專利名稱：Alvac在禽胚胎干細胞上的生產(chǎn)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及利用禽胚胎干細胞生產(chǎn)ALVAC病毒的改良的方法。
背景技術(shù)：
當前在雞胚胎成纖維細胞(CEF)上生產(chǎn)ALVAC疫苗的方法涉及處理許多含胚卵。胚胎解離后，在感染前將細胞接種到搖瓶中。通常，感染120個搖瓶需要約200個卵。使用生長在懸液中的連續(xù)細胞系允許抑制卵處理并且允許由20升生物發(fā)酵罐代替搖瓶。在對培養(yǎng)條件優(yōu)化后，可期望提高細胞密度，由此提高最終的病毒產(chǎn)量?？捎糜谠撃康牡囊环N合適的細胞系可以是生長在懸液中穩(wěn)定的雞胚胎成纖維細胞來源的細胞系。
禽胚胎細胞系已由一些不同的研究者生產(chǎn)。例如，Pettite等(North Carolina State Univ.；美國專利No.5,340,740)描述了通過在小鼠成纖維細胞飼養(yǎng)層存在下培養(yǎng)禽囊胚層細胞來開發(fā)禽胚胎干細胞。Pettite(美國專利No.5,656,479；WO 93/23528)還描述并要求保護表現(xiàn)胚胎干細胞表型的未分化禽細胞的禽細胞培養(yǎng)物。
Samarut等(Institut National de la Recherche Agronomique，等；U.S.Pat.No.6,114,168；WO 96/12793)描述了用于在CEF上使用特定培養(yǎng)基生產(chǎn)禽胚胎干細胞的方法。Bouquet，等(InstitutNational de la Recherche Agronomique；美國專利No.6,280,970B1；專利申請No.2001/0036656 A1，11.1，2001公開)描述了其基因組中包含SV40T抗原的轉(zhuǎn)化的禽胚胎成纖維細胞。Samarut和Pain(美國專利申請No 2001/0019840 A1，9.6，2001公開)提及了用于生產(chǎn)禽ES細胞的培養(yǎng)基和用于在所述培養(yǎng)基中培養(yǎng)的ES細胞中生產(chǎn)蛋白的方法。而Han，等(Hanmi Pharm.Co.Ltd.；WO 00/47717)描述了用于通過在包含特定的生長因子和分化抑制因子的培養(yǎng)基中培養(yǎng)禽原始生殖細胞而開發(fā)禽胚胎生殖細胞系的方法。
已表明禽胚胎干細胞適于生產(chǎn)重組病毒。例如，F(xiàn)oster，等(Regents of Univ.Minnesota，美國專利No.5,672,485；5,879,924；5,985,642；5,879,924)描述了用于在來源于雞胚胎成纖維細胞的穩(wěn)定細胞系中培養(yǎng)病毒的方法。
Reilly，等(Board of Trustees operating Michigan StateUniversity；美國專利No.5,989,805；WO 99/24068)提及了經(jīng)化學誘變劑修飾的雞胚胎干細胞生產(chǎn)Marek′s病毒、豬流感病毒、馬流感病毒、禽流感病毒、禽呼腸孤病毒、雞痘病毒、鴿痘病毒、金絲雀痘病毒、鸚鵡皰疹病毒、鴿皰疹病毒、隼皰疹病毒。新城疫病毒，傳染性粘液囊病病毒、傳染性支氣管病毒、禽腦脊髓炎病毒、雞貧血病毒、禽腺病毒以及禽多瘤病毒的用途。Coussens，等(Board ofTrustees operating Michigan State University；美國專利No.5,827,738；5,833,980)也提及了Marek′s病病毒在胚胎干細胞中的增殖。Bouquet，等(Institut National de 1a RechercheAgronomique；美國專利No.6,280,970 B1；專利申請No.2001/0036656 A1，11.1，2001公開)描述了用于通過將SV40 T抗原整合入基因組中而轉(zhuǎn)化的禽胚胎成纖維細胞來生產(chǎn)病毒的方法。
在本領(lǐng)域中需要用于生產(chǎn)基于ALVAC疫苗的改良方法。此處提供了一種這樣的方法，它提供了使用生產(chǎn)在懸浮液中的禽胚胎干細胞來生產(chǎn)ALVAC載體的方法。該方法提供了產(chǎn)量和安全的優(yōu)點。本發(fā)明的重要部分如下所述。
發(fā)明概要本發(fā)明提供了用于通過在禽胚胎干細胞中培養(yǎng)ALVAC病毒以及從細胞收集病毒而增殖ALVAC病毒、制備疫苗和將疫苗提供給宿主的方法。優(yōu)選的細胞為EB1或EB14細胞。在一些實施方案中，病毒在其基因組中帶有編碼免疫原的外源DNA，其在已給予病毒的宿主中的表達引起保護性的免疫應(yīng)答。
附圖簡述

圖1.細胞對DMEM/F12培養(yǎng)基的逐漸適應(yīng)。
圖2.測試1的細胞培養(yǎng)物分析。
圖3.測試1的另外的細胞培養(yǎng)物分析。
圖4.用vCP205進行的EB1感染。
發(fā)明詳述本發(fā)明提供了用于在胚胎干細胞上培養(yǎng)ALVAC病毒的新方法。本申請中所有引用的參考文獻作為參考被引入。
痘病毒是一種有效的表達載體(Smith，等1983，Gene，25(1)21-8；Moss，等1992，Biotechnology，20345-62；Moss，等1992，Curr.Top.Microbiol.Immunol.，15825-38；Moss，等1991.Science，2521662-1667)。金絲雀痘病毒ALVAC是一種用于在宿主細胞中表達外源DNA序列的特別有用的病毒?；贏LVAC的重組病毒(即，ALVAC-1和ALVAC-2)特別適于實施本發(fā)明(參見，例如，美國專利No.5,756,103)。ALVAC(2)除了其基因組包括在牛痘啟動子控制下的牛痘E3L和K3L基因外，與ALVAC(1)是一致的(美國專利No.6,130,066；Beattie等，1995a，1995b，1991；Chang等，1992；Davies等，1993)。已證實ALVAC(1)和ALVAC(2)均在表達外源DNA中是有用的，如TAs(Tartaglia等，1993a，b；美國專利No.5,833,975)。ALVAC已根據(jù)布達佩斯條約保藏于美國模式培養(yǎng)物保藏所(ATCC)，10801 University Boulevard，Manassas，Va.20110-2209，USA，ATCC登錄號VR-2547。
ALVAC已證實對在宿主中表達外源DNA序列是有用的(參見，例如，美國專利No.5,756,102；5,833,975；5,843,456；5,858,373；5,863,542；5942235；5989561；5997878；6265189；6267965；6309647；6541458；6596279；和6632438)。在實施本發(fā)明中，ALVAC可以以天然狀態(tài)或以包含編碼蛋白如抗原的外源DNA的重組體形式培養(yǎng)。特別有用的抗原包括那些抗原，其源自在人體中引起疾病的病原體(即，人病原體)如細菌、真菌，或病毒，除此之外，或是源自腫瘤的抗原(即，腫瘤或腫瘤相關(guān)抗原)。許多這樣的抗原在本領(lǐng)域中是已知的并且適于實施本發(fā)明。ALVAC載體還包括免疫共刺激分子如B7.1等。本發(fā)明進一步包括在藥學可接受的稀釋劑中包含ALVAC載體的組合物。還涉及所述組合物對需要免疫的動物或人宿主的給藥。
在一個實施方案中，本發(fā)明證實在源自禽胚胎干細胞的連續(xù)的、非致瘤的禽細胞上生產(chǎn)ALVAC病毒是可能的。用于該目的的合適細胞已在例如，美國專利No.5,340,740；5,656,479；5,672,485；5,879,924；5,985,642；5,989,805；6,114,168；6,280,970 B1；美國專利申請No.2001/0036656 A1；US2001/0019840 A1；和國際申請WO 93/23528；WO 96/12793；WO 99/24068；WO 00/47717；FR 02/02945；和WO 03/07661中描述。在一些實施方案中，所述細胞包括，例如，EB1、EB2、EB3、EB4、EB5和EB14細胞(如FR02/02945和WO 03/07661所述)。這些細胞從胚胎發(fā)育的很早期獲得并且呈現(xiàn)干細胞表型。細胞在其天然狀態(tài)下是未進行遺傳修飾的并且被培養(yǎng)在懸液中。在一個實施方案中，細胞為從VIVALISSA(法國；FR 02/02945和WO 03/07661)獲得的EB1細胞。在第二個實施方案中細胞為從VIVALIS SA(FR 02/02945和WO 03/07661)獲得的EB14細胞。EB1和EB14細胞為對禽胚胎干細胞的早期擴增。所述這些合適的細胞包括在術(shù)語“禽胚胎干細胞系”(“AES”)的定義中。在本領(lǐng)域已知的任何所述細胞，連同其他AES，均適于實施本發(fā)明。
從下列作為例證給出的實施例中可以更好地理解本發(fā)明及其許多優(yōu)點。
實施例實施例1材料與方法A.細胞和病毒從Vivalis收到處于p139(05.2001)或p148(07.2001)的EB1細胞(2×50×10E6細胞)。給培養(yǎng)基(改變的McCoy 5％和0％SVF)提供細胞。所有感染使用#362，澄清的(滴度7.9logTCID50/ml)、純化的(蔗糖墊+梯度，滴度8.5log TCID 50/ml)或半純化的(蔗糖墊，滴度9.2logTCID50)的ALVAC vCP205進行(ATCC No.VR-2557；美國專利No.5,863,542；HIV表達盒-牛痘H6啟動子/HIV截短的包膜蛋白基因MN株，在ALVAC C3插入位點帶有蛋白酶的I3L類群特異抗原基因)進行。
EB1細胞的系譜圖如下顯示 B.受感染細胞的處理通過離心收集受感染細胞。將細胞片狀沉淀物重懸入無血清培養(yǎng)基起始體積的1/20至1/20中，在培養(yǎng)基中短時超聲并且再次離心獲得澄清的裂解物。
C.病毒定量為了研究在病毒制備物中ALVAC DNA的復制，我們用LightCyclerTM裝置開發(fā)了一種ALVAC DNA定量PCR測定法。ALVAC DNA經(jīng)純化并用特異于編碼結(jié)構(gòu)VP8蛋白的K10R區(qū)域的引物在SYBRGreen染料存在時擴增。根據(jù)已知純化的病毒DNA濃度建立的標準曲線，用于測定每個樣品中的病毒DNA濃度。通過在LightCycler上，然后在SOP V100501/01上進行QPCR將ALVAC DNA定量，如下所述A.設(shè)備L2級區(qū)帶；在2個隔離室中用2種不同染料包被的II型層流櫥；帶圓盤傳送帶的LightCycler(羅氏診斷Ref2011468)；毛細管(羅氏診斷Ref1909339)；離心機接合器(羅氏診斷Ref1909312)；離心機(Eppendorf Ref5415D)；圓盤傳送帶離心機(羅氏診斷Ref2189682)；冰盒，薄壁96孔板模型M(COSTER Ref6511)；微量試管，1.5ml(Eppendorf Ref24077)；8道電子移液管，0.2-10μl(BIOHIT Ref710200)；卡式試管頭10、20、50、200、1000μl；以及10、20、50、200、1000μl手動移液管。
B.產(chǎn)物ALVAC標準DNA，50倍稀釋20至200,000拷貝；用于提取和定量的內(nèi)參ALVAC病毒，107TCID50/ml(約2×109拷貝/ml)；FastStart DNA Master SYBR Green I試劑盒(羅氏診斷Ref2239264)；H2O，無DNA酶和RNA酶(PROMEGA RefP1193)；樣品ALVAC DNA或ALVAC病毒；引物CPK1011(5μM)以及CPK1012(5μM)(參見下面) C.預防措施戴手套；Master Mix和DNA稀釋必須在2個不同的櫥中進行；SYBR Green需要避光保護并且在5℃±1℃保存；接合器需在冷卻塊中在5℃±1℃下預冷。
D.步驟●啟動LightCycler在樣品制備前，用LightCycler軟件，選擇程序(FastStart 50℃)和定義樣品數(shù)量，以及適當?shù)刈鳂擞洝?br> ●制備主要混合物制劑(冰上)○在第一個櫥下在冰上制備反應(yīng)混合物。使用1.5ml的反應(yīng)試管，計算5個標準點、1個陰性點、1個參照點和n+1個樣品所需的體積。
○將1b試管的60μl加入1a試管。用移液管混合(不要渦漩)。
○將18μl的混合物加入每個毛細管。隨后將冷卻塊轉(zhuǎn)移至第二個櫥下。
●DNA制備○在冰上，通過毛細管用無DNA酶/RNA酶的H2O在微量試管或96孔板中稀釋ALVAC DNA樣品，以獲得少于200,000拷貝(估算)。
○將ALVAC DNA標準樣品從200,000稀釋至20拷貝(10倍稀釋)。
○將ALVAC參照DNA稀釋100倍。
○在每個毛細管中，加入2μl DNA樣品，或在陰性樣品中加入2μl H2O。用塑料塞封口。在離心機上以100g離心接合器(包含毛細管)30s并且將毛細管放至圓盤傳送帶中。將包含樣品的圓盤傳送帶放至LightCycler并且關(guān)上蓋。
○啟動運行。
●通過LightCycler軟件分析○用于定量選擇分析的方法●選擇“配合點方法”●步驟1選擇“算法基線”●選擇標準樣品●步驟2校正噪音帶以消除熒光背景●步驟3校正交叉線使得誤差值低于0.1，而斜率值在-3.3和-4.0之間(最佳理論值3.4)并且截距值在30和40之間。在線的最優(yōu)設(shè)置時，計算的標準值應(yīng)該最接近他們的已知值。
○選擇解鏈曲線分析用于Tm分析●步驟1選擇“帶本底的線性”方法●選擇樣品●步驟2分別在解鏈豌豆(pea)的起始和結(jié)束時校正指針。
●步驟3選擇“人工Tm”軟件計算樣品的Tm。
●對照○對于所有樣品，基線熒光值應(yīng)該接近0○兩個參數(shù)允許對標準曲線的驗證。第一個是應(yīng)該低于0.1的誤差。第二個是二級方程式，其斜率值包括在-3.3至-4.0之間(最佳理論值3.4)而截距值在30和40之間。
○PCR產(chǎn)物的解鏈曲線允許控制引物的特異性Tm值通常約為78+/-1℃。也可在瓊脂糖凝膠電泳上對特異性進行控制僅一種產(chǎn)物將被擴增，在110bp處。
○內(nèi)參用于控制DNA提取的質(zhì)量。
感染效價通過標準的PFU測定法測量。
實施例2EB1細胞的生長優(yōu)化在使用前，分析細胞以優(yōu)化生長條件。如上所述，EB1細胞由VIVALI S在特定改良的培養(yǎng)基McCoy-5％FCS中提供。測試兩個參數(shù)FCS(2.5％對5％)和CO2(0％對5％)對EB1細胞生長的影響。還測試了該細胞對DMEM-F12的適應(yīng)。對于每個條件，計算世代時間。
為了進行測試，在所選條件下以104細胞/ml起始濃度給旋轉(zhuǎn)器接種并且在37℃振蕩孵育。培養(yǎng)基剛變?yōu)樗嵝詴r，在新鮮培養(yǎng)基中將細胞稀釋至104至105細胞/ml濃度。通過臺盼藍排除法測定細胞存活率。在其中細胞存活率太低(即，＜70％)的每種情況中，進行Ficoll梯度以剔除死亡細胞(圖上以箭頭A和C表示的)。
通過用DMEM/F12(圖上以箭頭C表示)逐步稀釋起始培養(yǎng)基(McCoy培養(yǎng)基)來完成細胞對DMEM/F12培養(yǎng)基的逐漸適應(yīng)。根據(jù)G＝N/D計算對應(yīng)于每天倍增(或子代)數(shù)目的世代時間(G)，其中D為培養(yǎng)天數(shù)而N為子代數(shù)目，其由方程式Cf＝Ci×2N確定，Cf和Ci分別為最終和起始細胞濃度。
通過未感染細胞的讀數(shù)獲得數(shù)據(jù)，并且以細胞的起始密度函數(shù)呈現(xiàn)。這些研究的結(jié)果概括在圖1和表1中。
表1
從這些研究中，概括得出●EB1細胞在懸液中的平均倍增時間約為1.1子代/天；●當在2.5％或5％FCS存在培養(yǎng)細胞時，生長曲線無顯著性差異。
●細胞對Ficoll梯度離心敏感，并且條件應(yīng)當被優(yōu)化。
●在我們的條件中達到的最大細胞密度約為800,000細胞/ml。在更高密度時，培養(yǎng)基變酸，細胞生長停止，細胞快速凋亡和降解。
●EB1細胞可以以懸液形式在包含2.5％FCS的標準DMEM/F12培養(yǎng)基中生長，平均倍增時間為約每天1個子代。
●在旋轉(zhuǎn)器中最大細胞密度在5×105和106細胞/ml之間，但生物發(fā)生器中的培養(yǎng)條件對提高生物量是有用的。
實施例3在旋轉(zhuǎn)器中EB1細胞的感染A.測試1將DMEM-F12-0％FCS(起始密度4×105細胞/ml)中的100ml EB1細胞(P138)與澄清的ALVAC-HIV vCP205(感染指數(shù)為0.1)制備物在37℃孵育1小時。隨后將培養(yǎng)物用等體積的改良的McCOY5A-5％FCS稀釋(最終細胞密度2×105細胞/ml)，并且在振蕩(旋轉(zhuǎn)器)和5％CO2下37℃孵育。在感染后48和96小時時收集細胞級分和培養(yǎng)物液體，并且分析感染性病毒(CEPs上的PFU測定法)和病毒DNA含量(qPCR)。在每個時間點，分析20ml培養(yǎng)物。離心后，收集懸浮碎片直接用于定量。在超聲處理和定量前，將對應(yīng)于細胞級分的片狀沉淀物重懸入1ml(起始體積的1∶20)的Tris 10mM pH9中。效價以每ml(左列)或每級分(右列)表示。通過加入該2個級分而計算在旋轉(zhuǎn)器中生產(chǎn)的總病毒物質(zhì)總量＝(S/ml×200)+(C/ml×10)。通過將該結(jié)果除以200而獲得每ml的總值。該測試的結(jié)果在表2中顯示。
表2
*以初始體積的1∶20濃縮細胞后估測的效價B.測試2將DMEM-F12-0％FCS(起始密度5.6×105細胞/ml)懸液中的22.5ml細胞(P138)與澄清的ALVAC-HIV vCP205(m.o.i0.1)制劑在37℃孵育1小時。隨后將培養(yǎng)物用等體積改良的McCOY5A-5％FCS稀釋(最終細胞密度2.8×105細胞/ml)，并且在振蕩(旋轉(zhuǎn)器)和5％CO2下在37℃下孵育。在感染后50、74和96小時時收集細胞級分和培養(yǎng)物液體，并且分析感染性病毒(PFU測定法)和病毒的DNA含量(qPCR)。細胞培養(yǎng)物分析如上面測試1所述的方式進行。測試的結(jié)果概括在表3中。
表3
*以初始體積的1∶5濃縮細胞后估測的效價C.測試3在改良的McCOY 5A培養(yǎng)基-0％FCS的最小體積(5ml)中以0.1的感染復數(shù)感染p148EB1細胞，并且以最終密度1.5×105細胞/ml將其稀釋在200ml改良的McCoy培養(yǎng)基2％FCS中。重復進行試驗(旋轉(zhuǎn)器A和B)，用半純化的(蔗糖墊，旋轉(zhuǎn)器A)或純化的(蔗糖墊+梯度，旋轉(zhuǎn)器B)vCP205(#363)制劑感染細胞。在時間點24、48、72和116小時時定量測定細胞級分和受感染細胞的上清液中的病毒DNA和感染性病毒。在旋轉(zhuǎn)器A和B間在感染后未獲得無顯著性差異。如上面測試1所述的對細胞培養(yǎng)物進行分析。測試的結(jié)果概括在表4和5以及圖2和3中。平行地測量細胞存活率，顯示在圖4中。
表4×10E6細胞/ml
旋轉(zhuǎn)器A
旋轉(zhuǎn)器B
與平均比率上清液/細胞相關(guān)的病毒(旋轉(zhuǎn)器A和B)比率＝[PFU/GEQ培養(yǎng)基]/[PFU/GEQ細胞級分]
表5平均值旋轉(zhuǎn)器[A，B]/ml
*以初始體積的1∶20濃縮細胞后估測的效價。
D.在靜止條件下感染，沒有振蕩(燒瓶)給75cm2培養(yǎng)瓶接種在總體積為50ml的DMEM-F12中的無FCS的3×105細胞，并且用vCP205以0.1m.o.i.在37℃，5％CO2下感染48小時。收集培養(yǎng)物液體和細胞級分且定量感染性病毒(PFU測定法)和病毒DNA(qPCR)。測試結(jié)果概括在表6和圖4中。
表6
*將細胞濃縮為1ml后測定的效價(初始體積的1∶50)
從該研究中得到如下結(jié)論●當在旋轉(zhuǎn)器中而不是在燒瓶中培養(yǎng)細胞時病毒產(chǎn)量更高(平均值5PFU/ml對0.5PFU/ml)；●平均PFU效價/細胞6.3(相對于如由vCP 205#S 3317、#S3292、#3134、#LST011和#LP012計算的平均值所確定的CEPs生長病毒的2.5TCID 50/細胞)；●平均GEQ效價/細胞105(相對于CEPs生長的vCP205的125GEQ/細胞)。作為比較，在雞胚胎成纖維細胞中病毒產(chǎn)量通常為約2.5TCID 50/細胞(5至20PFU)，相應(yīng)于125GEQ/細胞；●在Mc Coy培養(yǎng)基DMEM/F12(1∶1)2.5％FCS中，最大效價(感染效價和基因組效價)在感染后72至97小時時達到。在McCoy培養(yǎng)基2.5％FCS中，基因組效價增加直到感染后116小時，而感染效價在感染后48小時時是穩(wěn)定；●在測試1和2中，病毒主要從細胞培養(yǎng)物上清液中回收，其最可能是細胞裂解的結(jié)果；●EB1細胞以與CEPs類似的產(chǎn)量復制ALVAC vCP205；以及●不經(jīng)優(yōu)化，在6PFU/細胞的病毒產(chǎn)量和5×105細胞/ml細胞密度的基礎(chǔ)上，120個搖瓶的標準生產(chǎn)過程可以被一個20升的生物發(fā)生器代替。
雖然結(jié)合優(yōu)選的實施方案對本發(fā)明進行了描述，可以理解的是本領(lǐng)域技術(shù)人員可以想到多種變化和改進。因此，隨附的權(quán)利要求試圖涵蓋所有在本發(fā)明所要求保護的范圍內(nèi)進行的等效變化。
權(quán)利要求
1.一種用于繁殖ALVAC病毒的方法，包括(a)用ALVAC病毒感染一種或多種禽胚胎干細胞；(b)培養(yǎng)感染的禽胚胎干細胞以生產(chǎn)病毒；(c)分離病毒。
2.權(quán)利要求1的方法，其中所述的病毒在ALVAC基因組中包含外源DNA序列。
3.權(quán)利要求2的方法，其中外源DNA編碼腫瘤抗原、源自人病原體的抗原或其片段。
4.權(quán)利要求3的方法，其中病原體為細菌、真菌或病毒病原體。
5.權(quán)利要求1-4中任意一項的方法，其中外源DNA進一步編碼一種共刺激分子。
6.權(quán)利要求5的方法，其中外源DNA編碼共刺激分子B7.1。
7.一種用于繁殖病毒的方法，包括(a)用ALVAC病毒感染源自禽胚胎干細胞的一種或多種細胞；(b)培養(yǎng)感染的細胞以生產(chǎn)病毒；(c)分離病毒。
8.權(quán)利要求7的方法，其中所述的細胞為EB1或EB14細胞。
9.權(quán)利要求7或8的方法，其中所述的病毒在ALVAC基因組中包含外源DNA序列。
10.權(quán)利要求9的方法，其中外源DNA編碼腫瘤抗原、源自人病原體的抗原或其片段。
11.權(quán)利要求10的方法，其中病原體為細菌、真菌或病毒病原體。
12.權(quán)利要求7-11中任意一項的方法，其中外源DNA進一步編碼一種共刺激分子。
13.權(quán)利要求12的方法，其中外源DNA編碼共刺激分子B7.1。
14.權(quán)利要求1-13中任意一項的方法，其中ALVAC病毒為ALVAC(2)。
15.一種包括通過權(quán)利要求1-14中任意一項的方法生產(chǎn)的ALVAC病毒的組合物。
16.一種可用于生產(chǎn)用于治療人類疾病的藥物的組合物，該組合物包括通過權(quán)利要求1-14中任意一項的方法生產(chǎn)的ALVAC病毒。
17.一種用于制備免疫原性組合物的方法，包括(a)用ALVAC病毒感染禽胚胎干細胞，該病毒在ALVAC基因組內(nèi)包括至少一種編碼人腫瘤抗原、源自人病原體的抗原或其片段的外源核苷酸序列；(b)培養(yǎng)感染的細胞以生產(chǎn)病毒；(c)從培養(yǎng)的細胞中收集病毒；以及，(d)使病毒經(jīng)受至少一種下列的處理(i)滅活病毒，(ii)加入藥物可接受的載體或稀釋劑，(iii)加入佐劑，或(iv)冷凍干燥。
18.權(quán)利要求17的方法，其中ALVAC病毒為ALVAC(2)。
19.一種包括通過權(quán)利要求17或18的方法生產(chǎn)的ALVAC病毒的組合物。
20.一種可用于生產(chǎn)用于治療人類疾病的藥物的組合物，該組合物包括通過權(quán)利要求17或18的方法生產(chǎn)的ALVAC病毒。
21.一種用于制備免疫原性組合物的方法，包括(a)用ALVAC病毒感染源自禽胚胎干細胞的一種或多種細胞，該病毒在ALVAC基因組內(nèi)包括至少一種編碼人腫瘤抗原、源自人病原體的抗原或其片段的外源核苷酸序列；(b)培養(yǎng)感染的細胞以生產(chǎn)病毒；(c)從培養(yǎng)的細胞中收集病毒；以及，(d)使病毒經(jīng)受至少一種下列的處理(i)滅活病毒，(ii)加入藥物可接受的載體或稀釋劑，(iii)加入佐劑，或(iv)冷凍干燥。
22.權(quán)利要求17的方法，其中ALVAC病毒為ALVAC(2)。
23.權(quán)利要求21或22的方法，其中所述的細胞為EB1或EB14細胞。
24.一種包括通過權(quán)利要求21-23中任意一項的方法生產(chǎn)的ALVAC病毒的組合物。
25.一種可用于生產(chǎn)用于治療人類疾病的藥物的組合物，其包括通過權(quán)利要求21-24中任意一項的方法生產(chǎn)的ALVAC病毒。
26.一種用于給宿主提供疫苗的方法，包括(a)用ALVAC病毒感染禽胚胎干細胞，該病毒在ALVAC基因組內(nèi)包括至少一種編碼人腫瘤抗原、源自人病原體的抗原或其片段的外源核苷酸序列；(b)培養(yǎng)感染的細胞以生產(chǎn)病毒；(c)從培養(yǎng)的細胞中收集病毒；(d)使病毒經(jīng)受至少一種下列的處理(i)滅活病毒，(ii)加入藥物可接受的載體或稀釋劑，(iii)加入佐劑，或(iv)冷凍干燥以生產(chǎn)疫苗組合物；以及(e)將疫苗組合物給藥于宿主，由此在宿主中產(chǎn)生保護性免疫應(yīng)答。
27.權(quán)利要求27的方法，其中所述的細胞為EB1或EB14細胞。
28.權(quán)利要求27或28的方法，其中ALVAC病毒是ALVAC(2)。
29.一種包括通過權(quán)利要求26-29中任意一項的方法生產(chǎn)的ALVAC病毒的組合物。
30.一種可用于生產(chǎn)用于治療人類疾病的藥物的組合物，其包括通過權(quán)利要求26-29中任意一項的方法生產(chǎn)的ALVAC病毒。
全文摘要
本發(fā)明涉及用于在禽胚胎干細胞上生產(chǎn)ALVAC病毒的方法以及包括用該方法制得的ALVAC病毒的組合物。
文檔編號C12N5/06GK1726276SQ200380105997
公開日2006年1月25日 申請日期2003年12月12日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月13日
發(fā)明者V·巴班, L·奧雅姆 申請人:艾文蒂斯·帕斯圖爾公司