專利名稱：用于產(chǎn)生和遞送抗病毒劑、佐劑和疫苗促進劑的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)的制作方法
相關申請的交互參照本申請要求2002年10月8日提交的美國臨時申請60/417,124的權益，該臨時申請在此處被完整地(包括所有圖、表、序列和公式)并入作為參考。
背景技術：
細胞因子和趨化因子是功能免疫系統(tǒng)的重要成分。例如，干擾素是生物技術最先的重組藥物之一并且用作抗病毒劑和用于動物健康中疫苗的免疫佐劑(2；24)。γ干擾素(IFN-γ)是一種細胞因子，其在動物中引起強烈的抗病毒和免疫佐劑應答(1-3；6；8；13；17；18；20；22；23；25)。IFN-γ-強化的疫苗(13；18)可用于治療疾病諸如牲畜中的船熱(shipping fever)和乳腺炎。然而，在當前技術下，已經(jīng)證明IFN-γ既不穩(wěn)定，生產(chǎn)又極端昂貴。每毫克的成本為數(shù)百美元，而所需的治療水平為每劑若干毫克，所以認為使用IFN-γ作為動物健康抗病毒劑或者作為疫苗佐劑是不切實際的。干擾素和其他細胞因子(在表1中列出)作為治療疾病的魔法的最初希望還沒有被完全實現(xiàn)(1)。
在牲畜和其他動物，如其他哺乳動物、鳥、魚和爬行動物中，IFN-γ直接或間接作用于先天性和適應性免疫系統(tǒng)的幾乎每一種組分(1)。此外，IFN-γ是最多效的細胞因子之一(如果不是最多效的細胞因子的話)，深刻影響抗原加工和呈遞、淋巴細胞遷移的抑制、巨噬細胞活化、B-淋巴細胞抗體產(chǎn)生(21)、天然殺傷(NK)細胞活性、以及與運輸和免疫識別有關的白細胞細胞表面分子的上調(diào)。IFN-γ的強受體位于T、B-淋巴細胞、NK細胞、單核細胞、巨噬細胞、成纖維細胞、嗜中性粒細胞、內(nèi)皮細胞和平滑肌細胞上。而且，由于其作為抗病毒劑的中心角色，IFN-γ是病毒破壞活性的主要靶標。例如，病毒編碼可以使IFN-γ失活、干擾IFN-誘導的抗病毒途徑和中斷細胞內(nèi)IFN-γ信號傳遞的蛋白質(zhì)。
1986年在大腸桿菌中首先克隆并合成了具有生物學活性的牛IFN-γ(5)。在1994年報導了馬IFN-γ的核苷酸序列，該序列與人IFN-γ具有67％序列同一性，與牛IFN-γ具有78％同一性。在1999年報導了重組雞IFN-γ的結構，并且在大腸桿菌中表達了一種具有活性的截短形式(在lys133處截短)。其3D結構與牛和人IFN-γ的類似，盡管總氨基酸同一性僅為32％(14)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了活性細胞因子和/或趨化因子組合物，以及活性細胞因子和/或趨化因子組合物的產(chǎn)生、經(jīng)改良細胞的包封、以及活性細胞因子和/或趨化因子組合物的加工和遞送的廉價方法。本發(fā)明還提供了治療方法和促進免疫應答的方法，該方法包括對動物或人施用活性γ-干擾素以及其他細胞因子和/或趨化因子組合物。
在本發(fā)明的一個方面，使用本領域中熟知的基因工程，可以在多種微生物細胞，包括在細菌熒光假單胞菌(Pseudomonas fluorescens)中表達IFN-γ以及多種其他細胞因子。適宜地重構細胞因子基因并將其精確地置于強調(diào)節(jié)啟動子和轉(zhuǎn)錄/翻譯終止子之間的宿主質(zhì)粒載體，可以常規(guī)地實現(xiàn)在具體外源宿主中IFN-γ的表達。本領域中技術人員通過普通方法也可以常規(guī)地試驗任一種宿主的適宜性，而不用過多實驗。一旦被轉(zhuǎn)化的微生物細胞已經(jīng)高水平表達了IFN-γ或其他細胞因子，則可以用作用物(包括熱和化學試劑)改良細胞，該作用物殺死(消毒)細胞、穩(wěn)定所表達的活性細胞因子，并改善細胞壁以最佳地釋放細胞包裹的細胞因子。例如，用于本說明書中表達IFN-γ的熒光假單胞菌的細胞的消毒/改良方法是最初用于生產(chǎn)商業(yè)生物殺蟲劑MVP的方法的改進方法(4；9；19)。根據(jù)該方法，用pH約4.3的魯戈氏碘液處理熒光假單胞菌的細胞。該pH充分地原位消毒培養(yǎng)物，改善細胞壁的物理耐久性，并使得細菌細胞壁易受蛋白水解溶解(9)。該方面還消除了細胞絮凝，并且顯示出減小該假單胞菌細胞壁的內(nèi)毒素性質(zhì)。
可以通過經(jīng)口、鼻、眼或腸胃外注射方法遞送含有IFN-γ的經(jīng)改良重組細胞(IFN-γ/ARCs)。孵育IFN-γ/ARCs的這些方法可用于治療人和動物(例如牛)中的疾病，含有牛IFN-γ的ARCs可用作預防劑以防止船熱，或者用于母牛以保護新生牛免受病毒性疾病和/或細菌性胃潰瘍。此外，還可以治療人和除了牛之外的動物，如馬、豬、雞，以及家庭寵物。該方法還可用于縮短動物和人中的多種應激相關的疾病以及作為免疫應答的佐劑和促進劑增強多途徑人接種，這可通過施用足夠量的含有IFN-γ的ARCs以誘導所希望的生物學效應。
附圖簡述

圖1是pMYC1803的質(zhì)粒圖。
圖2是除去信號肽的合成牛γ-干擾素的編碼序列、互補序列和氨基酸序列。
圖3是SDS-PAGE照片，顯示α和γ牛干擾素分別為約18和17kDa。培養(yǎng)樣品在加入凝膠之前以1∶5稀釋。每孔加入10μL。
圖4是弗氏壓碎器(French-Press)破壞的含有BAI和BGI的熒光假單胞菌培養(yǎng)物的十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)的照片，其顯示多數(shù)BAI出現(xiàn)在沉淀級分。
圖5是BGI/ARC穩(wěn)定性試驗結果的列表說明。
圖6A是體外牛腎臟細胞應答從重組大腸桿菌純化的同種牛IFN-γ(BGI)而產(chǎn)生的MHC II蛋白的圖解表示。圖6B是體外牛腎臟細胞應答1)未轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌MB324(ARC，無載體、無BGI)，2)轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌BR1241(ARC，有載體、無BGI)，3)轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌MR1605(BGI/ARC，ARC，有載體，有BGI)，和5)從重組熒光假單胞菌純化的BGI所產(chǎn)生的MHC II蛋白的比較圖解。
圖7A圖解了來自大腸桿菌的經(jīng)純化重組BGI(RecBoIFNγ)對樹突細胞產(chǎn)生MHC II蛋白的影響。圖7B是樹突細胞應答1)未轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌宿主細胞對照(MB324)，2)pMYC1803(僅用載體轉(zhuǎn)化的)ARC對照(MR1241)，3)BGI/ARC(用BGI基因轉(zhuǎn)化的)(MR1605)，和4)來自熒光假單胞菌的經(jīng)純化BGI(DOWIFN)而產(chǎn)生的MHC II的比較。
圖8顯示了BGI/ARCs對受試小牛體溫的影響。
圖9描繪了BGI/ARCs對受試小牛體重的影響。
圖10描繪了BGI/ARCs對牛臨床癥狀的影響。
圖11圖解了BGI/ARCs的免疫佐劑活性以及BGI-ARCs加速小牛對抗原(例如，豬血清白蛋白)的免疫應答的能力。
圖12表明了BGI/ARCs對淋巴細胞的增殖性影響(通過3H胸苷的摻入來測量)。
圖13表明了禽IFN-γ/ARCs(CGI/ARCs)對雞巨噬細胞一氧化氮產(chǎn)生的活性。
發(fā)明詳述本主題發(fā)明提供了活性細胞因子和/或趨化因子組合物，其已經(jīng)在經(jīng)處理的(改良的)微生物系統(tǒng)中表達，該微生物系統(tǒng)在此處被命名為經(jīng)改良的重組細胞(Amended Recombinant Cells)或ARCs。ARCs是含有表達的、異源蛋白的重組微生物細胞，該細胞已經(jīng)通過特定化學消毒方法殺死，這些化學消毒方法改良了微生物細胞的細胞壁。該改良方法同時以兩種不同的方式改變微生物的細胞壁的性質(zhì)A)發(fā)生細胞壁的物理強化，使得微生物細胞更難被i)剪切，ii)超聲振蕩，或iii)對細胞施加壓力而破壞，和B)發(fā)生細胞壁蛋白質(zhì)的化學變性，使得細胞更易被蛋白水解破壞。
在多個實施方案中，本主題發(fā)明提供了載體轉(zhuǎn)化的微生物ARCs，這些載體含有編碼IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、11-16、IL-18、IL-23、IL-24、紅細胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、EGF、成纖維細胞生長因子(FGF；例如，aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7)、胰島素樣生長因子(例如，IGF-1、IGF-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、干擾素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β)、白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、制癌蛋白M、干細胞因子(SCF)、轉(zhuǎn)化生長因子(例如，TGF-α、TGF-β1、TGF-β1、TGF-β1)、或趨化因子(如，但不限于，BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、Eotaxin-1、Eotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1、ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/Exodus/LARC、MIP-3β/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARC或TECK)或表1、8和9中提供的那些細胞因子和/或趨化因子的至少一種異源基因。在優(yōu)選實施方案中，ARCs含有IFN-γ(例如，牛、禽(例如，雞)、魚或人IFN-γ)。在另一優(yōu)選實施方案中，ARCs含有IFN-γ和IFN-α(例如，牛、禽(例如，雞)、魚或人IFN-γ和IFN-α)。如此處所用的，術語“ARC”或“ARCs”表示含有一種或多種異源基因經(jīng)改良重組細胞。不含有異源干擾素基因或者干擾素蛋白經(jīng)改良重組細胞被稱作“對照ARCs”或“ARC對照”。
在一些實施方案中，微生物細胞共表達一種或多種編碼抗原和/或抗原性蛋白的其他異源基因?？乖蚩乖缘鞍椎姆窍拗菩詫嵗ǎ⑶也幌抻?，自身抗原、腫瘤抗原、MMR疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、破傷風疫苗、環(huán)境中個體通常遇到的病原(例如，食物帶有的病原如克雷伯桿菌屬(Klebsiella)、沙門氏菌屬(Salmonella)、埃希氏桿菌屬(Escherichia)中的種、肝炎病毒、流感病毒等)和特別導入個體環(huán)境的病原性物質(zhì)，如生物毒素(例如，真菌毒素如單端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌腸毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒桿菌(Clostridium botulinum)神經(jīng)毒素、武器化微生物細胞(例如，含有毒素DNA或RNA插入片段的病毒，或用毒素[例如，真菌毒素如單端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌腸毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒桿菌神經(jīng)毒素]轉(zhuǎn)化的細菌或真菌細胞、病毒病原、真菌病原、或細菌病原(例如，天花、炭疽、埃博拉病毒、鼠疫耶爾森氏菌(Yersinia pestis))、或免疫調(diào)節(jié)蛋白如超級抗原、血清白蛋白或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。不同的實施方案提供了表達單一異源基因(例如，單一細胞因子、趨化因子，或蛋白質(zhì))的分別的ARC組合物。在一些實施方案中，共表達的蛋白或抗原(如血清白蛋白)被來自目的動物物種的DNA編碼。在一些實施方案中，在一種微生物系統(tǒng)中表達的所有蛋白質(zhì)都包含在單一載體中。其他實施方案提供了用編碼目的蛋白質(zhì)的多個載體轉(zhuǎn)化微生物細胞。在其他實施方案中，可以以任一方便的方式將異源基因?qū)胨拗?，提供染色體外維持或整合到宿主基因組。(異源表示該基因不存在于它所導入的宿主中，該基因也不通常在該宿主中發(fā)現(xiàn)。即，即使宿主生物體和異源基因的來源交換信息，該異源基因也通常發(fā)現(xiàn)不存在于天然的野生型宿主細胞中。通常，術語“異源的”將包括作為宿主和基因來源的不同屬的物種。)可以使用多種構建體，其包括來自質(zhì)粒、病毒或著絲粒的復制系統(tǒng)與維持穩(wěn)定的自主復制片段的組合。僅希望整合時，所用的構建體可提供復制，并且或者是轉(zhuǎn)座子或者具有類似轉(zhuǎn)座子的插入活性或者提供與宿主基因組的同源性。通常，所用的DNA序列在與宿主基因組序列(染色體或質(zhì)粒)同源的序列之間具有異源基因。希望一種或多種異源基因以多份拷貝存在。見，例如，美國專利號4,399,216。從而，接合、轉(zhuǎn)導、轉(zhuǎn)染和轉(zhuǎn)化可用于導入異源基因。
在使用染色體外元件的實施方案中，希望DNA構建體包括一種下述標記，其允許選擇含有該構建體的那些宿主細胞。該標記通常提供殺生物劑抗性，例如，抗生素抗性或重金屬抗性，為營養(yǎng)缺陷型宿主提供原養(yǎng)型互補，等等。該復制系統(tǒng)可提供特別的性質(zhì)，如失控復制，可以包括cos細胞，或其他特別的特征。
具有可被宿主細胞識別的轉(zhuǎn)錄和翻譯起始和終止調(diào)節(jié)信號的異源基因可以與異源基因聯(lián)合使用。然而，在以下情況時，例如，通過除去前導序列修飾該異源基因或者提供編碼成熟形式細胞因子和/或趨化因子的序列(其中完整基因編碼前體)，通常需要操作DNA序列，從而可以提供與天然的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)序列不同的轉(zhuǎn)錄起始調(diào)節(jié)序列。
不同宿主存在不同的轉(zhuǎn)錄起始序列。該序列可提供細胞因子和/或趨化因子的組成型表達或受調(diào)節(jié)的表達，其中該調(diào)節(jié)可被化學品如代謝物、被溫度或者被可調(diào)節(jié)的阻抑物誘導。見，例如，美國專利號4,374,927，該專利在此處被完整并入作為參考。啟動子的具體選擇將取決于許多因素啟動子的強度、啟動子與細胞的存活力的干擾、細胞內(nèi)源調(diào)節(jié)機制對啟動子的影響，等等。可從多種來源包括商業(yè)來源得到多種啟動子。
表1、8和9中列出的適于細胞因子表達的載體是本領域技術人員熟知的。同樣，表1、8和9中列出的編碼細胞因子和趨化因子的異源基因是本領域中技術人員公知的并且編碼序列可從多種來源得到，這些來源包括多種專利數(shù)據(jù)庫、可公開利用的數(shù)據(jù)庫(如在國家醫(yī)學圖書館或歐洲分子生物學實驗室的核酸和蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫)，這些數(shù)據(jù)庫含有編碼前述細胞因子、趨化因子或其他蛋白質(zhì)的核酸或多肽序列，還包括科學文獻，或者在諸如Genzyme，Inc.、R & D Systems，Inc或InvivoGen，Inc.的公司出版的目錄中引用的科學文獻[見例如，1995細胞因子研究產(chǎn)品目錄、GenzymeDiagnostics，Genzyme Corporation，Cambridge MA；2002或1995Catalog of R & D Systems，Inc(Minneapolis，MN)；或2002Catalog ofInvivoGen，Inc(San Diego，CA)，它們的每一種都被完整(包括其中引用的參考文獻)并入作為參考]。備選地，可以從供應商，如R & D Systems，Inc.(Minneapolis，MN 55413)或InvivoGen，Inc.(San Diego，CA 92121)得到編碼細胞因子和/或趨化因子的核酸和含有編碼細胞因子和/或趨化因子的核酸的載體。在主題發(fā)明的一些方面，操作微生物細胞以表達細胞因子和/或趨化因子的多種組合。
適于用于主題發(fā)明的微生物細胞包括原核生物(革蘭氏陽性和革蘭氏陰性生物)和低等真核生物，如真菌。適于用于本發(fā)明的細菌細胞的種類包括如下屬的種類1)腸桿菌科(Enterobacteriaceae)，包括埃希氏菌屬(Escherichia)、歐文氏菌屬(Erwinia)、志賀氏菌屬(Shigella)、沙門氏菌屬(Salmonella)和變形桿菌屬(Proteus)的種；2)芽孢桿菌科(Bacillaceae)；3)根瘤菌科(Rhizobiaceae)，如根瘤菌屬(Rhizobium)；4)螺菌科(Spirillaceae)，如發(fā)光菌屬(photobacterium)、Zymomonas、沙雷氏菌屬(Serratia)、氣單胞菌屬(Aeromonas)、弧菌屬(Vibrio)、脫硫弧菌屬(Desulfovibrio)、螺菌屬(Spirillum)；6)乳桿菌科(Lactobacillaceae)；7)假單胞菌科(pseudomonadaceae)，如假單胞菌屬(Pseudomonas)和醋桿菌屬(Acetobacter)；8)固氮菌科(Azotobacteraceae)和硝化桿菌科(Nitrobacteraceae)。在低等真核生物中，真菌如藻狀菌綱(Phycornycetes)和子囊菌綱(Ascomycetes)，其包括酵母，如酵母屬(Saccharomyces)和粟酒裂殖酵母屬(Schizosaccharomyces)；和擔子菌綱(Basidiomycetes)酵母，如紅酵母屬(Rhodotorula)、短梗霉屬(Aureobasidium)、擲孢酵母屬(Sporobolomyces)，等等。一旦所轉(zhuǎn)化的微生物細胞高水平表達細胞因子蛋白，就可通過常規(guī)方法收獲細胞并用固定試劑處理以殺死細胞和穩(wěn)定活性細胞因子。在一些實施方案中，細胞因子和/或趨化因子在熒光假單胞菌細胞中表達；將細胞固定、收獲并洗滌或任選洗滌，然后固定。
含有一種或多種異源基因的細胞宿主可以生長在任一方便的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，其中提供選擇培養(yǎng)基為DNA構建體提供了選擇優(yōu)點(例如，生長在含有抗生素的選擇性培養(yǎng)基中)，從而基本上所有或所有細胞都保留一種或多種異源基因。然后可以按照常規(guī)方法收獲這些細胞并對其以上述多種方式修飾。備選地，可以在收獲前固定細胞。
通過下面的試驗在此處和整個本發(fā)明中定義ARCsA)ARCs是死亡的。它們不能在適于它們的活體形式生長的營養(yǎng)培養(yǎng)基上形成菌落。B)ARCs的物理耐久性增強。它們比未改良的活體形式更能夠抵抗超聲振蕩的破壞，或者更能抵抗穿過弗氏壓碎器造成的破壞。C)ARCs易受蛋白水解而溶解。通過顯微術、光學或通過其他方法可以發(fā)現(xiàn)它們比它們的未改良的活體形式更容易受到胰蛋白酶(或多種其他蛋白酶)的蛋白酶水解性溶解。D)ARCs含有重組的異源基因并且表達異源蛋白，其中異源蛋白的目的功能性質(zhì)被部分或完全保留。
宿主細胞失活和改良的多種技術包括用酸(如乙酸)酸化，加入或不加入鹵化劑如碘，UV輻射；凍干；毒素例如抗生素；酚類；苯胺，例如碳酰替苯胺(carbanilide)和水楊酰苯胺(salicylanilide)；羥基脲；季醇；抗細菌染料；EDTA和脒；非特異有機和無機化學品，如已經(jīng)提到的鹵化劑，例如，氯化、溴化或碘化劑；醛，例如，戊二醛或甲醛；有毒氣體，如臭氧和環(huán)氧乙烷過氧化物；補骨脂素；脫水劑；等等，它們可單獨使用或聯(lián)合使用。試劑的選擇將取決于具體細胞因子或趨化因子、宿主細胞的性質(zhì)、產(chǎn)生殺死細胞這一效果所需的細胞結構的經(jīng)改良性質(zhì)、保存細胞因子活性、物理上強化細胞壁、細胞壁蛋白的化學變性、使得細胞對蛋白質(zhì)水解更敏感。
用于失活和改良以產(chǎn)生ARCs的適宜試劑包括鹵化劑，尤其原子序數(shù)為17-80的鹵素。更具體地，可以在溫和條件下使用碘并進行足夠時間以實現(xiàn)所希望的結果。其他適宜的技術包括用醛，如甲醛和戊二醛；抗感染藥，如氯化芐基-二甲基-烷基銨(zephiran chloride)和十六烷基氯化吡啶鎓；如異丙醇和乙醇；多種組織固定劑，如布安氏固定劑和Helly固定劑處理(見Humason，Gretchen L.，動物組織技術，W.H.Freeman and Company，1967)；或者聯(lián)合使用物理(熱)和延長細胞因子和/或趨化因子的活性的化學劑。
對于用碘鹵化，溫度將通常為約0℃到50℃，但是可以在室溫下進行反應。本領域技術人員基于不同ARCs所表達的細胞因子的活性或活性的缺乏來確定這些變量的最佳值是常規(guī)的。本領域技術人員還可以檢測其他此類變量而不用過多實驗。例如，便利地，可以用溶于酸性水性介質(zhì)，尤其約0.5到5M水性羧酸溶液中0.5到5％的三碘化物或碘檢測碘化作用?？梢允褂靡宜幔蛘咭部梢允褂闷渌人?，這些羧酸的碳原子通常為約1到4個。反應時間將通常為小于1分鐘到約24小時，通常為約1到6小時；一般，鹵化(例如，碘化)溶液的pH保持在約4.0到約7.0。在一些實施方案中，pH范圍為約4.0到約6.0，約4.0到約5.0，約4.1到約4.7，約4.2到約4.6，約4.3到約4.4，或約4.3。在其他實施方案中，pH范圍為約3.0到約6.0，約3.5到約5.0，約3.7到約4.7，約3.8到約4.6，約3.9到約4.4，或約4.3。如果需要，可通過與還原劑，如連二亞硫酸鹽、硫代硫酸鈉或其他還原劑反應除去任何殘留的碘。此外，可對經(jīng)修飾的細胞實施進一步處理，如徹底洗滌以除去所有反應介質(zhì)，以干燥形式分離，并與本領域中技術人員通常使用的粘著劑、展開劑和佐劑配制。在一些實施方案中，可用本領域中公知的交聯(lián)劑處理經(jīng)修飾的細胞以制備ARCs。
在(9)和美國專利號4,695,455(它們在此處被完整并入作為參考)中描述了一種該改良方法的步驟一魯戈氏固定。細胞一旦經(jīng)改良，將細胞在水中洗滌并適當?shù)嘏渲埔杂糜诙喾N治療性應用中。在本發(fā)明的該方面，制備了含有經(jīng)改良生物的組合物并且該組合物可以以足夠量施用于個體以誘導目的生物學效果?？梢栽谌我惠d體中配制組合物，該載體包括，例如，E.W.Martin′s Remington′s Pharmaceutical Science，Mack Publishing Company，Easton，PA中描述的載體。
本主題發(fā)明提供了誘導和/或促進個體中免疫應答的方法，該方法包括以下步驟對個體(如禽、兩棲動物、爬行動物、甲殼動物、魚或哺乳動物個體)施用含有表達細胞因子/趨化因子的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)、一種或幾種目標抗原和任選地含有額外的佐劑分子如脂多糖(LPS)或CpG二核苷酸的組合物，所施用的組合物的量可有效產(chǎn)生免疫應答。在一些優(yōu)選的實施方案中，ARCs共表達a)一種或多種目標抗原，和b)一種或多種細胞因子/趨化因子，如IFN-γ或表1、8和9中列出的其他細胞因子/趨化因子。在其他實施方案中，對個體提供混合含有一種或多種抗原并含有表達一種或多種細胞因子/趨化因子的ARCs的組合物。為了所述混合組合物的目的，1)以純化的形式，2)作為粗提物，和/或3)以單獨的ARC組合物形式，其中細胞已經(jīng)用編碼目標抗原的DNA轉(zhuǎn)化，提供一種或多種抗原。在任一實施方案中，可以任選提供本領域中技術人員公知的佐劑。在一些優(yōu)選實施方案中，ARCs至少共表達IFN-γ和IFN-α。
本主題發(fā)明的另一方面提供了促進個體中免疫應答的方法，該方法包括對個體施用含有一種或多種細胞因子和/或趨化因子的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)，或其組合物，所施用的量可有效促進個體的免疫應答。在本發(fā)明的一方面，個體最高體液免疫應答(例如抗原攻擊后觀察到的IgM和/或IgG抗體的最大量)的出現(xiàn)可提前1到14天或更多天。在本發(fā)明的該方面，該個體可以以前暴露于抗原或者該抗原可以共同施用于該個體。
從而，本主題發(fā)明提供了促進個體中抗體同種型(例如，IgG1和IgG2)，或者多種型別的抗體(例如，IgM、IgG、IgA、IgE和/或IgY)產(chǎn)生的方法，該方法包括施用含有一種或多種細胞因子/趨化因子的ARCs的組合物。該方法還可以包括ARC施用之前、同時或隨后施用抗原或免疫原。在一些實施方案中，ARC組合物是IFN-γ/ARC。其他實施方案提供了含有INF-α和IFN-γ的ARCs。在不同實施方案中，干擾素基因是人、禽(例如，雞)、牛、哺乳動物或魚來源的干擾素基因。
在本發(fā)明的一些實施方案中，個體暴露目標抗原2到168小時后，將表達一種或多種細胞因子和/或趨化因子的ARCs施用于該個體。“目標抗原”包括，但不限于，自身抗原、腫瘤抗原、MMR疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、破傷風疫苗、環(huán)境中個體通常遇到的病原(例如，食物帶有的病原如克雷伯桿菌屬、沙門氏菌屬、埃希氏桿菌變種、肝炎病毒、流感病毒等)和特別導入個體環(huán)境的病原性物質(zhì)，如生物毒素(例如，真菌毒素如單端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌腸毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒桿菌神經(jīng)毒素、武器化微生物細胞(例如，含有毒素DNA或RNA插入片段的病毒，或用毒素[例如，真菌毒素如單端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌腸毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒桿菌神經(jīng)毒素]轉(zhuǎn)化的細菌或真菌細胞、病毒病原、真菌病原、或細菌病原(例如，天花、炭疽、埃博拉病毒、鼠疫耶爾森氏菌)、或免疫調(diào)節(jié)蛋白如超級抗原、血清白蛋白或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。從而，本主題發(fā)明可應用于a)治療暴露于生物恐怖活動中的生物劑的個體；和b)治療暴露于環(huán)境中通常遇到的病原的個體。在本發(fā)明的該方面的優(yōu)選實施方案中，ARCs共表達IFN-γ和/或IFN-α并任選地LPS。任選地，除了IFN-γ和IFN-α之外，ARCs還共表達其他蛋白質(zhì)、細胞因子和/或趨化因子。
本主題發(fā)明還提供了治療腫瘤、癌癥或惡性腫瘤的方法，該方法包括對個體施用含有一種或多種細胞因子/趨化因子的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)或者其組合物，所施用的量可有效實現(xiàn)個體中的治療效果。在一些實施方案中，術語“治療”和/或“治療效果”指任何方法、行動、應用、療法等等，其中個體受到醫(yī)務救護，該醫(yī)務救護的目的是改善該個體的病癥、生活質(zhì)量或者預后前景。在其他實施方案中，術語“治療”或“治療效果”還包括對個體提供治療，該治療導致腫瘤塊減小、癌細胞的數(shù)目減少、或者導致個體中所治療的腫瘤、癌或惡性腫瘤的緩解。
本主題發(fā)明提供了刺激、抑制、或調(diào)節(jié)個體的免疫系統(tǒng)的方法，該方法包括施用含有根據(jù)本發(fā)明主題教導的表達細胞因子和/或趨化因子(例如，表1、8和9中列出的那些)的經(jīng)改良微生物細胞(ARCs)的組合物。在一個特定實施方案中，本主題發(fā)明提供了個體中巨噬細胞的活化或刺激方法，該方法包括施用含有一種或多種異源基因的ARCs，所施用的量足夠活化或刺激個體的巨噬細胞。在特定實施方案中，ARCs含有編碼IFN-γ和任選地編碼IFN-α的異源基因。
本主題發(fā)明還提供了增加個體中病毒抗性的方法，該方法包括施用含有根據(jù)本發(fā)明主題教導的表達細胞因子和/或趨化因子的經(jīng)改良重組微生物細胞(ARCs)的組合物。在一些實施方案中，經(jīng)改良微生物細胞含有細胞因子，如IFN-γ。在其他實施方案中，組合物含有調(diào)節(jié)目的生物效應的細胞因子和/或趨化因子。這些組合物所施用的量可有效刺激、抑制、調(diào)節(jié)或?qū)崿F(xiàn)目的生物學效果(例如，抗病毒活性或表1、8或9中列出的其他活性)。從而，本主題發(fā)明還提供了誘導目的生物學效果如表1、8或9中列出的生物學效果的方法，該方法包括施用足夠量的ARC組合物(例如，含有編碼誘導目的生物學效果的細胞因子和/或趨化因子的異源基因的ARCs)以誘導目的生物學效果。
本主題發(fā)明還提供了在個體中誘導至少一種目的生物學效果的方法，該方法包括施用含有一種或多種異源基因的ARCs或者ARCs的組合物，所施用的量可有效誘導目的生物學效果。示例的細胞因子和/或趨化因子的生物學效果是技術人員公知的并且與多種細胞因子和/或趨化因子相關的生物學功能的非限制性實例在表8-9中列出。
本主題發(fā)明還提供了可人用和獸用的方法。術語“個體”包括魚、禽、哺乳動物和/或爬行動物。從所公開的方法受益的哺乳動物物種包括并且不限于猿、黑猩猩、猩猩、人、猴；馴養(yǎng)的動物(寵物)，如狗、貓、豚鼠、倉鼠、越南大肚豬、兔和雪貂；馴養(yǎng)的農(nóng)場動物，如奶牛、水牛、野牛、馬、驢、豬、綿羊，和山羊；通常在動物園中的外來動物，如熊、獅、虎、豹、象、河馬、犀牛、樹袋熊、羚羊、樹懶、瞪羚、斑馬、角馬、大草原犬、樹袋熊、袋鼠、負鼠、浣熊、熊貓、大熊貓、鬣狗、海豹、海獅、和海象。爬行動物包括，并且不限于，短吻鱷，鱷魚，海龜，烏龜，蛇，鬣蜥，和其他蜥蜴。禽類包括，并且不限于，雞、火雞、鴿子、畏縮、鸚鵡、金剛鸚鵡、鴿子、幾內(nèi)亞母雞、多情鸚鵡、長尾小鸚鵡、火烈鳥、鷹、鷹、獵鷹、禿鷹、鴕鳥、孔雀、鴨、和天鵝。魚包括，并且不限于，魷魚、槍烏賊、鰻魚、章魚、鱈魚、金槍魚、鮭魚、鱈魚、椏魚、鱒魚、黑線鱈、比目魚、鰈、銀魚、噴魚(blowfish)、雞泡魚(pufferfish)、狗魚、石斑魚、大比目魚、鯉魚、鱸魚、梭子魚、翻車魚、羅非魚、鯉魚、鯰魚、金魚、鯉科小魚、棉鯉(koi)、鱸魚、鯖、腌魚、水虎魚、刺蝶魚、小丑魚(clownfish)、扁鯊、綠青鱈、鱈魚、飛魚、箭魚、亞口魚、七鰓鰻、蝠魟(manta ray)、海鷂魚、鮭魚、鰩魚、青魚、古比、熏魚、棘魚、牙鱈、鱸魚、白鮭、weaverfish、深海狗母魚(spiderfish)、胡瓜魚、粘魚、西鯡、肺魚、彈涂魚、腔棘魚、比目魚、太平洋油鰈、keogh、檬鰨、鲆、鰩屬、勃氏笛鯛、魴魚、青鱈、琵琶魚、鸚哥魚(parrotfish)、炮彈魚(triggerfish)、霓虹脂鯉、梭魚類、石頭魚(stonefish)、鲉、瀨魚、丁鯛、斜齒鳊、槍魚、鋸鰩、旗魚、金槍魚、鳳尾魚、鱘魚、石頭泥鰍(stoneloach)、短鯽、barbie、河鱒、比目魚、尖吻鱸(barmundi)、朱文錦(shebunkin)、斗魚、雀鱔、海龍、蓑鲉、海鰻、綠色美洲鰻(morayeel)、翻車魚、剪刀魚(scissorfish)、梭鱸、斑馬魚、胭脂魚、沙丁魚、白鮭、pilotfish、蝦虎魚、喉盤魚、大鰩魚、海魴。還包括鯊魚，包括但不限于，灰鯖鯊、大白鯊、錘頭鯊、藍鯊、長尾鯊、須鯊(wobbegong)、檸檬鯊、白鰭鯊(whitetip)、白尖礁鯊(whitetipreef)、灰色礁鯊、公牛鯊、沙鯊、護士鯊、鯨鯊、姥鯊(basking)、豹鯊、虎鯊、鼠鯊、巨口鯊、翅鯊、天使鯊、沉睡鯊(sleeper)、燈籠鯊、貓鯊(swell)、角鯊魚、妖鯊、沙虎鯊、尖鼻鯊(sharpnosed)、黑鰭礁鯊、黑鼻鯊、牛頭鯊、黑鰭鯊、窄頭雙髻鯊(bonnet)、褐鯊、絨氈鯊、黑鯊、飾妝鯊、加拉帕戈斯鯊、cookie cutter、鱷魚鯊、尖吻鯊、星鯊、貓斑鯊(marbled cat)、圓鼻鯊、鋸鯊、七鰓鯊、窄頭雙髻鯊、絲鯊、小尾鯊、白斑角鯊、贊比西鯊、光尾鯊、寬紋虎鯊、鯨真鯊。爬行動物的非限制性實例包括，并且不限于，鱷魚、短吻鱷、蛇、蛙和龜(如鱷龜和海龜)。
其他爬行動物和/或魚包括在Regulatory Fish Encyclopedia，美國食品和藥物管理局，Seafood Products Research Center，Center for FoodSafety & Applied Nutrition；The 2001 Seafood List，U.S.Food & DrugAdministration，Center for Food Safety & Applied Nutrition；《魚類目錄》，William N.Eschmeyer編輯，California Academy of Sciences，SanFrancisco，1998；以及《爬行動物和兩棲動物百科全書》，第二版，Harold G.Cogger和Richard G.Zweifel(Editors)，1998，Academic Press，San Diego，CA中列出。這些爬行動物和魚類列表的每一個都被完整并入作為參考。
在不同實施方案中，可以經(jīng)口、腸胃外、作為噴霧劑(包括吸入噴霧劑)、局部、直腸、鼻、經(jīng)口腔、陰道或通過植入的儲庫施用根據(jù)本發(fā)明的組合物。如此處所用的術語“腸胃外”包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、intrastriatial、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)(intrasternal)、或顱內(nèi)注射和灌輸技術。
從而，本主題發(fā)明可用作治療動物(如奶牛)中船熱或保護新生小牛免受病毒性疾病和/或細菌胃腸炎的方法。該方法還可用于縮短各種應激相關的疾病，以及作為佐劑增強口服和IM/SQ人接種。在任一實施方案中，施用含有一種或多種細胞因子和/或趨化因子的經(jīng)分離ARCs或ARC組合物，所施用的量可有效減輕疾病或疾病癥狀的嚴重性和/或防止疾病或疾病癥狀的發(fā)作。在一些實施方案中，ARCs含有IFN-γ。
從而，本主題發(fā)明提供了非限制性實施方案和方面，它們包括
A)含有編碼細胞因子和/或趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARC)；B)根據(jù)實施方案A的ARC，其中異源基因編碼IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、11-16、IL-18、IL-23、IL-24、促紅細胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、EGF、成纖維細胞生長因子(FGF；例如，aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7)、胰島素樣生長因子(例如，IGF-1、IGF-2)、血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、干擾素(例如，IFN-γ、IFN-α、IFN-β)、白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、制癌蛋白M、干細胞因子(SCF)、轉(zhuǎn)化生長因子(例如，TGF-α、TGF-β1、TGF-β1、TGF-β1)、或趨化因子(如，但不限于，BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、Eotaxin-1、Eotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1、ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/Exodus/LARC、MIP-3β/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARC或TECK)或表1、8和9中提供的那些細胞因子和/或趨化因子。
C)根據(jù)前面任一實施方案的ARC，其中異源基因編碼IFN-γ(例如，牛、禽(例如，雞)、魚或人IFN-γ)；D)根據(jù)前面任一實施方案的ARC，其中ARC還含有編碼IFN-α(例如，牛、禽(例如，雞)、魚或人IFN-α)的異源基因。
E)根據(jù)前面任一實施方案的ARC，其還含有一種或多種異源基因，該異源基因編碼自身抗原、腫瘤抗原、MMR疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、破傷風疫苗、和環(huán)境中個體通常遇到的病原(例如，食物帶有的病原如克雷伯桿菌屬、沙門氏菌屬、埃希氏桿菌變種、肝炎病毒、流感病毒等)相關的抗原和特別導入個體環(huán)境的病原性物質(zhì)或抗原，如生物毒素(例如，真菌毒素如單端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌腸毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒桿菌神經(jīng)毒素、武器化微生物細胞相關的抗原(例如，含有毒素DNA或RNA插入片段的病毒，或用毒素[例如，真菌毒素如單端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌腸毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒桿菌神經(jīng)毒素]轉(zhuǎn)化的細菌或真菌細胞、病毒病原或其抗原、真菌病原或其抗原、或細菌病原或其抗原(例如，天花、炭疽、埃博拉病毒、鼠疫耶爾森氏菌)、或免疫調(diào)節(jié)蛋白如超級抗原、血清白蛋白或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑。
F)根據(jù)前面任一實施方案的ARC，其中ARC含有單一異源基因(例如，單一細胞因子、趨化因子或蛋白質(zhì))；G)根據(jù)前面任一實施方案的ARC，其中異源基因被包含在單一載體中；H)根據(jù)實施方案A到F的ARC，其中異源基因包含在多個載體中；I)根據(jù)前面任一實施方案的ARC，其中微生物細胞為革蘭氏陽性、革蘭氏陰性生物，或者低等真核生物，如真菌；J)根據(jù)前面任一實施方案的ARC，其中經(jīng)改良的重組細胞為a)如下屬的細菌1)腸桿菌科，包括埃希氏菌屬、歐文氏菌屬、志賀氏菌屬、沙門氏菌屬和變形桿菌屬的種；2)芽孢桿菌科；3)根瘤菌科，如根瘤菌屬；4)螺菌科，如發(fā)光菌屬、Zymomonas、沙雷氏菌屬、氣單胞菌屬、弧菌屬、脫硫弧菌屬、螺菌屬；6)乳桿菌科；7)假單胞菌科，如假單胞菌屬和醋桿菌屬；8)固氮菌科和硝化桿菌科；b)低等真核生物，真菌如藻狀菌綱和子囊菌綱，其包括酵母，如酵母屬和粟酒裂殖酵母屬；和擔子菌綱酵母，如紅酵母屬、短梗霉屬、擲孢酵母屬；K)根據(jù)實施方案A-J的ARC，其中微生物細胞是熒光假單胞菌；L)根據(jù)前面權利實施方案任一項的含有編碼趨化因子和/或細胞因子的一種或多種異源基因的ARC和載體的組合物；M)誘導和/或促進個體中針對抗原或免疫原的免疫應答的方法，該方法包括步驟對個體(如禽、兩棲動物、爬行動物、甲殼動物、魚，或哺乳動物個體)施用a)含有編碼細胞因子/趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARC)；b)包含含有編碼細胞因子/趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)的組合物；或c)根據(jù)實施方案A到L的ARC；和d)任選地，目標抗原；和e)任選地，脂多糖(LPS)，所施用的量可有效產(chǎn)生免疫應答；N)根據(jù)實施方案M的方法，其中ARCs共表達a)一種或多種目標抗原，和b)一種或多種細胞因子/趨化因子，如IFN-γ或表1、8和9中列出的其他細胞因子/趨化因子。
O)促進個體對抗原或免疫原的免疫應答的方法，該方法包括向個體施用a)含有編碼細胞因子/趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARC)；b)包含含有編碼細胞因子/趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)的組合物；或c)根據(jù)實施方案A到L的ARC；所施用的量可有效促進個體的免疫應答；P)促進個體中針對抗原或免疫原的不同類(例如，IgM、IgG、IgA，和/或IgE)和亞類抗體產(chǎn)生的方法，該方法包括對個體施用a)含有編碼細胞因子/趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARC)；b)包含含有編碼細胞因子/趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)的組合物；或c)根據(jù)實施方案A到L的ARC；所施用的量可有效促進個體中抗體類別的產(chǎn)生。
Q)根據(jù)實施方案M到P的方法，其還包括施用ARC組合物之前、同時、或之后施用抗原或免疫原。
R)根據(jù)實施方案M到Q的方法，其中ARC或ARC組合物含有IFN-γ；S)根據(jù)實施方案M到Q的方法，其中ARC或ARC組合物含有IFN-α和IFN-γ；T)根據(jù)實施方案R到S的方法，其中IFN-γ來源于人、禽(例如，雞)、?；螋~；U)根據(jù)實施方案R到S的方法，其中IFN-α和IFN-γ來源于人、禽(例如，雞)、?；螋~；V)根據(jù)實施方案M到U的方法，其中個體暴露于抗原或免疫原2到168小時后將表達一種或多種細胞因子和/或趨化因子的ARC或ARC組合物施用于該個體；W)根據(jù)實施方案M到V的方法，其中抗原或免疫原是個體在環(huán)境中通常遇到的病原或者專門導入該個體所在環(huán)境中的病原物質(zhì)；X)根據(jù)實施方案M到W的方法，其中抗原或免疫原選自自身抗原、腫瘤抗原、MMR疫苗、脊髓灰質(zhì)炎疫苗、破傷風疫苗、環(huán)境中個體通常遇到的病原(例如，食物帶有的病原如克雷伯桿菌屬、沙門氏菌屬、埃希氏桿菌變種、肝炎病毒、流感病毒等)或者其抗原，和特別導入個體環(huán)境的病原性物質(zhì)或者其抗原，如生物毒素(例如，真菌毒素如單端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌腸毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒桿菌神經(jīng)毒素、武器化微生物細胞(例如，含有毒素DNA或RNA插入片段的病毒，或用毒素[例如，真菌毒素如單端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌腸毒素B、蓖麻毒蛋白或肉毒桿菌神經(jīng)毒素]轉(zhuǎn)化的細菌或真菌細胞、病毒病原或其抗原、真菌病原或其抗原、或細菌病原或其抗原(例如，天花、炭疽、埃博拉病毒、鼠疫耶爾森氏菌、或免疫調(diào)節(jié)蛋白如超級抗原、血清白蛋白或蛋白質(zhì)穩(wěn)定劑；Y)根據(jù)實施方案M到X的方法，其中ARC或ARC組合物含有IFN-γ，并任選地含有IFN-α，和任選地含有LPS；Z)根據(jù)實施方案M到Y的方法，其中ARC或ARC組合物除了IFN-γ之外還含有其他蛋白質(zhì)、細胞因子和/或趨化因子；
AA)根據(jù)實施方案M到Z的方法，其中其他蛋白質(zhì)、細胞因子和/或趨化因子與IFN-γ共表達；BB)根據(jù)實施方案M到AA的方法，其中其他蛋白質(zhì)、細胞因子和/或趨化因子被加入含有IFN-γ的ARC或ARC組合物；CC)另一實施方案提供了治療腫瘤、癌癥或惡性腫瘤的方法，該方法包括對個體施用a)含有編碼細胞因子/趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARC)；b)包含含有編碼細胞因子/趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)的組合物；或c)根據(jù)實施方案A到L的ARC；所施用的量可有效治療腫瘤、癌癥或惡性腫瘤；DD)根據(jù)實施方案CC的方法，其還包括施用化療劑和任選地施用腫瘤/癌癥抗原；EE)本主題發(fā)明還提供了在個體中誘導目的生物學效果的方法，該方法包括對個體施用a)含有編碼細胞因子/趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARC)；b)包含含有編碼細胞因子/趨化因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)的組合物；或c)根據(jù)實施方案A到L的ARC；FF)在實施方案EE的一方面，目的生物學效果選自1)個體中巨噬細胞的活化或刺激；2)個體免疫系統(tǒng)的刺激、抑制、或調(diào)節(jié)；3)增加個體的病毒抗性；和4)實現(xiàn)如表1、8或9中提出的目的生物學效果；GG)在另一個實施方案中，本主題發(fā)明可用作治療動物(如奶牛)中船熱或保護新生小牛免受病毒性疾病和/或細菌性胃腸炎的方法。該方法還可用于縮短各種應激相關的疾病以及作為佐劑增強個體(如人)中IM/SQ接種。在任一實施方案中，所施用的經(jīng)分離ARCs或ARC組合物的量可有效減輕疾病或疾病癥狀的嚴重性和/或防止疾病或疾病癥狀的發(fā)作。在一些實施方案中，ARCs含有細胞因子，如IFN-γ；HH)在實施方案M到GG的方法的多種實踐中，可以經(jīng)口、腸胃外、作為噴霧劑(包括吸入噴霧劑)、局部、直腸、鼻、經(jīng)口腔、陰道或通過植入的儲庫施用根據(jù)主題發(fā)明的組合物。如此處所用的術語腸胃外包括皮下、皮內(nèi)、靜脈內(nèi)、intrastriatial、肌內(nèi)、腹膜內(nèi)、鞘內(nèi)、心室內(nèi)、胸骨內(nèi)、或顱內(nèi)注射和灌輸技術；II)本主題發(fā)明還提供了制備a)含有編碼趨化因子和/或細胞因子的一種或多種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARC)或b)根據(jù)實施方案A到L的ARC的方法，該方法包括向細胞導入一種或多種異源基因。該細胞可以生長在任一方便的營養(yǎng)培養(yǎng)基中，其中提供選擇培養(yǎng)基為DNA構建體提供了選擇優(yōu)點(例如，生長在含有抗生素的選擇性培養(yǎng)基中)，從而基本上所有或所有細胞都保留一種或多種異源基因。然后可以按照常規(guī)方法收獲這些細胞并采用上述多種方式進行改良。備選地，可以在收獲前固定細胞；和JJ)在實施方案II的一方面，可以使用多種技術失活并改良宿主細胞，這些技術包括用酸(如乙酸)酸化，加入或不加入鹵化劑，如碘，UV輻射；凍干；毒素，例如，抗生素；酚類；苯胺，例如碳酰替苯胺和水楊酰苯胺；羥基脲；季醇；抗細菌染料；EDTA和脒；非特異有機和無機化學品，如鹵化劑，例如，氯化、溴化或碘化劑；醛，例如，戊二醛或甲醛；有毒氣體，如臭氧和環(huán)氧乙烷過氧化物；補骨脂素；脫水劑；等等，它們可單獨使用或聯(lián)合使用。備選地，可以施用前面的段落31、32、33和/或34中提出的方法。還可以在任一載體中配制組合物，這些載體包括例如，E.W.Martin′s Remington′s Pharmaceutical Science，Mack PublishingCompany，Easton，PA中描述的載體。
術語“含有”、“由...組成”和“基本上由...組成”根據(jù)它們的一般意思定義。在本申請中這些術語可以相互代替以便附加與每個術語相關的特定意思。同樣，在主題申請全文中，術語“約”可以用短語“至少約”代替，術語“含有”可以用“包含”代替。
下面是闡明實施本發(fā)明的方法實施例。這些實施例不應被理解為限制，而是應該包括本主題發(fā)明的多種可變方案。除非另外說明，溶劑混合物比例是按體積計，百分數(shù)按重量計。
實施例1-熒光假單胞菌宿主細胞和表達系統(tǒng)生產(chǎn)菌株MB324被用于轉(zhuǎn)化實驗，質(zhì)粒pMYC 1803(圖1)用于亞克隆實驗。用限制酶SpeI和XhoI切除載體的蘇云金芽孢桿菌(Bacillusthuringiensis)BuiBui插入片段后，插入牛IFN-γ(BGI)基因或雞IFN-γ(CGI)基因。用SeqWeb軟件從GenBank得到公開的BGI(圖2)和CGI核苷酸序列。修飾所要合成的序列以排除信號序列并包括核糖體結合位點、SpeI和XhoI限制性位點。所得序列信息被送到Operon Technologies進行基因合成。用P.E.377測序儀對所克隆的基因測序并用Factura和AutoAssembler軟件分析。通過Genosys制備用于測序的正向和反向引物。
實施例2-干擾素基因的亞克隆將含有5mL L-培養(yǎng)基(LB)的錐形管(50mL)接種來自熒光假單胞菌MB 324的冰凍甘油儲用培養(yǎng)物的冰片。培養(yǎng)物在旋轉(zhuǎn)搖床中以300轉(zhuǎn)/分鐘和30℃孵育過夜。0.75mL每種培養(yǎng)物用于接種250mL側面帶擋板的搖瓶中的50mL LB。培養(yǎng)物在300轉(zhuǎn)/分鐘和30℃下?lián)u動2小時并生長到A600(600nM處吸光度)為0.2到0.3。然后將培養(yǎng)物在冰上冷卻并以3000轉(zhuǎn)/分鐘離心沉淀。用冷的無菌蒸餾水洗滌沉淀物3次并將沉淀重懸在水中。
向電穿孔杯中加入細胞懸浮物(每個電穿孔杯中約100μL)，將其與10μL干擾素基因或?qū)φ者B接混合物混合；用BioRad GenePulser在0.2cm杯中以200歐姆、25μF和2.25kV對重懸的細胞電穿孔，并以4.6到4.8的時間常數(shù)“脈沖”。
向每個樣品加入1mL LB，并將液體轉(zhuǎn)移到冰凍的2059Falcon管中。將管寬松地蓋上，并以280轉(zhuǎn)/分鐘和30℃搖動2小時。將100μL到200μL等分試樣涂布到L-培養(yǎng)基-四環(huán)素(LB-四環(huán)素)(30μg/mL)瓊脂上并在30℃孵育過夜。隨機從兩個100μL平板接種的每一塊平板選出一個菌落并從200μL平板接種的平板選出兩個菌落，并用于接種含有上述LB-四環(huán)素培養(yǎng)基的50mL錐形管。所得培養(yǎng)物的樣品與無菌甘油(1.0mL培養(yǎng)物加0.25mL 75％甘油)混合并保存在-70℃。剩余的培養(yǎng)物(1.8mL)在2mLEppendorf管中離心10分鐘。將沉淀重懸在0.5mL Qiagen P1溶液中，并用0.5mL P2溶液輕輕倒轉(zhuǎn)6次。
約5分鐘內(nèi)，將樣品用N3溶液再次倒轉(zhuǎn)6次并冰凍。離心冷卻的樣品10分鐘，小心地與沉淀和表面泡沫分離，并將所得上清液(約1.5mL)轉(zhuǎn)移到新Eppendorf管中。用Qiagen自旋柱和收集管通過將全部1.5mL樣品自旋加到柱子上，通過約0.7mL到0.8mL等分試樣的兩次30秒、1400轉(zhuǎn)/分鐘(14K)自旋進一步純化樣品。用0.62mL Qiagen PB和0.85mL PE洗滌自旋柱，最后自旋90秒。將柱子轉(zhuǎn)移到新的Eppendorf管，以50μLTris-EDTA洗脫1分鐘，以14K自旋1分鐘。洗脫液被轉(zhuǎn)移到新Eppendorf管并在-20℃保存。用XhoI和SpeI消化所得小量制備物并通過瓊脂糖凝膠電泳分析。
實施例3-干擾素蛋白的表達和定量基于小量制備結果，選擇具有IFN-γ插入片段的一個克隆用于表達分析。熒光假單胞菌MR 843和MR837用作干擾素陰性對照。接種LB四環(huán)素的搖瓶生長到A600為0.15到0.5并標準化到0.15，以2％稀釋到含有200mL四環(huán)素生產(chǎn)培養(yǎng)基的1升搖瓶中。30℃下旋轉(zhuǎn)搖動24小時使熒光假單胞菌細胞生長到A600約0.4。用0.6mL 100mM IPTG+5mL 40％MSG對細胞誘導48小時。通過顯微術檢查細胞的總體外觀和包含體形成。
取50mL樣品并在4℃保存在錐形管中以通過十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)分析表達。將100μL以14K離心5分鐘以沉淀細胞。將沉淀物重懸在100μL1×Laemmli緩沖液中并煮沸3分鐘，將上清液樣品用Laemmli緩沖液以1∶1稀釋然后煮沸。將10μL煮沸的樣品與30μL新鮮Laemmli緩沖液混合并繼續(xù)沸騰3分鐘。制備物過夜冰凍，第二天解凍，加熱到70℃5分鐘，加入12個泳道、15％BioRad凝膠的孔(每孔10μL)中并用BioRad電泳緩沖液電泳。電泳以50伏特運行20分鐘，然后以75伏特運行1小時20分鐘。電泳后，將凝膠在蒸餾水中洗滌3次，每次5分鐘，并用BioRad BioSafe染料染色1.5小時。染色的凝膠在蒸餾水中脫色，每隔一小時換一次蒸餾水。用MD光密度計通過樣品與無干擾素的對照和BSA蛋白質(zhì)標準的考馬斯藍強度完成定量。
順利地用pMYC1803的SpeI和XhoI位點處的BGI基因替換BuiBui毒素基因(圖1)。對CGI基因的亞克隆得到類似結果。所選擇的所有轉(zhuǎn)化體都具有目的干擾素插入片段，這首先通過瓊脂糖凝膠電泳，然后通過對插入的DNA測序進行驗證(圖2)。選擇了熒光假單胞菌的含有DnaK陪伴蛋白的株系MB324的一個克隆用于進一步研究。
在對BGI和CGI所預期的分子量處觀察到蛋白質(zhì)的一個主要帶(例如，見圖3)，并且假單胞菌中BGI和CGI兩者的表達為總細胞蛋白的約40％。通過純化主要帶中所含的蛋白質(zhì)，結合對所純化產(chǎn)物的生物測定來證實具有真實BGI或CGI的主要帶的身份。優(yōu)化表達并用假單胞菌實現(xiàn)高密度發(fā)酵，在單個發(fā)酵生產(chǎn)試驗中得到的干擾素產(chǎn)量大于1000Kg。
實施例4-溶解性測定將0.975mL熒光假單胞菌培養(yǎng)物在微量離心管中以14,000轉(zhuǎn)/分鐘離心5分鐘。倒出上清液并將細胞重懸在高達起始體積的裂解緩沖液中[裂解緩沖液Tris HCl，50mM，最終pH7.5；NaCl，200mM；甘油，5％v/v；EDTA，20mM；Triton X-100，5％v/v；并最后加入1mM DTT]。向螺口微量離心管(2mL)中裝入約3/4體積的0.1mm玻璃珠并用細胞懸液加滿?？焖贀u動離心管以混合珠子并除去氣泡，并進一步裝入細胞懸液至頂部。將管蓋上、密封，并插入BioSpec小型珠-攪拌器中以5000轉(zhuǎn)/分鐘攪拌60秒。在攪拌之間的時間里將樣品置于冰上，攪拌3到5次，直到約90％的細胞都被裂解。通過顯微鏡觀察細胞裂解。從每個管吸量0.025mL裂解細胞制備物(沒有珠子)置于新的微量離心管中并離心5分鐘。小心地將上清液級分轉(zhuǎn)移到含有0.075mL LSB的另一管中，并向沉淀級分加入0.100mLLSB。用渦旋攪拌器使上清液和沉淀部分重懸，蓋上管，并將其置于沸水浴中5分鐘，并通過SDS-PAGE分析級分的0.005mL到0.010mL等分試樣。用弗氏壓碎器或BioSpec Mini珠子攪拌器評估假單胞菌中表達的BGI或CGI蛋白質(zhì)的溶解性得到相同結果。
如圖4所示，檢測了假單胞菌中BGI的溶解性并表明多數(shù)(如果不是全部)BGI保持可溶形式。對CGI得到類似結果。為了進行這些溶解性試驗，將存活的未改良假單胞菌細胞在弗氏壓碎器(或者小型-珠子攪拌器)中破碎，離心以將細胞碎片和任何包含體與可溶蛋白分離。這兩種級分的SDS凝膠表明BGI保留在可溶級分，而BAI(牛α-干擾素)—該實施例中的一種標記，其已經(jīng)被克隆并且為了另一實驗而被表達—主要在不可溶的級分中。此外，不像BGI(或CGI)，BAI在假單胞菌中形成大的包含體，其在相差顯微鏡下清晰可見。
圖4中顯示了弗氏壓碎器處理的含有BAI和BGI的熒光假單胞菌培養(yǎng)物的SDS-PAGE分析。將假單胞菌細胞在弗氏壓碎器中破裂并以16000g離心5分鐘。泳道1-4是上清液樣品，顯示出可溶的BGI的單一主要帶(約17kDa)，看不到BAI。泳道5-8是沉淀的樣品，其顯示了與少量污染性可溶BGI(較低的帶，約17kDa)一起的不可溶BAI主要帶(約18kDa)。污染似乎是由于溢出的上清液級分和未裂解的細胞。
實施例5-假單胞菌改良的重組細胞(ARC)改良方法用于該方法中的所有材料都被完全滅菌。將完成的熒光假單胞菌發(fā)酵培養(yǎng)物倒入含有無菌磁力攪拌棒的無菌燒杯中。緩慢攪拌培養(yǎng)物，并用酒精消毒的pH-探頭監(jiān)視pH。在約10分鐘內(nèi)逐滴加入冰乙酸，直到pH達到約4.3。滴定培養(yǎng)物到約pH4.3后，加入濃魯戈氏碘到1％v/v[魯戈氏碘無菌蒸餾水90mL；KI，10g/100mL；碘，5g/100mL；冰乙酸，10mL]。充分攪拌溶液并將其無菌轉(zhuǎn)移到含有無菌攪拌板的新無菌燒瓶中。蓋上溶液并將其在室溫攪拌1小時?？梢蕴幚砑毎L時間(例如，長達2小時)而得到類似結果。將魯戈氏/細胞混合物轉(zhuǎn)移到無菌500mL有蓋瓶中并以7500轉(zhuǎn)/分鐘離心15分鐘。倒出并丟棄上清液。室溫下加入無菌蒸餾水至原始體積，用無菌刮刀移去沉淀，并用高壓滅菌的IKA(Ultra-Turrax)重懸，以T25勻漿器在#2設置下處理約10秒。如上面描述的重復重懸和離心，洗滌細胞3次以除去魯戈氏溶液。在最后洗滌期間，將ARC細胞重懸到1/10原始體積，并在-80℃下在無菌螺口管中冰凍長期保存。將0.1到1.0mL樣品涂布在L-培養(yǎng)基和LB-四環(huán)素上以證實沒有活細胞。
實施例6-干擾素生物活性的定量對于體外生物測定，使牛腎臟(MDBK)細胞生長至匯合，并與對照假單胞菌樣品和與BGI/ARC樣品的多種稀釋物孵育24小時。用皰疹性口腔炎病毒(VSV)攻擊所有平板并再孵育24小時(10和29-32)。
牛腎臟(MDBK)細胞在微量滴定板中匯合。丟棄上清液并向每孔加入100μL MEM加5％FBS。向兩列的頂部兩行每孔加入100μL樣品。用最初濃度為100U/mL的干擾素作為陽性對照。標準BGI的比活性為3×106U/mg。在第一行中以1∶2連續(xù)稀釋并繼續(xù)進行到板的底部。在37℃過夜孵育微量滴定板以允許樣品中的任一種干擾素都誘導MDBK細胞中的抗病毒狀態(tài)。第二天，將VSV原種在MEM中稀釋得到約50個噬菌斑-形成單位(PFU)/100μL。從微量滴定板除去所有液體后向每孔加入100μL稀釋后的病毒。板在37℃孵育1小時以使VSV感染MDBK細胞。然后從板除去病毒接種物。從10mL吸液管向每孔加入一滴甲基纖維素。將微量滴定板再次在37℃孵育過夜，之后除去甲基纖維素，并對板用結晶紫染色約5分鐘。
由于BGI/ARC細胞的出色的抗病毒效果，最初的實驗是令人驚奇的。含有BGI/ARCs的經(jīng)固定完整細胞得到最佳結果，其滴度為107到108.5。在保護50％腎臟細胞免于VSV感染而死亡方面，需要高水平稀釋，產(chǎn)生活性僅需要幾十皮克BGI/ARC。相比，重組改良細胞中的牛IFN-α(BAI)的活性低得多(表2)。
如表3中所闡明的，隨后類似的體外實驗證實BGI/ARCs保護牛腎細胞免受VSV感染的效能。
ARCs中與BGI共表達的BAI的低活性(注意盡管其活性低，但是BAI與BGI協(xié)同作用，刺激BGI活性增加10倍，參見表2)似乎是由于所觀察到的假單胞菌中多數(shù)BAI蛋白作為不可溶的包含體而聚集。最近使用用于溶解大腸桿菌或其他表達系統(tǒng)中的包含體的groEL/groES陪伴蛋白和融合蛋白結果表明這些或其他陪伴蛋白可用于使BAI在細胞內(nèi)保持為可溶的活性形式。然而，用于本研究的dnaK陪伴蛋白株系MB324在這方面對于BAI似乎僅稍微有效。
實施例7-BGI/ARC穩(wěn)定性取出在-80℃及在-20℃、4℃、室溫(RT)和37℃保存6個月的BGI/ARCs樣品(無菌水中)，以檢測貯存期穩(wěn)定性；不對樣品實施操作，也不向樣品加入額外的物質(zhì)。各種孵育時間后使樣品返回到-80℃并保存直到完成6個月試驗期。使用牛腎細胞-VSV攻擊試驗時，對BGI/ARC樣品的生物測定表明在-20℃或4℃的6個月保存中沒有活性損失。此外，BGI/ARC樣品在室溫保持穩(wěn)定8到17天，并且BGI/ARCs可以在37℃保持穩(wěn)定長達4天(見圖5)。
固定的假單胞菌細胞中BGI的量和活性都非常高。如下面的實施例中所闡明1)假單胞菌是IFN-γ的良好生物工廠，能夠產(chǎn)生的干擾素為總細胞蛋白的高達40％或以上；2)ARC穩(wěn)定性和改良方法不明顯破壞IFN-γ，也不產(chǎn)生對所表達的IFN-γ含量的屏障；3)BGI/ARCs在皮克范圍內(nèi)具有活性；5)BGI/ARCs具有很好的微粒流動、注射器處理和懸浮性質(zhì)；6)經(jīng)固定ARC的制備物保護BGI和其他表達的蛋白質(zhì)產(chǎn)物免受反復處理、冰凍，或其他潛在的破壞性操作導致的變性。
在哺乳動物中，通過同種抗原、腫瘤或有絲分裂原可以刺激活化的T細胞和天然殺傷細胞產(chǎn)生干擾素。γ-干擾素除了抗病毒活性，還表現(xiàn)出抑制腫瘤(10-12)和促進B細胞終末分化成產(chǎn)生免疫球蛋白的細胞(15；16)。γ-干擾素還可以活化巨噬細胞、增強天然殺傷細胞的細胞毒性、刺激T-細胞細胞毒性、和通過特異的細胞表面受體(17)與α-干擾素協(xié)同作用(7)。從而，BGI/ARCs的增強的γ-干擾素活性非常有利地用于杰出的治療性或預防性產(chǎn)品，而且當IFN-γ與其他細胞因子共表達時還有額外的價值。
如在下面的實施例中證明的，BGI/ARCs在體內(nèi)比體外發(fā)揮地更好。盡管其他實驗室(13；18；26)已經(jīng)表明IFN-γ以及其他物種的特異γ-干擾素是非常有效的佐劑，但是IFN-γ/ARCs的增強的活性、它們在穩(wěn)定性方面、低成本、容易生產(chǎn)、長效釋放、不絮凝和微粒流動性方面的所述優(yōu)點使得IFN-γ/ARCs是非常吸引人的備選佐劑。此外，用牛IFN-γ/ARCs得到的結果表明它們能夠令人驚奇地作為免疫促進劑以及有效的免疫佐劑。從熒光假單胞菌提取的IFN-γ活性極強，并且令人驚奇地，其當在腎組織培養(yǎng)物測定中試驗時具有同樣高的活性。如在下面實施例中所示的，ARC包封形式的IFN-γ在體內(nèi)比其可溶形式更具活性，并且具有作為免疫促進劑的額外令人驚奇的性質(zhì)。
實施例8-主要組織相容性(MHC)II類誘導測定評估BGI活性的另一方法是測定BGI對腎或樹突狀細胞誘導產(chǎn)生MHC II類抗原的能力的影響。將MDBK或樹突狀細胞以5×106個細胞/mL重懸在MEM加10％磷酸鹽緩沖液中。將4mL等分到6孔板中并在37℃過夜孵育。從板除去所有培養(yǎng)基并用HBSS洗滌每孔。一半的孔接受5mL MEM加100ng/mL BGI。另一半接受MEM與BGI。將板在37℃過夜孵育。再次除去培養(yǎng)基并用HBSS洗滌孔。向每孔加入1mL下面的混合物17.5mL利多卡因、32.2mL HBSS，用1N NaOH調(diào)pH至7.4。用細胞刮刀從孔中除去細胞，洗除利多卡因，F(xiàn)ACS染色，并用BectonDickenson Facscan分析。(2；3；5；7；14；15；18；19；26；和27)。
在下面的測定中使用從牛分離的商業(yè)化牛腎細胞(MDBK)或樹突狀細胞?！癕HC％”值指所測量的表達MHC抗原的細胞百分數(shù)。如在表4(從圖6A和6B得到)中所闡明的，實施BGI/ARCs、ARC對照和兩種不同BGI純化樣品的并列比較。
圖6A是來自大腸桿菌的純重組牛IFN-γ(RecBoIFNγ)的MHC表達曲線的圖解說明。圖6B圖解了1)未轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌宿主細胞對照(MB324)，2)pMYC1803(僅用載體轉(zhuǎn)化)ARC對照(MR1241)，3)BGI/ARC(用BGI基因轉(zhuǎn)化)(MR1605)，和4)從熒光假單胞菌純化的BGI(DOWIFN)的比較。MB324和MR1241的表達基本上相同。
還測定了從血液收獲的樹突狀細胞的MHC表達。圖7A闡明了從大腸桿菌純化的RecBoIFNγ的效果。圖7B是1)未轉(zhuǎn)化的熒光假單胞菌宿主細胞對照(MB324)，2)pMYC1803(僅用載體轉(zhuǎn)化)ARC對照(MR1241)，3)BGI/ARC(用BGI基因轉(zhuǎn)化)(MR1605)，和4)從熒光假單胞菌純化的BGI(DOWIFN)的比較。
實施例9-牛中BGI活性的劑量滴定(2；3；5；7；14；15；18；19；26；和27)試驗了四組牛以確定可以表現(xiàn)出可檢測的生物學活性的牛IFN-γ/ARC(BGI/ARC)的最小劑量。對每組5頭小牛的四組小牛A、B、C和D分別皮下注射BGI/ARCs，劑量為4800、480、48和0μg。0μg ARC對照和實驗樣品相同，只是對照假單胞菌細胞缺少牛IFN-γ基因。
用于該實驗的方案如下1.將3mL BGI/ARC和3mLARC對照用磷酸鹽緩沖液(PBS)稀釋到終體積6mL，其足夠為5頭小牛的每一頭提供5個等量1mL劑量，分別代表高BGI濃度和ARC對照組。此外，通過將0.4mL BGI/ARC母液或?qū)⒛敢旱?/10稀釋液用PBS稀釋到終體積4.0mL，從而制備母液BGI/ARC制備物的兩種連續(xù)10倍稀釋液。然后將3mL每種BGI/ARC連續(xù)稀釋液(1/10和1/100)稀釋到終體積6mL，其足夠為兩組小牛的每一頭提供5個1mL劑量，分別代表1/10和1/100稀釋的BGI/ARC樣品。
2.將BGI/ARC和ARC對照分散到無菌、密封的玻璃小瓶中并用適宜的組編號(表5)、日期、和施用用法說明標記。
3.將樣品在4℃保存直到由動物照料人員施用。
為臨床獸醫(yī)提供了動物編號和它們的組名稱列表。通過產(chǎn)生一組隨機編號(Excel程序)將小牛隨機分配到實驗組中。對隨機號編號并順序分配到組A、B、C和D。
用于檢測生物學活性的標準是體溫和體重的變化。單次皮下注射約4800μg BGI/ARC誘導處理48小時后體溫的顯著上升(圖8)，以及體重長時間(＞4天)下降(圖9)。單次皮下注射約480μg BGI/ARC誘導處理48小時后體溫輕微上升(＜1℃)，以及體重長時間(＞4天)下降。單次皮下注射約48μg BGI/ARC沒有誘導體溫的可檢測變化但是導致處理后24小時體重略微(＜5kg)下降。單次皮下注射約0.5mL ARC對照樣品沒有誘導體溫或體重中的可檢測的變化。
來自4800μg BGI/ARC劑量的組A的一個動物在處理后第一天死亡。尸體解剖結果揭示與腫脹(瘤胃郁積)診斷一致的病灶。沒有報導其他總的或組織病灶。該組中的其他小牛幸存下來但是表現(xiàn)出典型的干擾素用藥過量的癥狀，包括嚴重的體重損失和體溫升高。每天評估動物的各種臨床病征，包括跛、嗜睡、厭食、腹瀉、和注射部位腫脹。組A動物(4800μg BGI)的大多數(shù)在處理后第2、3和4天表現(xiàn)出這些臨床病征。組B(480μg BGI)動物也表現(xiàn)出高頻率的臨床病征但是僅在處理后的第一天表現(xiàn)(圖10)。劑量滴定研究表明為佐劑研究所選的BGI/ARC中BGI的劑量應該在50μg或更小的范圍內(nèi)。用BGI的該劑量處理的動物應該不表現(xiàn)出任何臨床上可檢測的不利反應。小牛中BGI/ARCs所產(chǎn)生的強烈的特征性干擾素反應與ARC-遞送的BGI一致，該ARC-遞送的BGI的比活性比純化的可溶牛IFN-γ的比活性高大約1000倍。
注射后0、2和4天檢驗每頭動物中血清觸珠蛋白水平(表6)。組C的牛在48μg BGI/ARC劑量下產(chǎn)生平均243,011ng/mL觸珠蛋白。將該結果與未處理的動物中產(chǎn)生的平均38,807ng/mL觸珠蛋白比較表明低至48μg的劑量也可誘導觸珠蛋白產(chǎn)量的顯著增加。
還測定了注射后0、2和4天時每頭動物中血清2’5’A合酶水平并將其在表7中闡明。
實施例10BGI/ARC對二次免疫應答的影響用50μg豬血清白蛋白(PSA)免疫小牛，并聯(lián)合下面的處理組A250μg BGI/ARC；組B25.0μg BGI/ARC；組C2.5μg BGI/ARC；組DARC對照(缺少BGI插入片段的ARC)，用足夠ARCs提供細胞量上與組A相當?shù)膶φ铡Ｐ∨Ｔ诘?天接受初次免疫(箭頭)，在第28天接受二次免疫(箭頭)。每組動物由6頭6-8月齡、Angus-Hereford雜交小牛組成，這些小牛為雌性或閹割的雄性。所給出的數(shù)據(jù)是平均值±SEM并且在圖11中圖解。
二次免疫應答的數(shù)據(jù)與初次免疫的數(shù)據(jù)一致。BGI/ARC的最低劑量(2.5μg BGI)最大地增強了抗體滴度，而ARC減、BGI對照幾乎沒有增強免疫應答。對照和最大滴度之間的差異從初次應答中的27倍增加到二次應答中的150倍以上。如圖12中所闡明的，BGI/ARCs對淋巴細胞具有增殖效果(通過3H胸苷的摻入測量)。
本實施例闡明ARCs是廉價生產(chǎn)、制備和遞送穩(wěn)定化IFN-γ的有價值的工具。IFN-γ/ARCs還令人驚奇地用作免疫佐劑和免疫應答的促進劑。如此處描述的1)熒光假單胞菌表達系統(tǒng)可用于廉價生產(chǎn)大量活性IFN-γ，其表達水平等于商業(yè)殺蟲劑MVP(9)蛋白所得到的表達水平(此處描述的方法可以從一次100,000升發(fā)酵產(chǎn)生1噸以上的IFN-γ)；2)化學滅菌方法改良了假單胞菌細胞、穩(wěn)定了ARCs的IFN-γ含量，并提供了巨噬細胞或其他IFN-γ反應性細胞內(nèi)或表面上IFN-γ的有效釋放；3)改良并穩(wěn)定的BGI/ARCs在它們的完整形式中是有活性的，并且IFN-γ的皮克水平就能夠保護細胞免受病毒感染(見，例如，牛腎細胞的VSV感染)；4)不像許多其他重組蛋白，IFN-γ是可溶的并且可以在熒光假單胞菌中以可溶形式過量表達并且即使以大于總細胞蛋白的40％的水平表達時也不在細胞中形成包含體；5)BGI/ARCs具有很好的貯存期性質(zhì)，在37℃數(shù)周后仍然保持穩(wěn)定和活性并且當冰凍時可以保持活性6個月以上而不損失活性；6)BGI/ARCs具有優(yōu)越的物理性質(zhì)；它們是機械上耐久的、不絮凝的顯微顆粒，可以以懸浮液保持并容易穿過注射器；7)BGI/ARCs具有所希望的長效釋放性質(zhì)；8)BGI/ARCs中IFN-γ的微克量在牛中出乎意料地產(chǎn)生強烈應答并且出乎意料地促進劇烈免疫佐劑應答和免疫加強，和9)BGI/ARCs可以通過肌內(nèi)、皮下施用或者通過粘膜導入體內(nèi)，使得可能實施非侵入性遞送。下面的實施例利用禽IFN-γ/ARCs(CGI/ARCs)進一步闡明本主題發(fā)明的有用性。
實施例11IFN-γ對禽巨噬細胞的影響得到禽(雞)巨噬細胞系(MQ-NCSU和HD11)，將其擴增并制備用于體外試驗的原種。兩種細胞系都生長在24孔板中并用不同濃度的重組雞IFN-γ(CGI)刺激。進行兩個獨立實驗。在第一個實驗中，將細胞鋪板1天后用CGI處理。在第二個實驗中，將細胞鋪板5天后用CGI處理。
在第一個實驗(即，鋪板后1天后用CGI處理巨噬細胞)中的第1、2、3、5、6、9、13和16(CGI處理后)測定細胞的一氧化氮(NO)產(chǎn)生。分析鋪板后5天用CGI處理的細胞在CGI處理后1、2、3、6、9和15天時NO的產(chǎn)生。從單個孔除去培養(yǎng)上清液的樣品并以4,000轉(zhuǎn)/分鐘離心至少5分鐘使上清液澄清。用Greiss試劑一式兩份地確定NO濃度。對于每個NO測定，還用來自沒有用CGI刺激的細胞的對照作為空白。CGI激活NO產(chǎn)生，并且NO產(chǎn)生在此處用于表示CGI活性。表10給出了所觀察到的最大NO濃度，觀察了最大NO濃度的天數(shù)(加入CGI后)以及與細胞系產(chǎn)生最大NO相關的重組CGI濃度。
使用鋪板后第二天的細胞進行第二組實驗。用重組的經(jīng)純化CGI(RCGI)、BGI/ARC、CGI/ARC(批1)和CGI/ARC(批2)刺激細胞。用10ng或100ng IFN-γ刺激后3天或4天測定細胞系的NO產(chǎn)生。這些結果在表11和12和圖13中給出。盡管牛γ干擾素(BGI)的活性比CGI小，但是令人驚奇地發(fā)現(xiàn)BGI刺激禽巨噬細胞。
實施例12-對禽施用含有雞IFN-γ的ARCs如上面描述的制備CGI/ARCs，并根據(jù)本領域中公知的方法制備來自HN植物抗原(見，例如，美國專利號5,310,678和2003年5月5日提交的美國臨時申請60/467,998，它們在此處完整并入作為參考)，這些方面具有下面的修改。植物來源的抗原NT1細胞在傳代后6-12天收獲。對直接從細胞培養(yǎng)物收獲的完整濕潤NT1細胞過濾以除去過多培養(yǎng)基，過濾步驟為將Spectramesh 30過濾器置于Buchner漏斗并倒入細胞，使用輕微真空使培養(yǎng)基穿過過濾器。
為了制備用于測定檢測的HN疫苗物質(zhì)，將0.5g細胞置于2mL提取緩沖液(Dulbecco磷酸鹽緩沖液(DPBS)，1mM EDTA，pH7.2)，然后在冰上超聲處理約2分鐘。用Branson 450超聲波儀進行超聲處理，該超聲波儀具有可更換的微型尖端(microtip)，輸出控制為8，工作期60次共兩分鐘(對于更大的制備(＞5g)，在冰上進行超聲處理5-10分鐘)。然后將超聲處理物置于冰上備用。從預先失活的卵滴度≥1010.6EID50/mL的尿囊液(Lohman Animal Health)得到失活的NDV La Sota品系。將尿囊液以冰凍制劑保存(-80℃)備用。
為了接種，從SPAFAS(North Franklin，Conn.)得到1天齡的SPF小雞并將其置于籠中并允許其適應直到7天齡。每次處理的小雞數(shù)目基于完全隨機化的設計，該設計使用重復測量。任何過多的小雞都被隨機置于單個籠中并用于代替死于運輸或安置壓力(placement stress)的小雞。將0.1-0.25mL注射到后頸實施皮下接種。
如下實施抗原和CGI/ARCs的劑量和施用。通過將凍干的CHN提取物與25μg CGI/ARC物質(zhì)在DPBS中水合制備植物來源的樣品。將失活的尿囊液解凍并通過向樣品直接加入25μg CGI/ARC混合。對于含有油/水乳液樣品的植物來源的樣品，將凍干的材料直接重懸在含有0.5％Tween和2.5％Drakeol油和0.165％Span80的DPBS中。施用兩次抗原接種，為(7天齡的第0天)并在第14天(21天齡)施用第二次加強劑量，然后在第35天(42天齡)施用失活的NDV-感染的尿囊液(上面描述)，并在第42天(49天齡)結束試驗。在研究的第14、21、35和42天通過頸靜脈或外周翼靜脈的靜脈穿刺從每只鳥收集1到2mL血樣。
為了測量免疫應答，從Colorado Serum(L#8152)得到Alsever溶液中的雞血紅細胞(CRBC)。為了制備1％CRBCs溶液，將5mL轉(zhuǎn)移到15mL錐形管并以250×g離心10分鐘。從RBC沉淀移去上清液和血沉棕黃層(buffy coat)；將沉淀重懸在1×DPBS(Dulbecco磷酸鹽緩沖液)(L#003435E JRH)中洗滌并以250×g離心10分鐘，進行2次。將沉淀以1％(v/v)重懸在DPBS中。為了證實懸浮液濃度，將400μl轉(zhuǎn)移到1.6mL去離子水中并通過劇烈混合裂解細胞。OD540為0.4-0.5。將1％溶液保存在2-7℃?zhèn)溆谩?br> 為了檢測血細胞凝集，首先以Static Guard噴霧96孔U形底平皿(Falcon)并印跡到紙巾上。將病毒樣品在DPBS中以1∶2預稀釋并將50μl DPBS置于96孔平皿的每個孔。向第一行加入稀釋病毒，然后連續(xù)2-倍稀釋以得到每個病毒樣品稀釋液的所希望的數(shù)目。向每孔加入50μl1％CRBC并將板以600轉(zhuǎn)/分鐘混合20秒。將板置于濕潤紙巾上并孵育直到對照孔中的CRBCs(DPBS和CRBCs以1∶1比例)沉到板的底部，或者在2-7℃至少1小時。終點為提供100％凝集的系列中最后一個孔的稀釋。
將病毒在DPBS中預稀釋以提供每50μl 4-8HA單位(基于滴定上述病毒)。用第1列和3-12列每孔25μl DPBS設置單獨的板；向列1和3中每孔加入25μl血清；列3中的血清被連續(xù)2倍稀釋直到10個孔。然后將預滴定的病毒(25μl)加入列3-12的所有孔并以600轉(zhuǎn)/分鐘混合20秒，將板室溫孵育1小時±15分鐘。每孔加入50μl 1％CRBC，以600轉(zhuǎn)/分鐘混合20秒并對于AIV在濕室中2-7℃過夜孵育，對于NDV在2-7℃孵育1-2小時。血清的滴度是抑制凝集100％的連續(xù)稀釋中的最后一個孔。
用Microsoft Excel 2000版本9.0.3821SR-1為每個處理組確定血清幾何平均滴度(GMT)。對于這些計算，＜10的背景ELISA滴度被給予的值為1。用最小二乘法分析確定經(jīng)處理鳥和對照的最小二乘法均值的差異。如果處理組和未接種的攻擊對照組之間存在顯著差異，那么認為處理是有效的。
在表13中顯示了每個取血日期的HI滴度。當用20μg劑量植物來源的HN蛋白與IFN-γ一起施用時，在第21天(第二個劑量后7天)HI滴度增加4倍，當該HN蛋白與油/水乳液聯(lián)合施用時HI滴度在第21天增加2倍。結果表明和不用CGI/ARC施用的抗原相比，使用與IFN-γ(CGI/ARC)共同施用的抗原可以誘導對靶抗原的增強的血清應答(見表13)。
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表1與免疫應答有關的因子
表2病毒攻擊試驗
表3病毒攻擊試驗
表4使用牛腎細胞的MHC II類誘導試驗
表5組的設計和處理
表6血清觸珠蛋白(ng/mL)
表7血清2’5’A合成酶水平(pMol/dL)
表8趨化因子
表9細胞因子
表10用純化的重組CGI刺激的禽巨噬細胞NO產(chǎn)生
表11用100ng IFN-γ處理的禽巨噬細胞中3天后的NO產(chǎn)生(μM)
表12用100ngIFN-γ處理的禽巨噬細胞中4天后的NO產(chǎn)生(μM)
表13雞IFN-γ(CGI/ARC)存在下針對植物細胞來源的HN的禽免疫應答
序列表<110>美國陶氏益農(nóng)公司<120>用于產(chǎn)生和遞送抗病毒劑、佐劑和疫苗促進劑的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)<130>DAS-103XC1<150>US 60/417,124<151>2002-10-08<160>3<170>PatentIn版本3.1<210>1<211>475<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的牛IFN-γ<400>1agagaactag taaaaaggag aaatccatgc agggccaatt ttttagagaa atagaaaact60taaaggagta ttttaatgca agtagcccag atgtagctaa gggtgggcct ctcttctcag120aaattttgaa gaattggaaa gatgaaagtg acaaaaaaat tattcagagc caaattgtct180ccttctactt caaactcttt gaaaacctca aagataacca ggtcattcaa aggagcatgg240atatcatcaa gcaagacatg tttcagaagt tcttgaatgg cagctctgag aaactggagg300acttcaaaaa gctgattcaa attccggtgg atgatctgca gatccagcgc aaagccataa360atgaactcat caaagtgatg aatgacctgt caccaaaatc taacctcaga aagcggaaga420gaagtcagaa tctctttcga ggccggagag catcaacgta atgactcgag tctct 475<210>2<211>475<212>DNA<213>人工序列<220>
<223>合成的牛IFN-γ<400>2tctcttgatc atttttcctc tttaggtacg tcccggttaa aaaatctctt tatcttttga 60atttcctcat aaaattacgt tcatcgggtc tacatcgatt cccacccgga gagaagagtc 120tttaaaactt cttaaccttt ctactttcac tgttttttta ataagtctcg gtttaacaga 180ggaagatgaa gtttgagaaa cttttggagt ttctattggt ccagtaagtt tcctcgtacc 240tatagtagtt cgttctgtac aaagtcttca agaacttacc gtcgagactc tttgacctcc 300tgaagttttt cgactaagtt taaggccacc tactagacgt ctaggtcgcg tttcggtatt 360tacttgagta gtttcactac ttactggaca gtggttttag attggagtct ttcgccttct 420cttcagtctt agagaaagct ccggcctctc gtagttgcat tactgagctc agaga 475<210>3<211>144<212>PRT<213>人工序列<220>
<223>合成的牛IFN-γ<400>3Met Gln Gly Gln Phe Phe Arg Glu Ile Glu Asn Leu Lys Glu Tyr Phe1 5 10 15Asn Ala Ser Ser Pro Asp Val Ala Lys Gly Gly Pro Leu Phe Ser Glu20 25 30Ile Leu Lys Asn Trp Lys Asp Glu Ser Asp Lys Lys Ile Ile Gln Ser35 40 45Gln Ile Val Ser Phe Tyr Phe Lys Leu Phe Glu Asn Leu Lys Asp Asn50 55 60
Gln Val Ile Gln Arg Ser Met Asp Ile Ile Lys Gln Asp Met Phe Gln65 70 75 80Lys Phe Leu Asn Gly Ser Ser Glu Lys Leu Glu Asp Phe Lys Lys Leu85 90 95Ile Gln Ile Pro Val Asp Asp Leu Gln Ile Gln Arg Lys Ala Ile Asn100 105 110Glu Leu Ile Lys Val Met Asn Asp Leu Ser Pro Lys Ser Asn Leu Arg115 120 125Lys Arg Lys Arg Ser Gln Asn Leu Phe Arg Gly Arg Arg Ala Ser Thr130 135 140
權利要求
1.經(jīng)改良的重組細胞(ARC)，其包含至少一種編碼趨化因子或細胞因子的異源基因。
2.根據(jù)權利要求1的ARC，其中異源基因編碼IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、11-16、IL-18、IL-23、IL-24、促紅細胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、EGF、成纖維細胞生長因子(FGF)、aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、胰島素樣生長因子(IGF-1)、IGF-2；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β；白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、制癌蛋白M、干細胞因子(SCF)、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、選自BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、Eotaxin-1、Eotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neurotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1、ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/Exodus/LARC、MIP-3β/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARC和TECK的趨化因子；或表1、8和9中提供的那些細胞因子或趨化因子。
3.根據(jù)權利要求2的ARC，其中異源基因編碼IFN-γ。
4.根據(jù)權利要求3的ARC，其中所述IFN-γ是牛、禽、魚或人IFN-γ。
5.根據(jù)權利要求4的ARC，其中所述IFN-γ是牛IFN-γ。
6.根據(jù)權利要求4的ARC，其中所述禽IFN-γ是雞IFN-γ。
7.根據(jù)權利要求2的ARC，其中ARC還包含編碼INF-α的異源基因。
8.根據(jù)權利要求1的ARC，其中所述細胞為選自革蘭氏陽性生物、革蘭氏陰性生物、酵母和真菌的微生物細胞。
9.根據(jù)權利要求8的ARC，其中微生物細胞是熒光假單胞菌。
10.根據(jù)權利要求1的ARC，其還包含載體。
11.誘導或促進個體對抗原或免疫原的免疫應答的方法，該方法包括對個體施用包含編碼趨化因子或細胞因子的至少一種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)；或?qū)€體施用包含含有編碼趨化因子或細胞因子的至少一種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)的組合物。
12.根據(jù)權利要求11的方法，其中所述方法還包括施用目標抗原。
13.根據(jù)權利要求12的方法，其還包括施用脂多糖(LPS)。
14.根據(jù)權利要求11的方法，其中所述異源基因編碼INF-γ。
15.根據(jù)權利要求14的方法，其中所述INF-γ是牛、禽、魚或人IFN-γ。
16.根據(jù)權利要求15的方法，其中所述INF-γ是牛IFN-γ。
17.根據(jù)權利要求15的方法，其中所述禽INF-γ是雞INF-γ。
18.根據(jù)權利要求11的方法，其中ARCs共表達至少一種目標抗原。
19.促進個體對抗原或免疫原的免疫應答的方法，該方法包括對個體施用a)包含編碼趨化因子或細胞因子的至少一種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)；或b)包含含有編碼趨化因子或細胞因子的至少一種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)的組合物；所施用的量可有效促進個體的免疫應答。
20.根據(jù)權利要求19的方法，其中所述方法促進IgM、IgG、IgA、IgE或IgY抗體的形成。
21.根據(jù)權利要求19的方法，其還包括在ARC組合物施用之前、同時或隨后施用抗原或免疫原。
22.根據(jù)權利要求19的方法，其中ARCs或ARC組合物包含IFN-γ。
23.根據(jù)權利要求19的方法，其中ARCs或ARC組合物包含IFN-α和IFN-γ。
24.根據(jù)權利要求22的方法，其中INF-γ是人、禽、牛或魚IFN-γ。
25.根據(jù)權利要求23的方法，其中IFN-α和IFN-γ為人、禽、?；螋~源的。
26.根據(jù)權利要求19的方法，其中抗原或免疫原是個體在環(huán)境中通常會遇到的病原或者專門導入個體環(huán)境中的病原物質(zhì)。
27.根據(jù)權利要求26的方法，其中抗原或免疫原是1)選自真菌毒素、單端孢菌毒素真菌毒素(T-2)、葡萄球菌腸毒素B、蓖麻毒蛋白和肉毒桿菌神經(jīng)毒素的生物毒素；2)選自天花、炭疽、埃博拉病毒、鼠疫耶爾森氏菌和武器化微生物細胞的病毒或細菌病原；或3)真菌病原。
28.治療腫瘤、癌癥或惡性腫瘤的方法，該方法包括對個體施用a)包含編碼趨化因子或細胞因子的至少一種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)；或b)包含含有編碼趨化因子或細胞因子的至少一種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)的組合物；所施用的量可有效治療腫瘤、癌癥或惡性腫瘤。
29.根據(jù)權利要求28的方法，其還包括施用化療劑和任選地施用腫瘤或癌抗原。
30.在個體中誘導目的生物學效果的方法，該方法包括對個體施用a)包含編碼趨化因子或細胞因子的至少一種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)；或b)包含含有編碼趨化因子或細胞因子的至少一種異源基因的經(jīng)改良重組細胞(ARCs)的組合物。
31.根據(jù)權利要求30的方法，其中目的生物學效果選自1)活化或刺激個體的巨噬細胞；2)刺激、抑制或調(diào)節(jié)個體的免疫系統(tǒng)；3)增加個體的病毒抗性；4)實現(xiàn)如表1、8或9中所示的目的生物學效果；5)治療動物的船熱；6)保護新生動物免于病毒性疾病或細菌性胃腸炎；和7)降低疾病或疾病癥狀的嚴重性。
32.制備經(jīng)改良重組細胞(ARC)的方法，該方法包括以下步驟a)向細胞中導入編碼細胞因子和任選地編碼趨化因子的至少一種異源基因；b)在營養(yǎng)培養(yǎng)基中生長所述細胞；c)收獲所述細胞；和d)失活或固定所述細胞。
33.根據(jù)權利要求32的方法，其中異源基因編碼IL-1、IL-2、IL-3、IL-4、IL-5、IL-6、IL-7、IL-8、IL-9、IL-10、IL-11、IL-15、11-16、IL-18、IL-23、IL-24、促紅細胞生成素、G-CSF、M-CSF、血小板衍生生長因子(PDGF)、MSF、FLT-3配體、EGF、成纖維細胞生長因子(FGF)、aFGF(FGF-1)、bFGF(FGF-2)、FGF-3、FGF-4、FGF-5、FGF-6、FGF-7、胰島素樣生長因子(IGF-1)、IGF-2；血管內(nèi)皮生長因子(VEGF)、IFN-γ、IFN-α、IFN-β；白血病抑制因子(LIF)、睫狀神經(jīng)營養(yǎng)因子(CNTF)、制癌蛋白M、干細胞因子(SCF)、TGF-α、TGF-β1、TGF-β2、選自BCA-1/BLC-1、BRAK/Kec、CXCL16、CXCR3、ENA-78/LIX、Eotaxin-1、Eotaxin-2/MPIF-2、Exodus-2/SLC、Fractalkine/Neu rotactin、GROα/MGSA、HCC-1、I-TAC、Lymphotactin/ATAC/SCM、MCP-1/MCAF、MCP-3、MCP-4、MDC/STCP-1、ABCD-1、MIP-1α、MIP-1β、MIP-2α/GROβ、MIP-3α/Exodus/LARC、MIP-3β/Exodus-3/ELC、MIP-4/PARC/DC-CK1、PF-4、RANTES、SDF1α、TARC和TECK的趨化因子；或表1、8和9中提供的那些細胞因子或趨化因子。
34.根據(jù)權利要求33的方法，其中異源基因編碼IFN-γ。
35.根據(jù)權利要求34的方法，其中所述INF-γ是牛、禽、魚或人INF-γ。
36.根據(jù)權利要求35的方法，其中所述IFN-γ是牛INF-γ。
37.根據(jù)權利要求35的方法，其中所述禽IFN-γ是雞IFN-γ。
38.根據(jù)權利要求33的方法，其中ARC還包含編碼INF-α的異源基因。
全文摘要
本發(fā)明提供了活性細胞因子和/或趨化因子組合物，以及活性細胞因子和/或趨化因子組合物的產(chǎn)生、經(jīng)改良細胞的包封、以及活性細胞因子和/或趨化因子組合物的加工和遞送的廉價方法。本發(fā)明還提供了治療方法和促進免疫應答的方法，該方法包括對動物或人施用含有細胞因子和/或趨化因子的經(jīng)改良重組細胞(ARC)的組合物。
文檔編號C12N15/00GK1723040SQ200380105335
公開日2006年1月18日 申請日期2003年10月7日 優(yōu)先權日2002年10月8日
發(fā)明者F·H·蓋特納, S·L·李, R·W·沙特爾 申請人:美國陶氏益農(nóng)公司