專利名稱：生產改變含油量的植物的制作方法
相關申請本申請要求2002年12月18日提交的美國臨時專利申請60/434,795的優(yōu)先權，其內容全部引入作為參考。
背景技術：
控制農作物種子的組合物，尤其是種子油類的含量和組合物的能力在涉及加工食品油類以及動物飼養(yǎng)油類的農業(yè)工業(yè)中具有重要的應用價值。農作物的種子含有多種有價值的組分包括油類，蛋白以及淀粉。工業(yè)生產過程可以分離若干或所有這些組分用于專門應用的單獨銷售。例如，幾乎60％的美國大豆農作物通過大豆加工工業(yè)進行壓榨。大豆加工產生高價銷售的精煉油，而殘余物主要作為低價值的飼料銷售(US Soybean Board，2001 Soy Stats)。加拿大油菜(canola)種子被壓榨產生油類以及副產品加拿大油菜粗粉(加拿大加拿大油菜協(xié)會)。幾乎20％的1999/2000年的美國谷物農作物經過工業(yè)化精煉，主要用于產生淀粉，乙醇以及油類(谷物精煉業(yè)者協(xié)會)。因此，常常需要使種子的含油量最大化。例如，對于諸如大豆以及加拿大油菜的加工含油種子而言，提高種子的絕對含油量將提高這種谷物的價值。對于加工的谷物而言，可能需要根據其它主要組分的應用提高或者降低含油量。降低油類可以通過降低與油類氧化相關的不希望的味道改善分離淀粉的質量?；蛘撸谖兜啦恢匾囊掖籍a生中，提高含油量可以提高總的價值。在許多谷物飼料中，諸如谷物以及小麥，可能希望提高植物含油量，因為油類比諸如碳水化合物的其它種子組分具有較高的能含量。含油種子加工，就像大多數谷物加工業(yè)一樣是資金密集產業(yè)；因此產品從低值組分到高價值油類組分的分布的較小改變可能對于谷物加工者而言就有顯著的經濟影響。
油類的生物技術處理可以提供組成的改變以及油產量的改進。組成的改變尤其包括高油酸的大豆以及玉米油(美國專利6,229,033以及6,248,939)，以及含有月桂酸酯的種子(美國專利5,639,790)等。組成改變的工作主要集中在加工的含油種子但是已經可以很容易地延伸至非-含油種子農作物包括谷物。雖然對提高含油量具有相當的興趣，在這一領域目前唯一實踐的生物技術是高油類谷物(HOC)技術(杜邦，美國專利5,704,160)。HOC利用通過標準的選擇育種連同生產系統(tǒng)中稱為頂交的優(yōu)良品種(不孕雄性)雜交雌性得到的高油類授粉者。頂交高油類系統(tǒng)使玉米收獲的谷物含油量從～3.5％提高到～7％，改善了谷物的能含量。
雖然HOC生產系統(tǒng)已經卓有成效，但是其仍然具有固有的局限性。首先，擔負全部的土地的種子栽植的低授粉者百分比的系統(tǒng)含有固有風險，尤其是在早年。第二，當前HOC領域含油量已經平穩(wěn)在大約9％的油類。最后，高油類谷物主要不是生物化學變化，而是對于提高含油量產生間接結果的解剖學上的突變體(提高胚芽芽尺寸)。為此，可選擇的高油類策略，尤其是來源于改變生化產量的高油類策略將是非常重要的。
操作油市場最明顯的目標農作物是大豆以及油菜籽，并且大量商業(yè)工作(例如美國專利5,952,544；PCT申請WO9411516)證明擬南芥是這些農作物油類代謝的優(yōu)良模型。植物油組合物的生物化學篩選已經鑒定了許多關鍵生物合成酶的擬南芥基因并且導致農業(yè)上重要基因的直向同源物的鑒定。例如，利用化學誘變處理群的篩選已經鑒定了其種子顯示脂肪酸成份改變的脂類突變體(Lemieux B等1990，Theor ApplGenet 80，234-240；James DW以及Dooner HK(1990)Theor Appl Genet80，241-245)。檢測脂肪酸成份改變的T-DNA誘變篩選(Feldmann等，Science 2431351-1354，1989)鑒定了ω3脫氫酶(FAD3)以及δ-12脫氫酶(FAD2)基因(美國專利5952544；Yadav NS等(1993)Plant Physiol103，467476；Okuley等，Plant Cell.1994 Jan；6(1)147-58)。集中在含油量而非油類質量的篩選分析化學上誘導的皺縮種子或籽粒容量改變的突變體，據此推斷出改變的植物含油量(Focks N以及Benning C，Plant Physiol 11891-101，1998)。用來鑒定參與非常長鏈脂肪酸產生的酶的另一種篩選鑒定了編碼負責降低種子中三酰甘油聚集的甘油二酯?；D移酶(DGAT)的基因的突變(Katavic V等，Plant Physiol.1995May；108(1)399-409)。此外，還顯示DGAT cDNA的種子特異性過量表達與提高的植物含油量有關(Jako等，Plant Physiol.2001 Jun；126(2)861-74)。
發(fā)明概述本發(fā)明提供了具有高油類含量表現型的轉基因植物。轉基因植物包括含有編碼或互補于編碼檸檬酸合成酶多肽的序列的核苷酸序列的轉化載體。在優(yōu)選的實施方案中，轉基因植物選自油菜，大豆，谷物，向日葵，棉花，可可粉，紅花，油棕，椰子，亞麻蓖麻以及花生。本發(fā)明還提供了產生油類的方法，包括培育轉基因植物以及從所述植物回收油類。
本發(fā)明的轉基因植物通過包括向植物的祖細胞引入含有編碼或互補于編碼檸檬酸合成酶多肽的序列的核苷酸序列的植物轉化載體，以及培育轉化的祖細胞產生轉基因植物的方法產生，其中檸檬酸合成酶多核苷酸序列的表達產生高油類含量表現型。
發(fā)明詳述定義除非另有陳述，這里使用的全部技術以及科學名詞具有與本領域技術人員知曉的相同的含義。專業(yè)人員尤其是參考Sambrook等的分子克隆實驗指南(第二版)，Cold Spring Harbor Press，Plainview，N.Y.，1989，以及Ausubel FM等的Current Protocols in MolecularBiology，John Wiley & Sons，New York，N.Y.，1993的定義以及術語。立該理解本發(fā)明不限于所描述的特定方法，流程以及試劑，因為這些可以改變。
此處所述的術語“載體”是指設計用于在不同宿主細胞之間轉移的核酸構建體?！氨磉_載體”是指可以在異源細胞中整合并表達異源DNA片段的載體。許多原核以及真核生物表達載體是可以市售獲得的。選擇合適的表達載體是本領域述人員所熟知的。
“異源的”核酸構建體或序列具有一部分序列不是植物細胞的野生型序列但是在其中表達。異源的控制序列是指不天然調節(jié)目前正在調節(jié)的相同基因表達的控制序列(即啟動子或增強子)。通常，異源核酸序列不是它們所存在于的細胞或者基因組的一部分所內源產生的，并且已經通過傳染，轉染，顯微注射，電穿孔法等加入至細胞中?！爱愒吹摹焙怂針嫿w可以含有控制序列/DNA編碼序列組合，其與野生型植物中發(fā)現的控制序列/DNA編碼序列組合相同或者不同。
此處所述的術語“基因”是指參與多肽鏈產生的DNA片段，其可能包括或者不包括編碼區(qū)之前以及之后的區(qū)域，例如5′非翻譯區(qū)(5′UTR)或者“前導”序列以及3′UTR或者“尾部”序列以及單獨的編碼片段(外顯子)以及非-轉錄調節(jié)序列之間的內含子序列(內含子)。
這里使用的“重組體”包括已經通過引入異源的核酸序列進行修飾的細胞或者載體，或者所述細胞來源于如此修飾的細胞。因此，例如，重組細胞表達在天然(非-重組體)形式的細胞內沒有發(fā)現相同形式的基因或者表達在人為干預下完全表達或者完全不表達的異常表達的天然基因。
此處所述的術語“基因表達”是指基于基因的核酸序列產生多肽的方法。所述方法包括轉錄以及翻譯；因此“表達”可以是針對多核苷酸或者多肽序列或者兩者。有時，多核苷酸序列的表達不會引起蛋白翻譯?！斑^量表達”是指相對于其在野生型(或者其它的參考[例如，非-轉基因])植物中的表達，多核苷酸和/或多肽序列表達增加并且可能涉及自然存在或者非-自然存在的序列?！爱愇槐磉_”是指在非-改變或者野生型植物中不自然發(fā)生的，在某時，某地和/或提高水平的表達?！跋抡{表達”是指多核苷酸和/或多肽序列，通常是內源性基因相對于其在野生型植物中表達的降低表達。術語“錯誤表達”以及“改變表達”包括過量表達，下調表達以及異位表達。
在將核酸序列插入細胞的概念中，術語“引入的”是指“轉染”，或者“轉化”或者“轉導”，并且包括針對核酸序列整合到真核或者原核細胞，其中核酸序列可以整合入細胞的基因組(例如染色體，質粒，質體或者線粒體DNA)，轉化為自主復制子，或者瞬間表達(例如，轉染的mRNA)。
本文使用的“植物細胞”是指來源于植物的任意細胞，包括來自未分化的組織(例如愈傷組織)以及植物種子，花粉，繁殖體(progagules)并且胚芽的細胞。
此處所述的術語“天然的”以及“野生型”相對于給定植物特性或者表現型是指具有在相同種類的植物本身發(fā)現的特征或者表現型的形式。
此處所述的術語關于植物特性的“修飾的”是指轉基因植物相對于類似的非-轉基因植物的表現型的改變?！案淖兒土康谋憩F型”是指基因修飾植物的可測量的表現型，其中植物與類似的但是非-修飾的植物相比顯示總含油量的統(tǒng)計上顯著的增減(即，油類相對種子質量的百分比)。高油類表現型是指總含油量的增加。
本文使用的“突變體”多核苷酸序列或者基因與相應的野生型多核苷酸序列或者基因是在序列或者表達上不同，其中的差異導致修飾的植物的表現型或者特性。相對于植物或植物株系，術語“突變體”是指植物或者株系具有修飾的植物表現型或特性，其中修飾的表現型或特性與野生型多核苷酸序列或基因的修飾表達有關。
此處所述的術語“T1”是指來自T0植物的種子的植物子代。T1子代是可通過應用選擇性試劑篩選的第一系列轉化的植物，所述的選擇性試劑為例如抗生素或除草劑，由此轉基因植物含有相應的抗性基因。術語“T2”是指通過T1植物的花進行自體受精產生的植物子代，所述T1植物之前被篩選作為轉基因植物。T3植物是由T2植物等產生的。這里所述的特定植物的“直系子代”來源于所述植物的種子(或者，有時來自其它的組織)且是直接緊接的子代；例如，對于特定的家系而言，T2植物是T1植物的直系子代。特定植物的“間接子代”來源于所述植物直系子代的種子(或其它組織)，或來自該家系隨后子代的種子(或其它組織)；例如，T3植物是T1植物的間接子代。
此處所述的術語“植物的部分”包括任意的植物器官或組織，包括，但不限于種子，胚芽，分生組織區(qū)域，愈傷組織，葉，根，芽，配子體，孢子體，花粉，和小孢子。植物細胞可獲自任意的植物器官或組織以及由其制備的培養(yǎng)物?？捎糜诒景l(fā)明方法的植物種類通常是廣泛的，其可以是可用于轉化技術的高等植物，包括單子葉的和雙子葉的植物。
在這里所述的“轉基因植物”包括在其基因組內含有異源多核苷酸的植物。異源的多核苷酸可以穩(wěn)定地整合到基因組中，或可以被插入到染色體外。優(yōu)選地，本發(fā)明的多核苷酸被穩(wěn)定地整合到基因組中從而使多核苷酸被連續(xù)傳代。植物細胞，組織，器官，或已被導入異源多核苷酸的植物被認為是“轉化的”，“轉染的”或“轉基因的”植物。也含有該異源多核苷酸的轉化植物或植物細胞的直系和間接子代也被視為是轉基因的。
具有改變的含油量表現型的植物的鑒定產生轉基因植物過量表達編碼乙醛酸途徑酶的不同基因并且檢驗來自T1轉基因植物的種子的高油表現型。人們發(fā)現烏頭酸酶(At3g58750；GI#15231130)的過量表達賦予改變含油量的表現型(具體地，高植物油表現型)。因此，檸檬酸合成酶基因和/或多肽可用于開發(fā)具有修飾的含油量表現型(“檸檬酸合成酶表現型”)的遺傳修飾的植物。檸檬酸合成酶基因可用于產生由含油種子加工提供增加的油產量的含油種子農作物以及可用于產生提供動物飼養(yǎng)增加能的谷物飼料作物。檸檬酸合成酶基因可進一步地被用于增加特定油料作物的含油量，以增加目的稀有脂肪酸的產量。已被遺傳修飾表達檸檬酸合成酶的轉基因植物可用于產生油類，其中轉基因植物被培育，并且通過常規(guī)方法由植物部分(例如種子)獲取油類。
檸檬酸合成酶核酸和多肽擬南芥檸檬酸合成酶核酸(基因組DNA)序列提供于SEQ IDNO1以及Genbank中，登錄號為GI#30694870。相應的蛋白序列提供于SEQ ID NO2中，登錄號為GI#131124706。作為擬南芥檸檬酸合成酶的直向同源物或橫向同源物的核酸和/或蛋白質，描述在下面實施例2中。
此處所述的術語“檸檬酸合成酶多肽”是指全長的檸檬酸合成酶蛋白或其片段，衍生物(變體)，或其“功能活性的”的直向同源物，是指該蛋白片段，衍生物，或直向同源物顯示出一或多種或與SEQ IDNO2多肽有關的功能性活性。在一個優(yōu)選的實施方案中，當功能活性的檸檬酸合成酶多肽在植物中錯誤表達時產生改變含油量的表現型。在另一個優(yōu)選的實施方案中，檸檬酸合成酶多肽的錯誤表達產生高含油量表現型的植物。在另一個實施方案中，當功能性活性的檸檬酸合成酶多肽在植物或植物細胞中表達時能夠拯救缺陷的(包括不足的)內源性檸檬酸合成酶活性；拯救多肽可以是來自與缺陷活性種類相同或來自不同的種類。在另一個實施方案中，全長檸檬酸合成酶多肽的功能活性片段(即，具有SEQ ID NO2序列或其天然存在的直向同源物的天然多肽)保持一或多個與全長檸檬酸合成酶多肽相關的生物學特性，諸如信號活性，結合活性，催化活性，或胞內或胞外定位活性。檸檬酸合成酶片段優(yōu)選含有檸檬酸合成酶結構域，諸如C-或N-末端或催化結構域，尤其優(yōu)選地含有至少10個，優(yōu)選地至少20個，更優(yōu)選地至少25個，且最優(yōu)選地至少50個連續(xù)的檸檬酸合成酶蛋白的氨基酸。功能域可利用PFAM程序來鑒定(Bateman A等，1999 NucleicAcids Res 27260-262；網址為pfam.wustl.edu)。全長檸檬酸合成酶多肽或其片段的功能性活性變體包括具有氨基酸插入、缺失或取代的并保持一或多種與全長檸檬酸合成酶多肽有關的生物學特性的多肽。有時，產生改變檸檬酸合成酶多肽翻譯后加工的變體。例如，變體與天然的多肽相比可能具有改變的蛋白質轉運或蛋白質定位特性或改變的蛋白半衰期。
此處所述的術語“檸檬酸合成酶核酸”包括具有SEQ ID NO1序列或與其互補的序列的核酸，及其功能活性片段，衍生物或直向同源物。本發(fā)明的檸檬酸合成酶核酸可以是DNA，來源于基因組DNA或cDNA，或RNA。
在一個實施方案中，功能活性的檸檬酸合成酶核酸編碼功能活性檸檬酸合成酶多肽或與編碼功能活性檸檬酸合成酶多肽的核酸互補。此定義所包括的為充當初級RNA轉錄模板的基因組DNA(即，mRNA前體)，其中所述的初級RNA轉錄需要編碼功能活性檸檬酸合成酶多肽之前的加工，諸如剪接。檸檬酸合成酶核酸可包括其它的非編碼序列，其可被或可不被轉錄；此種序列包括5′和3′UTRs，尤其是本領域已知的調控基因表達的多聚腺苷酸化信號和調節(jié)序列。某些多肽需要加工事件，諸如蛋白水解，共價修飾等，以使其具有完全的活性。因此，功能活性核酸可編碼成熟或預加工的檸檬酸合成酶多肽，或中間體形式。檸檬酸合成酶多核苷酸也可包括異源的編碼序列，例如，編碼包括的促進融合多肽純化的標記或轉化標記的序列。
在另一個實施方案中，功能活性的檸檬酸合成酶核酸可用于產生檸檬酸合成酶功能缺失的表現型，例如，通過反義抑制，共-抑制等等。
在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明方法中使用的檸檬酸合成酶核酸含有編碼檸檬酸合成酶多肽或互補于編碼檸檬酸合成酶多肽的序列的核酸序列，所述編碼檸檬酸合成酶多肽的序列與SEQ ID NO2的多肽序列具有至少50％，60％，70％，75％，80％，85％，90％，95％或更多的序列同一性。
在另一個實施方案中，本發(fā)明的檸檬酸合成酶多肽含有與SEQ IDNO2的多肽序列具有至少50％或60％序列同一性的多肽序列，且可與SEQ ID NO2的檸檬酸合成酶多肽序列具有至少70％，80％，85％，90％或95％或更高的序列同一性。在另一個實施方案中，檸檬酸合成酶多肽含有與SEQ ID NO2所示多肽的功能活性片段具有至少50％，60％，70％，80％，85％，90％或95％或更高序列同一性的多肽序列。在另一個實施方案中，檸檬酸合成酶多肽含有與SEQ ID NO2所示多肽的全長具有至少50％，60％，70％，80％或90％序列同一性的多肽序列。
在另一方面，檸檬酸合成酶多核苷酸序列與SEQ ID NO1所示檸檬酸合成酶核酸序列的全長，或與此檸檬酸合成酶序列互補的核酸序列具有至少50％到60％的同一性，且可包括與SEQ ID NO1所示檸檬酸合成酶序列或其功能性活性片段，或互補序列具有至少70％，80％，85％，90％或95％或更高的序列同一性。
這里所述的，相對于特定的受試序列或其特定部分的“百分(％)序列同一性”，被定義為侯選衍生物的核苷酸或氨基酸序列與受試序列中核苷酸或氨基酸序列(或其特定部分)的同一性的百分比，在比對序列和引入缺口之后，如有必要來獲得最大的百分序列同一性，如通過程序WU-BLAST-2.0a19(Altschul等，產生的J.Mol.Biol.(1997)215403-410；比較網址wustl.edu/blast/README.html)，檢索參數設置為默認值。HSP S和HSP S2參數是動態(tài)值且通過程序本身根據特定序列的組成以及用于目標序列正在其中進行檢索的特定數據庫的組成來建立。通過匹配的相同核苷酸或氨基酸的數目除以所報道的百分比同一性的序列長度測定“％同一性值”?！鞍俜?％)氨基酸序列相似性”通過進行測定％氨基酸序列同一性的相同計算來測定，但是包括除了計算中的相同氨基酸之外的保守氨基酸的取代。保守的氨基酸取代是其中的一個氨基酸被另一個具有類似特性的氨基酸取代而對蛋白的折疊或活性沒有顯著地影響。可彼此取代的芳族氨基酸為苯丙氨酸，色氨酸，和酪氨酸；可互換的疏水氨基酸為亮氨酸，異亮氨酸，甲硫氨酸，和纈氨酸；可互換的極性氨基酸為谷氨酰胺和天冬酰胺；可互換的堿性氨基酸為精氨酸，賴氨酸和組氨酸；可互換的酸性氨基酸為天冬氨酸和谷氨酸；且可互換的小氨基酸為丙氨酸，絲氨酸，蘇氨酸，半胱氨酸和甘氨酸。
受試核酸分子的衍生核酸分子包括與SEQ ID NO1核酸序列選擇性雜交的序列?？赏ㄟ^溫度，離子強度，pH和雜交和沖洗過程中變性劑諸如甲酰胺的存在來控制雜交的嚴格性。通常使用的條件是公知的(參見，例如，Current Protocol in Molecular Biology，Vol.1，Chap.2.10，John Wiley & Sons，Publishers(1994)；Sambrook等，Molecular Cloning，Cold Spring Harbor(1989))。在一些實施方案中，本發(fā)明的核酸分子能夠在嚴格條件下雜交于含有SEQ ID NO1的核苷酸序列的核酸分子含有核酸的濾膜預雜交8小時在65℃含有6X單一濃度檸檬酸鹽(SSC)(1X SSC為0.15 NaCl，0.015M檸檬酸鈉；pH 7.0)，5X Denhardt溶液，0.05％焦磷酸鈉和100μg/ml鯡魚精DNA的溶液中過夜；以及在65℃含有6X SSC，1X Denhardt溶液，100μg/ml酵母tRNA和0.05％焦磷酸鈉的溶液中雜交18-20小時；并在65C在含有0.1X SSC和0.1％SDS(十二烷基硫酸鈉)的溶液中沖洗濾膜1小時。在其它的實施方案中，所使用的溫和嚴格雜交條件為含有核酸的濾膜在40℃在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mM Tris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.1％PVP，0.1％PVP，聚蔗糖，1％BSA，和500μg/ml變性鮭精DNA的溶液中預處理6小時；在40℃在含有35％甲酰胺，5X SSC，50mMTris-HCl(pH 7.5)，5mM EDTA，0.02％PVP，0.02％聚蔗糖，0.2％BSA，100μg/ml鮭精DNA和10％(wt/vol)葡聚糖硫酸酯的溶液中雜交18-20小時；然后在55℃在含有2XSSC和0.1％SDS的溶液中沖洗兩次持續(xù)1小時。或者，可使用的低嚴格條件包括在37℃在含有20％甲酰胺，5x SSC，50mM磷酸鈉(pH 7.6)，Denhardt′s溶液，10％葡聚糖硫酸酯和20μg/ml變性剪切的鮭精DNA的溶液中溫育8小時到過夜；在相同緩沖液中雜交18到20小時；并在1x SSC中大約37℃沖洗濾膜1小時。
由于遺傳密碼的簡并性，可產生大量的編碼檸檬酸合成酶多肽的多核苷酸序列。例如，按照由特定的宿主生物體賦予的最佳密碼子選擇，可選擇密碼子來增加在特定宿主種類中出現多肽表達的比率(參見，例如，Nakamura等，1999，Nucleic Acids Res 27292)。這樣的序列變體可用于本發(fā)明的方法中。
本發(fā)明的方法可利用擬南芥檸檬酸合成酶的直向同源物。在其它植物品種中鑒定直向同源物的方法是本領域公知的。通常，不同品種中的直向同源物保持相同的功能，取決于一或多個蛋白基序和/或3-三維結構的存在。在進化中，當物種形成后基因復制時，一個品種諸如擬南芥中的單一基因，可對應于另一種中的多個基因(橫向同源物)。此處所述的術語“直向同源物”包括橫向同源物。當序列數據可用于特定的植物品種時，直向同源物通常通過序列同源性分析，諸如BLAST分析，通常利用蛋白誘餌序列來進行鑒定。如果正向BLAST結果的最佳目標序列在反向BLAST中檢索到最初查詢序列，則序列被認為是可能的直向同源物(Huynen MA和Bork P，Proc Natl Acad Sci(1998)955849-5856；Huynen MA等，Genome Research(2000)101204-1210)。用于多重序列比對的程序，諸如CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 224673-4680)可用于高亮顯示保守的區(qū)域和/或直向同源蛋白質的殘基以及來產生系統(tǒng)發(fā)生樹。在表示來自不同品種的多重同源序列的系統(tǒng)樹中(例如，通過BLAST分析檢索的)，來自兩個品種的直向同源序列通常相對于來自此兩個品種的所有其它序列最靠近地出現在樹上。蛋白質折疊的結構線程(Structural threading)或其它分析(例如，利用ProCeryon，Biosciences，Salzburg，Austria的軟件)也可鑒定可能的直向同源物。核酸雜交方法也可用于發(fā)現直向同源基因且當不能獲得序列數據是優(yōu)選的。變性PCR和cDNA或基因組DNA文庫的篩選是發(fā)現相關基因序列的常規(guī)方法且是本領域公知的(參見，例如，Sambrook，見上文；Dieffenbach C和Dveksler G(Eds.)PCR PrimerA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，NY，1989)。例如，由目的植物品種產生cDNA文庫以及用部分同源的基因探針探測文庫的方法描述下述文獻中Sambrook等，同上。擬南芥檸檬酸合成酶編碼序列的高度保守部分可用作探針。檸檬酸合成酶直向同源物核酸可在高度，中度，或低嚴格條件下與SEQ ID NO1的核酸雜交。假定的直向同源物片段的擴增或分離之后，那些片段可通過常規(guī)技術來克隆和測序并用作探針來分離全長cDNA或基因組克隆。或者，可啟動EST項目來產生目的植物品種的序列信息的數據庫。在另一種方法中，特異性結合已知的檸檬酸合成酶多肽的抗體被用于直向同源物分離(參見，例如，Harlow E和Lane D，Using AntibodiesA Laboratory Manual，Cold Spring Harbor Laboratory Press，1999，NewYork)。Western印跡分析可確定檸檬酸合成酶直向同源物(即，直向同源的蛋白)存在于特定植物品種的粗提物中。當觀察到反應時，編碼侯選直向同源物的序列可通過篩選表示特定植物品種的表達文庫來分離。表達文庫可構建在各種市售的載體中，包括λgt11，如描述在Sambrook，等中，同上文。一旦通過任意的方式鑒定了候選的直向同源物，候選的直向同源序列被用作誘餌(“查詢”)用于來自擬南芥或其中檸檬酸合成酶核酸和/或多肽序列已被鑒定的其它品種的序列對比的反向BLAST。
可利用任意有效的方法來獲得檸檬酸合成酶核酸和多肽。例如，通過篩選DNA文庫或通過利用聚合酶鏈式反應(PCR)分離目的cDNA或基因組DNA序列的技術，如先前描述的，是本領域公知的?；蛘?，核酸序列可以是合成的。任意已知的方法，諸如位點定向誘變(KunkelTA等，Methods Enzymol.204125-39，1991)可被用于將目的變化導入到克隆的核酸中。
通常，本發(fā)明的方法涉及將檸檬酸合成酶核酸的目的形式整合入植物表達載體中用于轉化植物細胞，且檸檬酸合成酶多肽在宿主植物中表達。
分離的檸檬酸合成酶核酸分子除了以其在自然中發(fā)現的形式或者組外的形式或者組且被鑒定和與最小的一種污染物核酸分子分離，所述的污染物核酸分子通常與檸檬酸合成酶核酸的天然來源關聯(lián)。然而，分離的檸檬酸合成酶核酸分子包括通常表達檸檬酸合成酶的細胞中包含的檸檬酸合成酶核酸分子其中，例如核酸分子在不同于自然細胞中的染色體中。
具有改變的含油量表現型的基因改造植物的產生檸檬酸合成酶核酸和多肽可被用于產生具有修飾的含油量表現型的基因改造植物。在這里所述的“修飾的含油量表現型”可指植物任意部分中修飾的含油量；修飾的含油量通常在種子中被觀察到。在優(yōu)選的實施方案中，植物中檸檬酸合成酶基因的改變表達被用于產生具有高含油量表現型的植物。
在這里描述的方法通常適用于所有的植物。在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明針對產油植物，其在特異性器官，主要在種子中產生和儲藏三酰甘油。這樣的品種包括大豆(毛豆)，油菜和加拿大油菜(包括蕓苔，B.campestris)，向日葵(Helianthus annus)，棉花(Gossypiumhirsutum)，玉米(Zea mays)，可可(Theobroma cacao)，紅花(Carthamustinctorius)，油棕(Elaeis guineensis)，椰子(Cocos nucifera)，亞麻(Linumusitatissimum)，蓖麻(Ricinus communis)和花生(Arachis hypogaea)。本發(fā)明的目的也在于提供水果-和蔬菜植物，產谷類-植物，產堅果-植物，短周期蕓苔品種，苜蓿(紫苜蓿)，煙草(Nicotiana)，turfgrass(Poaceae家族)，其它的飼料作物，以及可作為獨特的脂肪酸來源的野生品種。
技術人員可理解本領域已存在的各種轉化技術以及新技術不斷地適于應用。適于目標宿主植物的任意技術可在本發(fā)明的范圍內實施。例如，構建體可以各種各樣的形式包括但不限于如DNA的鏈被導入到質粒中，或人工染色體中。可通過各種各樣的技術將構建體導入到目標植物細胞中，包括但不限于農桿菌-介導的轉化，電穿孔法，顯微注射，微粒轟擊鈣-磷酸鹽-DNA共沉淀或脂質體-介導的異源核酸的轉化。植物的轉化優(yōu)選地是穩(wěn)定的，即，通過將導入的表達構建體整合到宿主植物基因組中，從而使得導入的構建體連續(xù)存在于植物子代中。取決于目的應用，含有檸檬酸合成酶多核苷酸的異源核酸構建體可編碼全蛋白或其生物學活性部分。
在一個實施方案中，二元的基于Ti的載體系統(tǒng)可被用于轉移多核昔酸。標準農桿菌二元載體是本領域技術人員公知的，且許多是市售的(例如，pBI121 Clontech Laboratories，Palo Alto，CA)。
用農桿菌載體轉化植物的最佳方法將依據轉化的植物的類型而變化。農桿菌介導的轉化的示例性方法包括胚軸外植體，芽梢，來源于不育秧苗和/或幼苗干或葉組織的轉化。這樣的轉化植物可以有性繁殖，或通過細胞或組織培養(yǎng)。先前描述的用于大量不同類型植物的農桿菌轉化以及此種轉化的方法可在科學文獻中發(fā)現。特定相關的是轉化商業(yè)上重要的作物的方法，諸如油菜籽(De Block等，Plant Physiol.(1989)91694-701)，向日葵(Everett等，Bio/Technology(1987)51201)，以及大豆(Christou等，Proc.Natl.Acad.Sci USA(1989)867500-7504；Kline等，Nature(1987)32770)。
檸檬酸合成酶的表達(包括轉錄和翻譯)可相對于表達的水平，進行表達的組織類型和/或表達的發(fā)育階段被調節(jié)。大量的異源調節(jié)序列(例如，啟動子和增強子)可有效調節(jié)檸檬酸合成酶核酸的表達。這些調節(jié)序列包括組成性的，可誘導的和可調節(jié)的啟動子，以及以組織-或時間特異性方式調節(jié)表達的啟動子和增強子。示例性的組成性啟動子包括樹莓E4啟動子(美國專利5,783,393和5,783,394)以及35S CaMV(Jones JD等，Transgenic Res 1285-297 1992)，CsVMV啟動子(Verdaguer B等，Plant Mol Biol 371055-1067，1998)以及甜瓜肌動蛋白啟動子(公開的PCT申請WO0056863)。示例性的組織特異性啟動子包括番茄E4以及E8啟動子(US專利No.5,859,330)以及番茄2AII基因啟動子(Van Haaren MJJ等，Plant Mol Bio 21625-640，1993)。
在一個優(yōu)選的實施方案中，檸檬酸合成酶表達在來自其表達與早期種子和/或胚發(fā)育有關的基因的調節(jié)序列的調節(jié)之下。其啟動子與早期種子和胚發(fā)育有關的豆莢基因包括V.faba legumin(Baumlein等，1991，Mol Gen Genet 225121-8；Baumlein等，1992，Plant J 2233-9)，V.faba usp(Fiedler等，1993，Plant Mol Biol 22669-79)，pea convicilin(Bown等，1988，Biochem J 251717-26)，pea lectin(dePater等，1993，Plant Cell 5877-86)，P.vulgaris beta phaseolin(Bustos等，1991，EMBOJ 101469-79)，P.vulgaris DLEC2和PHS[beta](Bobb等，1997，NucleicAcids Res 25641-7)和大豆β-Conglycinin，7S貯藏蛋白(Chamberland等，1992，Plant Mol Biol 19937-49)。其啟動子與早期的種子和胚發(fā)育有關的谷類基因包括稻米谷蛋白(″GluA-3，″Yoshihara和Takaiwa，1996，Plant Cell Physiol 37107-11；″GluB-1，″Takaiwa等，1996，Plant Mol Biol 301207-21；Washida等，1999，Plant Mol Biol401-12；″Gt3，″Leisy等，1990，Plant Mol Biol 1441-50)，大米醇溶蛋白(Zhou & Fan，1993，Transgenic Res 2141-6)；小麥醇溶蛋白(Hammond-Kosack等，1993，EMBO J 12545-54)，玉米玉米蛋白(Z4，Matzke等，1990，Plant Mol Biol 14323-32)，和大麥B-hordeins(Entwistle等，1991，Plant Mol Biol 171217-31)。其啟動子與早期的種子和胚發(fā)育有關的其它基因包括油椰GLO7A(7S globulin，Morcillo等，2001，Physiol Plant 112233-243)，Brassica napus napin，2S貯藏蛋白和napA基因(Josefsson等，1987，J Biol Chem 26212196-201；Stalberg等，1993，Plant Mol Biol 1993 23671-83；Ellerstrom等，1996，Plant Mol Biol 321019-27)，蕓苔油質蛋白(Keddie等，1994，PlantMol Biol 24327-40)，擬南芥油質蛋白(Plant等，1994，Plant Mol Biol25193-205)，擬南芥FAE1(Rossak等，2001，Plant Mol Biol 46717-25)，Canavalia gladiata conA(Yamamoto等，1995，Plant Mol Biol27729-41)，和長春花strictosidine合成酶(Str，Ouwerkerk和Memelink，1999，Mol Gen Genet 261635-43)。在另一個優(yōu)選的實施方案中，利用來自在油類生物合成過程中表達的基因的調節(jié)序列(參見，例如美國專利5,952,544)?？蛇x擇的啟動子來自植物貯藏蛋白基因(Bevan等，1993，Philos Trans R Soc Lond B Biol Sci 342209 15)。
在又一個方面，有時可能需要抑制內源性檸檬酸合成酶在宿主細胞中的表達。實施本發(fā)明此方面的示例性方法包括，但不限于反義抑制(Smith等，Nature 334724-726，1988；van der Krol等，Biotechniques(1988)6958-976)；共-抑制(Napoli，等，Plant Cell 2279-289，1990)；核酶(PCT公開WO 97/10328)；以及反義和正義的組合(Waterhouse，等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 9513959-13964，1998)。抑制宿主細胞內源性序列的方法典型地利用被抑制序列的至少一部分的轉錄或轉錄和翻譯。這樣的序列可能與內源性序列的編碼和非編碼區(qū)是同源的。反義抑制可利用全部的cDNA序列(Sheehy等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1988)858805-8809)，部分cDNA序列包括5′編碼序列的片段，(Cannon等，Plant Molec.Biol.(1990)1539-47)，或3′非-編碼序列(Ch′ng等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA(1989)8610006-10010)。共抑制技術可利用全部的cDNA序列(Napoli等，同上；van der Krol等，ThePlant Cell(1990)2291-299)或部分的cDNA序列(Smith等，Mol.Gen.Genetics(1990)224477-481)。
可進行標準的分子和遺傳測試來進一步分析基因和所觀察的表現型之間的關聯(lián)。示例性的技術描述如下。
1.DNA/RNA分析突變體比較野生型品系的階段-和組織特異性的基因表達模式可通過例如，原位雜交來測定。可以進行基因尤其是側翼調節(jié)區(qū)域甲基化狀態(tài)的分析。其它合適的技術包括過量表達，異常表達，在其它植物品種中的表達以及基因敲除法(反向遺傳，目標敲除，病毒誘導的基因沉默[VIGS，參見Baulcombe D，Arch Virol Suppl 15189-201，1999])。
在優(yōu)選的應用表達分布圖中，通常通過微陣列分析，用于同時測定差異或許多不同基因表達中誘導的變化。微陣列分析技術是本領域公知的(Schena M等，Science(1995)270467-470；Baldwin D等，CurOpin Plant Biol.2(2)96-103，1999；Dangond F，Physiol Genomics(2000)253-58；van Hal NL等，J Biotechnol(2000)78271-280；Richmond T和Somerville S，Curr Opin Plant Biol(2000)3108-116)?？煞治鰡为殬擞浀钠废档谋磉_分布。這樣的分析可鑒定由于目的基因的過量表達協(xié)調調節(jié)的其它基因，其可促進將未知的基因放置在特定通道中。
2.基因產物分析基因產物的分析可包括重組蛋白質表達，抗血清產生，免疫定位，催化或其它活性的生物化學分析，磷酸化狀態(tài)的分析，以及通過酵母二-雜交分析進行的與其它蛋白質相互作用的分析。
3.途徑分析途徑分析可包括根據基因或置于特定的生物化學，新陳代謝或信號傳導途徑中。或者，分析可包括與野生型品系及其它突變品系的遺傳雜交(產生雙重突變型)來對途徑中的基因進行排序，或測定突變對途徑中下游“報道”基因表達的作用。
具有改變的含油量表現型的突變植物的產生本發(fā)明進一步提供了鑒定在內源性檸檬酸合成酶中具有突變從而賦予了改變含油量的植物的方法，以及產生未遺傳修飾的這些植物的改變含油量的子代的方法。在一個方法中，稱為“TILLING”(用于靶向基因組中誘導的局部損害)，例如利用EMS處理在目的植物的種子中誘導突變。培育產生的植物并進行自體受精，且將子代用于制備DNA樣品。利用檸檬酸合成酶-特異性PCR鑒定突變的植物是否具有檸檬酸合成酶突變。然后測定具有檸檬酸合成酶突變的植物的改變的含油量，或者，測定植物的改變的含油量，然后進行檸檬酸合成酶-特異性PCR測定具有改變含油量的植物是否具有突變的檸檬酸合成酶基因。TILLING可鑒定改變特異性基因的表達或由這些基因編碼的蛋白質活性的突變(參見Colbert等(2001)Plant Physiol 126480-484；McCallum等(2000)Nature Biotechnology 18455-457)。
在另一個方法中，候選基因/數量性狀定位(QTLs)方法可被用于標記-輔助的育種計劃來鑒定等位基因或可賦予改變的含油量的檸檬酸合成酶基因或檸檬酸合成酶直向同源物中的突變(參見Bert等，TheorAppl Genet.2003 Jun；107(1)181-9；以及Lionneton等，Genome.2002Dec；45(6)1203-15)。因此，在本發(fā)明另一個方面，檸檬酸合成酶核酸被用于鑒定具有含油量改變的植物在內源性檸檬酸合成酶中是否具有突變或具有引起含油量改變的特定的等位基因。
所有在這里引用的出版物被明確地引入作為參考來用于描述和公開可在本發(fā)明的相關方面使用的組合物和方法。所有引用的專利，專利申請，和參考網址和公眾數據庫中的序列信息也引入作為參考。
實施例實施例1產生過量表達烏頭酸酶的轉基因植物編碼乙醛酸途徑酶的基因的亞型在野生型擬南芥中過量表達并且檢驗來自T1轉基因植物的種子的高油表現型。為了過量表達基因，用每個基因的特異性引物PCR擴增基因組DNA。將PCR產物克隆在含有NPTII基因(作為選擇性標記)T-DNA載體的CsVMV啟動子后面并且轉化入野生型擬南芥植物。通過在含有卡那霉素的瓊脂培養(yǎng)基上萌發(fā)種子選擇轉基因植物。將卡那霉素抗性幼苗移植到土壤并且培育成熟。非-轉化的野生型Col-0植物用作對照。種子在瓊脂培養(yǎng)基(缺少卡那霉素)上萌芽并且將幼苗移植到土壤并且培育成熟。收獲自轉基因和對照植物的種子含油量利用近紅外波譜(NIR)進行測定。利用Bruker 22 N/F捕獲NIR紅外波譜。利用NIR分析的數據和參考廠商說明通過Bruker軟件估計總植物油的含量。
結果表明Arabidopisis烏頭酸酶基因(At3g58750)的過量表達賦予高種子油表現型。來自4個過量表達At3g58750(編碼烏頭酸酶)的轉基因品系的種子比所有檢驗的對照植物具有更高的含油量。轉基因植物的該值的范圍為41.6％到41.2％，而對照種子的所述值范圍介于40.9％和38.7％之間。對照種子中平均的含油量為39.9％。因此，烏頭酸酶的過量表達可賦予植物油差不多7％的增加。
實施例2擬南芥烏頭酸酶的分析利用BLAST(Altschul等，1997，J.Mol.Biol.215403-410)，PFAM(Bateman等，1999，Nucleic Acids Res 27260-262)，PSORT(Nakai K，和Horton P，1999，Trends Biochem Sci 2434-6)，和/或CLUSTAL(Thompson JD等，1994，Nucleic Acids Res 224673-4680)進行序列分析。鑒定具有高序列同一性的大量直向同源物，并且因此預計當在植物中過量表達時也賦予高油表現型。來自不同植物品種的直向同源的檸檬酸合成酶包括GI#1345933，以及GI#975633(Cucurbita cv)；GI#15231128，以及GI#11268305(擬南芥)；GI#8928010(Daucuscarota)；GI#6647461(馬鈴薯)；GI#1352088(柚)；GI#15982952(桃)；GI#11066954(稻)；GI#2300712(煙草)，以及GI#2300710(甜菜)。
序列表<110>農業(yè)經濟有限責任公司(Agrinomics LLC)<120>生產改變含油量的植物(GENERATION OF PLANTS WITH ALTEREDOILCONTENT)<130>SCT052490-66<150>60/434,601<151>2002-12-18<160>2<170>Patentln version 3.2<210>1<211>1545<212>DNA<213>Arabidopsis thaliana<400>1atggagattt cgcagagagt gaaagctaga ttagccgttc tcaccgcgca tttggcggtg 60tctgataccg tcggattgga acaggtgttg ccggcgatcg cgccatggtg tacatcggct 120cacattaccg ctgcacctca tggatcactc aaaggaaact tgacgatcgt cgatgagcgt 180acggggaaga aatatcaggt ccctgtctca gagcatggta ccgttaaagc cgttgatctc 240aagaagataa cgacggggaa ggatgataag gggctgaagt tgtacgatcc tggttacttg 300aacacggctc cggttcgatc ttcgatttgt tacatcgacg gagatgaagg aatcttacgt 360tatcggggat acccaattga agagttggct gagagcagta cttttattga ggttgcttat 420ctcctcatgt atggaaatct gccttctcaa agtcagctag ctgattggga gttcactgtt 480
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<211>514<212>PRT<213>Arabidopsis thaliana<400>2Met Glu Ile Ser Gln Arg Val Lys Ala Arg Leu Ala Val Leu Thr Ala1 5 10 15His Leu Ala Val Ser Asp Thr Val Gly Leu Glu Gln Val Leu Pro Ala20 25 30Ile Ala Pro Trp Cys Thr Ser Ala His Ile Thr Ala Ala Pro His Gly35 40 45Ser Leu Lys Gly Asn Leu Thr Ile Val Asp Glu Arg Thr Gly Lys Lys50 55 60Tyr Gln Val Pro Val Ser Glu His Gly Thr Val Lys Ala Val Asp Leu65 70 75 80Lys Lys Ile Thr Thr Gly Lys Asp Asp Lys Gly Leu Lys Leu Tyr Asp85 90 95Pro Gly Tyr Leu Asn Thr Ala Pro Val Arg Ser Ser Ile Cys Tyr Ile100 105 110Asp Gly Asp Glu Gly Ile Leu Arg Tyr Arg Gly Tyr Pro Ile Glu Glu115 120 125
Leu Ala Glu Ser Ser Thr Phe Ile Glu Val Ala Tyr Leu Leu Met Tyr130 135 140Gly Asn Leu Pro Ser Gln Ser Gln Leu Ala Asp Trp Glu Phe Thr Val145 150 155 160Ser Gln His Ser Ala Val Pro Gln Gly Val Leu Asp Ile Ile Gln Ser165 170 175Met Pro His Asp Ala His Pro Met Gly Val Leu Val Ser Ala Met Ser180 185 190Ala Leu Ser Ile Phe His Pro Asp Ala Asn Pro Ala Leu Ser Gly Gln195 200 205Asp Ile Tyr Lys Ser Lys Gln Val Arg Asp Lys Gln Ile Val Arg Ile210 215 220Leu Gly Lys Ala Pro Thr Ile Ala Ala Ala Ala Tyr Leu Arg Thr Ala225 230 235 240Gly Arg Pro Pro Val Leu Pro Ser Ala Asn Leu Ser Tyr Ser Glu Asn245 250 255Phe Leu Tyr Met Leu Asp Ser Met Gly Asn Arg Ser Tyr Lys Pro Asn260 265 270Pro Arg Leu Ala Arg Val Leu Asp Ile Leu Phe Ile Leu His Ala Glu275 280 285
His Glu Met Asn Cys Ser Thr Ala Ala Ala Arg His Leu Ala Ser Ser290 295 300Gly Val Asp Val Tyr Thr Ala Cys Ala Gly Ala Val Gly Ala Leu Tyr305 310 315 320Gly Pro Leu His Gly Gly Ala Asn Glu Ala Val Leu Lys Met Leu Ala325 330 335Glu Ile Gly Thr Ala Glu Asn Ile Pro Asp Phe Ile Glu Gly Val Lys340 345 350Asn Arg Lys Arg Lys Met Ser Gly Phe Gly His Arg Val Tyr Lys Asn355 360 365Tyr Asp Pro Arg Ala Lys Val Ile Lys Lys Leu Ala Asp Glu Val Phe370 375 380Ser Ile Val Gly Arg Asp Pro Leu Ile Glu Val Ala Val Ala Leu Glu385 390 395 400Lys Ala Ala Leu Ser Asp Glu Tyr Phe Val Lys Arg Lys Leu Tyr Pro405 410 415Asn Val Asp Phe Tyr Ser Gly Leu Ile Tyr Arg Ala Met Gly Phe Pro420 425 430
Pro Glu Phe Phe Thr Val Leu Phe Ala Val Pro Arg Met Ala Gly Tyr435 440 445Leu Ser His Trp Arg Glu Ser Leu Asp Asp Pro Asp Thr Arg Ile Met450 455 460Arg Pro Gln Gln Ala Tyr Thr Gly Val Trp Met Arg His Tyr Glu Pro465 470 475 480Val Arg Glu Arg Thr Leu Ser Ser Asp Ser Asp Lys Asp Lys Phe Gly485 490 495Gln Val Ser Ile Ser Asn Ala Ser Arg Arg Arg Leu Ala Gly Ser Ser500 505 510Ala Leu
權利要求
1.轉基因植物，包括含有編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的檸檬酸合成酶多肽的核苷酸序列或其互補序列或其直向同源物的植物轉化載體，由此，轉基因植物相對于對照植物為高油表現型。
2.權利要求1的轉基因植物，其選自油菜，大豆，谷物，向日葵，棉花，可可，紅花，油棕，椰子，亞麻，蓖麻以及花生。
3.從權利要求1的植物獲得的植物的部分。
4.權利要求3的植物的部分，其是種子。
5.產生油類的方法，包括培育權利要求1的轉基因植物以及從所述植物回收油類。
6.產生高油表現型植物的方法，所述方法包括a)向植物的祖細胞引入包括編碼含有SEQ ID NO2的氨基酸序列的檸檬酸合成酶多肽的核苷酸序列或其互補序列或其直向同源物的植物轉化載體，以及b)培育轉化的祖細胞產生轉基因植物，所述多核苷酸序列在所述轉基因植物中表達，并且所述轉基因植物相對于對照植物表現改變的含油量表現型。
7.通過權利要求6的方法獲得的植物。
8.權利要求7的轉基因植物，其選自油菜，大豆，谷物，向日葵，棉花，可可，紅花，油棕，椰子，亞麻，蓖麻以及花生。
9.產生具有高油表現型植物的方法，包括鑒定具有檸檬酸合成酶基因的等位基因的植物，所述檸檬酸合成酶基因的等位基因引起與缺少等位基因且產生所述鑒定的植物子代的植物相比含油量的增加，其中產生的子代遺傳等位基因并且為高油表現型。
10.權利要求9的方法，利用候選基因/QTL法。
11.權利要求9的方法，利用TILLING法。
全文摘要
本發(fā)明涉及由于改變檸檬酸合成酶核酸表達顯示改變含油量表現型的植物。本發(fā)明還涉及產生具有改變含油量表現型的植物的方法。
文檔編號C12N15/82GK1728940SQ200380107099
公開日2006年2月1日 申請日期2003年12月18日 優(yōu)先權日2002年12月18日
發(fā)明者喬納森·萊特納, 杰里米·E·科特, 斯特凡妮·K·克倫德寧, 南茜·安妮·費德斯皮爾 申請人:農業(yè)經濟有限責任公司