利用通用引物對AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9及AlbioGP10的結(jié)果。
圖4A至4G顯示的條帶與表4對于含特異HPV DNA的大腸桿菌的預(yù)測結(jié)果相同，即，在圖4A至4G每一圖中的泳道1，對每一目標(biāo)菌株AlbioGP4約為380～410bp；在圖4A至4G每一圖中的泳道2，對每一目標(biāo)菌株AlbioGP5約為310～330bp；在圖4A至4G每一圖中的泳道3，對每一目標(biāo)菌株AlbioGP6約為520～550bp；在圖4A至4G每一圖中的泳道4，對每一目標(biāo)菌株AlbioGP7約為210～230bp；在圖4A至4G每一圖中的泳道5，對每一目標(biāo)菌株AlbioGP8約為430～450bp；在圖4A至4G每一圖中的泳道6，對每一目標(biāo)菌株AlbioGP9約為280～310bp；及在圖4A至4G每一圖中的泳道7，對每一目標(biāo)菌株AlbioGP10約為290～310bp。
實施例7利用含HPV的不同質(zhì)粒的PCR擴增在此實施例中，利用實施例2合成的通用引物對AlbioGP11來擴增作為靶標(biāo)的含有不同HPV類型的質(zhì)粒DNA的大腸桿菌菌株。靶標(biāo)菌株與實施例6相同。
提取含有每種HPV類型的質(zhì)粒DNA的每種大腸桿菌作為模板DNA溶液，并以與實施例6相同的反應(yīng)條件和步驟完成PCR擴增反應(yīng)。
圖5為當(dāng)使用AlbioGP11擴增含有特異HPV類型的每一種大腸桿菌菌株時，顯示PCR結(jié)果的凝膠電泳照片。在圖中，M帶為標(biāo)準(zhǔn)大小標(biāo)志，其旁邊的數(shù)據(jù)顯示標(biāo)志大小，及在底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5、泳道6及泳道7分別顯示含有16型(ATCC 45113菌株)、18型(ATCC 45142菌株)、31型(ATCC 65446菌株)、43型(ATCC 40338菌株)、2a型(ATCC 45202菌株)、6b型(ATCC 45140菌株)及11型(ATCC45152菌株)的HPV DNA的靶標(biāo)大腸桿菌菌株的結(jié)果。
圖5顯示條帶與表4對于含有特異HPV DNA的每種大腸桿菌的期望結(jié)果相同，也就是，對于每種含有HPV 16 DNA的ATCC 45113菌株、含有HPV 18 DNA的ATCC 45142菌株、含有HPV 31 DNA的ATCC65446菌株、含有HPV 43 DNA的ATCC 40338菌株、含有HPV 2a DNA的ATCC 45202菌株、含有HPV 6b的ATCC 45140菌株及含有HPV 11DNA的ATCC 45151菌株，AlbioGP11產(chǎn)生約160～180bp的擴增產(chǎn)物。
對比實施例1HPV感染的細(xì)胞學(xué)檢驗在此對比實施例中，根據(jù)常規(guī)的細(xì)胞學(xué)試驗對獲得自個體的臨床樣本進行試驗。
在主管臨床醫(yī)生的控制下，對獲得自隨機挑選的30例個體的臨床樣本進行諸如陰道鏡試驗、宮頸成像試驗(cervicography test)、活檢試驗及Pap涂片的細(xì)胞學(xué)試驗，所述個體在“Pochon CHA大學(xué)醫(yī)學(xué)院”醫(yī)院的附屬婦科癌癥中心看過門診。如表4所示，其顯示了細(xì)胞學(xué)試驗的結(jié)果，個體1、2、3、4、5、6、7、9、10、12、13、14、18、19和20被診斷為SCC(鱗狀細(xì)胞癌)；個體6被診斷為“CIS(原位癌)”，其為宮頸癌的前期病變；以及個體8、11、15、16和17被診斷為“SIL(鱗狀上皮內(nèi)病變)”，其也為宮頸癌的早期病變。這些20例個體被分類為異常患者。
其它個體中，由于個體21、22、23、26和27具有正常的宮頸細(xì)胞、個體24、28、29和30僅具有與宮頸癌無關(guān)的肌瘤、以及個體25僅具有與宮頸癌無關(guān)的子宮內(nèi)膜異位癥，因此被歸類為宮頸癌非相關(guān)患者。
表5.細(xì)胞學(xué)試驗的臨床結(jié)果

*鱗狀細(xì)胞癌；**原位癌；***鱗狀上皮內(nèi)病變****子宮肌瘤對比實施例2雜交捕獲試驗與DNA芯片試驗在此對比實施例中，基于雜交捕獲(hybrid capture)II型試驗和DNA芯片試驗，對獲得自對比實施例1中個體的樣本進行檢測來診斷HPV感染與否。表6顯示依照雜交捕獲II型和DNA芯片試驗的試驗結(jié)果。
利用雜交捕獲II型試驗(DIGENE Corp.)對來自個體1、6、8、9、21、22、23、24、25和28的樣本進行試驗。根據(jù)雜交捕獲II型試驗，個體1、6、8和9被診斷為宮頸癌陽性以及個體21、22、23、24、25和28被診斷為宮頸癌陰性。
利用DNA芯片試驗(BIOMEDRAB Co.，LTD，韓國)對來自個體2、3、4、5、10、11、12、18、19和20的樣本進行試驗。個體2、3、4、5、10、11、12、18、19和20的樣本分別被診斷為被HPV 16、16、16、16、16、58、16、16、58和58型感染。這些的雜交捕獲試驗與DNA芯片試驗的結(jié)果與對比實施例1的結(jié)果是相同的。
表6.雜交捕獲和DNA芯片的臨床結(jié)果


*未進行試驗實施例8通過通用引物對進行宮頸癌的診斷在此實施例中，利用實施例1中AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3的通用引物對和在PCR中通常用于HPV的檢測的通用引物組合MY09(5’-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3’，SEQ ID No15)/MY11(5’-GC MCAGGGWCATAAYAATGG-3’，SEQ ID No16)，對作為靶DNA的來自對比實施例1中的異常個體的樣本進行擴增并隨后進行電泳。以常規(guī)步驟獲得異常個體的DNA樣本，并且根據(jù)實施例3所述的相同條件和步驟進行PCR和電泳。
圖6A至6T分別為當(dāng)利用實施例1合成的3對引物及常規(guī)用于擴增HPV DNA的引物對來擴增來自對比實施例1的異常個體(個體1至20)宮頸癌相關(guān)DNA樣本時，顯示PCR結(jié)果的凝膠電泳照片。
在圖中，M帶為標(biāo)準(zhǔn)大小標(biāo)志，其旁邊的數(shù)據(jù)顯示標(biāo)志大小，及在底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4分別顯示利用引物對AlbioGP1、AlbioGP2、AlbioGP3及MY09/MY11組合的結(jié)果。
圖6A至6G顯示的條帶與表4對于來自宮頸癌相關(guān)個體的每一種DNA樣本的預(yù)測結(jié)果相同，即，在圖6A至6T中的每一圖的泳道1中AlbioGP1約為310～320bp；在圖6A至6T中的每一圖的泳道2中AlbioGP2約為300～320bp；及在圖6A至6T中的每一圖的泳道3中AlbioGP3約為210～230bp。特別是，利用引物對AlbioGP1、AlbioGP2、AlbioGP3而非MY09/MY11組合的來擴增作為靶標(biāo)的來自宮頸癌復(fù)發(fā)患者的DNA樣本(對比實施例1的個體14)的結(jié)果如圖6N所示。
實施例9通過通用引物對進行宮頸癌的診斷在此實施例中，利用與實施例8相同的條件和步驟來擴增作為靶標(biāo)DNA的來自對比實施例1的正常個體的樣本。
圖7A至7J分別為當(dāng)利用AlbioGP1、AlbioGP2、AlbioGP3以及通常使用的引物對MY09/NY11引物組合來擴增每個來自對比實施例1正常個體(個體21至30)的宮頸癌非相關(guān)的DNA樣本時，顯示的PCR結(jié)果的凝膠電泳照片。
在圖中，M帶為標(biāo)準(zhǔn)大小標(biāo)志，邊上的數(shù)據(jù)顯示標(biāo)志的大小，及在底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4分別顯示利用引物對AlbioGP1、AlbioGP2、AlbioGP3及MY09/MY11組合的結(jié)果。
如圖6A至6G所示，在使用每一種本發(fā)明的AlbioGP1、AlbioGP2和AlbioGP3及MY09/MY11引物組合情況下，沒有擴增出來自正常個體的DNA樣本。
對比實施例3對HPV感染的細(xì)胞學(xué)檢驗在此對比實施例中，根據(jù)與對比實施例1步驟相同的常規(guī)細(xì)胞學(xué)試驗檢驗來自30例個體的臨床樣本。
表7所示為30例個體的細(xì)胞學(xué)試驗結(jié)果。如表7所示，個體1、2、5、7、8、13、14、16、17及18被診斷為HSIL(高度鱗狀上皮內(nèi)病變)，個體6、9、11、12、19和20被診斷為“ASCUS(非典型鱗狀細(xì)胞但意義未明確)，二者均被視為宮頸癌的前期病變，以及個體3、4、10及15被診斷為“SCC(鱗狀細(xì)胞癌)。此20例個體歸類為異?；颊?。另一方面，其它個體歸類為非宮頸癌相關(guān)的正?；颊?。
表7.細(xì)胞學(xué)試驗臨床結(jié)果

*高度鱗狀上皮內(nèi)癌；**鱗狀細(xì)胞病變；及***非典型鱗狀細(xì)胞但意義未明確對比實施例4雜交捕獲試驗與DNA芯片試驗在此對比實施例中，根據(jù)雜交捕獲II型試驗進行檢測來自對比實施例1的個體DNA樣本來診斷HPV的感染與否。
利用雜交捕獲II型方法(DIGENE Corp.)檢測來自個體1至30的樣本。來自宮頸癌相關(guān)異常個體1～11和11～19的每一樣本被診斷為宮頸癌陽性，而非宮頸癌相關(guān)的正常個體的每一樣本被診斷為宮頸癌陰性。這些雜交捕獲II型為基礎(chǔ)的試驗結(jié)果與對比實施例1的結(jié)果相同。然而，來自對比實施例3的異常個體12和20的樣本被診斷為宮頸癌陰性。
表8.雜交捕獲II型臨床結(jié)果

實施例10利用通用引物對對宮頸瘤形成的診斷在此實施例中，利用實施例2中的通用引物對AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP9及AlbioGP10在PCR中對來自對比實施例3的異常個體DNA樣本進行擴增并隨后進行電泳來早期診斷HPV感染和宮頸瘤形成。以常規(guī)步驟獲得異常個體的DNA樣本并以與實施例4相同的條件和步驟進行PCR和電泳。
圖8A至8T分別為當(dāng)利用根據(jù)實施例2合成的7對引物來擴增來自對比實施例3的異常個體(個體1至20)的宮頸癌相關(guān)DNA樣本時，顯示PCR結(jié)果的凝膠電泳照片。
在圖中，M條帶為標(biāo)準(zhǔn)大小標(biāo)志，邊上的數(shù)據(jù)顯示標(biāo)志的大小，底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5、泳道6和泳道7分別顯示利用引物對AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9和AlbioGP10的結(jié)果。
圖8A至8T顯示的條帶與表4對每一種來自宮頸瘤形成相關(guān)個體的DNA樣本的預(yù)測結(jié)果相同，即，在圖8A至8T的每一圖的泳道1中AlbioGP4約為310～320bp；在圖8A至8T的每一圖的泳道2中AlbioGP5約為300～320bp；在圖8A至8T的每一圖的泳道3中AlbioGP6約為210～230bp；在圖8A至8T的每一圖的泳道4中AlbioGP7約為～430bp；在圖8A至8T的每一圖的泳道5中AlbioGP8約為～444bp；在圖8A至8T的每一圖的泳道6中AlbioGP9約為～450bp；及在圖8A至8T的每一圖的泳道7中AlbioGP10約為～33bp。
實施例11通用引物對對正常臨床樣本的診斷在此實施例中，以與實施例8相同的條件和步驟擴增作為靶標(biāo)DNA的來自對比實施例3的正常個體樣本。
圖9A至9J分別為，當(dāng)利用AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP9及AlbioGP10對來自對比實施例3的正常個體(個體21至30)非宮頸癌相關(guān)的DNA樣本進行擴增時，顯示PCR結(jié)果的凝膠電泳照片。
在圖中，M條帶為標(biāo)準(zhǔn)大小標(biāo)志，邊上的數(shù)據(jù)顯示標(biāo)志的大小，底部的泳道1、泳道2、泳道3、泳道4、泳道5、泳道6和泳道7分別顯示利用引物對AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9和AlbioGP10的結(jié)果。
如圖9A至9G所示，來自正常個體的DNA樣本在使用任何AlbioGP4、AlbioGP5、AlbioGP6、AlbioGP7、AlbioGP8、AlbioGP9及AlbioGP10的情況下均未得到擴增。
在完成和應(yīng)用本發(fā)明時，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下，可對其進行多種修改和變化，這對于本領(lǐng)域所屬技術(shù)人員是顯而易見的。因此，只要這些修改和變化在所附權(quán)利要求和其等價物的范圍內(nèi)，本發(fā)明就涵蓋了對于本發(fā)明的修改和變化。
實用性本發(fā)明的寡核苷酸可用作互補結(jié)合并擴增通常的不同HPV基因型的引物對。
再者，因其與不同HPV基因組的特異序列互補結(jié)合，所以所述的寡核苷酸可用作檢測不同HPV基因型的探針。
特別是，在諸如PCR的核酸擴增步驟中，利用所述寡核苷酸作為引物對，以樣本DNA作為靶標(biāo)DNA，并檢測擴增產(chǎn)物，能夠確定樣本DNA是否被HPV感染。
因此，早期診斷和預(yù)測宮頸癌及其前期病變也是是可能的。
序列表<110>阿爾生物醫(yī)藥株式會社(ALBIOMED Co.，LTD.)<120>通過PCR檢測人乳頭瘤狀病毒不同基因型的通用引物和方法<150>KR10-2002-0075370<151>2002-11-29<150>KR10-2003-0053147<151>2003-07-31<160>16<170>KopatentIn 1.71<210>1<211>25<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPVDNA的探針<400>1ggcgatatgg ttgatacagg ctttg 25<210>2<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>2gcacaactat ttaataagcc atattgg 27<210>3<211>35<212>DNA
<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>3ttcttcttac gaagggaaca actgtttgtt agaca35<210>4<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>4gatggtgata tggtagatac aggatttgg 29<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>5tgatatggtt catacaggat ttgg24<210>6<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>6tgtacctgct attggggaac actgggctaa ggg 33<210>7<211>23
<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>7gaggtgggcc ggggncarcc nyt 23<210>8<211>29<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>8gcgtcagagg ttaccataga gccactagg 29<210>9<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>9agaagtaacc atagagccac tagg24<210>10<211>24<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>10aataaactgt aaatcatatt cctc24
<210>11<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>11cataattgaa acataaactg taaatcatat tcctc35<210>12<211>33<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>12taattgggaa tcagaagtaa ccatagagcc act 33<210>13<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>13aagccggtgt cgaccatrtc nccrtcyt28<210>14<211>28<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>檢測HPV DNA的探針<400>14ccgaagccgg tgtcgaycat rtcnccrt28
<210>15<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于HPV DNA擴增的引物MY09<400>15cgtccmarrg gawactgatc 20<210>16<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>用于HPV DNA擴增的引物MY11<400>16gcmcagggwc ataayaatgg 20
權(quán)利要求
1.用于擴增和測定人乳頭瘤狀病毒基因型的通用引物，所述通用引物為選自以下的寡核苷酸(a)SEQ ID NO1或與SEQ ID NO1完全互補的序列；(b)SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2完全互補的序列；(c)SEQ ID NO3或與SEQ ID NO3完全互補的序列；(d)SEQ ID NO4或與SEQ ID NO4完全互補的序列；(e)SEQ ID NO5或與SEQ ID NO5完全互補的序列；(f)SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6完全互補的序列；及(g)SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7完全互補的序列。
2.用于擴增和測定人乳頭瘤狀病毒基因型的通用引物，所述通用引物為選自以下的寡核苷酸(a)SEQ ID NO8或與SEQ ID NO8完全互補的序列；(b)SEQ ID NO9或與SEQ ID NO9完全互補的序列；(c)SEQ ID NO10或與SEQ ID NO1完全互補的序列；(d)SEQ ID NO11或與SEQ ID NO11完全互補的序列；(e)SEQ ID NO12或與SEQ ID NO12完全互補的序列；(f)SEQ ID NO13或與SEQ ID NO13完全互補的序列；及(g)SEQ ID NO14或與SEQ ID NO14完全互補的序列。
3.擴增人乳頭瘤狀病毒基因型的核酸擴增步驟中使用的通用引物對，其中第一引物為選自以下的寡核苷酸(a)SEQ ID NO1或與SEQ ID NO1完全互補的序列；(b)SEQ ID NO2或與SEQ ID NO2完全互補的序列；(c)SEQ ID NO3或與SEQ ID NO3完全互補的序列；(d)SEQ ID NO4或與SEQ ID NO4完全互補的序列；(e)SEQ ID NO5或與SEQ ID NO5完全互補的序列；(f)SEQ ID NO6或與SEQ ID NO6完全互補的序列；及(g)SEQ ID NO7或與SEQ ID NO7完全互補的序列；以及第二引物為選自以下的寡核苷酸(h)SEQ ID NO8或與SEQ ID NO8完全互補的序列；(i)SEQ ID NO9或與SEQ ID NO9完全互補的序列；(j)SEQ ID NO10或與SEQ ID NO1完全互補的序列；(k)SEQ ID NO11或與SEQ ID NO11完全互補的序列；(l)SEQ ID NO12或與SEQ ID NO12完全互補的序列；(m)SEQ ID NO13或與SEQ ID NO13完全互補的序列；及(n)SEQ ID NO14或與SEQ ID NO14完全互補的序列。
4.如權(quán)利要求3所述的通用引物對，其中所述第一引物為(a)及第二引物為(h)，所述的引物對擴增人乳頭瘤狀病毒基因型1a、2a、3、4、6b、7、10、11、13、16、16r、18、26、27、28、30、31、32、33、34、36、35h、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、65、66、67、68、70、72、73、74及77型。
5.如權(quán)利要求3所述的通用引物對，其中所述第一引物為(b)及第二引物為(i)，所述的引物對擴增人乳頭瘤狀病毒基因型1a、2a、3、4、6b、7、10、11、13、16、16r、18、26、27、28、30、31、32、33、34、35、35h、39、40、42、43、44、45、48、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、65、66、67、68、70、72、73、74及77型。
6.如權(quán)利要求3所述的通用引物對，其中所述第一引物為(c)及第二引物為(j)，所述的引物對擴增人乳頭瘤狀病毒基因型2a、3、6b、7、10、11、13、16、16r、18、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、35h、39、40、42、43、44、45、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、66、67、68、70、72、73、74、75及76型。
7.如權(quán)利要求3所述的通用引物對，其中所述第一引物為(d)及第二引物為(k)，所述的引物對擴增人乳頭瘤狀病毒基因型3、6b、7、10、11、13、16、18、26、29、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、62、64、66、68、70、73、74、75、76及77型。
8.如權(quán)利要求3所述的通用引物對，其中所述第一引物為(e)及第二引物為(j)，所述的引物對擴增人乳頭瘤狀病毒基因型2a、3、6b、10、11、13、16、18、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、39、40、43、44、45、48、49、50、51、52、54、55、56、57、58、59、61、62、64、66、67、68、70、72、73、75、76及77型。
9.如權(quán)利要求3所述的通用引物對，其中所述第一引物為(f)及第二引物為(1)，所述的引物對擴增人乳頭瘤狀病毒基因型2a、7、10、11、13、16、18、28、29、30、31、32、33、35、39、40、42、43、44、45、52、53、54、55、56、58、59、61、63、66、67、68、70、72、75、75及77型。
10.如權(quán)利要求3所述的通用引物對，其中所述第一引物為(g)及第二引物為(m)，所述的引物對擴增人乳頭瘤狀病毒基因型2a、3、6b、7、10、11、13、16、18、26、29、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、65、66、67、68、70、73、74及77型。
11.如權(quán)利要求3所述的通用引物對，其中所述第一引物為(g)及第二引物為(n)，所述的引物對擴增人乳頭瘤狀病毒基因型2a、3、6b、7、10、11、13、16、18、26、29、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、65、66、67、68、70、73、74及77型。
12.如權(quán)利要求3所述的通用引物對，其中所述第一引物為(d)及第二引物為(h)，所述的引物對擴增人乳頭瘤狀病毒基因型3、6b、7、10、11、13、16、18、26、29、30、31、32、33、34、35、39、40、42、43、44、45、51、52、53、54、55、56、58、59、60、61、65、66、67、68、70、73及74型。
13.擴增人乳頭瘤狀病毒基因型DNA的方法，其包括利用權(quán)利要求3所述的一對通用引物進行核酸擴增的步驟。
14.分析樣本中人乳頭瘤狀病毒基因型存在的方法，其包括步驟(a)利用權(quán)利要求3所述的一對通用引物，通過核酸擴增步驟來擴增所述樣本中人乳頭瘤狀病毒DNA；及(b)檢測擴增產(chǎn)物，其中所述擴增產(chǎn)物的出現(xiàn)表明所述樣本中存在人乳頭瘤狀病毒基因型。
15.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述擴增產(chǎn)物為標(biāo)記的。
16.如權(quán)利要求14所述的方法，其中所述樣本獲得自宮頸細(xì)胞。
17.試劑盒，其包括(a)如權(quán)利要求3所述的一對引物；(b)dNTP(dATP、dGTP、dCTP及dTTP)的混合物；(c)聚合酶；及(d)PCR緩沖液。
全文摘要
本發(fā)明涉及利用引物的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)的循環(huán)來測定樣本中不同人乳頭瘤狀病毒基因型的存在。在該方法中使用的引物為能夠與所有宮頸癌及其前期病變相關(guān)的HPV基因型特異核酸序列互補結(jié)合的通用引物，且該引物能夠用于擴增包括致癌高風(fēng)險組和低風(fēng)險組的宮頸瘤形成相關(guān)的HPV基因型。
文檔編號C12Q1/68GK1717498SQ200380104588
公開日2006年1月4日 申請日期2003年11月28日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月29日
發(fā)明者李相和, 金淵洙, 柳康烈, 金丞兆, 車光烈, 高正在 申請人:Cha威爾因斯株式會社