專利名稱：來(lái)自紅球菌屬的新表達(dá)系統(tǒng)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及來(lái)自紅球菌屬(Rhodococcus)，更具體地說(shuō)來(lái)自紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)的啟動(dòng)子，其調(diào)節(jié)和這個(gè)啟動(dòng)子及其調(diào)節(jié)在異源應(yīng)用中作為表達(dá)系統(tǒng)的用途。
背景技術(shù)：
放線菌(Actinomycetes)，和特別是紅球菌屬細(xì)菌以其代謝復(fù)雜分子的能力而聞名。幾種紅球菌屬種能夠降解燃料、苯、甚至TNT，因此涉及生化途徑和細(xì)胞工廠的微生物學(xué)領(lǐng)域廣泛研究了它們。在氧化天然和人為的碳?xì)浠衔镆约盀樯锶Φ纳锏厍蚧瘜W(xué)過(guò)程的積極參與者的微生物當(dāng)中，如有助于地球上產(chǎn)生不含碳?xì)浠衔锏拇髿獾奈⑸铮t球菌屬占據(jù)主要的位置。
幾種紅球菌屬種也降解天然的植物甾醇，其通過(guò)甾族化合物形成作為途徑中間體而進(jìn)行。這些甾族化合物可以反過(guò)來(lái)用作制備藥物活性化合物的前體。
為了大量制備作為微生物的途徑中間體的藥物前體化合物，常規(guī)轉(zhuǎn)化制備型菌株以優(yōu)化目的基因的表達(dá)和/或?yàn)榱诉_(dá)到中間體的蓄積而阻斷某些代謝途徑。這種轉(zhuǎn)化常常包括蛋白的異源表達(dá)。隨著紅球菌屬和其它放線菌屬(如分枝桿菌屬(Mycobacterium)、節(jié)桿菌屬(Arthrobacter)、諾卡氏菌屬(Nocardia)、棒桿菌屬(Corynebacterium)和短桿菌屬(Brevibacterium)種)細(xì)菌用于異源蛋白表達(dá)的增加，對(duì)于提高這種表達(dá)的調(diào)節(jié)和對(duì)于分子工具有增長(zhǎng)的需要。
目前，用經(jīng)典誘變分離了具有期望性質(zhì)的突變株，如紫外線照射，但是由于遺傳不穩(wěn)定性和/或生物轉(zhuǎn)化效率低，這些菌株常常不足以用于生產(chǎn)過(guò)程。分子限定的(構(gòu)建的)突變株將比經(jīng)典誘變產(chǎn)生的突變株呈現(xiàn)重要的優(yōu)點(diǎn)。構(gòu)建的突變株遺傳上更穩(wěn)定并且引入的突變代表明確的基因修飾。轉(zhuǎn)化構(gòu)建基因工程菌株也可以利用化學(xué)試劑阻斷某些陳舊途徑。用于主要阻斷酶活性的化學(xué)試劑大多數(shù)常常不具有反應(yīng)特異性并且可能抑制其它重要的酶反應(yīng)，其可能對(duì)生物轉(zhuǎn)化效率有消極效果。通過(guò)利用基因工程限定的突變株將克服這種問(wèn)題。
甾族化合物代謝中一種重要的酶，其可以例如在紅串紅球菌中發(fā)現(xiàn)，是3-甾酮Δ1-脫氫酶(KSTD1，EC 1.3.99.4)，其基因存在于所謂的kstD1位點(diǎn)(van der Geize，R.等人，2000.Appl.Environm.Microbiol.662029-2036)。盡管眾所周知甾族化合物分解代謝基因的分子組成在不同的紅球菌種之間可能有差異，但是在幾個(gè)其它細(xì)菌中已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了這個(gè)基因的同源物，如簡(jiǎn)單節(jié)桿菌(Arthrobactersimplex)、假單胞菌屬(Pseudomonas spp.)、限定諾卡氏菌(Nocardiarestrictus)、珊瑚色諾卡氏菌(Nocardia corallina)、不透明諾卡氏菌(Nocardia opaca)和偶發(fā)分枝桿菌(Mycobacteriumfortuitum)。Van der Geize等在WO 01/31050中已經(jīng)公開(kāi)了紅串紅球菌株SQ1的kstD基因序列并描述為SEQ ID NO1。
已知來(lái)自相同菌株的同工酶KSTD2，其相應(yīng)基因kstD2。已經(jīng)表明kstD1基因的破壞不完全消除3-甾酮Δ1-脫氫酶(KSTD)活性并且由于同工酶的存在而保持活性(Van der Geize等，2002.Microbiology1483285-3292；WO 01/31050)。
KSTD活性對(duì)于甾核降解是必需的，而且甾族化合物中間體蓄積需要kstD基因失活。基因失活是分析基因功能和引入代謝阻斷的有效方法。用攜帶選擇性標(biāo)記的非復(fù)制型載體進(jìn)行的基因破壞是基因失活的常用方法。
人們發(fā)現(xiàn)應(yīng)用3-酮-Δ4-甾族化合物可以誘導(dǎo)基因破壞突變株紅串紅球菌SDH420中的野生型KSTD活性，如4-雄甾烯-3，17-二酮，表明甾族化合物依賴性調(diào)節(jié)機(jī)制的存在。kstD基因座上游鑒定了一個(gè)基因(ORF2)，其功能迄今無(wú)人知道，但被稱作攜帶TetR家族的阻抑蛋白共有序列的推定調(diào)節(jié)基因(Van der Geize，R.等人，2000.Appl.Environ.Microbiol.662029-2036)。
現(xiàn)在已經(jīng)發(fā)現(xiàn)kstD1基因啟動(dòng)子存在于紅串紅球菌的kstD基因座，和這個(gè)啟動(dòng)子是通過(guò)該細(xì)菌ORF2的基因產(chǎn)物的抑制來(lái)調(diào)節(jié)的，此后命名為kstR?，F(xiàn)在也已經(jīng)發(fā)現(xiàn)用甾族化合物誘導(dǎo)表達(dá)可以克服由kstR基因產(chǎn)物造成的kdtD啟動(dòng)子抑制。kstD基因-kstR組合阻抑系統(tǒng)的性質(zhì)使其特別適于在細(xì)菌中表達(dá)異源蛋白，如放線菌科的細(xì)菌。
發(fā)明概述在一個(gè)方面，本發(fā)明涉及包含來(lái)自紅串紅球菌的啟動(dòng)子的分離的多核苷酸，其特征在于所述啟動(dòng)子是kstD啟動(dòng)子。
該多核苷酸可以非常有利地用作可控制的轉(zhuǎn)錄激活。通過(guò)給所述分離的多核苷酸提供編碼所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)的核苷酸序列可以提供所述控制功能。在本發(fā)明中，這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)可以在外部誘導(dǎo)，如通過(guò)甾族化合物的引入。
在本發(fā)明可供選擇的實(shí)施方案中，該分離的多核苷酸可以包含作為kstD啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的kstR基因或其同源物或功能部分。
由于本發(fā)明分離的多核苷酸可以非常有利地用作異源表達(dá)系統(tǒng)，因此本發(fā)明的多核苷酸可以進(jìn)一步包含與所述所述啟動(dòng)子可操作連接的編碼多肽的核苷酸序列。
為了提供轉(zhuǎn)移了表達(dá)系統(tǒng)的細(xì)菌的可選擇性狀，該多核苷酸可以進(jìn)一步包含編碼選擇性標(biāo)記、反選擇性標(biāo)記和/或報(bào)道基因的這種序列。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明分離的多核苷酸的重組載體。這種重組載體合適地包含代表多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列。
本發(fā)明也涉及構(gòu)建基因修飾的微生物菌株的方法，該微生物缺乏降解甾核的能力，該方法包括制備根據(jù)本發(fā)明的多核苷酸和用所述多核苷酸轉(zhuǎn)化所述菌株。
在另一方面，本發(fā)明涉及本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。所述宿主細(xì)胞優(yōu)選是來(lái)自放線菌目的細(xì)菌。非常合適的宿主細(xì)胞是屬于放線菌科、棒狀桿菌科、分枝桿菌科、諾卡氏菌科、短桿菌科或微球菌科的細(xì)菌，尤其是紅球菌屬的細(xì)菌。
在另一方面，本發(fā)明涉及在宿主細(xì)胞中制備目的蛋白的方法，包括用本發(fā)明的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
在另一方面，本發(fā)明涉及包含本發(fā)明的多核苷酸的微生物表達(dá)系統(tǒng)。
在又一方面，本發(fā)明涉及目的蛋白組成型表達(dá)的方法，包括用多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞，其中所述蛋白編碼區(qū)的表達(dá)在kstD啟動(dòng)子控制下。
在另一方面，本發(fā)明涉及甾族化合物誘導(dǎo)異源蛋白表達(dá)的用途，其中表達(dá)在kstD啟動(dòng)子控制下，所述甾族化合物取消(lifting)kstR基因產(chǎn)物發(fā)揮的阻抑功能。
附圖簡(jiǎn)述

圖1是構(gòu)建kstR非標(biāo)記基因缺失的誘變質(zhì)粒pREG104的示意圖。
圖2是來(lái)源于pRESQ的紅球菌表達(dá)載體pRESX的示意圖(Van derGeize，R.等人，2002.Mol.Microbiol.451007-1018)。閉合的實(shí)曲線棒表示kstD啟動(dòng)子區(qū)域。開(kāi)放的實(shí)曲線棒表示編碼自主復(fù)制的紅球菌基因。aphII編碼卡那霉素抗性。
發(fā)明詳述這里使用的術(shù)語(yǔ)“多核苷酸”是指任何長(zhǎng)度的多聚形式的核苷酸，核糖核苷酸或脫氧核糖核苷酸。因此，這個(gè)術(shù)語(yǔ)包括雙鏈和單鏈DNA和RNA。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“重組多核苷酸”意指基因組、cDNA、半合成或合成來(lái)源的多核苷酸，根據(jù)其來(lái)源或操作它(1)不與天然與其相關(guān)聯(lián)的多核苷酸的全部或一部分相關(guān)聯(lián)；或(2)與除天然與其連接的多核苷酸之外的多核苷酸連接；或(3)天然不存在。
這里使用的“轉(zhuǎn)化”是指外源多核苷酸向宿主細(xì)胞的插入，不管用于插入的方法是什么，例如直接吸收、轉(zhuǎn)導(dǎo)、f-配對(duì)或電穿孔法。外源多核苷酸可以維持在非整合載體上，例如質(zhì)粒，或可供選擇地，可以整合到宿主細(xì)胞基因組中。
“宿主細(xì)胞”是指含有載體和支持該載體復(fù)制和/或表達(dá)的細(xì)胞。宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞如大腸桿菌，或真核細(xì)胞如酵母、昆蟲(chóng)、兩棲動(dòng)物或哺乳動(dòng)物細(xì)胞。優(yōu)選，宿主細(xì)胞是放線菌目的細(xì)菌細(xì)胞。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“可操作連接”是指并列(juxtaposition)，其中所述的元件是允許它們以其預(yù)定方式發(fā)揮功能的關(guān)系。與另一控制序列和/或編碼序列“可操作連接”的控制序列以編碼序列在與控制序列相適合的條件下轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的方式連接。通常，可操作連接是指所連接的核酸序列是鄰近的，并且在需要連接兩個(gè)蛋白編碼區(qū)之處，是鄰近的或在同一閱讀框中。
這里使用的“啟動(dòng)子”是指導(dǎo)(結(jié)構(gòu))基因轉(zhuǎn)錄的DNA序列。典型地，啟動(dòng)子位于基因的5′區(qū)，最接近(結(jié)構(gòu))基因的轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)。如果啟動(dòng)子是誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，那么轉(zhuǎn)錄率隨響應(yīng)誘導(dǎo)劑而增加。相反，如果啟動(dòng)子是組成型啟動(dòng)子，則轉(zhuǎn)錄率不受誘導(dǎo)劑調(diào)節(jié)。
術(shù)語(yǔ)“多肽”是指氨基酸的聚合物并且不涉及產(chǎn)物的具體長(zhǎng)度，因此，肽、寡肽和蛋白都包括在多肽的定義內(nèi)。這個(gè)術(shù)語(yǔ)也不涉及或排斥多肽的表達(dá)后修飾，例如，糖基化、乙?；⒘姿峄鹊?。包括在該定義內(nèi)的是，例如含有一個(gè)或多個(gè)氨基酸類似物(包括例如非天然氨基酸)的多肽。具有取代鍵，以及本領(lǐng)域已知的天然存在或非天然存在的修飾的多肽。
這里使用的關(guān)于核酸的“異源”是來(lái)源于外來(lái)物種的核酸，或，如果來(lái)自相同物種，是在與天然狀態(tài)不同的天然基因組基因座進(jìn)行故意人為干預(yù)得到的。例如，與異源結(jié)構(gòu)基因可操作連接的啟動(dòng)子來(lái)自不同于結(jié)構(gòu)基因所來(lái)源的物種，或如果來(lái)自相同物種，則該啟動(dòng)子和基因天然不是可操作連接。異源蛋白可以來(lái)源于外來(lái)物種，或如果來(lái)自相同物種，則是通過(guò)異源核酸表達(dá)產(chǎn)生的。
“阻抑蛋白”是能夠識(shí)別并結(jié)合位于結(jié)構(gòu)基因5′區(qū)的DNA序列(操縱子)中所含的核苷酸序列的蛋白。阻抑蛋白與其同性質(zhì)(cognate)操縱子的結(jié)合引起結(jié)構(gòu)基因轉(zhuǎn)錄的抑制。
“增強(qiáng)子”是可以增加轉(zhuǎn)錄效率的DNA調(diào)節(jié)元件，不論該增強(qiáng)子相對(duì)于轉(zhuǎn)錄起始位點(diǎn)的距離或方向怎樣。
術(shù)語(yǔ)“分離的”是指物質(zhì)，如核酸，其實(shí)質(zhì)上或本質(zhì)上不含在其天然存在環(huán)境中發(fā)現(xiàn)的正常伴有的或與其相互作用的成分。分離的DNA分子是已經(jīng)分開(kāi)并且不再整合到其所來(lái)源的生物體基因組DNA的DNA片段。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”是指基因產(chǎn)物的生物合成。
“表達(dá)載體”是包含在宿主細(xì)胞表達(dá)的基因的DNA分子。典型地，基因表達(dá)處于某些調(diào)節(jié)元件的控制下，包括組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子、調(diào)節(jié)元件和/或增強(qiáng)子。這種基因“可操作連接”調(diào)節(jié)元件并且其表達(dá)在該調(diào)節(jié)元件的“控制下”。
術(shù)語(yǔ)“選擇性標(biāo)記”是指編碼代謝性狀的多核苷酸序列，其允許轉(zhuǎn)基因和非轉(zhuǎn)基因生物的分離，主要是指抗生素抗性的提供。選擇性標(biāo)記是例如編碼卡那霉素抗性標(biāo)記的aphII。
術(shù)語(yǔ)“反選擇性標(biāo)記”是指一種多核苷酸序列，它的表達(dá)是致死性的，而不是引起抗性，選擇性標(biāo)記通常就是這樣。反選擇性標(biāo)記是例如編碼枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶的sacB基因，在蔗糖存在下，其表達(dá)是致死性的。
這里使用的術(shù)語(yǔ)“報(bào)道基因”是指編碼可以被鑒定的基因產(chǎn)物的基因。報(bào)道基因包括但不限于氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶、[β]-半乳糖苷酶、螢光素酶和綠熒光蛋白。報(bào)道基因產(chǎn)物的鑒定方法包括但不限于酶試驗(yàn)和熒光試驗(yàn)。報(bào)道基因和檢測(cè)其產(chǎn)物的試驗(yàn)是本領(lǐng)域熟知的并且例如在Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等，Greene Publishing and Wiley-InterscienceNew York(1987)及定期更新物中描述。
如紅球菌屬的ORF2表示的序列，在SEQ ID NO4中描述，已經(jīng)被視為染色體基因簇的一部分且含有kstD1基因(Van der Geize，R.等，2000.Appl.Environ.Microbiol.662029-2036)，其中據(jù)說(shuō)它編碼TetR型阻抑蛋白(命名為kstR)。然而，直到現(xiàn)在從未公開(kāi)阻抑功能行使或取消(lifted)的環(huán)境。而且，kstR的阻抑功能和kstD1基因啟動(dòng)子之間的關(guān)系至今仍未確立。
在簡(jiǎn)單節(jié)桿菌中，已經(jīng)描述了kstD基因和編碼ORF的推定阻抑蛋白(命名為kdsR)的類似基因組組成(Molnar，I.等人，1995.Mol.Microbiol.15895-905)。在這種情況下，已經(jīng)確定阻抑蛋白和甾族化合物酶表達(dá)之間沒(méi)有關(guān)系。
kstD1基因的啟動(dòng)子區(qū)尚未精確確定。kstD1基因的起始密碼子和kstR基因開(kāi)始處(與kstD1基因相比以倒序存在)之間的區(qū)域是大約158個(gè)堿基對(duì)的序列，其含有kstD1基因啟動(dòng)子的啟動(dòng)子和推測(cè)也含有kstR的啟動(dòng)子。萬(wàn)一這個(gè)啟動(dòng)子雙向工作，則kstD1啟動(dòng)子也可以驅(qū)動(dòng)編碼阻抑蛋白的基因表達(dá)。
根據(jù)本發(fā)明的啟動(dòng)子是驅(qū)動(dòng)kstD基因在紅球菌屬中表達(dá)的啟動(dòng)子并且它優(yōu)選包含根據(jù)SEQ ID NO3的158個(gè)堿基對(duì)的核苷酸序列或其截短形式(如刪除5′末端)，其仍具有啟動(dòng)子的功能能力，即驅(qū)動(dòng)它控制表達(dá)的蛋白表達(dá)。如何得到啟動(dòng)子缺失突變體是本領(lǐng)域熟知的，以及鑒定這種缺失突變體啟動(dòng)子的活性所需的試驗(yàn)無(wú)需過(guò)多勞動(dòng)且是本領(lǐng)域技術(shù)人員熟知的。各種參考文獻(xiàn)中描述了實(shí)施本發(fā)明有用的多核苷酸操作技術(shù)，如Molecular CloningA Laboratory Manual，2ndEd.，Vol.1-3，eds.Sambrook等人，Cold Spring Harbor LaboratoryPress (1989)或Current Protocols in Molecular Biology，eds.Ausubel等人，Greene Publishing and Wiley-InterscienceNew York(1987)及其定期更新物。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將知曉鑒定kstD啟動(dòng)子活性片段的方法，該方法可以包括，例如，測(cè)定mRNA轉(zhuǎn)錄或需要添加功能性啟動(dòng)子的來(lái)自報(bào)道基因的多肽表達(dá)。為了確定能夠控制與其可操作連接的編碼序列轉(zhuǎn)錄和/或表達(dá)的活性kstD啟動(dòng)子片段的存在，本領(lǐng)域技術(shù)人員將容易理解可以隨即進(jìn)行啟動(dòng)子功能性測(cè)試。為了確定啟動(dòng)子功能性，這種測(cè)試?yán)缈梢园ū景l(fā)明啟動(dòng)子和報(bào)道基因在載體中的可操作連接，將載體引入合適宿主，將宿主暴露在適于表達(dá)的條件下，和確定報(bào)道基因產(chǎn)物的存在。
雖然SEQ ID NO3給出了啟動(dòng)子(包括啟動(dòng)子元件)的核苷酸序列，但是應(yīng)認(rèn)識(shí)到可以進(jìn)行核苷酸取代，它不影響啟動(dòng)子或啟動(dòng)子元件的功能。
本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以對(duì)這里公開(kāi)的kstD啟動(dòng)子序列進(jìn)行點(diǎn)突變和缺失，而不改變?cè)撔蛄谢罨D(zhuǎn)錄的能力。此外，可以獲得kstD啟動(dòng)子的活性片段。類似的方法可以用于鑒定kstD啟動(dòng)子的活性片段。鑒定kstD啟動(dòng)子的活性片段的其它方法是常規(guī)的并且是本領(lǐng)域熟知的。例如，可以合成kstD啟動(dòng)子的重疊片段并克隆入合適的表達(dá)載體以確定活性kstD啟動(dòng)子片段。類似地，點(diǎn)突變可以引入公開(kāi)的kstD啟動(dòng)子序列，使用例如定點(diǎn)誘變或合成在一個(gè)或多個(gè)預(yù)定位置具有隨機(jī)核苷酸的序列。
本發(fā)明包括包含kstD啟動(dòng)子或其活性片段的分離的多核苷酸作為實(shí)施方案。這些分離的多核苷酸含有小于大約50％，優(yōu)選小于大約70％，和更優(yōu)選小于大約90％的與kstD啟動(dòng)子通常天然相關(guān)聯(lián)的染色體遺傳物質(zhì)。“基本上由kstD啟動(dòng)子組成”的分離的多核苷酸缺乏來(lái)源于kstD所在染色體的其它啟動(dòng)子。這些術(shù)語(yǔ)“分離的”和“基本上由…組成”類似地適用于kstR阻抑元件。例如，基本上由kstR阻抑蛋白組成的分離的多核苷酸缺乏位于kstR所在染色體上的多核苷酸材料，例如分別是增強(qiáng)子或啟動(dòng)子。
可以用本領(lǐng)域已知技術(shù)制備包含或基本上由kstD啟動(dòng)子和編碼kstR阻抑蛋白或其活性片段組成的分離的多核苷酸(如Sambrook等)。這些技術(shù)包括例如使用這里提供的序列信息提供引物和探針以PCR擴(kuò)增kstD基因組克隆的特殊區(qū)域，或通過(guò)化學(xué)合成，或通過(guò)重組方法。
使用這里提供的序列信息，通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的任何技術(shù)可能制備包含kstD啟動(dòng)子或其活性片段的重組多核苷酸，以及可能包含這里描述的其它kstD轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)元件的重組多核苷酸。
在實(shí)驗(yàn)部分，顯示啟動(dòng)子受阻抑蛋白調(diào)節(jié)，推測(cè)是與該啟動(dòng)子結(jié)合并因此抑制其控制的蛋白表達(dá)。包含kstD啟動(dòng)子的重組多核苷酸也可以包含kstR阻抑蛋白的編碼序列(如SEQ ID NO4所述)，該序列引起kstD促進(jìn)基因轉(zhuǎn)錄的抑制并提供該細(xì)胞接觸誘導(dǎo)物而被取消的調(diào)節(jié)機(jī)制，例如如下所述。
包含kstD啟動(dòng)子的重組多核苷酸也可以包含與啟動(dòng)子可操作連接的編碼序列，在該啟動(dòng)子控制下引起編碼序列轉(zhuǎn)錄。編碼序列可以編碼同源或異源多肽。然而，它們也可以編碼轉(zhuǎn)錄形式下期望的其它部分。例如，編碼序列可以編碼尤其是與轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合的誘騙(decoy)多核苷酸、反義RNAs、和感興趣的各種多肽(例如作為細(xì)胞內(nèi)疫苗的病毒蛋白，作為標(biāo)記的蛋白等等)、為商業(yè)目的的多肽，也就是說(shuō)在表達(dá)kstD蛋白的細(xì)胞中待表達(dá)的多肽、和特別是在細(xì)胞代謝調(diào)節(jié)和制備藥物前體中有用的蛋白。
對(duì)于啟動(dòng)子控制下蛋白的細(xì)胞外表達(dá)，可以在啟動(dòng)子和編碼目的基因的DNA之間插入信號(hào)序列。提供這種信號(hào)序列以允許蛋白靶向至特殊的細(xì)胞區(qū)室。優(yōu)選這些信號(hào)序列是馬紅球菌(R.equi)中存在并存放于Genbank登錄號(hào)為AJ242746的編碼膽固醇氧化酶的基因的信號(hào)序列(也見(jiàn)Navas，J.等人，2001.J.Bacteriol.1834796-4805)。
該啟動(dòng)子可以用于任何宿主細(xì)胞，但是優(yōu)選原核生物宿主細(xì)胞，更優(yōu)選來(lái)自放線菌目的細(xì)菌，如屬于放線菌科、棒狀桿菌科、分枝桿菌科、諾卡氏菌科、短桿菌科、微球菌科等的那些細(xì)菌。更優(yōu)選它是紅球菌屬、分枝桿菌屬、節(jié)桿菌屬、諾卡氏菌屬、棒狀桿菌屬或短桿菌屬的細(xì)菌。最優(yōu)選它是紅球菌屬的細(xì)菌，如Rhodococcusaetherovorans、嗜糞紅球菌(Rhodococcus coprophilus)、馬紅球菌(Rhodococcus equi)、Rhodococcus erythreus、紅串紅球菌、成束紅球菌(Rhodococcus fascians)、圓紅球菌(Rhodococcusgloberulus)、Rhodococcus jostii、Rhodococcus koreensis、Rhodococcus maanshanensis、海生紅球菌(Rhodococcusmarinonascens)、混濁紅球菌(Rhodococcus opacus)、滲濾紅球菌(Rhodococcus percolatus)、Rhodococcus pyridinivorans、椿象紅球菌(Rhodococcus rhodnii)、紫紅色紅球菌(Rhodococcusrhodochrous)、赤紅球菌(Rhodococcus rubber)、Rhodococcustukisamuensis、Rhodococcus wratislaviensis、佐氏紅球菌(Rhodococcus zopfii)等種的細(xì)菌菌株。
具有啟動(dòng)子，不具有阻抑蛋白的基因的細(xì)菌宿主細(xì)胞也是本發(fā)明的一部分。優(yōu)選這個(gè)宿主細(xì)胞是2002年10月9日保藏在德意志微生物保藏中心的保藏號(hào)為DSM15231的紅串紅球菌RG10。在這個(gè)細(xì)菌中，如實(shí)施例1所示，已經(jīng)刪除了編碼抑制蛋白的基因。
其中已經(jīng)刪除了抑制基因的這種宿主細(xì)胞可以用于蛋白的表達(dá)。優(yōu)選(盡管宿主細(xì)胞可能仍具有其內(nèi)源kstD啟動(dòng)子)控制目的蛋白表達(dá)的具有本發(fā)明kstD啟動(dòng)子的載體應(yīng)該導(dǎo)入細(xì)胞。構(gòu)建這種載體和這種載體轉(zhuǎn)化或轉(zhuǎn)染宿主細(xì)胞對(duì)于本領(lǐng)域技術(shù)人員來(lái)說(shuō)是常規(guī)的。因此，如實(shí)施例1所示，kstD啟動(dòng)子將不被抑制且充當(dāng)組成型啟動(dòng)子。
應(yīng)理解包含分離的kstD啟動(dòng)子或其活性片段的根據(jù)本發(fā)明的宿主細(xì)胞包括已經(jīng)被轉(zhuǎn)化的原始細(xì)胞的后代。當(dāng)然，由于自然、偶然或有意突變，單一親本細(xì)胞的后代在形態(tài)學(xué)或基因組或總DNA互補(bǔ)物上也許不一定與原始親本完全相同。
認(rèn)識(shí)到kstD啟動(dòng)子元件而不是kstR內(nèi)特殊的核苷酸或區(qū)域可能被鑒定為調(diào)節(jié)所需的。通過(guò)分析許多啟動(dòng)子突變體的功能能力由該元件的精細(xì)結(jié)構(gòu)切割可能定位這些核苷酸區(qū)域。利用聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)可以產(chǎn)生單一堿基突變。美國(guó)專利4,683,202。突變啟動(dòng)子區(qū)域可以使用標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)克隆回到報(bào)道構(gòu)建體并通過(guò)轉(zhuǎn)染合適細(xì)胞和檢測(cè)報(bào)道基因功能來(lái)評(píng)價(jià)。這個(gè)分析也將鑒定不影響啟動(dòng)子功能的核苷酸改變。
本發(fā)明的更多方面是使用阻抑蛋白及其誘導(dǎo)性進(jìn)行受控表達(dá)，通過(guò)給細(xì)胞提供編碼阻抑蛋白的序列和編碼需要可控制表達(dá)的蛋白的序列，在那里那個(gè)序列與kstD啟動(dòng)子可操作連接。kstR阻抑蛋白的序列可以包含在與目的kstD啟動(dòng)子基因構(gòu)建體相同的表達(dá)構(gòu)建體上，但是也可以在不同的構(gòu)建體上。還可以宿主細(xì)胞已含有阻抑基因，該基因位于質(zhì)粒或染色體上。然后，用包含kstD啟動(dòng)子的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化這種宿主細(xì)胞而建立表達(dá)系統(tǒng)。類似地，該宿主細(xì)胞可以已含有控制目的基因表達(dá)的啟動(dòng)子。然后編碼阻抑蛋白的基因的插入將在阻抑蛋白產(chǎn)生時(shí)終止目的基因的表達(dá)并且取消阻抑蛋白功能可以再次誘導(dǎo)表達(dá)。而且，kstR阻抑蛋白序列的表達(dá)可以在組成型啟動(dòng)子控制下。
用kstD-kstR系統(tǒng)控制目的基因表達(dá)的更多方法是通過(guò)在原處kstD啟動(dòng)子之后插入目的基因的編碼序列來(lái)取代正常在kstD啟動(dòng)子控制下的kstD基因。這可以通過(guò)本領(lǐng)域通常已知的技術(shù)來(lái)完成，如同源重組和/或使用重組酶及其識(shí)別位點(diǎn)如cre-lox系統(tǒng)。
添加具有3-酮-Δ4功能性的化合物可以取消(lift)由kstR基因產(chǎn)物發(fā)揮的kstD啟動(dòng)子的抑制。尤其是如4-雄烯-3，17-二酮(AD)、1，4-androstadiene-3，17-二酮(ADD)、酯-4-單烯-3，17-二酮、睪酮、黃體酮、降二酮(nordione)、7α-甲基-降二酮、11-亞甲基-降二酮的這種化合物，以及如孕烯醇酮和二氫睪酮(17β-OH-5α-雄甾烷-3酮)、19-OH-7-脫氫-雄烯-3，17-二酮和9α-羥基-4-雄烯-3，17-二酮(90HAD)的化合物能夠取消(lift)kstD啟動(dòng)子的抑制。
也可以鑒定可供選擇的調(diào)節(jié)化合物。例如，在kstD啟動(dòng)子控制下表達(dá)報(bào)道基因產(chǎn)物的細(xì)胞具有鑒定調(diào)節(jié)kstD啟動(dòng)子活性的試劑的用途。因此，在kstD啟動(dòng)子控制下表達(dá)報(bào)道基因產(chǎn)物的宿主細(xì)胞具有篩選的用途，本發(fā)明進(jìn)一步的目的是提供鑒定調(diào)節(jié)kstD啟動(dòng)子活性的化合物的方法。該方法包括含有kstD啟動(dòng)子的細(xì)胞接觸待確定的至少一種具有調(diào)節(jié)kstD啟動(dòng)子活性的能力的化合物。然后監(jiān)測(cè)由調(diào)節(jié)引起的該細(xì)胞的改變。
實(shí)施例實(shí)施例1.kstR非標(biāo)記基因缺失后kstD的組成型表達(dá)構(gòu)建kstR非標(biāo)記基因缺失的誘變質(zhì)粒pREG104，該基因編碼紅串紅球菌SQ1中kstD基因的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子(編碼3-甾酮Δ1-脫氫酶KSTD1)(圖1)。簡(jiǎn)言之，用限制性內(nèi)切酶NruI和BalI消化pSDH205(Van der Geize，R.等，2000. Appl. Environ. Microbiol.662029-2036)，隨后自身連接產(chǎn)生質(zhì)粒pREG103。含有kstR基因缺失的pREG103的EcoRI DNA片段隨后克隆入EcoRI消化的pK18mobsacB載體產(chǎn)生pREG104。使用pREG104通過(guò)如(Van der Geize R.等人，2001.FEMS Microbiol.Lett.205197-202)所述的sacB反選擇方法從紅串紅球菌SQ1分離kstR非標(biāo)記基因缺失突變株紅串紅球菌RG10。使用正向引物(REG-FOR)5’GGCGACGTTGCCGAGAATT 3’和反向引物(REG-REV)5’TCAGTGTCGTGAGAGATTCA 3’通過(guò)聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)證實(shí)真實(shí)的kstR基因缺失。由親本株SQ1基因組DNA(對(duì)照)得到618bp的PCR擴(kuò)增子。用kstR基因缺失突變株RG10的基因組DNA，擴(kuò)增子減少為393bp，證實(shí)kstR基因缺失。
通過(guò)突變株RG10和親本株SQ1的細(xì)胞在葡萄糖(20mM)礦物質(zhì)培養(yǎng)基(mineral medium)(1g·l-1NH4NO3，0.25g·l-1K2HPO4，0.25g·l-1MgSO4·7H2O，5mg·l-1NaCl，5mg·l-1FeSO4·7H2O(pH7.2))中30℃生長(zhǎng)3天，隨后甾族化合物(0.5g·l-14-雄烯-3，17-二酮(AD))誘導(dǎo)5小時(shí)，檢查組成型KstD1表達(dá)。作為對(duì)照，使用無(wú)甾族化合物誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)。AD溶于DMSO(50mg·ml-1)并添加到高壓滅菌的培養(yǎng)基中。用200ml磷酸緩沖液(KH2PO42.72g·l-1；K2HPO43.48g·l-1；MgSO4·7H2O 2.46g·l-1；pH7.2)洗滌細(xì)胞沉淀(30分鐘；7,300xg；4℃)。兩次通過(guò)弗氏壓碎器(140Mpa)破壞洗滌細(xì)胞懸浮液(5ml)。細(xì)胞抽提物以25,000xg離心20分鐘除去細(xì)胞碎片。KSTD活性染色的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(PAGE)檢測(cè)kstD表達(dá)(Van der Geize，R.等，2000.Appl.Environ.Microbiol.662029-2036)(表1)。由菌株RG10的無(wú)誘導(dǎo)細(xì)胞制備的無(wú)細(xì)胞抽提液發(fā)現(xiàn)KSTD1活性條帶，表明kstR基因缺失引起kstD基因的組成型表達(dá)(表1)。
表1.KSTD1活性染色的非變性PAGE檢測(cè)的kstR非標(biāo)記基因缺失時(shí)的組成型kstD表達(dá)。
實(shí)施例2.微生物的甾族化合物Δ1-脫氫作用下KstD2的組成型表達(dá)使用pREG104(圖1，見(jiàn)實(shí)施例1)構(gòu)建kstR基因缺失突變株紅串紅球菌RG9(Van der Geize，R.等，2002. Mol. Microbiol.451007-1018)，記做紅串紅球菌RG17。因此菌株RG17是kstD kstD2kshA1 kstR四部分基因缺失突變株，除了kstD啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子之外，缺乏3-甾酮Δ1-脫氫酶(KSTD1和KSTD2)和3-甾酮9α-羥化酶(KSH)活性。由于這個(gè)突變株的kstD kstD2 kshA表型，菌株RG17代謝4-雄烯-3，17-二酮(AD)、1，4-androstadiene-3，17-二酮(ADD)和9α-羥基-4-雄烯-3，17-二酮(90HAD)完全被阻斷。
為在紅串紅球菌SQ1(Van der Geize，R.等人，2000.Appl.Environ.Microbiol.662029-2036)的kstD啟動(dòng)子控制下表達(dá)基因，構(gòu)建紅球菌屬表達(dá)載體。使用kstD啟動(dòng)子，包含kstR基因缺失的紅串紅球菌突變株中基因的表達(dá)將是組成型的，因?yàn)槿狈stD表達(dá)的阻抑蛋白。使用正向引物5’ATAAAGCTTATCGATTATGTGTCCCGGCCGCGAAC3’和反向引物5’ATAGGTACCATATGTGCGTCCTTACTCCAAGAGGG3’，通過(guò)PCR擴(kuò)增(25循環(huán)30秒95℃，30秒64℃，30秒72℃，使用Taq聚合酶)從紅串紅球菌SQ1染色體DNA分離kstD啟動(dòng)子區(qū)(158bp)。NdeI位點(diǎn)(下劃線)并入擴(kuò)增子以能夠在kstD基因的ATG起始密碼子精確克隆目的基因。擴(kuò)增子(175bp)平端連接入穿梭載體pRESQ(Van der Geize，R.等，2002.Mol.Microbiol.451007-1018)的唯一SnaBI限制性位點(diǎn)，所得紅球菌屬表達(dá)載體記做pRESX(圖2)。
使用正向引物5′GCGCATATGGCTAAGAATCAGGCACCC3’(NdeI位點(diǎn)被下劃線)和反向引物5′GCGGGATCCCTACTTCTCTGCTGCGTGATG 3’(BamHI位點(diǎn)被下劃線)，采用PCR從親本株SQ1的染色體DNA分離編碼紅串紅球菌SQ1中KSTD2同工酶的kstD2基因(條件見(jiàn)上)。導(dǎo)入的NdeI和BamHI位點(diǎn)用于將kstD2擴(kuò)增子連接入NdeI/BglII消化的pRESX載體。所得質(zhì)粒記做pRESX-KSTD2。
用電轉(zhuǎn)化法將質(zhì)粒pRESX-KSTD2導(dǎo)入紅串紅球菌株RG17(Van derGeize，R.等，2000.Appl.Environ.Microbiol.662029-2036)，一個(gè)轉(zhuǎn)化體用于AD生物轉(zhuǎn)化。在卡那霉素(200μg·ml-1)存在下，100mlYG15(15g·l-1酵母提取物，15g·l-1葡萄糖)培養(yǎng)基中28℃(200rpm)生長(zhǎng)的培養(yǎng)物中實(shí)施由KSTD2引起的AD生物轉(zhuǎn)化為ADD。生長(zhǎng)直到晚期指數(shù)生長(zhǎng)期后(5至9的OD600)，添加AD(1g·l-1在0.1％[體積/體積]吐溫80中)，隨后幾天AD生物轉(zhuǎn)化為ADD。對(duì)于HPLC分析，培養(yǎng)樣品用甲醇/水(70∶30)稀釋5倍并過(guò)濾(0.45μm)。HPLC(用250-by3-mm反相Lichrosorb 10RP18柱[Varian Chrompack International，Middelburg，The Netherlands]，在254nm下UV檢測(cè)，和液相甲醇-水[60∶40]35℃)分析甾族化合物。
用帶有pRESX-KSTD2的紅串紅球菌株RG17的細(xì)胞的生物轉(zhuǎn)化實(shí)驗(yàn)表明KSTD2甾族化合物Δ1-脫氫酶活性的存在導(dǎo)致AD生物轉(zhuǎn)化為ADD至接近完成。相比之下，具有野生型KSTD1和KSTD2同工酶，但KSH反應(yīng)被阻斷的紅球菌屬突變株，AD轉(zhuǎn)變?yōu)锳DD，產(chǎn)量通常不超過(guò)50％，可能是由于調(diào)節(jié)機(jī)制(Van der Geize，R.等，2002.Mol.Microbiol.451007-1018)。
實(shí)施例3.kshA同工基因kshA2的表達(dá)互補(bǔ)kshA突變表型UV誘導(dǎo)的紅球菌屬突變株的互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)分離的DNA片段的核苷酸測(cè)序后鑒定了紅串紅球菌SQ1(Van der Geize，R.等，2002.Mol.Microbiol. 451007-1018)的kshA基因的同源物(homologue)。紅串紅球菌SQ1含有至少兩個(gè)kshA同工基因，記做kshA和kshA2。
紅串紅球菌RG2-紅串紅球菌SQ1(Van der Geize，R.等，2002.Mol. Microbiol. 451007-1018)的kshA基因缺失突變株，顯示不在補(bǔ)充AD(0.25g·l-1)作為唯一碳和能量來(lái)源的礦物質(zhì)瓊脂板(1g·l-1NH4NO3，0.25g·l-1K2HPO4，0.25g·l-1MgSO4·7H2O，5mg·l-1NaCl，5mg·l-1FeSO4·7H2O(pH7.2)，1.5％瓊脂)上生長(zhǎng)。因此，這些生長(zhǎng)條件下kshA2不在紅串紅球菌RG2中表達(dá)。
pRESX中kshA2基因位于kstD啟動(dòng)子的控制下。為了完成這點(diǎn)，使用正向引物5’GGCCATATGTTGACCACAGACGTGACGACC 3’(NdeI位點(diǎn)被下劃線)和反向引物5’GCCACTAGTTCACTGCGCTGCTCCTGCACG 3’(SpeI位點(diǎn)被下劃線)，通過(guò)PCR以紅串紅球菌染色體DNA為模板擴(kuò)增kshA2基因。所得kshA2擴(kuò)增子首先連接入EcoRV消化的pBlueScript(II)KS(pKSH311)，并隨后以NdeI/SpeI片段亞克隆入NdeI/SpeI消化的pRESX，產(chǎn)生pKSH312。
用電轉(zhuǎn)化將質(zhì)粒pKSH312導(dǎo)入紅串紅球菌RG2，所得轉(zhuǎn)化體復(fù)制鋪在含有0.25g·l-1AD作為唯一碳和能量來(lái)源的礦物質(zhì)瓊脂培養(yǎng)基中。所有轉(zhuǎn)化體能夠在AD礦物質(zhì)培養(yǎng)基中生長(zhǎng)，表明kshA2在kstD啟動(dòng)子控制下表達(dá)和互補(bǔ)kshA突變表型。
實(shí)施例4.誘導(dǎo)甾族化合物和組成型表達(dá)。
為了評(píng)估甾族化合物能夠誘導(dǎo)KstD基因的阻抑蛋白-啟動(dòng)子系統(tǒng)，在具有1，4-androstadiene-3，17-二酮(ADD)、睪酮、黃體酮、降二酮、雌酮(estron)、7α-甲基-降二酮、11-亞甲基-降二酮、二氫睪酮(17βOH-5α-雄甾烷-3-酮、19OH-7-脫氫-雄烯-3，17-二酮和孕烯醇酮的誘導(dǎo)條件下檢測(cè)如上所述的紅串紅球菌SQ1(野生型)和紅串紅球菌RG10(kstR突變株)的細(xì)胞培養(yǎng)物。4-雄烯-3，17-二酮(AD)誘導(dǎo)作為陽(yáng)性對(duì)照。
從誘導(dǎo)培養(yǎng)物，如上指出制備無(wú)細(xì)胞抽提物并使用DCPIP作為電子受體和AD作為底物檢測(cè)KSTD活性。發(fā)現(xiàn)除雌酮(estron)之外，所有檢測(cè)的甾族化合物都能夠誘導(dǎo)紅串紅球菌SQ1中的KSTD活性。對(duì)于所有檢測(cè)的甾族化合物，該活性水平不相同。天然凝膠上對(duì)照證實(shí)KSTD1活性確認(rèn)在所有陽(yáng)性例子中誘導(dǎo)。
此外，調(diào)查了KSTD1是否在紅串紅球菌RG10中組成型表達(dá)。從AD誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物和從非誘導(dǎo)的細(xì)胞培養(yǎng)物制備無(wú)細(xì)胞抽提物。使用DCPIP作為電子受體和AD作為底物檢測(cè)這些提取物的KSTD活性。為了比較，用紅串紅球菌SQ1實(shí)施相同程序。
發(fā)現(xiàn)在紅串紅球菌RG10的誘導(dǎo)以及非誘導(dǎo)培養(yǎng)物中，存在KSTD活性。另一方面，在紅串紅球菌SQ1中，僅僅在AD誘導(dǎo)的培養(yǎng)物中檢測(cè)到KSTD活性。天然凝膠上對(duì)照證實(shí)KSTD1活性確實(shí)在所有陽(yáng)性例子中誘導(dǎo)。
序列表<110>Akzo Nobel N.V.
<120>來(lái)自紅球菌屬的新表達(dá)系統(tǒng)<130>
<140>
<141>
<160>13<170>PatentIn Ver.2.1<210>1<211>1543<212>DNA<213>紅串紅球菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(1533)<400>1atg cag gac tgg acc agc gag tgc gac gtg ttg gta gtc ggc tcc ggc48Met Gln Asp Trp Thr Ser Glu Cys Asp Val Leu Val Val Gly Ser Gly1 5 10 15ggc gga gcg ctg acc ggc gca tat acc gcc gct gct cag gga ttg acg96Gly Gly Ala Leu Thr Gly Ala Tyr Thr Ala Ala Ala Gln Gly Leu Thr20 25 30acg atc gtc ctc gag aaa acc gat cgt ttc ggc ggg acc tcc gcc tac144Thr Ile Val Leu Glu Lys Thr Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ser Ala Tyr35 40 45tcg ggc gcc tcg atc tgg ctc cca ggt acc cag gtg cag gaa cgc gcc192Ser Gly Ala Ser Ile Trp Leu Pro Gly Thr Gln Val Gln Glu Arg Ala50 55 60gga ctt ccc gac tcg acc gag aat gcc cgc acc tat ctg cgc gcg ttg240Gly Leu Pro Asp Ser Thr Glu Asn Ala Arg Thr Tyr Leu Arg Ala Leu65 70 75 80ctc ggt gac gcc gag tcc gag cgc cag gac gcc tac gtc gag acc gct288Leu Gly Asp Ala Glu Ser Glu Arg Gln Asp Ala Tyr Val Glu Thr Ala85 90 95ccc gct gtc gtc gct cta ctc gag cag aac ccg aac atc gaa ttc gag336Pro Ala Val Val Ala Leu Leu Glu Gln Asn Pro Asn Ile Glu Phe Glu100 105 110ttc cgt gcg ttc ccc gac tac tac aaa gcc gaa ggc cgg atg gac acg384Phe Arg Ala Phe Pro Asp Tyr Tyr Lys Ala Glu Gly Arg Met Asp Thr115 120 125gga cgc tcc atc aac cct ctc gat ctc gat ccc gcc gac atc ggt gac432Gly Arg Ser Ile Asn Pro Leu Asp Leu Asp Pro Ala Asp Ile Gly Asp130 135 140ctc gco ggc aag gtg cgt ccg gaa ctg gac caa gac cgc acc ggt cag480Leu Ala Gly Lys Val Arg Pro Glu Leu Asp Gln Asp Arg Thr Gly Gln145 150 155 160gat cat gct ccc ggc ccg atg atc ggt ggg cgc gca ctg atc ggc cgt528Asp His Ala Pro Gly Pro Met Ile Gly Gly Arg Ala Leu Ile Gly Arg165 170 175
ctg ctg gcc gca gtt cag agc acc ggt aag gca gaa ctt cgc acc gaa576Leu Leu Ala Ala Val Gln Ser Thr Gly Lys Ala Glu Leu Arg Thr Glu180 185 190tcc gtc ctc acc tcc ctg atc gtg gaa gac ggc cgt gtt gtc ggc gcc624Ser Val Leu Thr Ser Leu Ile Val Glu Asp Gly Arg Val Val Gly Ala195 200 205gag gtc gaa tcc ggc ggc gaa acc cag cga atc aag gcg aac cgc ggt672Glu Val Glu Ser Gly Gly Glu Thr Gln Arg Ile Lys Ala Asn Arg Gly210 215 220gtc ctg atg gca gca ggc ggc atc gaa ggc aac gcc gag atg cgt gag720Val Leu Met Ala Ala Gly Gly Ile Glu Gly Asn Ala Glu Met Arg Glu225 230 235 240cag gca ggc acc ccc ggc aag gcg atc tgg agt atg ggt ccc ttc ggc768Gln Ala Gly Thr Pro Gly Lys Ala Ile Trp Ser Met Gly Pro Phe Gly245 250 255gcc aac acc ggc gac gcg atc tct gcc ggt att gct gtc ggc ggc gca816Ala Asn Thr Gly Asp Ala Ile Ser Ala Gly Ile Ala Val Gly Gly Ala260 265 270aca gcc ttg ctc gat cag gcg tgg ttc tgc ccc ggc gtc gag cag ccc864Thr Ala Leu Leu Asp Gln Ala Trp Phe Cys Pro Gly Val Glu Gln Pro275 280 285gac ggc agc gcc gcc ttc atg gtc ggc gtt cgc ggt ggg ctc gtc gtc912Asp Gly Ser Ala Ala Phe Met Val Gly Val Arg Gly Gly Leu Val Val290 295 300gac agc gcc ggt gag cgc tac ctc aac gag tcg ctt ccg tac gac cag960Asp Ser Ala Gly Glu Arg Tyr Leu Asn Glu Ser Leu Pro Tyr Asp Gln305 310 315 320ttc gga cga gcc atg gat gct cac gac gac aac ggt tct gcc gtg ccg1008Phe Gly Arg Ala Met Asp Ala His Asp Asp Asn Gly Ser Ala Val Pro325 330 335tcg ttc atg atc ttc gac tcg cgc gag ggt ggc gga ctg ccc gcc atc1056Ser Phe Met Ile Phe Asp Ser Arg Glu Gly Gly Gly Leu Pro Ala Ile340 345 350tgc atc ccg aac acg gcg ccc gcc aag cac ctc gaa gcc gga acg tgg1104Cys Ile Pro Asn Thr Ala Pro Ala Lys His Leu Glu Ala Gly Thr Trp355 360 365gtc ggt gcc gac act ctc gaa gaa ctc gct gcc aag acc gga cta ccg1152Val Gly Ala Asp Thr Leu Glu Glu Leu Ala Ala Lys Thr Gly Leu Pro370 375 380gcc gac gca ttg cgc agc act gtc gaa aag ttc aac gat gcc gca aaa1200Ala Asp Ala Leu Arg Ser Thr Val Glu Lys Phe Asn Asp Ala Ala Lys385 390 395 400ctg ggc gtc gac gaa gag ttc cat cgc ggc gaa gac ccg tac gac gcg1248Leu Gly Val Asp Glu Glu Phe His Arg Gly Glu Asp Pro Tyr Asp Ala405 410 415ttc ttc tgc cca ccc aac ggc ggt gcg aat gcg gca ctg acg gcc atc1296Phe Phe Cys Pro Pro Asn Gly Gly Ala Asn Ala Ala Leu Thr Ala Ile420 425 430gag aac gga ccg ttc tac gcg gcc cgc atc gtc ctc agt gac ctc ggc1344Glu Asn Gly Pro Phe Tyr Ala Ala Arg Ile Val Leu Ser Asp Leu Gly
435 440 445acc aag ggc gga ttg gtc acc gac gtc aac ggc cga gtc ctg cgt gct1392Thr Lys Gly Gly Leu Val Thr Asp Val Asn Gly Arg Val Leu Arg Ala450 455 460gac ggc agc gcc atc gac ggc ctg tac gcc gcc ggc aac acg agc gcg1440Asp Gly Ser Ala Ile Asp Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn Thr Ser Ala465 470 475 480tca ctg agc ggc cgc ttc tac ccc ggc ccc gga gtt cca ctc ggc acg1488Ser Leu Ser Gly Arg Phe Tyr Pro Gly Pro Gly Val Pro Leu Gly Thr485 490 495gct atg gtc ttc tcg tac cga gca gct cag gac atg gcg aag taa1533Ala Met Val Phe Ser Tyr Arg Ala Ala Gln Asp Met Ala Lys500 505 510cgcagttcaa 1543<210>2<211>511<212>PRT<213>紅串紅球菌<400>2Met Gln Asp Trp Thr Ser Glu cys Asp Val Leu Val Val Gly Ser Gly1 5 10 15Gly Gly Ala Leu Thr Gly Ala Tyr Thr Ala Ala Ala Gln Gly Leu Thr20 25 30Thr Ile Val Leu Glu Lys Thr Asp Arg Phe Gly Gly Thr Ser Ala Tyr35 40 45Ser Gly Ala Ser Ile Trp Leu Pro Gly Thr Gln Val Gln Glu Arg Ala50 55 60Gly Leu Pro Asp Ser Thr Glu Asn Ala Arg Thr Tyr Leu Arg Ala Leu65 70 75 80Leu Gly Asp Ala Glu Ser Glu Arg Gln Asp Ala Tyr Val Glu Thr Ala85 90 95Pro Ala Val Val Ala Leu Leu Glu Gln Asn Pro Asn Ile Glu Phe Glu100 105 110Phe Arg Ala Phe Pro Asp Tyr Tyr Lys Ala Glu Gly Arg Met Asp Thr115 120 125Gly Arg Ser Ile Asn Pro Leu Asp Leu Asp Pro Ala Asp Ile Gly Asp130 135 140Leu Ala Gly Lys Val Arg Pro Glu Leu Asp Gln Asp Arg Thr Gly Gln145 150 155 160Asp His Ala Pro Gly Pro Met Ile Gly Gly Arg Ala Leu Ile Gly Arg165 170 175Leu Leu Ala Ala Val Gln Ser Thr Gly Lys Ala Glu Leu Arg Thr Glu180 185 190Ser Val Leu Thr Ser Leu Ile Val Glu Asp Gly Arg Val Val Gly Ala195 200 205Glu Val Glu Ser Gly Gly Glu Thr Gln Arg Ile Lys Ala Asn Arg Gly
210 215 220Val Leu Met Ala Ala Gly Gly Ile Glu Gly Asn Ala Glu Met Arg Glu225 230 235 240Gln Ala Gly Thr Pro Gly Lys Ala Ile Trp Ser Met Gly Pro Phe Gly245 250 255Ala Asn Thr Gly Asp Ala Ile Ser Ala Gly Ile Ala Val Gly Gly Ala260 265 270Thr Ala Leu Leu Asp Gln Ala Trp Phe Cys Pro Gly Val Glu Gln Pro275 280 285Asp Gly Ser Ala Ala Phe Met Val Gly Val Arg Gly Gly Leu Val Val290 295 300Asp Ser Ala Gly Glu Arg Tyr Leu Asn Glu Ser Leu Pro Tyr Asp Gln305 310 315 320Phe Gly Arg Ala Met Asp Ala His Asp Asp Asn Gly Ser Ala Val Pro325 330 335Ser Phe Met Ile Phe Asp Ser Arg Glu Gly Gly Gly Leu Pro Ala Ile340 345 350Cys Ile Pro Asn Thr Ala Pro Ala Lys His Leu Glu Ala Gly Thr Trp355 360 365Val Gly Ala Asp Thr Leu Glu Glu Leu Ala Ala Lys Thr Gly Leu Pro370 375 380Ala Asp Ala Leu Arg Ser Thr Val Glu Lys Phe Asn Asp Ala Ala Lys385 390 395 400Leu Gly Val Asp Glu Glu Phe His Arg Gly Glu Asp Pro Tyr Asp Ala405 410 415Phe Phe Cys Pro Pro Asn Gly Gly Ala Asn Ala Ala Leu Thr Ala Ile420 425 430Glu Asn Gly Pro Phe Tyr Ala Ala Arg Ile Val Leu Ser Asp Leu Gly435 440 445Thr Lys Gly Gly Leu Val Thr Asp Val Asn Gly Arg Val Leu Arg Ala450 455 460Asp Gly Ser Ala Ile Asp Gly Leu Tyr Ala Ala Gly Asn Thr Ser Ala465 470 475 480Ser Leu Ser Gly Arg Phe Tyr Pro Gly Pro Gly Val Pro Leu Gly Thr485 490 495Ala Met Val Phe Ser Tyr Arg Ala Ala Gln Asp Met Ala Lys500 505 510<210>3<211>158<212>DNA<213>紅串紅球菌<400>3atcatcgatt atgtgtcccg gccgcgaacg accgcgctaa ttctctcacc tggaccaccc 60atctcggcat attgcccgct cagtgggacc tggcatggcc ttccagtgcc gtgcggtatt 120
ccgtggacac cccaccctct tggagtaagg acgcaatg158<210>4<211>19<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明引物<400>4ggcgacgttg ccgagaatt 19<210>5<211>624<212>DNA<213>紅串紅球菌<220>
<221>CDS<222>(1)..(624)<400>5atg ggg gcg acg ttg ccg aga att gcc gag gtc agg gac gct gct gag 48Met Gly Ala Thr Leu Pro Arg Ile Ala Glu Val Arg Asp Ala Ala Glu1 5 10 15ccc agt tcg gac gag cag cgg gcg cgc cat gtg cgg atg ctg gaa gcg 96Pro Ser Ser Asp Glu Gln Arg Ala Arg His Val Arg Met Leu Glu Ala20 25 30gcc gcc gaa ttg ggg acc gag aaa gaa ctc tca cgg gtt cag atg cac 144Ala Ala Glu Leu Gly Thr Glu Lys Glu Leu Ser Arg Val Gln Met His35 40 45gaa gtt gcc aag cgg gca ggc gtg gcc atc ggc act ctc tac cgc tat 192Glu Val Ala Lys Arg Ala Gly Val Ala Ile Gly Thr Leu Tyr Arg Tyr50 55 60ttc cct tcg aag acg cac ctc ttc gtc gct gtg atg gtc gag cag ate 240Phe Pro Ser Lys Thr His Leu Phe Val Ala Val Met Val Glu Gln Ile65 70 75 80gat cag atc ggc gac agt ttc gcc aag cat cag gtg cag tcg gcc aat 288Asp Gln Ile Gly Asp Ser Phe Ala Lys His Gln Val Gln Ser Ala Asn85 90 95ccg cag gac gcc gtg tac gag gtc ctg gtg cgc gcg act cgc ggg tta 336Pro Gln Asp Ala Val Tyr Glu Val Leu Val Arg Ala Thr Arg Gly Leu100 105 110ctg cgt cgg ccg gcc ctt tcg act gcg atg ctg cag tcg tcc agt acc 384Leu Arg Arg Pro Ala Leu Ser Thr Ala Met Leu Gln Ser Ser Ser Thr115 120 125gcc aac gtc gcg acg gtg ccg gac gtg ggc aag atc gat cgc ggc ttc 432Ala Asn Val Ala Thr Val Pro Asp Val Gly Lys Ile Asp Arg Gly Phe130 135 140cgg cag atc atc ctc gat gcg gcc ggg atc gag aac ccg acc gag gaa 480Arg Gln Ile Ile Leu Asp Ala Ala Gly Ile Glu Asn Pro Thr Glu Glu145 150 155 160gac aac acc ggg ttg cgt ctg ctg atg cag ctg tgg ttc ggg gtc atc 528Asp Asn Thr Gly Leu Arg Leu Leu Met Gln Leu Trp Phe Gly Val Ile
165 170 175caa tcg tgc ctc aac ggt cga att tcc atc ccg gat gcg gag tac gac576Gln Ser Cys Leu Asn Gly Arg Ile Ser Ile Pro Asp Ala Glu Tyr Asp180 185 190atc cgc aag ggg tgc gac ctg ctt ctg gtg aat ctc tca cga cac tga624Ile Arg Lys Gly Cys Asp Leu Leu Leu Val Asn Leu Ser Arg His195 200 205<210>6<211>208<212>PRT<213>紅串紅球菌<400>6Met Gly Ala Thr Leu Pro Arg Ile Ala Glu Val Arg Asp Ala Ala Glu1 5 10 15Pro Ser Ser Asp Glu Gln Arg Ala Arg His Val Arg Met Leu Glu Ala20 25 30Ala Ala Glu Leu Gly Thr Glu Lys Glu Leu Ser Arg Val Gln Met His35 40 45Glu Val Ala Lys Arg Ala Gly Val Ala Ile Gly Thr Leu Tyr Arg Tyr50 55 60Phe Pro Ser Lys Thr His Leu Phe Val Ala Val Met Val Glu Gln Ile65 70 75 80Asp Gln Ile Gly Asp Ser Phe Ala Lys His Gln Val Gln Ser Ala Asn85 90 95Pro Gln Asp Ala Val Tyr Glu Val Leu Val Arg Ala Thr Arg Gly Leu100 105 110Leu Arg Arg Pro Ala Leu Ser Thr Ala Met Leu Gln Ser Ser Ser Thr115 120 125Ala Asn Val Ala Thr Val Pro Asp Val Gly Lys Ile Asp Arg Gly Phe130 135 140Arg Gln Ile Ile Leu Asp Ala Ala Gly Ile Glu Asn Pro Thr Glu Glu145 150 155 160Asp Asn Thr Gly Leu Arg Leu Leu Met Gln Leu Trp Phe Gly Val Ile165 170 175Gln Ser Cys Leu Asn Gly Arg Ile Ser Ile Pro Asp Ala Glu Tyr Asp180 185 190Ile Arg Lys Gly Cys Asp Leu Leu Leu Val Asn Leu Ser Arg His195 200 205<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明引物<400>7tcagtgtcgt gagagattca 20
<210>8<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明引物<400>8ataaagctta tcgattatgt gtcccggccg cgaac 35<210>9<211>35<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明引物<400>9ataggtacca tatgtgcgtc cttactccaa gaggg 35<210>10<211>27<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明引物<400>10gcgcatatgg ctaagaatca g gcaccc 27<210>11<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明引物<400>11gcgggatccc tacttctctg ctgcgtgatg30<210>12<211>30<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>人工序列的說(shuō)明引物<400>12ggccatatgt tgaccacaga cgtgacgacc30<210>13<211>30<212>DNA<213>人工序列
<220>
<223>人工序列的說(shuō)明引物<400>13gccactagtt cactgcgctg ctcctgcacg30
權(quán)利要求
1.包含來(lái)自紅球菌屬(Rhodococcus)的啟動(dòng)子的分離的多核苷酸，其特征在于所述啟動(dòng)子是kstD啟動(dòng)子。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的多核苷酸，其中所述紅球菌屬是紅串紅球菌(Rhodococcus erythropolis)。
3.根據(jù)權(quán)利要求1或2的多核苷酸，其特征在于它包含來(lái)自SEQID NO3的序列的核苷酸1-158或其功能部分。
4.根據(jù)權(quán)利要求1-3的多核苷酸，進(jìn)一步包含編碼所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的核苷酸序列。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的多核苷酸，其中所述核苷酸序列的表達(dá)由甾族化合物控制。
6.根據(jù)權(quán)利要求5的多核苷酸，其中所述調(diào)節(jié)子包含kstR基因或其同系物或功能部分。
7.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的多核苷酸，進(jìn)一步包含與所述啟動(dòng)子可操作連接的編碼多肽的核苷酸序列。
8.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的多核苷酸，進(jìn)一步包含選擇性標(biāo)記、反選擇性標(biāo)記和/或報(bào)道基因。
9.根據(jù)前述任一項(xiàng)權(quán)利要求的多核苷酸，進(jìn)一步包含信號(hào)序列。
10.包含根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的多核苷酸的重組載體。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的重組載體，進(jìn)一步包含具有多克隆位點(diǎn)的核苷酸序列。
12.用根據(jù)權(quán)利要求10或11的重組載體轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是來(lái)自放線菌目(Actinomycetales)的細(xì)菌。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自屬于放線菌科(Actinomycetaceae)、棒狀桿菌科(Corynebacterineae)、分枝桿菌科(Mycobacteriaceae)、諾卡氏菌科(Nocardiaceae)、短桿菌科(Brevibacteriaceae)或微球菌科(Micrococcaceae)的細(xì)菌。
15.根據(jù)權(quán)利要求13的細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞選自屬于紅球菌屬的細(xì)菌。
16.根據(jù)權(quán)利要求13的細(xì)菌宿主細(xì)胞，其中所述宿主細(xì)胞是保藏在德意志微生物保藏中心的保藏號(hào)為DSM15231的紅串紅球菌RG10。
17.根據(jù)權(quán)利要求12-16任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞，其不含有功能性kstR基因或其同系物或功能部分。
18.在宿主細(xì)胞中產(chǎn)生目的蛋白的方法，包含用權(quán)利要求10或11的重組載體轉(zhuǎn)化宿主細(xì)胞。
19.包含根據(jù)權(quán)利要求1-9任一項(xiàng)的多核苷酸的微生物表達(dá)系統(tǒng)。
20.目的蛋白的組成型表達(dá)的方法，包括用多核苷酸構(gòu)建體轉(zhuǎn)化根據(jù)權(quán)利要求17的宿主細(xì)胞，其中所述蛋白編碼區(qū)的表達(dá)在kstD啟動(dòng)子控制下。
21.甾族化合物誘導(dǎo)異源蛋白表達(dá)的用途，其表達(dá)在kstD啟動(dòng)子控制下，所述甾族化合物取消由kstR基因產(chǎn)物發(fā)揮的阻抑蛋白功能。
22.鑒定調(diào)節(jié)kstD啟動(dòng)子活性的化合物的方法，包括將根據(jù)權(quán)利要求12-17任一項(xiàng)的宿主細(xì)胞暴露于至少一種待確定其調(diào)節(jié)kstD啟動(dòng)子活性的能力的化合物，和監(jiān)測(cè)所述細(xì)胞調(diào)節(jié)kstD啟動(dòng)子的活性。
全文摘要
本發(fā)明提供了包含來(lái)自紅串紅球菌的kstD啟動(dòng)子的分離的多核苷酸。該多核苷酸可以非常有利地用作可控制的轉(zhuǎn)錄激活子。通過(guò)給所述分離的多核苷酸提供編碼所述啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的核苷酸序列可以提供所述控制功能。在本發(fā)明中，這種轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子可以外部誘導(dǎo)，例如通過(guò)甾族化合物的引入。在本發(fā)明的可供選擇的實(shí)施方案中，分離的多核苷酸可以包含作為kstD啟動(dòng)子的轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)子的kstR基因或其同系物或功能部分。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1720329SQ200380104968
公開(kāi)日2006年1月11日 申請(qǐng)日期2003年12月2日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月3日
發(fā)明者R·范德蓋澤, G·赫塞爾斯, L·戴克休伊曾, P·范德梅登 申請(qǐng)人:阿克佐諾貝爾公司