專利名稱：用于增加谷物產(chǎn)量的基因及其用途的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分離和鑒定調(diào)節(jié)植物著粒數(shù)(包括穎花、果實(shí)和種子)增減的基因，以及利用這些基因增加植物著粒數(shù)(包括穎花、果實(shí)和種子)的育種方法。
背景技術(shù)：
當(dāng)世界人口持續(xù)顯示迅速增長(zhǎng)，由于環(huán)境污染、全球變熱和沙漠化可耕地迅速減少，而在發(fā)展中國(guó)家中持續(xù)著長(zhǎng)期的糧食短缺。此外，目前1.0％的谷物生產(chǎn)增長(zhǎng)率低于每年1.4％的全球人口增長(zhǎng)率；而且，在2025年，當(dāng)預(yù)測(cè)世界人口超過(guò)80億時(shí)，谷物需求將增加50％，進(jìn)一步加速了糧食短缺。為了打破這個(gè)嚴(yán)重的情況，不僅政治和經(jīng)濟(jì)的措施是必需的，而且增加谷物生產(chǎn)數(shù)量的科學(xué)的谷物育種策略也是必需的。這個(gè)嚴(yán)重的狀況不再能通過(guò)傳統(tǒng)的育種，單獨(dú)利用異花受精和選擇技術(shù)加以避免，而關(guān)于針對(duì)增加產(chǎn)率的谷物植株類型以及特異和有效的谷物育種的研究才是必需的。
當(dāng)在60年代提出關(guān)于世界糧食危機(jī)的憂慮時(shí)，在國(guó)際水稻研究機(jī)構(gòu)(菲律賓)培養(yǎng)出了稱為奇跡水稻的矮莖高產(chǎn)水稻，而在國(guó)際玉米和小麥改良中心(墨西哥)栽培出了矮莖高產(chǎn)的小麥。由于這兩個(gè)品種的快速擴(kuò)展避免了世界糧食危機(jī)。這就是所謂的″綠色革命″。兩個(gè)品種都顯示為傳統(tǒng)品種的兩倍產(chǎn)量，而這個(gè)高產(chǎn)特性是由稱為半矮化的矮莖植株類型所引起的。由于當(dāng)為了得到高產(chǎn)量時(shí)必須應(yīng)用氮肥，這同時(shí)誘導(dǎo)了植株的伸長(zhǎng)，并且由于風(fēng)雨，伸長(zhǎng)谷物的倒伏顯著降低了產(chǎn)量。另一方面，即使應(yīng)用肥料，矮莖品種容許增加產(chǎn)量而沒(méi)有肉質(zhì)部分的生長(zhǎng)。也就是說(shuō)，兩個(gè)矮莖品種都通過(guò)獲得抗倒伏性而促進(jìn)了顯著增加產(chǎn)量的″綠色革命″。目前，半矮化的谷物極大地促進(jìn)了產(chǎn)量的增加，但是因?yàn)樵S多谷物品種已經(jīng)利用了半矮化基因，就不能預(yù)期進(jìn)一步在產(chǎn)量中再利用這個(gè)技術(shù)，而必須開(kāi)發(fā)利用新技術(shù)的谷物生產(chǎn)方法。
水稻是50％的世界人口所利用的食品。特別地，對(duì)于生活在亞洲的人口，其栽培特性與高度濕潤(rùn)的季風(fēng)氣候相匹配，其不僅早已作為主食成為能源，而且也已經(jīng)很好地進(jìn)行存活和栽培。因此，已經(jīng)在許多地方進(jìn)行育種，并且已經(jīng)將其改良而具有便于人類使用的特性。此外，利用最近確定的水稻基因組核苷酸序列，使用分子遺傳學(xué)的工具，可預(yù)期開(kāi)發(fā)利用基因組遺傳學(xué)的新育種技術(shù)。
迄今為止，已經(jīng)通過(guò)多種努力來(lái)增加谷物(植物)的產(chǎn)量；然而，對(duì)于分離和鑒定涉及直接對(duì)增產(chǎn)負(fù)責(zé)的花和種子(穎花)的數(shù)目增減的基因尚無(wú)報(bào)道。除傳統(tǒng)的半矮化谷物外，如果開(kāi)發(fā)了調(diào)節(jié)花和種子(穎花)的數(shù)目增減的技術(shù)，就可預(yù)期進(jìn)一步增加谷物的產(chǎn)量。
發(fā)明公開(kāi)本發(fā)明已經(jīng)鑒于上述情況而實(shí)現(xiàn)。本發(fā)明的目的是分離和鑒定涉及植物著粒數(shù)(包括穎花、果實(shí)和種子)增減的基因，并且提供利用這些基因增加植物著粒數(shù)(包括穎花、果實(shí)和種子)的育種方法。
為了增加谷物(植物)產(chǎn)量，本發(fā)明人使用水稻植株作為單子葉植物模型，搜索直接對(duì)增產(chǎn)負(fù)責(zé)的基因，更具體地說(shuō)搜索涉及花和種子(穎花)的數(shù)目增減的基因。通過(guò)多于一個(gè)基因的相互作用將花和種子(穎花)的數(shù)目控制作為數(shù)量性狀(QTL)。因此，為了產(chǎn)生用于QTL分析的雜種群體，選擇雜種的親本品種。2個(gè)品種顯示著粒數(shù)(particle-bearing number)的明顯差異，選擇出粳稻″Koshihikari″和秈稻″Habataki″(

圖1)。將通過(guò)使2個(gè)品種雜交產(chǎn)生的F1個(gè)體利用Koshihikari作為重復(fù)親本進(jìn)行回交并且進(jìn)行自交。在名古屋大學(xué)農(nóng)場(chǎng)栽培和發(fā)展所得到的74個(gè)品種的BC2F1、BC2F2、和BC3F2群體。利用74個(gè)BC2F2植株進(jìn)行關(guān)于著粒數(shù)的QTL分析，檢測(cè)大量的增加著粒數(shù)的QTL(圖2)。特別地，成功地發(fā)現(xiàn)位于1號(hào)染色體短臂中大約28cM的Habataki的QTL(YQ1；Yielding QTL 1)與Koshihikari的QTL相比，極有效的增加谷粒(或種子)的數(shù)目。為了檢驗(yàn)YQ1的存在，使用重復(fù)回交和MAS產(chǎn)生YQ1半等基因系，研究Nil-YQ1和Koshihikari(對(duì)照)的最大著粒數(shù)。結(jié)果是，證實(shí)QTL(YQ1)的存在，并且發(fā)現(xiàn)用Habataki的位點(diǎn)取代1號(hào)染色體短臂中大約28cM位點(diǎn)的品種其著粒數(shù)平均增加了50。
然后，從每一74個(gè)BC2F1個(gè)體中，利用CTAB法提取DNAs，利用完全覆蓋所有染色體的93個(gè)分子標(biāo)記物確定每一個(gè)體的基因型。在每個(gè)品種的10個(gè)個(gè)體發(fā)展出其自交后代BC2F2，并且從中隨機(jī)選擇每個(gè)品種的一個(gè)個(gè)體。在從每一選擇的個(gè)體取樣6個(gè)圓錐花序后，對(duì)于每個(gè)圓錐花序研究著粒數(shù)。在每一品種的6個(gè)圓錐花序中，選擇具有最大著粒數(shù)的圓錐花序，并將這個(gè)數(shù)目用作最大著粒數(shù)。然后利用Qgene軟件進(jìn)行QTL分析。
利用分子標(biāo)記物，使用BC3F2群體研究表型和基因型(F2和F3)，并且再進(jìn)行連鎖分析。結(jié)果表明YQ1位于分子標(biāo)記物6A和8A之間(圖3)。利用YQ的分離群體(12500個(gè)個(gè)體)進(jìn)行高分辨率連鎖分析的結(jié)果是，表明YQ1位點(diǎn)處于標(biāo)記物4A9和20之間的大約8Kb的區(qū)域(圖4)。當(dāng)在這個(gè)區(qū)域中進(jìn)行基因預(yù)測(cè)時(shí)，預(yù)測(cè)到單個(gè)基因，并且同源性搜索的結(jié)果是發(fā)現(xiàn)與CKX(細(xì)胞分裂素氧化酶)高度同源的基因(圖4)。當(dāng)對(duì)于Habataki和Koshihikari確定這個(gè)CKX基因的核苷酸序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)了核苷酸中的差異，Habataki的CKX似乎已經(jīng)丟失其功能(圖5)。
此外，當(dāng)搜索水稻基因組序列來(lái)分析水稻中的CKX基因時(shí)，在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)存在11個(gè)CKX基因。當(dāng)對(duì)于這些基因以及擬南芥中的CKX基因構(gòu)建系統(tǒng)演化樹(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)擬南芥的AtCKX2、3、和4，以及5個(gè)水稻CKX基因(位于Chr.1 25cM P695A4的CKX、位于Chr.127P419B01的CKX(本基因)、位于Chr.679cM OsJ0006A22-GS的CKX基因、和2個(gè)位于32cM的CKX基因)是極為緊密相關(guān)的(圖6)。當(dāng)研究這些基因的同源性時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诎被崴绞歉叨韧吹?圖7至9)。此外，當(dāng)證實(shí)了水稻中所有CKX基因的基因座位置時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中一些位于YQ區(qū)域上(圖10)。
更具體地說(shuō)，本發(fā)明人成功地分離了涉及植物著粒數(shù)增減的新基因，并因此完成了本發(fā)明。
本發(fā)明涉及分離和鑒定調(diào)節(jié)植物著粒數(shù)(包括穎花、果實(shí)和種子)增減的基因，以及利用這些基因增加植物著粒數(shù)(包括穎花、果實(shí)和種子)的育種方法，并且本發(fā)明提供如下所述的[1]至[19]。
一種編碼其功能缺失導(dǎo)致植物著粒數(shù)增加的植物來(lái)源蛋白質(zhì)的DNA，其中該DNA是(a)至(d)中的任意一項(xiàng)(a)編碼包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；(b)包括包含SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的編碼區(qū)的DNA；
(c)編碼包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，其中已經(jīng)取代、缺失、添加、和/或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸；以及(d)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包括SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的DNA雜交的DNA。
權(quán)利要求[1]的DNA，其中該DNA來(lái)源于稻(rice)。
編碼與權(quán)利要求[1]或[2]的DNA的轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的RNA的DNA。
編碼具有特異切割權(quán)利要求[1]或[2]的DNA轉(zhuǎn)錄本的核糖酶活性的RNA的DNA。
編碼通過(guò)在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)的共抑制效果而抑制權(quán)利要求[1]或[2]的DNA表達(dá)的RNA的DNA。
包括權(quán)利要求[1]至[5]中任意一項(xiàng)DNA的載體。
用權(quán)利要求[6]的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
用權(quán)利要求[6]的載體轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞。
包括權(quán)利要求[8]的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植物。
權(quán)利要求[9]的轉(zhuǎn)化植物的后代或克隆的轉(zhuǎn)化植物。
權(quán)利要求[9]或[10]的轉(zhuǎn)化植物的再生材料。
用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)化植物的方法，其中該方法包括將權(quán)利要求[1]至[5]中任意一項(xiàng)DNA導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，以及從所述的植物細(xì)胞再生植物體的步驟。
由權(quán)利要求[1]或[2]的DNA編碼的蛋白質(zhì)。
用于生產(chǎn)權(quán)利要求[13]的蛋白質(zhì)的方法，其中該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求[7]的宿主細(xì)胞，以及從所述的細(xì)胞或其培養(yǎng)物上清液收集重組蛋白質(zhì)的步驟。
結(jié)合權(quán)利要求[13]的蛋白質(zhì)的抗體。
包括與SEQ ID NO1或2的核苷酸序列、或其互補(bǔ)序列互補(bǔ)的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸。
用于增加植物著粒數(shù)的方法，其中該方法包括在植物體的細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求[3]至[5]中任意一項(xiàng)的DNA的步驟。
用于改變植物著粒數(shù)的試劑，其中該試劑包括權(quán)利要求[1]至[5]的任意一項(xiàng)DNA或權(quán)利要求[6]的載體作為活性成分。
一種用于確定植物著粒數(shù)的方法，其中該方法包括下列步驟
(a)從待測(cè)植物體或其再生培養(yǎng)基制備DNA樣品；(b)擴(kuò)增所述DNA樣品的相應(yīng)于權(quán)利要求1的DNA的區(qū)域；以及(c)確定所擴(kuò)增的DNA區(qū)域的核苷酸序列；其中當(dāng)該核苷酸序列編碼其功能缺失導(dǎo)致植物著粒數(shù)增加的蛋白質(zhì)時(shí)，確定該植物是具有小的著粒數(shù)的品種，而當(dāng)沒(méi)有編碼所述的蛋白質(zhì)時(shí)，確定該植物是具有大的著粒數(shù)的品種。
本發(fā)明提供編碼水稻來(lái)源的CKX蛋白質(zhì)的DNAs?！錕oshihikari″中DNA的基因組序列如SEQ ID NO1所示，其cDNA序列如SEQ ID NO2所示，而由此DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO3所示?！錒abataki″中DNA的基因組序列如SEQ ID NO4所示，其cDNA序列如SEQID NO5所示，而由此DNA編碼的蛋白質(zhì)的氨基酸序列如SEQ ID NO6所示。
通過(guò)本發(fā)明分離的CKX基因位于利用″Habataki″和″Koshihikari″的雜交后代檢測(cè)到的一個(gè)數(shù)量性狀位點(diǎn)(QTL)，并且發(fā)現(xiàn)其位于1號(hào)染色體上。當(dāng)在Habataki和Koshihikari中確定這個(gè)CKX基因的核苷酸序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)了核苷酸中的差異，發(fā)現(xiàn)與例如Koshihikari的其它品種相比具有較大著粒數(shù)的Habataki的CKX蛋白質(zhì)已經(jīng)丟失其功能。
細(xì)胞分裂素(對(duì)于一組具有與激動(dòng)素(kinetin)相似的生物活性，并且在腺嘌呤的第6位具有取代基的化合物的通稱)，是植物激素，涉及促進(jìn)細(xì)胞分裂、花芽形成、側(cè)芽形成、抑制老化、氣孔運(yùn)動(dòng)、根伸展等。特別地，花芽形成和側(cè)芽形成的促進(jìn)可能與令人感興趣的性狀(穎花數(shù)目的增加)緊密相關(guān)。利用甲羥戊酸作為底物，借助4個(gè)催化反應(yīng)合成細(xì)胞分裂素，但是通過(guò)細(xì)胞分裂素氧化酶，它在腺嘌呤的第6位發(fā)生裂解而失活(例如，玉米素降解為腺嘌呤和甲基丁醛)。更具體地說(shuō)，當(dāng)CKX(細(xì)胞分裂素氧化酶)基因的功能丟失，細(xì)胞分裂素不能降解，結(jié)果是細(xì)胞分裂素積聚。因?yàn)榧?xì)胞分裂素的累積誘導(dǎo)花芽形成，這可導(dǎo)致著粒數(shù)(穎花的數(shù)目)增加，這與CKX基因的功能和表型很好的相符。這表明CKX基因功能的缺失增加水稻(rice)植株的著粒數(shù)(穎花的數(shù)目)，結(jié)果是產(chǎn)量增加。迄今為止，尚未鑒定或分離出認(rèn)為與著粒數(shù)(穎花數(shù))增加相關(guān)的基因。通過(guò)進(jìn)行復(fù)雜的步驟，本發(fā)明人最終闡明了其存在的區(qū)域并且首次成功地分離了作為單個(gè)基因的所述基因。
目前，在日本水稻品種的改良中著粒數(shù)的增加是重要的育種目標(biāo)。增加著粒數(shù)直接導(dǎo)致增加谷物產(chǎn)量的性狀，并且因?yàn)檫@種性狀在農(nóng)業(yè)方面是非常重要的，預(yù)期其可用于通過(guò)使用CKX基因進(jìn)行育種。
因?yàn)镃KX基因功能的缺失增加植物的著粒數(shù)，因此利用反義方法、核糖酶方法等調(diào)節(jié)該DNA的表達(dá)可導(dǎo)致增加谷物的產(chǎn)量。例如，通過(guò)將CKX基因以反義方向?qū)隒KX基因有功能的品種，例如″Koshihikari″，可增加著粒數(shù)。此外，可利用分子標(biāo)記物通過(guò)導(dǎo)入失活形式的CKX基因而增加著粒數(shù)。導(dǎo)入的方法可以是轉(zhuǎn)化或雜交。與通過(guò)雜交的基因轉(zhuǎn)移相比，轉(zhuǎn)化所需要的時(shí)間是很短的，并且這容許增加著粒數(shù)而不伴隨其它性狀的變化。利用本發(fā)明分離的并且涉及著粒數(shù)增減的CKX基因，容許水稻植物的著粒數(shù)容易地變化，并且可促進(jìn)栽培增加著粒數(shù)的水稻品種。因?yàn)樵诠任镏谢蚪M同線性(遺傳同源性)是高度保守的，可以預(yù)期將水稻CKX基因應(yīng)用在繁殖谷物，例如小麥、大麥和玉米中。此外，因?yàn)镃KX基因不限于谷物，并且廣泛分布于植物中，CKX基因功能的缺失可能增加所有植物的花和種子(穎花)的數(shù)目，而導(dǎo)致產(chǎn)量的增加。
本發(fā)明的編碼CKX蛋白質(zhì)的DNA包括基因組DNA、cDNA、和化學(xué)合成的DNA?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的常規(guī)方法制備基因組DNA和cDNA。更具體地說(shuō)，例如可如下制備基因組DNA(1)從具有CKX基因的水稻品種(例如Koshihikari)提取基因組DNA；(2)構(gòu)建基因組文庫(kù)(利用載體，例如質(zhì)粒、噬菌體、柯斯質(zhì)粒、BAC和PAC)；(3)擴(kuò)展文庫(kù)；以及(4)利用根據(jù)本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)的DNA(例如SEQ ID NO1或2)制備的探針進(jìn)行集落雜交或噬菌斑雜交。備選地，可通過(guò)PCR，利用特異于本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)的DNA(例如SEQ ID NO1或2)的引物來(lái)制備基因組DNA。另一方面，例如可如下制備cDNA(1)根據(jù)從具有CKX基因的水稻品種(例如Koshihikari)提取的mRNAs合成cDNAs；(2)通過(guò)將合成的cDNA插入到載體，例如λZAP中來(lái)制備cDNA文庫(kù)；(3)擴(kuò)展cDNA文庫(kù)；以及(4)如上所述進(jìn)行集落雜交或噬菌斑雜交。備選地，也可通過(guò)PCR制備cDNA。
本發(fā)明包括編碼與SEQ ID NO3的CKX蛋白質(zhì)功能等效的蛋白質(zhì)的DNAs(Koshihikari)。在此，術(shù)語(yǔ)″與CKX蛋白質(zhì)功能等效″表明目的蛋白質(zhì)的功能缺失導(dǎo)致著粒數(shù)的增加。這種DNA優(yōu)選來(lái)源于單子葉植物，更優(yōu)選地來(lái)源于禾本科，以及最優(yōu)選地來(lái)源于水稻。
這種DNAs的實(shí)例包括編碼包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的突變體、衍生物、等位基因、變體和同系物的DNAs，其中取代、缺失、添加和/或插入一個(gè)或多個(gè)氨基酸。
本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的、用于制備編碼包括改變氨基酸的蛋白質(zhì)的DNA的方法實(shí)例包括定點(diǎn)誘變(Kramer，W.和Fritz，H.-J.，(1987)″Oligonucleotide-directed construction of mutagenesis via gapped duplex DNA.″Methods in Enzymology，154350-367)。也可在自然界中由于核苷酸序列的突變而改變蛋白質(zhì)的氨基酸序列。其中取代、缺失和/或添加了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的、編碼具有天然CKX蛋白質(zhì)的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA也包括在本發(fā)明的DNA內(nèi)，只要其編碼與天然CKX蛋白質(zhì)(SEQ ID NO3)功能等效的蛋白質(zhì)。另外，不在蛋白質(zhì)中產(chǎn)生氨基酸序列變化的核苷酸序列突變體(簡(jiǎn)并突變體)也包括在本發(fā)明的DNA內(nèi)。
例如可通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的方法產(chǎn)生編碼與SEQ ID NO3中所描述的CKX蛋白質(zhì)功能等效的蛋白質(zhì)的DNA，包括利用雜交技術(shù)的方法(Southern，E.M.Journal of Molecular Biology，Vol.98，503，1975.)；和聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)技術(shù)(Saiki，R.K.等人Science，vol.230，1350-1354，1985；Saiki，R.K.等人Science，vol.239，487-491，1988)。也就是說(shuō)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，利用CKX基因的核苷酸序列(SEQ ID NO2)或其部分作為探針、和特異地與CKX基因核苷酸序列(SEQ ID NO2)雜交的寡核苷酸作為引物而分離與來(lái)自水稻和其他植物的CKX基因具有高同源性的DNA是常規(guī)的。這種通過(guò)雜交技術(shù)或PCR技術(shù)可獲得的、編碼與CKX蛋白質(zhì)功能等效的蛋白質(zhì)的DNA包括在本發(fā)明的DNA內(nèi)。
分離這種DNAs的雜交反應(yīng)優(yōu)選在嚴(yán)謹(jǐn)條件下進(jìn)行。本發(fā)明的嚴(yán)謹(jǐn)雜交條件包括例如6M尿素，0.4％SDS，和0.5×SSC的條件；以及產(chǎn)生與該條件相似嚴(yán)謹(jǐn)度的條件。當(dāng)在較高嚴(yán)謹(jǐn)?shù)臈l件，例如6M尿素，0.4％SDS和0.1×SSC下進(jìn)行雜交時(shí)，預(yù)期DNAs具有較高的同源性。預(yù)期在這種條件下分離的那些DNAs編碼與CKX蛋白質(zhì)(SEQ ID NO3或6)具有高氨基酸水平同源性的蛋白質(zhì)。在此，高同源性是指通過(guò)全部的氨基酸序列同一性為至少50％以上，更優(yōu)選為70％以上，以及更加優(yōu)選為90％以上(例如95％、96％、97％、98％、99％以上)?？砂凑誎arlin和Altschul的算法BLAST(Proc.Natl.Acad.Sci.USA 872264-2268，1990；Proc.Natl.Acad.Sci.USA，905873，1993)確定一個(gè)氨基酸序列或核苷酸序列與另一個(gè)的同源性程度。根據(jù)BLAST算法(Altschul SF，等人J.Mol.Biol.215403，1990)開(kāi)發(fā)例如BLASTN和BLASTX的程序。為了根據(jù)BLASTN分析核苷酸序列，設(shè)置參數(shù)，例如積分＝100和字長(zhǎng)＝12。另一方面，經(jīng)BLASTX用于氨基酸序列分析的參數(shù)包括例如，積分＝50和字長(zhǎng)＝3。當(dāng)利用BLAST和Gapped BLAST程序時(shí)使用每個(gè)程序的默認(rèn)參數(shù)。用于這種分析的特定技術(shù)是本領(lǐng)域已知的。
可如下對(duì)特定的DNA是否編碼涉及植物著粒數(shù)增減的蛋白質(zhì)進(jìn)行評(píng)估。大多數(shù)常規(guī)方法包括缺失DNA的功能，然后進(jìn)行栽培，并且研究著粒數(shù)。更具體地說(shuō)，該方法包括在保持DNA功能的條件下和在缺失DNA功能的條件下進(jìn)行載培，并且比較所得到的著粒數(shù)。如果著粒數(shù)沒(méi)有變化或幾乎是相同的，則判斷DNA不涉及著粒數(shù)的增減。當(dāng)DNA涉及著粒數(shù)的增減時(shí)，著粒數(shù)進(jìn)一步得到增加，而這個(gè)差異被認(rèn)為是著粒數(shù)增減的程度。
本發(fā)明的DNA可用于例如制備重組蛋白質(zhì)，和產(chǎn)生具有改變著粒數(shù)的植物轉(zhuǎn)化體。通常通過(guò)將本發(fā)明的編碼蛋白質(zhì)的DNA插入到適當(dāng)?shù)谋磉_(dá)載體中，將載體導(dǎo)入到適當(dāng)?shù)募?xì)胞中，載培轉(zhuǎn)化細(xì)胞，容許細(xì)胞表達(dá)重組蛋白質(zhì)以及純化表達(dá)的蛋白質(zhì)來(lái)制備重組蛋白質(zhì)。重組蛋白質(zhì)可表達(dá)為與其它蛋白質(zhì)一起的融合蛋白以便于容易地純化，例如作為大腸桿菌中與麥芽糖結(jié)合蛋白一起的融合蛋白(New England Biolabs，美國(guó)，載體pMAL系列)，作為與谷胱甘肽-S-轉(zhuǎn)移酶(GST)一起的融合蛋白(Amersham PharmaciaBiotech，載體pGEX系列)，或帶有組氨酸標(biāo)記(Novagen，pET系列)。不限制宿主細(xì)胞，只要該細(xì)胞適合于表達(dá)重組蛋白。除上述的大腸桿菌外有可能利用酵母或多種動(dòng)物、植物、或昆蟲(chóng)細(xì)胞?？赏ㄟ^(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的多種方法將載體導(dǎo)入宿主細(xì)胞。例如，可使用利用鈣離子的轉(zhuǎn)化方法(Mandel，M.和Higa，A.(1970)Journal of Molecular Biology，53，158-162，Hanahan，D.(1983)Journal of Molecular Biology，166，557-580)將載體導(dǎo)入到大腸桿菌中?？蓮乃拗骷?xì)胞或其培養(yǎng)物上清液通過(guò)已知的方法純化和回收在宿主細(xì)胞中表達(dá)的重組蛋白。當(dāng)重組蛋白質(zhì)表達(dá)為與麥芽糖結(jié)合蛋白或其它伴侶一起的融合蛋白時(shí)，可通過(guò)親和色譜法容易地純化重組蛋白質(zhì)?？蓮囊呀?jīng)通過(guò)將本發(fā)明的DNA如下所述導(dǎo)入到植物中而產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化植物來(lái)制備本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此，本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物不僅包括攜帶已經(jīng)如下所述被導(dǎo)入以改變著粒數(shù)的本發(fā)明DNA的植物，而且包括攜帶已經(jīng)被導(dǎo)入以制備本發(fā)明蛋白質(zhì)的本發(fā)明DNA的植物。
所得到的蛋白質(zhì)可用于制備結(jié)合該蛋白質(zhì)的抗體。例如，可通過(guò)用本發(fā)明的純化蛋白質(zhì)或其部分免疫免疫動(dòng)物，例如兔，在某一段時(shí)間后收集血液并且移出凝塊來(lái)制備多克隆抗體?？赏ㄟ^(guò)將骨髓瘤細(xì)胞與用上述蛋白質(zhì)或其部分免疫的動(dòng)物的抗體-形成細(xì)胞融合，分離表達(dá)所需要抗體的單克隆細(xì)胞(雜交瘤)，并且從該細(xì)胞回收抗體來(lái)制備單克隆抗體。可利用所得到的抗體來(lái)純化或檢測(cè)本發(fā)明的蛋白質(zhì)。因此、本發(fā)明包括結(jié)合本發(fā)明蛋白質(zhì)的抗體。利用這些抗體能夠鑒別涉及植物體著粒數(shù)增減的蛋白質(zhì)的表達(dá)位點(diǎn)，或確定植物品種是否表達(dá)涉及著粒數(shù)增減的蛋白質(zhì)。
例如，因?yàn)樘禺愖R(shí)別具有小的著粒數(shù)的″Koshihikari″的羧基末端氨基酸序列的抗體不結(jié)合在例如具有大的著粒數(shù)的″Habataki″品種中表達(dá)的蛋白質(zhì)，因此它可用于鑒別涉及著粒數(shù)增減的蛋白質(zhì)是否在特定的植物品種中表達(dá)。
當(dāng)生產(chǎn)已經(jīng)利用本發(fā)明的DNA增加著粒數(shù)的轉(zhuǎn)化植物時(shí)，將用于抑制本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)的DNA表達(dá)的DNA插入到適當(dāng)?shù)妮d體中，然后將該載體導(dǎo)入植物細(xì)胞。然后使通過(guò)這些步驟獲得的轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞再生。接收載體的植物細(xì)胞優(yōu)選是顯示正常表達(dá)本發(fā)明DNA的植物細(xì)胞?！逡种票景l(fā)明編碼蛋白質(zhì)的DNA的表達(dá)″包括抑制基因的轉(zhuǎn)錄和抑制翻譯成為蛋白質(zhì)。此外，它不僅包括實(shí)現(xiàn)終止DNA表達(dá)，而且包括降低表達(dá)。
例如可利用編碼與本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的RNA的DNA抑制植物中特定內(nèi)源基因的表達(dá)。
″編碼與本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的RNA的DNA″的一個(gè)實(shí)施方案是編碼與本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的反義RNA的DNA。Ecker等人最先證明了通過(guò)電穿孔在植物細(xì)胞中利用瞬時(shí)基因表達(dá)方法導(dǎo)入反義RNA的反義效果(J.R.Ecker和R.W.Davis(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 835372)。此后，據(jù)報(bào)道在煙草和矮牽牛中通過(guò)表達(dá)反義RNAs降低了靶基因表達(dá)(A.R.van der Krol等人(1988)Nature 333866)?，F(xiàn)在已經(jīng)確定反義技術(shù)為抑制植物中靶基因表達(dá)的方式。
多個(gè)因素導(dǎo)致反義核酸抑制靶基因表達(dá)。這些因素包括通過(guò)形成三倍體鏈抑制轉(zhuǎn)錄起始；通過(guò)在RNA聚合酶已經(jīng)形成局部開(kāi)環(huán)結(jié)構(gòu)的位點(diǎn)形成雜合物抑制轉(zhuǎn)錄；通過(guò)與正在合成的RNA形成雜合物而抑制轉(zhuǎn)錄；通過(guò)在內(nèi)含子和外顯子之間的接合點(diǎn)形成雜合物而抑制拼接；通過(guò)在剪接體形成位點(diǎn)形成雜合物而抑制拼接；通過(guò)與mRNA形成雜合物而抑制mRNA從細(xì)胞核移位到細(xì)胞質(zhì)；通過(guò)在加帽位點(diǎn)或poly A添加位點(diǎn)形成雜合物而抑制拼接；通過(guò)在翻譯起始因子的結(jié)合位點(diǎn)形成雜合物而抑制翻譯起始；通過(guò)在核糖體結(jié)合起始密碼子附近的位點(diǎn)形成雜合物而抑制翻譯；通過(guò)在翻譯區(qū)或在mRNA的多核糖體結(jié)合位點(diǎn)形成雜合物而抑制肽鏈延伸；以及通過(guò)在核酸和蛋白質(zhì)之間相互作用的位點(diǎn)形成雜合物而抑制基因表達(dá)。這些因素通過(guò)抑制轉(zhuǎn)錄、拼接或翻譯的過(guò)程而抑制靶基因表達(dá)(Hirashima和Inoue，″Shin Seikagaku Jikken Koza(New Biochemistry Experimentation Lectures)2，Kakusan(Nucleic Acids)IV，Idenshi No Fukusei To Hatsugen(Replication andExpression of Genes)，″Nihon Seikagakukai Hen(The Japanese BiochemicalSociety)，Tokyo Kagaku Dozin，pp.319-347，(1993))。
本發(fā)明的反義序列可通過(guò)任何上述的機(jī)制抑制靶基因表達(dá)。在一個(gè)實(shí)施方案中，如果設(shè)計(jì)反義序列是與基因mRNA 5′末端附近的非翻譯區(qū)互補(bǔ)的，則它將有效地抑制基因的翻譯。也可利用與編碼區(qū)或3′側(cè)的非翻譯區(qū)互補(bǔ)的序列。因此，用于本發(fā)明的反義DNA包括具有針對(duì)基因的非翻譯區(qū)和翻譯區(qū)的反義序列的DNA。所使用的反義DNA連接適當(dāng)啟動(dòng)子的下游，并且優(yōu)選地包含轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)的序列連接到3′側(cè)上?？赏ㄟ^(guò)已知的方法將如此制備的DNA轉(zhuǎn)染到所需要的植物中。反義DNA的序列優(yōu)選是與待轉(zhuǎn)化的植物內(nèi)源基因或其部分互補(bǔ)的序列，但不必是完全互補(bǔ)的，只要它有效地抑制基因表達(dá)。轉(zhuǎn)錄的RNA優(yōu)選與靶基因的轉(zhuǎn)錄本是至少90％，以及最優(yōu)選至少95％互補(bǔ)的。為了借助反義序列有效抑制靶基因的表達(dá)，反義DNA應(yīng)為至少15個(gè)核苷酸長(zhǎng)，更優(yōu)選至少100個(gè)核苷酸長(zhǎng)，以及更優(yōu)選至少500個(gè)核苷酸長(zhǎng)。所使用的反義DNA一般短于5kb，以及優(yōu)選短于2.5kb。
也可使用編碼核糖酶的DNA抑制內(nèi)源基因的表達(dá)。核糖酶是具有催化活性的RNA分子。存在許多具有多種活性的已知核糖酶。關(guān)于核糖酶作為RNA切割酶的研究使得能夠設(shè)計(jì)核糖酶在特異位點(diǎn)切割RNA。雖然I組內(nèi)含子型的一些核糖酶或包含在RNaseP中的M1RNA由400個(gè)以上的核苷酸組成，其它屬于錘型或發(fā)夾型的核糖酶具有大約40個(gè)核苷酸的活性結(jié)構(gòu)域(Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka(1990)Tanpakushitsu Kakusan Kohso(Protein，Nucleic acid and Enzyme)352191)。
錘型核糖酶的自裂解結(jié)構(gòu)域在序列G13U14C15的C15的3′側(cè)進(jìn)行切割。認(rèn)為在U14和第9位A之間形成的核苷酸對(duì)對(duì)于核糖酶活性是重要的。此外，已經(jīng)表明當(dāng)?shù)?5位的核苷酸是A或U而不是C時(shí)也發(fā)生裂解(M.Koizumi等人(1988)FEBS Lett.228225)。如果設(shè)計(jì)核糖酶的底物結(jié)合位點(diǎn)與鄰近于靶位點(diǎn)的RNA序列是互補(bǔ)的，就可產(chǎn)生限制性酶樣的RNA切割核糖酶，其在靶RNA內(nèi)識(shí)別序列UC、UU、或UA(M.Koizumi等人(1988)FEBS Lett.239285；Makoto Koizumi和Eiko Ohtsuka(1990)Tanpakushitsu KakusanKohso(Protein，Nucleic acid and Enzyme)，352191；M.Koizumi等人(1989)Nucleic Acids Res.177059)。例如，在CKX基因(SEQ ID NO2)的編碼區(qū)中，存在許多可用作核糖酶靶的位點(diǎn)。發(fā)夾型核糖酶也對(duì)本發(fā)明有用。例如可在煙草環(huán)斑病毒的衛(wèi)星RNA的負(fù)鏈中發(fā)現(xiàn)發(fā)夾型核糖酶(J.M.Buzayan，Nature 323349(1986))。這個(gè)核糖酶也已經(jīng)顯示靶特異地切割RNA(Y.Kikuchi和N.Sasaki(1992)Nucleic Acids Res.196751；Yo Kikuchi(1992)Kagaku To Seibutsu(Chemistry and Biology)30112)。
設(shè)計(jì)成能切割靶的核糖酶是與啟動(dòng)子，例如花椰菜花葉病毒35S啟動(dòng)子以及與轉(zhuǎn)錄終止序列融合的，以便它能夠在植物細(xì)胞中轉(zhuǎn)錄。然而如果將附加的序列添加到轉(zhuǎn)錄RNA的5′末端或3′末端，可能丟失核糖酶活性。在這種情況下，可安置以順式在核糖酶部分的5′或3′側(cè)上進(jìn)行修整的附加修整核糖酶，以便準(zhǔn)確地從包含核糖酶的轉(zhuǎn)錄RNA切下核糖酶部分(K.Taira等人(1990)Protein Eng.3733；A.M.Dzaianott和J.J.Bujarski(1989)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 864823C.A.Grosshands和R.T.Cech(1991)NucleicAcids Res.193875；K.Taira等人(1991)Nucleic Acid Res.195125)?？赏ㄟ^(guò)串聯(lián)排列這些結(jié)構(gòu)單位而切割靶基因內(nèi)的多個(gè)位點(diǎn)來(lái)獲得更大的效果(N.Yuyama等人，Biochem.Biophys.Res.Commun.1861271(1992))。利用這種核糖酶，有可能在本發(fā)明中特異切割靶基因的轉(zhuǎn)錄本，從而抑制基因的表達(dá)。
″編碼與本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)的DNA轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的RNA的DNA″的另一個(gè)實(shí)施方案是編碼與本發(fā)明編碼蛋白質(zhì)的DNA的轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的dsRNA的DNA。RNAi是將包括與靶基因序列相同或相似的序列的雙鏈RNA(下文中為dsRNA)導(dǎo)入到細(xì)胞中抑制導(dǎo)入的外源基因和內(nèi)源靶基因表達(dá)的現(xiàn)象。當(dāng)將大約40至幾百個(gè)堿基對(duì)的dsRNA導(dǎo)入細(xì)胞時(shí)，具有解旋酶結(jié)構(gòu)域、稱為Dicer的RNaseIII-樣的核酸酶，在存在ATP的情況下從3′端切除dsRNA，一次切除大約21至23個(gè)堿基對(duì)，并產(chǎn)生siRNA(短的干擾RNA)。特異的蛋白質(zhì)與siRNA結(jié)合形成核酸酶復(fù)合物(RISCRNA-誘導(dǎo)的沉默復(fù)合物)。該復(fù)合物識(shí)別并結(jié)合與siRNA相同的序列，在相應(yīng)于siRNA的中心的位置通過(guò)RNaseIII-樣酶活性切割靶基因的mRNA。除這個(gè)途徑外，siRNA的反義鏈結(jié)合mRNA并且作為引物對(duì)于依賴RNA的RNA聚合酶(RsRP)來(lái)合成dsRNA。也可認(rèn)為在該dsRNA再成為Dicer底物的途徑中產(chǎn)生新的siRNA以擴(kuò)增其作用。
上述RNAi最初是在秀麗線蟲(chóng)(Caenorhabditis elegans)中發(fā)現(xiàn)的(Fire，A.等人Potent and specific genetic interference by double-stranded RNA inCaenorhabditis elegans.Nature 391，806-811，(1998))，并且現(xiàn)在不僅已經(jīng)在秀麗線蟲(chóng)，而且在多種生物體，例如植物、線蟲(chóng)類、果蠅和原生動(dòng)物中被觀察到(Fire，A.RNA-triggered gene silencing.Trends Genet.15，358-363(1999)；Sharp，P.A.RNA interference 2001.Genes Dev.15，485-490(2001)；Hammond，S.M.，Caudy，A.A.&Hannon，G.J.Post-transcriptional genesilencing by double-stranded RNA.Nature Rev.Genet.2，110-1119(2001)；Zamore，P.D.RNA interferencelistening to the sound of silence.Nat.Struct.Biol.8，746-750(2001))。從外部實(shí)際導(dǎo)入dsRNA證實(shí)了可在生物體中抑制靶基因的表達(dá)，這也被用作產(chǎn)生敲除個(gè)體的方法。
最初當(dāng)導(dǎo)入RNAi時(shí)，認(rèn)為dsRNA必須是某一長(zhǎng)度(40個(gè)核苷酸)或更長(zhǎng)才是有效的。然而，Tuschl等人(Rockefeller University，美國(guó).)報(bào)道說(shuō)通過(guò)將21個(gè)堿基對(duì)左右的短鏈dsRNA(siRNA)導(dǎo)入細(xì)胞，甚至在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中，可觀察到RNAi的效果，而不會(huì)由于PKR導(dǎo)致抗病毒反應(yīng)(Tuschl，Nature，411，494-498(2001))，因此突然RNAi作為適用于分化的哺乳動(dòng)物細(xì)胞，例如人細(xì)胞的技術(shù)而受到注意。
本發(fā)明的DNA包括編碼針對(duì)靶基因mRNA任何一個(gè)區(qū)域的反義RNA的反義編碼DNA，和編碼靶基因mRNA任何一個(gè)區(qū)域的有義RNA的有義編碼DNA，并且反義RNA和有義RNA可從反義編碼DNA和有義編碼DNA表達(dá)出來(lái)。也可從這些反義RNA和有義RNA制備dsRNA。
當(dāng)將本發(fā)明的dsRNA表達(dá)系統(tǒng)整合到載體等中時(shí)，反義RNA和有義RNA可從相同的載體表達(dá)出來(lái)，或它們可從不同的載體表達(dá)出來(lái)。例如，反義RNA和有義RNA可分別通過(guò)裝配到反義RNA表達(dá)盒和有義RNA表達(dá)盒中而從相同的載體表達(dá)出來(lái)，在所述表達(dá)盒中將可能表達(dá)短RNA，例如polIII系統(tǒng)的啟動(dòng)子分別連接到反義編碼DNA和有義編碼DNA的上游，并且將這些盒以相同方向或相反方向插入到載體中。此外，可組成具有以相反方向安置，以便其在不同鏈上相對(duì)的反義編碼DNA和有義編碼DNA的表達(dá)系統(tǒng)。在這種排列方式中，提供反義RNA編碼鏈和有義RNA編碼鏈成對(duì)(siRNA編碼DNA)的單個(gè)雙鏈DNA，并且可在兩側(cè)以相反的方向安置啟動(dòng)子以便反義RNA和有義RNA可從每條鏈表達(dá)出來(lái)。在這種情況下，為了避免在有義RNA或反義RNA的下游加入不必要的序列，優(yōu)選將終止子安置在每條鏈(反義RNA編碼鏈和有義RNA編碼鏈)的3′末端?？墒褂?個(gè)以上連續(xù)的A(腺嘌呤)核苷酸的序列作為終止子。此外，在這種回文表達(dá)系統(tǒng)中，優(yōu)選2個(gè)啟動(dòng)子的類型是不同的。
另一方面，反義RNA和有義RNA可分別通過(guò)例如裝配到反義RNA表達(dá)盒和有義RNA表達(dá)盒中而從不同的載體表達(dá)出來(lái)，在所述表達(dá)盒中將可能激發(fā)表達(dá)短RNA，例如polIII系統(tǒng)的啟動(dòng)子分別連接到反義編碼DNA和有義編碼DNA的上游，并且將這些盒插入到不同的載體中。
在本發(fā)明的RNAi中，siRNA可用作dsRNA。術(shù)語(yǔ)″siRNA″是指包括在細(xì)胞內(nèi)不顯示毒性的范圍中的短鏈、以及不限于如由Tuschl等人(上述)所報(bào)道的全長(zhǎng)為21至23個(gè)堿基對(duì)的雙鏈RNA，只要其長(zhǎng)度在不顯示毒性的范圍內(nèi)。例如，長(zhǎng)度可以是15至49個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選15至35個(gè)堿基對(duì)，以及更優(yōu)選21至30個(gè)堿基對(duì)。備選地，可以轉(zhuǎn)錄待表達(dá)的siRNA以使得雙鏈RNA部分的最終長(zhǎng)度可以是例如15至49個(gè)堿基對(duì)，優(yōu)選15至35個(gè)堿基對(duì)，以及更優(yōu)選21至30個(gè)堿基對(duì)。
形成具有發(fā)夾結(jié)構(gòu)的雙鏈RNA(自我互補(bǔ)的′發(fā)夾′RNA(hpRNA))、在靶序列的反向重復(fù)之間插入適當(dāng)序列(優(yōu)選內(nèi)含子序列)(Smith N.A.等人，Nature，407319，2000；Wesley，S.V.等人Plant J.27581，2001；Piccin，A.等人，Nucleic Acids Res.29E55，2001)的構(gòu)建體也可用作本發(fā)明的DNA。
用于RNAi的DNA不必與靶基因完全相同，但是應(yīng)具有同一性為至少70％以上，優(yōu)選80％以上，更優(yōu)選90％以上，以及最優(yōu)選95％以上的序列。可通過(guò)如上所述的方法確定序列同一性。
在dsRNA中，RNAs成對(duì)的雙鏈部分不限于完全成對(duì)的雙鏈部分，并且可包括由錯(cuò)配所產(chǎn)生的不成對(duì)部分(其中相應(yīng)的核苷酸不是互補(bǔ)的)、鼓包(其中一條鏈缺乏相應(yīng)的核苷酸)等等。在本發(fā)明中，其中dsRNA的RNAs成對(duì)的雙鏈RNA區(qū)域可包括凸起(bulges)和錯(cuò)配。
也可通過(guò)轉(zhuǎn)化具有與靶基因序列相同或相似的序列的DNA的共抑制來(lái)抑制內(nèi)源的基因表達(dá)?！骞惨种啤迨侵笇⒕哂信c靶內(nèi)源基因序列相同或相似的序列的基因通過(guò)轉(zhuǎn)化導(dǎo)入植物，并且導(dǎo)入的外源基因和靶內(nèi)源基因的表達(dá)受到抑制的現(xiàn)象。盡管共抑制的詳細(xì)機(jī)制是未知的，但經(jīng)?？稍谥参镏杏^察到(Curr.Biol.7R793，1997，Curr.Biol.6810，1996)。例如，如果想要獲得CKX基因受到共抑制的植物體，可用設(shè)計(jì)成便于表達(dá)CKX基因或具有相似序列的DNA的載體DNA轉(zhuǎn)化所述的植物以選擇具有CKX突變性狀的植株，即在所得到的植物中選擇光照敏感性降低的植株。用于共抑制的基因不必與靶基因完全相同，但是應(yīng)具有至少70％以上的序列同一性，優(yōu)選80％以上的序列同一性，以及更優(yōu)選90％以上(例如，95％、96％、97％、98％、99％以上)的序列同一性。
此外，也可通過(guò)用具有靶基因占顯性陰性(dominant negative)表型基因轉(zhuǎn)化植物來(lái)抑制本發(fā)明中的內(nèi)源基因表達(dá)。在此，具有顯性陰性表型的基因是指當(dāng)表達(dá)時(shí)，該基因可消除或減少植物固有的野生型內(nèi)源基因的活性。
本發(fā)明提供已經(jīng)插入本發(fā)明的DNA或抑制本發(fā)明DNA表達(dá)的DNA的載體。除用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的上述載體外，本發(fā)明的載體也包括用于在植物細(xì)胞中表達(dá)本發(fā)明DNA或抑制本發(fā)明DNA表達(dá)的DNA的載體，以便產(chǎn)生轉(zhuǎn)化植物。對(duì)于所使用的載體類型沒(méi)有限制，只要它們包含可在植物細(xì)胞中引發(fā)轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子序列，和包括為轉(zhuǎn)錄本的穩(wěn)定化所需要的多聚腺苷酸位點(diǎn)的終止子序列。實(shí)例包括質(zhì)粒″pBI121″、″pBI221″、和″pBI101″(所有的都來(lái)自Clontech)。不特別限制用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的載體，只要它們可在細(xì)胞內(nèi)表達(dá)插入的基因。例如，可使用包括在植物細(xì)胞中用于進(jìn)行組成型基因表達(dá)的啟動(dòng)子(例如，花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子)的載體，和包括通過(guò)外刺激誘導(dǎo)性活化的啟動(dòng)子的載體。在此所使用的術(shù)語(yǔ)″植物細(xì)胞″包括多種形式的植物細(xì)胞，例如懸浮培養(yǎng)細(xì)胞、原生質(zhì)體、葉子切片和愈傷組織。
本發(fā)明的載體可包括用于組成性或誘導(dǎo)性表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的啟動(dòng)子。用于組成性表達(dá)的啟動(dòng)子實(shí)例包括花椰菜花葉病毒的35S啟動(dòng)子(Odell等人1985 Nature 313810)、水稻的肌動(dòng)蛋白啟動(dòng)子(Zhang等人1991 PlantCell 31155)、和玉米的泛素啟動(dòng)子(Comejo等人1993 Plant Mol.Biol.23567)。
用于誘導(dǎo)性表達(dá)的啟動(dòng)子實(shí)例包括已知由于外因，例如絲狀真菌、細(xì)菌和病毒的感染和侵入、低溫、高溫、干燥、紫外線照射和特定化合物的噴涂而激發(fā)的啟動(dòng)子。這種啟動(dòng)子的實(shí)例包括水稻的殼多糖酶基因啟動(dòng)子(Xu等人1996Plant Mol.Biol.30387)和煙草PR蛋白質(zhì)基因啟動(dòng)子(Ohshima等人1990 Plant Cell 295)，其受到絲狀真菌、細(xì)菌和病毒的感染和侵入的誘導(dǎo)、由低溫誘導(dǎo)的水稻″lip19″基因啟動(dòng)子(Aguan等人1993Mol.Gen Genet.2401)、由高溫誘導(dǎo)的水稻″hsp 80″基因和″hsp 72″基因啟動(dòng)子(Van Breusegem等人1994Planta 19357)、由干燥誘導(dǎo)的擬南芥″rab 16″基因啟動(dòng)子(Nundy等人，1990Proc.Natl.Acad.Sci.USA 871406)、由紫外線照射誘導(dǎo)的查耳酮合酶基因啟動(dòng)子(Schulze-Lefert等人1989 EMBO J.8651)、和由缺氧條件誘導(dǎo)的玉米乙醇脫氫酶基因啟動(dòng)子(Walker等人，1987Proc.Natl.Acad.Sci.USA 846624)。此外，水稻的殼多糖酶基因啟動(dòng)子和煙草的PR蛋白質(zhì)基因啟動(dòng)子也可受到特定化合物，例如水楊酸的誘導(dǎo)，而″rab 16″也可受到噴涂脫落酸，植物激素的誘導(dǎo)。
此外，本發(fā)明提供已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明載體的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。除上述用于產(chǎn)生重組蛋白質(zhì)的細(xì)胞外，導(dǎo)入本發(fā)明載體的細(xì)胞包括用于制備轉(zhuǎn)化植物的植物細(xì)胞。對(duì)于植物細(xì)胞的類型沒(méi)有特別的限制，實(shí)例是擬南芥、水稻、玉米、馬鈴薯和煙草的細(xì)胞。除培養(yǎng)細(xì)胞外，本發(fā)明的植物細(xì)胞包括植物內(nèi)的細(xì)胞，以及原生質(zhì)體、芽原基(shoot primordia)、復(fù)合芽(multiple shoot)和毛根?？赏ㄟ^(guò)已知的方法將載體導(dǎo)入植物細(xì)胞，例如聚乙二醇法、電穿孔、土壤桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)移和粒子轟擊。可根據(jù)植物細(xì)胞的類型從轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞通過(guò)已知的方法再生植物(Toki等人，(1995)Plant Physiol.1001503-1507)。例如，用于水稻植株的轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)化和再生方法包括(1)利用聚乙二醇將基因?qū)氲皆|(zhì)體中，并使植物體再生(適于秈稻品種)(Datta，S.K.(1995)in″Gene Transfer To Plants″，Potrykus I和Spangenberg編輯，pp66-74)；(2)利用電脈沖將基因?qū)氲皆|(zhì)體中，并使植物體再生(適于粳稻品種)(Toki等人(1992)Plant Physiol.100，1503-1507)；(3)通過(guò)粒子轟擊將基因直接導(dǎo)入到細(xì)胞中，并使植物體再生(Christou等人(1991)Bio/Technology，9957-962)；以及(4)利用土壤桿菌導(dǎo)入基因，并使植物體再生(Hiei等人(1994)Plant J.6271-282)。已在本領(lǐng)域中建立這些方法，并且廣泛用于本發(fā)明的技術(shù)領(lǐng)域。這種方法可適當(dāng)?shù)赜糜诒景l(fā)明。
可通過(guò)使轉(zhuǎn)化的植物細(xì)胞再分化而使植物再生。再分化的方法根據(jù)植物細(xì)胞的類型而不同，實(shí)例包括Fujimura等人(Plant Tissue Culture Lett.274(1995))用于水稻的方法、Shillito等人(Bio/Technology 7581(1989))和Gorden-Kamm等人(Plant Cell 2603(1990))用于玉米的方法、Visser等人(Theor.Appl.Genet.78594(1989))用于馬鈴薯的方法、Nagata和Takebe(Planta 9912(1971))用于煙草的方法、Akama等人(Plant Cell Reports 127-11(1992))用于擬南芥的方法、以及Dohi等人(Unexamined PublishedJapanese Patent Application No.(JP-A)Hei 8-89113)用于桉樹(shù)的方法。
一旦獲得已經(jīng)將本發(fā)明的DNA或抑制本發(fā)明DNA表達(dá)的DNA整合到其基因組中的轉(zhuǎn)化植物，就有可能通過(guò)有性或無(wú)性繁殖獲得植物的后代。也可能從植物或其后代或克隆獲得再生的材料(例如種子、水果、穗狀花序(spikes)、塊莖(tuber)、塊莖狀根(tuberous root)、殘根(stubs)、愈傷組織和原生質(zhì)體)，以根據(jù)這種材料大量生產(chǎn)該植物。因此，本發(fā)明包括已經(jīng)導(dǎo)入本發(fā)明DNA的植物細(xì)胞、包含這些細(xì)胞的植物、這些植物的后代和克隆，以及該植物的再生材料及其后代和克隆。
當(dāng)與野生型植物相比時(shí)，如此生產(chǎn)的并且其著粒數(shù)已經(jīng)改變的植物顯示了其著粒數(shù)和產(chǎn)量的變化。例如，預(yù)期其中已經(jīng)通過(guò)導(dǎo)入反義DNA等抑制編碼CKX蛋白質(zhì)的DNA表達(dá)的植物顯示由于其著粒數(shù)增加而增產(chǎn)。利用本發(fā)明的方法，可增加有用農(nóng)作物水稻的著粒數(shù)。本發(fā)明在高產(chǎn)水稻品種的開(kāi)發(fā)中是更為有益的。
此外，本發(fā)明提供包括至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的多核苷酸，其與SEQ IDNO1或2的核苷酸序列或其互補(bǔ)序列是互補(bǔ)的。在此，短語(yǔ)″互補(bǔ)的序列″是指相應(yīng)于雙鏈DNA的一條鏈的序列，另一條鏈的序列包括A:T和G:C堿基對(duì)。術(shù)語(yǔ)″互補(bǔ)的″不限于其中序列與在至少15個(gè)連續(xù)核苷酸的區(qū)域中是完全互補(bǔ)的情況，并且包括其中核苷酸序列的同一性是至少70％，優(yōu)選至少80％，更優(yōu)選90％，以及更優(yōu)選95％以上的情況。這種DNAs可用作檢測(cè)或分離本發(fā)明的DNAs的探針以及用于擴(kuò)增該DNAs的引物。
此外，本發(fā)明提供用于確定植物著粒數(shù)增減的基因診斷方法。植物的著粒數(shù)是與植物產(chǎn)量緊密相關(guān)的，確定植物的著粒數(shù)在以增加產(chǎn)量為目的的水稻品種的育種中是很重要的。
在本發(fā)明中，短語(yǔ)″確定植物著粒數(shù)的增減″不僅包括確定迄今栽培的品種著粒數(shù)的增減，而且包括確定通過(guò)雜交或遺傳重組技術(shù)產(chǎn)生的新品種著粒數(shù)增減。
本發(fā)明的評(píng)估植物著粒數(shù)增減的方法的特點(diǎn)在于檢測(cè)植物是否已經(jīng)丟失編碼CKX蛋白質(zhì)的DNA的功能。可通過(guò)檢測(cè)基因組DNA相應(yīng)于CKX基因的核苷酸序列中的變化來(lái)評(píng)估植物是否已經(jīng)丟失編碼CKX蛋白質(zhì)的DNA的功能。
直接確定相應(yīng)于本發(fā)明DNA的待測(cè)植物DNA區(qū)域的核苷酸序列后，當(dāng)核苷酸序列編碼其功能缺失導(dǎo)致植物著粒數(shù)增加的蛋白質(zhì)時(shí)，確定該植物是具有小的著粒數(shù)的品種，或當(dāng)沒(méi)有編碼該蛋白質(zhì)時(shí)確定該植物是具有大的著粒數(shù)的品種。
例如，如果在待測(cè)植物DNA的核苷酸序列中發(fā)現(xiàn)導(dǎo)致水稻CKX蛋白質(zhì)的功能缺失的突變，則這個(gè)待測(cè)植物將被診斷為具有大的著粒數(shù)的品種。
例如當(dāng)通過(guò)雜交植物選育良種時(shí)，通過(guò)本發(fā)明的方法評(píng)估植物著粒數(shù)的增減是極為有利的。例如，當(dāng)不需要導(dǎo)入增加著粒數(shù)的性狀時(shí)，可避免與具有增加著粒數(shù)的性狀的品種雜交，相反，當(dāng)需要導(dǎo)入增加著粒數(shù)的性狀時(shí)，可與具有增加著粒數(shù)性狀的品種進(jìn)行雜交。當(dāng)從雜交后代選擇合乎需要的個(gè)體時(shí)它是更為有效的。與從表型確定相比，可更便利和可靠地在基因水平確定植物著粒數(shù)的增減。因此，本發(fā)明的用于評(píng)估著粒數(shù)增減的方法可極大地促進(jìn)改良植物品種的育種。
附圖簡(jiǎn)述圖1顯示一組描繪Koshihikari和Habataki的表型的照片。左側(cè)顯示的是Koshihikari，而右側(cè)顯示的是Habataki。
圖2顯示染色體上Yielding QTL(YQ)的位置。
圖3顯示Yielding QTL(YQ)的小型連鎖圖譜。
圖4顯示Yielding QTL(YQ)的高分辨率連鎖圖譜。
圖5比較了Koshihikari和Habataki的Yielding QTL(YQ)的高分辨率連鎖圖譜。
圖6顯示擬南芥和水稻的CKX基因的系統(tǒng)演化樹(shù)。
圖7比較CKX基因的序列。
圖8是圖7的繼續(xù)。
圖9是圖8的繼續(xù)。
圖10顯示水稻中所有的CKX基因位點(diǎn)。
實(shí)施本發(fā)明的最佳方式在下文中，本發(fā)明參考實(shí)施例進(jìn)行具體地說(shuō)明，但不應(yīng)被認(rèn)為只限于此。
試驗(yàn)材料的選擇和半等基因系的產(chǎn)生最初，為了產(chǎn)生用于QTL分析的雜種群體，選擇將成為雜種親本的品種。首先，研究了幾個(gè)粳稻(japonica)品種和幾個(gè)秈稻(indica)品種中的著粒數(shù)，從這些品種中，2個(gè)品種顯示著粒數(shù)的明顯差異，選擇出粳稻品種“Koshihikari”和秈稻品種“Habataki”(圖1)。對(duì)于通過(guò)將粳稻″Koshihikari″與″Habataki″雜交而產(chǎn)生的F1個(gè)體，利用Koshihikari作為重復(fù)的親本進(jìn)行回交并且進(jìn)行自交，在名古屋大學(xué)農(nóng)場(chǎng)培養(yǎng)和發(fā)展出74個(gè)各種的BC2F1、BC2F2和BC3F2群體。
通過(guò)利用74個(gè)BC2F2植株進(jìn)行關(guān)于著粒數(shù)的QTL分析，檢測(cè)增加著粒數(shù)的大量QTL(圖2)。特別地，成功地發(fā)現(xiàn)位于1號(hào)染色體短臂中大約28cM的Habataki的QTL(YQ1；Yielding QTL 1)與Koshihikari的QTL相比極有效的增加谷粒(或種子)的數(shù)目。為了檢驗(yàn)YQ1的存在，利用重復(fù)回交和MAS產(chǎn)生YQ 1的半等基因系(Ni1-YQ1將Habataki的基因座，1號(hào)染色體短臂中大約28cM的位點(diǎn)取代入Koshihikari的染色體的品種)。研究Ni1-YQ1和Koshihikari(對(duì)照)的最大著粒數(shù)，結(jié)果證實(shí)了QTL(YQ1)的存在。用Habataki的基因座取代1號(hào)染色體短臂中大約28cM位點(diǎn)的品種其著粒數(shù)平均增加了50。
QTL分析從每一74個(gè)BC2F1個(gè)體中，利用CTAB法提取DNAs，利用完全覆蓋所有染色體的93個(gè)分子標(biāo)記物確定每一個(gè)體的基因型。在每個(gè)品種的10個(gè)個(gè)體發(fā)展出它們的自交后代，BC2F2，并且從中隨機(jī)選擇每個(gè)品種的一個(gè)個(gè)體，在從每一選擇個(gè)體取樣6個(gè)圓錐花序后，對(duì)于每個(gè)圓錐花序研究著粒數(shù)。在每一品種的6個(gè)圓錐花序中，選擇具有最大著粒數(shù)的圓錐花序，并將這個(gè)數(shù)目用作最大著粒數(shù)。利用Qgene軟件進(jìn)行QTL分析。
利用YQ的分離群體的高分辨率連鎖分析利用分子標(biāo)記物，使用BC3F2群體研究表型和基因型(F2和F3)，并且再進(jìn)行連鎖分析。結(jié)果表明YQ1位于分子標(biāo)記物6A和8A之間的區(qū)域(圖3)。利用YQ的分離群體(12500個(gè)個(gè)體)進(jìn)行高分辨率連鎖分析來(lái)表示YQ1位點(diǎn)區(qū)域的結(jié)果是，表明YQ1是標(biāo)記物4A9和20之間的大約8Kb位置的區(qū)域(圖4)。當(dāng)在這個(gè)區(qū)域中進(jìn)行基因預(yù)測(cè)時(shí)，預(yù)測(cè)到單個(gè)基因，同源性搜索的結(jié)果是發(fā)現(xiàn)與CKX(細(xì)胞分裂素氧化酶)高度同源的基因(圖4)。當(dāng)對(duì)Habataki和Koshihikari確定這個(gè)CKX基因的核苷酸序列時(shí)，發(fā)現(xiàn)了核苷酸中的差異，Habataki的CKX似乎已經(jīng)丟失其功能(圖5)。
水稻基因組中CKX基因的分析當(dāng)搜索水稻基因組序列分析水稻中的CKX基因時(shí)，在水稻基因組中發(fā)現(xiàn)11個(gè)CKX基因。當(dāng)對(duì)于這些基因以及擬南芥中的CKX基因構(gòu)建系統(tǒng)演化樹(shù)時(shí)，發(fā)現(xiàn)擬南芥的AtCKX2、3、和4，以及5個(gè)水稻CKX基因(位于Chr.125cM P695A4的CKX、位于Chr.127P419B01的CKX(本基因)、位于Chr.679cM OsJ0006A22-GS的CKX基因、和2個(gè)位于32cM的CKX基因)是極緊密相關(guān)的(圖6)。當(dāng)研究這些基因的同源性時(shí)，發(fā)現(xiàn)它們?cè)诎被崴绞歉叨韧吹?圖7至9)。此外，當(dāng)證實(shí)了水稻中所有CKX基因的基因座位置時(shí)，發(fā)現(xiàn)其中一些位于YQ區(qū)域上(圖10)。
工業(yè)實(shí)用性由本發(fā)明提供的CKX基因的功能缺失增加了植物的著粒數(shù)。因此，利用例如反義法和核糖酶法的方法調(diào)節(jié)該DNA的表達(dá)可導(dǎo)致谷粒產(chǎn)率的增加。因?yàn)樵诠任镏谢蚪M同線性(遺傳同源性)是高度保守的，可以預(yù)期將水稻CKX基因應(yīng)用在繁殖谷物，例如小麥、大麥和玉米中。此外，因?yàn)镃KX基因不限于谷物，并且廣泛分布于植物中，CKX基因功能的缺失可能增加所有植物的花和種子(穎花)的數(shù)目，而導(dǎo)致產(chǎn)量的增加。
此外，本發(fā)明提供用于確定植物中著粒數(shù)增減的遺傳診斷方法?？筛奖愕卦诨蛩竭M(jìn)行植物著粒數(shù)增減的確定并且可靠地與來(lái)自表型的確定進(jìn)行比較。因此，本發(fā)明的用于評(píng)估著粒數(shù)增減的方法可極大地促進(jìn)改良植物品種的育種。
序列表<110>HONDA MOTOR CO.，LTD.(本田技研工業(yè)株式會(huì)社)<120>用于增加作物產(chǎn)量的基因及其用途<130>H3-A0201P<150>US 60/425,919<151>2002-11-13<160>6<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>5400<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220>
<221>內(nèi)含子<222>(1)..(108)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(109)..(817)<223>
<220>
<221>內(nèi)含子<222>(818)..(908)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(909)..(1375)<223>
<220>
<221>內(nèi)含子<222>(1376)..(3823)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(3824)..(4089)<223>
<220>
<221>內(nèi)含子
<222>(4090)..(4540)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(4541)..(5400)<223>
<400>1acagctctac tgtctatcta gctatctatc agctgccttc catcgtcagc acacaaacta 60cacaagaatc tgcttattta taggccacct tgtcccttct acaatggtgc aagaacacac 120aaattcacac acacactgac acacacaaac cgatcgattg attgattgat a atg aag 177Met Lys1caa gag cag gtc agg atg gca gtg ctc ctc atg ctc aac tgc ttc gtc225Gln Glu Gln Val Arg Met Ala Val Leu Leu Met Leu Asn Cys Phe Val5 10 15aag gcc acg gcg ccg ccg cca tgg ccg ccg tcg gct tcg tcc gcc tcc273Lys Ala Thr Ala Pro Pro Pro Trp Pro Pro Ser Ala Ser Ser Ala Ser20 25 30ttc ctc gac gac ctc ggc gac ctc ggc atc gcg ccg ctc atc cgc gcc321Phe Leu Asp Asp Leu Gly Asp Leu Gly Ile Ala Pro Leu Ile Arg Ala35 40 45 50gac gag gcg ggc acc gcg cgc gcc tcc gcc gac ttt ggc aac ctc tcc369Asp Glu Ala Gly Thr Ala Arg Ala Ser Ala Asp Phe Gly Asn Leu Ser55 60 65gtc gcc ggc gtc ggg gcg cct cgg ctc gcc gcc gcc gcc gcc gtg ctc417Val Ala Gly Val Gly Ala Pro Arg Leu Ala Ala Ala Ala Ala Val Leu70 75 80tac ccg tcg cgc ccc gcc gac atc gcc gcg ctg ctg cgc gcg tcg tgc465Tyr Pro Ser Arg Pro Ala Asp Ile Ala Ala Leu Leu Arg Ala Ser Cys85 90 95gca cgc ccg gcg ccg ttc gcg gtg tcc gcg cgg ggg tgt ggc cac tcg513Ala Arg Pro Ala Pro Phe Ala Val Ser Ala Arg Gly Cys Gly His Ser100 105 110gtg cac ggc cag gcc tcc gcg ccc gac ggc gtc gtc gtc gac atg gcg561Val His Gly Gln Ala Ser Ala Pro Asp Gly Val Val Val Asp Met Ala115 120 125 130tcg ctc ggc cgc ctg cag ggc ggc ggc gcg cgg cgc ctc gcc gtg tca609Ser Leu Gly Arg Leu Gln Gly Gly Gly Ala Arg Arg Leu Ala Val Ser135 140 145
gtg gag ggg cgg tac gtc gac gcc ggc ggc gag cag ctg tgg gtg gac 657Val Glu Gly Arg Tyr Val Asp Ala Gly Gly Glu Gln Leu Trp Val Asp150 155 160gtg ctg cgc gcg tcc atg gcg cac ggg ctc acg ccg gtg tcg tgg aca 705Val Leu Arg Ala Ser Met Ala His Gly Leu Thr Pro Val Ser Trp Thr165 170 175gac tac ctc cac ctc acc gtc ggc ggc acg ctg tcc aac gcc ggc atc 753Asp Tyr Leu His Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile180 185 190agc ggc cag gcc ttc cgc cat ggc ccc cag att tcc aac gtg cta gag 801Ser Gly Gln Ala Phe Arg His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu195 200 205 210ctc gac gtc atc acc g gtacgtagat ccatcacatc tactaagaca cgcgccgcca 857Leu Asp Val Ile Thr215tgatcgaggt aattaaggta taggtgtttt gacgtataca tgtatctgca g gt gtc 913Gly Valggg gag atg gtg acg tgc tcg aag gag aag gcg ccg gac ctg ttc gac 961Gly Glu Met Val Thr Cys Ser Lys Glu Lys Ala Pro Asp Leu Phe Asp220 225 230gcg gtg ctg ggc ggg ctg ggg cag ttc ggc gtc atc acg cgg gcg cgc1009Ala Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg235 240 245atc ccg ctc gcg ccg gcg ccg gcg agg gcg cgg tgg gtg cgg ttc gtg1057Ile Pro Leu Ala Pro Ala Pro Ala Arg Ala Arg Trp Val Arg Phe Val250 255 260 265tac acg acg gcg gcg gcg atg acg gcc gac cag gag cgc ctc atc gcc1105Tyr Thr Thr Ala Ala Ala Met Thr Ala Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ala270 275 280gtc gat cgc gcc ggc ggc gcc ggc gcg gtg ggc ggg ctg atg gac tac1153Val Asp Arg Ala Gly Gly Ala Gly Ala Val Gly Gly Leu Met Asp Tyr285 290 295gtc gag ggc tcg gtc cac ctg aac cag ggc ctg gtc gag acc tgg cgc1201Val Glu Gly Ser Val His Leu Asn Gln Gly Leu Val Glu Thr Trp Arg300 305 310acg cag ccg cag ccg cct tcg ccg tcc tcc tcc tcc tcc tca tcc ttc1249Thr Gln Pro Gln Pro Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe315 320 325ttc tcc gac gcc gac gag gcc cgc gtc gcc gcg ctc gcc aag gag gcc1297
Phe Ser Asp Ala Asp Glu Ala Arg Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala330 335 340 345ggc ggc gtg ctg tat ttc ctc gag ggc gcc atc tac ttc ggc ggc gcc 1345Gly Gly Val Leu Tyr Phe Leu Glu Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Gly Ala350 355 360gcc ggg ccg tcc gcc gcc gac gtt gac aag gtatactagc tagctactag1395Ala Gly Pro Ser Ala Ala Asp Val Asp Lys365 370cttgctctgc gctgagccga ccagagcggg tcccacctcg tgatgatggc gggaacaact1455aagctgcaaa aacttttggc gccacctggg gcttacgctt acgcacgcat gcaattaagg1515ggtgttctag atggggctaa aactttttag cccatgtcac atcggatgtt tggacgctaa1575tttggagtat taaatataga ctaataaaaa aactaatttc ataaatgaga gctaatccgc1635gagacgaatt ttttaagcct aattaatcta taattataaa agtttattgt agcatcacat1695tgtcaaaatc atgacataat tagactcaaa agattcgtct cgtgaattag tccaagatat1755ggaatatgtt ttataattag tgtatgttta atactccaaa ttagtattca aacatctggt1815gtgacatgga cttggaataa gtccgtggaa accaaacaga ccctaacggt gcatgaaatt1875gaagtctctt gcgccgtcga catcgtcgta cttggcctac cacttttgtc tgccacgcga1935tgcacctctc gctatcacac acctaactgg aagtaattaa ataattattc gattctgtgt1995taattttttt ttatcttcct tagttcccgg agagacaaag attagatact atagtagcaa2055cttagtaagc tagtatatgg agtattaggt tagtcgctct cactaagctt aaacaggtgt2115ataaaatata tgcatcgtct gatcgtgaca tattctttta gctacttatg gtgaaaactt2175tttcgtccaa aacagtgaaa agcatgcgtg ctagtgtagg tagtagctac caggacgaat2235tatatcatta acagtatttg tagcacatca aggaaaaact tgtcttttta aacactgtta2295cagtcttcag aacgcacaac tttaacaggt atttttgtat tatatttttt taaaaaaaaa2355taaaggtaat aaaattatgg tattgtaaaa gtatattttt aaggaaaatc atataaccaa2415tcaaaagttt atgaagatat acatattgat gttcaaagtt actaaaagtt gacttaaaca2475tcacattttc atcttgacca aagagggttc atatatatac tccctcaatt ttaaaatata2535agcatttcta attatatgca tctagacaaa tgcatataaa aatactttat tttttaaagt2595gagggagtat caattttgag catgtagcta gactagatta gtgtatgtct acgcacatat2655
ctgttgttct gcacaaaact actactcatc ggtcctaaaa tataagaatt taaaattgga2715tgggacatac cctaatacaa tgaatttaga catggacata tactagtaat accatgtact2775acctccatcc caaaataagt tcacttttca tccatctcac acataccaat agaaagtact2835acaaatttcg gttattctct attttcacaa actccgatgc aatgattatt ttaaaaataa2895acttatttta gaataaatgg aatgagcaaa atataaactg gtgtgtttga ggagaagggg2955attgaggaga ttgggaagat acgcaaaacg aggtgagcca ttagctcatg attaattgag3015tattaactat tttaaatttc aaaaatggat taatatgatt ttttaaagca actttcctat3075ataaaatttt tacaaaaaac acaccgttta atagtttgga aagcgtactt gcggaaaacg3135aggtgctttc tccctcaatg tcgtccaaac gaacgctgcc ttattacggg actgaggaat3195tagagctttg ccagaaagaa atcagcatcg ccagcttgga cctaccatcc atgcatgcat3255catgtggcca ttgacacatc acatagtatg tgctagctag ctagcttttg atcatagtta3315catgtatcta gctaggctag aagctggaaa ccgatggata tgatggatct ctcatggatg3375acaggccagc caaagatctg tgcgccacta gatacagtgc atgcatcagc ttgtatggtt3435ataaccctag ctagccagct ttagcacaca catgcatatg catgcatgag cccccatctt3495ttgcaacacg accgaccaac tatgttggct ctatatagat agctagctag ttattccatg3555catatacagt ttgcatttcc tagctatagc ttttgctatg tgatccgaga agatcctgca3615tgcccacacg tgacacgtca cacacacatg tggacaaagt actgcctcac tttatccttg3675catgacgtca cgtcgccacc tgtccatcca cgctgctagt gctggcaaaa ttaataactc3735gatcaaattt cggtgatctc tctgcaaaga atttgatgaa ttttaccaac atatatgctt3795taatttcttt gcttgatttt atttgcag agg atg gat gtg ctg cgt cgc gag 3847Arg Met Asp Val Leu Arg Arg Glu375ctg cgg cac gag cgc ggg ttc gtg ttc gcg cag gac gtg gcg tac gcc 3895Leu Arg His Glu Arg Gly Phe Val Phe Ala Gln Asp Val Ala Tyr Ala380 385 390 395ggg ttc ctg gac cgc gtc cac gac ggc gag ctc aag ctc cgc gcc gcg 3943Gly Phe Leu Asp Arg Val His Asp Gly Glu Leu Lys Leu Arg Ala Ala400 405 410ggg ctc tgg gac gtg ccg cac cca tgg ctg aac ctg ttc ctc ccc cgc 3991Gly Leu Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Leu Pro Arg415 420 425
tcc ggc gtc ctc gcc ttc gcc gac ggc gtc ttc cac ggc atc ctc agc4039Ser Gly Val Leu Ala Phe Ala Asp Gly Val Phe His Gly Ile Leu Ser430 435 440cgc acc ccc gcc atg ggc ccc gtc ctc atc tac ccc atg aac cgc aac4087Arg Thr Pro Ala Met Gly Pro Val Leu Ile Tyr Pro Met Asn Arg Asn445 450 455aa gtaataataa taataaaaag ctttactaca tatacacatg tatataattt 4139Lysttacggggtg gattttttcg ttcaaaatga cgacccctca tattgtgcgt gtcgtctgaa 4199aacttattaa aatgtttaaa taaaaaatta atatgataca taaatatatt atatatcact 4259atataaacat tgtaatctta aactcaactt gcacaagtag taaaaaaaca aatttgactg 4319caaatagtgt gtactaagtt atttatttac ttatgctagt atgctacttg aatttaaacg 4379tacatattta tgaagtggta tattatatat ttccagagta tttttatggt tcttttacga 4439catgaaaaac aatgtccgtt ctcttgaagg atgaatagac tttccttaat tttaacatat 4499atggtggtaa ctaaacatac acacacctgg atatgtttca g g tgg gac agt aac4553Trp Asp Ser Asnatg tcg gca gtg atc acc gac gac gac ggt gac gag gtg ttc tac acg4601Met Ser Ala Val Ile Thr Asp Asp Asp Gly Asp Glu Val Phe Tyr Thr465 470 475 480gtg ggg atc ctg cgg tcg gcg gcg gcg gcc ggc gac gtg ggg agg ctg4649Val Gly Ile Leu Arg Ser Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Gly Arg Leu485 490 495gag gag cag aac gac gag atc ttg ggt ttc tgc gag gtg gcc ggg ata4697Glu Glu Gln Asn Asp Glu Ile Leu Gly Phe Cys Glu Val Ala Gly Ile500 505 510gcc tac aag cag tac ctg cct tac tac ggc agc cag gca gag tgg cag4745Ala Tyr Lys Gln Tyr Leu Pro Tyr Tyr Gly Ser Gln Ala Glu Trp Gln515 520 525aag cgg cac ttc ggt gcc aat ctc tgg cca aga ttc gtg cag cgg aag4793Lys Arg His Phe Gly Ala Asn Leu Trp Pro Arg Phe Val Gln Arg Lys530 535 540agc aag tat gat cca aag gcc atc ctg tcc cgt ggc cag ggg att ttc4841Ser Lys Tyr Asp Pro Lys Ala Ile Leu Ser Arg Gly Gln Gly Ile Phe545 550 555 560
acg tca cca ctc gca tga aatgacacat gtatgcaaat gcatatctac 4889Thr Ser Pro Leu Ala565atgcgtatat atacacgtat atatacgtat gtatgcatac acatatgggt gtactgtgca 4949tacgttatag cacactgcag ctaattaagc ttgacaggga gatcgatcaa tggacaatgc 5009tctagtcaag ctaatataaa taatggagta gtagtatata tgtagtgcga gataattaag 5069tagtgtgttt gcctactaaa aggagaggca aagtagtact gtgatgcatg catgccaact 5129aataggtgat aagtacgtgt gtgtggccgc atgtatgatt agaagaagtt ggtttttaat 5189taattaatta ggtcatgtat gtaaatatat agtacagtac tacgtactac tagtgtacta 5249ccagccaatt tgcatgcatg catggatgcc ttcatatgca tgtcgatctc aaacgtacgg 5309catgcttgaa tgcatcatga tgcatatcta tcgtcgtctt gtgggtgtaa actaaattaa 5369tcttagttat atgtattata agtttgcaat a 5400<210>2<211>2302<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>2gcaagaacac acaaattcac acacacactg acacacacaa accgatcgat tgattgattg60ataatgaagc aagagcaggt caggatggca gtgctcctca tgctcaactg cttcgtcaag 120gccacggcgc cgccgccatg gccgccgtcg gcttcgtccg cctccttcct cgacgacctc 180ggcgacctcg gcatcgcgcc gctcatccgc gccgacgagg cgggcaccgc gcgcgcctcc 240gccgactttg gcaacctctc cgtcgccggc gtcggggcgc ctcggctcgc cgccgccgcc 300gccgtgctct acccgtcgcg ccccgccgac atcgccgcgc tgctgcgcgc gtcgtgcgca 360cgcccggcgc cgttcgcggt gtccgcgcgg gggtgtggcc actcggtgca cggccaggcc 420tccgcgcccg acggcgtcgt cgtcgacatg gcgtcgctcg gccgcctgca gggcggcggc 480gcgcggcgcc tcgccgtgtc agtggagggg cggtacgtcg acgccggcgg cgagcagctg 540tgggtggacg tgctgcgcgc gtccatggcg cacgggctca cgccggtgtc gtggacagac 600tacctccacc tcaccgtcgg cggcacgctg tccaacgccg gcatcagcgg ccaggccttc 660cgccatggcc cccagatttc caacgtgcta gagctcgacg tcatcaccgg tgtcggggag 720
atggtgacgt gctcgaagga gaaggcgccg gacctgttcg acgcggtgct gggcgggctg 780gggcagttcg gcgtcatcac gcgggcgcgc atcccgctcg cgccggcgcc ggcgagggcg 840cggtgggtgc ggttcgtgta cacgacggcg gcggcgatga cggccgacca ggagcgcctc 900atcgccgtcg atcgcgccgg cggcgccggc gcggtgggcg ggctgatgga ctacgtcgag 960ggctcggtcc acctgaacca gggcctggtc gagacctggc gcacgcagcc gcagccgcct1020tcgccgtcct cctcctcctc ctcatccttc ttctccgacg ccgacgaggc ccgcgtcgcc1080gcgctcgcca aggaggccgg cggcgtgctg tatttcctcg agggcgccat ctacttcggc1140ggcgccgccg ggccgtccgc cgccgacgtt gacaagagga tggatgtgct gcgtcgcgag1200ctgcggcacg agcgcgggtt cgtgttcgcg caggacgtgg cgtacgccgg gttcctggac1260cgcgtccacg acggcgagct caagctccgc gccgcggggc tctgggacgt gccgcaccca1320tggctgaacc tgttcctccc ccgctccggc gtcctcgcct tcgccgacgg cgtcttccac1380ggcatcctca gccgcacccc cgccatgggc cccgtcctca tctaccccat gaaccgcaac1440aagtgggaca gtaacatgtc ggcagtgatc accgacgacg acggtgacga ggtgttctac1500acggtgggga tcctgcggtc ggcggcggcg gccggcgacg tggggaggct ggaggagcag1560aacgacgaga tcttgggttt ctgcgaggtg gccgggatag cctacaagca gtacctgcct1620tactacggca gccaggcaga gtggcagaag cggcacttcg gtgccaatct ctggccaaga1680ttcgtgcagc ggaagagcaa gtatgatcca aaggccatcc tgtcccgtgg ccaggggatt1740ttcacgtcac cactcgcatg aaatgacaca tgtatgcaaa tgcatatcta catgcgtata1800tatacacgta tatatacgta tgtatgcata cacatatggg tgtactgtgc atacgttata1860gcacactgca gctaattaag cttgacaggg agatcgatca atggacaatg ctctagtcaa1920gctaatataa ataatggagt agtagtatat atgtagtgcg agataattaa gtagtgtgtt1980tgcctactaa aaggagaggc aaagtagtac tgtgatgcat gcatgccaac taataggtga2040taagtacgtg tgtgtggccg catgtatgat tagaagaagt tggtttttaa ttaattaatt2100aggtcatgta tgtaaatata tagtacagta ctacgtacta ctagtgtact accagccaat2160ttgcatgcat gcatggatgc cttcatatgc atgtcgatct caaacgtacg gcatgcttga2220atgcatcatg atgcatatct atcgtcgtct tgtgggtgta aactaaatta atcttagtta2280tatgtattat aagtttgcaa ta 2302
<210>3<211>565<212>PRT<213>稻(0ryza sativa)<400>3Met Lys Gln Glu Gln Val Arg Met Ala Val Leu Leu Met Leu Asn Cys1 5 10 15Phe Val Lys Ala Thr Ala Pro Pro Pro Trp Pro Pro Ser Ala Ser Ser20 25 30Ala Ser Phe Leu Asp Asp Leu Gly Asp Leu Gly Ile Ala Pro Leu Ile35 40 45Arg Ala Asp Glu Ala Gly Thr Ala Arg Ala Ser Ala Asp Phe Gly Asn50 55 60Leu Ser Val Ala Gly Val Gly Ala Pro Arg Leu Ala Ala Ala Ala Ala65 70 75 80Val Leu Tyr Pro Ser Arg Pro Ala Asp Ile Ala Ala Leu Leu Arg Ala85 90 95Ser Cys Ala Arg Pro Ala Pro Phe Ala Val Ser Ala Arg Gly Cys Gly100 105 110His Ser Val His Gly Gln Ala Ser Ala Pro Asp Gly Val Val Val Asp115 120 125Met Ala Ser Leu Gly Arg Leu Gln Gly Gly Gly Ala Arg Arg Leu Ala130 135 140Val Ser Val Glu Gly Arg Tyr Val Asp Ala Gly Gly Glu Gln Leu Trp145 150 155 160Val Asp Val Leu Arg Ala Ser Met Ala His Gly Leu Thr Pro Val Ser165 170 175Trp Thr Asp Tyr Leu His Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala180 185 190Gly Ile Ser Gly Gln Ala Phe Arg His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val195 200 205Leu Glu Leu Asp Val Ile Thr Gly Val Gly Glu Met Val Thr Cys Ser210 215 220Lys Glu Lys Ala Pro Asp Leu Phe Asp Ala Val Leu Gly Gly Leu Gly225 230 235 240
Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile Pro Leu Ala Pro Ala Pro245 250 255Ala Arg Ala Arg Trp Val Arg Phe Val Tyr Thr Thr Ala Ala Ala Met260 265 270Thr Ala Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ala Val Asp Arg Ala Gly Gly Ala275 280 285Gly Ala Val Gly Gly Leu Met Asp Tyr Val Glu Gly Ser Val His Leu290 295 300Asn Gln Gly Leu Val Glu Thr Trp Arg Thr Gln Pro Gln Pro Pro Ser305 310 315 320Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Asp Ala Asp Glu Ala325 330 335Arg Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Gly Gly Val Leu Tyr Phe Leu340 345 350Glu Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Gly Ala Ala Gly Pro Ser Ala Ala Asp355 360 365Val Asp Lys Arg Met Asp Val Leu Arg Arg Glu Leu Arg His Glu Arg370 375 380Gly Phe Val Phe Ala Gln Asp Val Ala Tyr Ala Gly Phe Leu Asp Arg385 390 395 400Val His Asp Gly Glu Leu Lys Leu Arg Ala Ala Gly Leu Trp Asp Val405 410 415Pro His Pro Trp Leu Asn Leu Phe Leu Pro Arg Ser Gly Val Leu Ala420 425 430Phe Ala Asp Gly Val Phe His Gly Ile Leu Ser Arg Thr Pro Ala Met435 440 445Gly Pro Val Leu Ile Tyr Pro Met Asn Arg Asn Lys Trp Asp Ser Asn450 455 460Met Ser Ala Val Ile Thr Asp Asp Asp Gly Asp Glu Val Phe Tyr Thr465 470 475 480Val Gly Ile Leu Arg Ser Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Gly Arg Leu485 490 495Glu Glu Gln Asn Asp Glu Ile Leu Gly Phe Cys Glu Val Ala Gly Ile500 505 510Ala Tyr Lys Gln Tyr Leu Pro Tyr Tyr Gly Ser Gln Ala Glu Trp Gln
515 520 525Lys Arg His Phe Gly Ala Asn Leu Trp Pro Arg Phe Val Gln Arg Lys530 535 540Ser Lys Tyr Asp Pro Lys Ala Ile Leu Ser Arg Gly Gln Gly Ile Phe545 550 555 560Thr Ser Pro Leu Ala565<210>4<211>5003<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220>
<221>外顯子<222>(1)..(687)<223>
<220>
<221>內(nèi)含子<222>(688)..(778)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(779)..(1245)<223>
<220>
<221>內(nèi)含子<222>(1246)..(3424)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(3425)..(3690)<223>
<220>
<221>內(nèi)含子<222>(3691)..(4141)<223>
<220>
<221>外顯子<222>(4142)..(5003)<223>
<220>
<221>misc_feature<222>(4037)..(4062)<223>″n″表示a，t，g，或c.
<400>4gcaagaacac acaaattcac acacacactg acacacacaa attgata atg aag caa56Met Lys Gln1gag cag gtc agg atg gca gtg ctc ctc atg ctc aac tgc ttc gtc aag104Glu Gln Val Arg Met Ala Val Leu Leu Met Leu Asn Cys Phe Val Lys5 10 15gcc acg gcg ccg ccg cca tgg ccg ccg tcg gct tcg tcc gcc tcc ttc152Ala Thr Ala Pro Pro Pro Trp Pro Pro Ser Ala Ser Ser Ala Ser Phe20 25 30 35ctc gac gac ctc ggc gac ctc ggc atc gcg ccg ctc atc cgc gcc gac200Leu Asp Asp Leu Gly Asp Leu Gly Ile Ala Pro Leu Ile Arg Ala Asp40 45 50gag gcg gcc acc gcg cgc gcc tcc gcc gac ttt ggc aac ctc tcc gtc248Glu Ala Ala Thr Ala Arg Ala Ser Ala Asp Phe Gly Asn Leu Ser Val55 60 65gcc ggc gtc ggg gcg cct cgg ctc gcc gcc gcc gtg ctc tac ccg tcg296Ala Gly Val Gly Ala Pro Arg Leu Ala Ala Ala Val Leu Tyr Pro Ser70 75 80cgc ccc gcc gac atc gcc gcg ctg ctg cgc gcg tcg tgc gca cgc ccg344Arg Pro Ala Asp Ile Ala Ala Leu Leu Arg Ala Ser Cys Ala Arg Pro85 90 95gcg ccg ttc gcg gtg tcc gcg cgg ggg tgt ggc cac tcg gtg cgc ggc392Ala Pro Phe Ala Val Ser Ala Arg Gly Cys Gly His Ser Val Arg Gly100 105 110 115cag gcc tcc gcg ccc gac ggc gtc gtc gtc gac atg gcg tcg ctc ggc440Gln Ala Ser Ala Pro Asp Gly Val Val Val Asp Met Ala Ser Leu Gly120 125 130cgc ctg cag ggc ggc ggc gcg cgg cgc ctc gcc gtg tca gtg gag ggg488Arg Leu Gln Gly Gly Gly Ala Arg Arg Leu Ala Val Ser Val Glu Gly135 140 145cgg tac gtc gac gcc ggc ggc gag cag ctg tgg gtg gac gtg ctg cgc536Arg Tyr Val Asp Ala Gly Gly Glu Gln Leu Trp Val Asp Val Leu Arg150 155 160gcg tcc atg gcg cac ggg ctc acg ccg gtg tcg tgg aca gac tac ctc584Ala Ser Met Ala His Gly Leu Thr Pro Val Ser Trp Thr Asp Tyr Leu165 170 175
cac ctc acc gtc ggc ggc acg ctg tcc aac gcc ggc atc agc ggc cag632His Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile Ser Gly Gln180 185 190 195gcc ttc cgc cat ggc ccc cag att tcc aac gtg cta gag ctc gac gtc680Ala Phe Arg His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu Leu Asp Val200 205 210atc acc g gtacgtagat ccatcacatc tactaagaca cgcgccgcca tgatcgaggt 737Ile Thraattaaggta taggtgtttt gacgtataca tgtatctgca g gt gtc ggg gag atg 792Gly Val Gly Glu Met215gtg acg tgc tcg aag gag aag gcg ccg gac ctg ttc gac gcg gtg ctg840Val Thr Cys Ser Lys Glu Lys Ala Pro Asp Leu Phe Asp Ala Val Leu220 225 230ggc ggg ctg ggg cag ttc ggc gtc atc acg cgg gcg cgc atc ccg ctc888Gly Gly Leu Gly Gln Phe Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile Pro Leu235 240 245 250gcg ccg gcg ccg gcg agg gcg cgg tgg gtg cgg ttc gtg tac acg acg936Ala Pro Ala Pro Ala Arg Ala Arg Trp Val Arg Phe Val Tyr Thr Thr255 260 265gcg gcg gcg atg acg gcc gac cag gag cgc ctc atc gcc gtc gat cgc984Ala Ala Ala Met Thr Ala Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ala Val Asp Arg270 275 280gcc ggc ggc gcc ggc gcg gtg ggc ggg ctg atg gac tac gtc gag ggc1032Ala Gly Gly Ala Gly Ala Val Gly Gly Leu Met Asp Tyr Val Glu Gly285 290 295tcg gtc cac ctg aac cag ggc ctg gtc gag acc tgg cgc acg cag ccg1080Ser Val His Leu Asn Gln Gly Leu Val Glu Thr Trp Arg Thr Gln Pro300 305 310cag ccg cct tcg ccg tcc tcc tcc tcc tcc tca tcc ttc ttc tcc gac1128Gln Pro Pro Ser Pro Ser Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Asp315 320 325 330gcc gac gag gcc cgc gtc gcc gcg ctc gcc aag gag gcc ggc ggc gtg1176Ala Asp Glu Ala Arg Val Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Gly Gly Val335 340 345ctg tat ttc ctc gag ggc gcc atc tac ttc ggc ggc gcc gcc ggg ccg1224Leu Tyr Phe Leu Glu Gly Ala Ile Tyr Phe Gly Gly Ala Ala Gly Pro350 355 360tcc gcc gcc gac gtt gac aag gtatactagc tagctactag cttgctctgc 1275
Ser Ala Ala Asp Val Asp Lys365gctgcgccga ccagagcggg tcccacctcg tgatgatggc gggaacaact aagctgcaaa1335aacttttggc gccacctggg gcttacgctt acgcacgcat gcaattaagg gggtgttcag1395atcgggctgc ccatgtcaca tcggatgttt agacgctaat ttagagtatt aaacatagac1455taataaaaaa actaatttca taaatgagag ttatccgcga gacgaatttt ttaagcacaa1515ttaatctata attataaaaa gtttactgta gcatcacatt gtcaaaatca tgatataatt1575agactcaaag attcgtctca tgaattagtc caagaatata gaatgtgttt tataattagt1635gtatgtttat tagtatccaa acatccgatg tgatatggac ttagaataag ttttccaaac1695aggacctaac ggtgcatgaa attgaagtct cttgcgccgt cgacatcgtc gtacttggcc1755taccactttt gtctgccacg cgatgcacct ctcgctatca cacacctaac tggaagtaat1815taaataatta ttcgattctg tgttaatttt tttttatctt ccttagttct cggagagaca1875aagattagat actatagtag caacttagta agctagtata tggagtatta ggttagtcgc1935tctcactaag cttaaacagg tgtataaaat atatgcatcg tctgatcgtg acatattctt1995ttagctactt atggtgaaaa ctttttcgtc caaaacagtg aaaagcatgc atgctagtgt2055aggtagtagc taccaggacg aattatatca ttaacagtat ttgtagcaca tcaaggaaaa2115acttgtcttt ttaaacactg ttacagtctt cagaacgcac aactttaaca ggtatttttg2175tattatattt ttttaaaaaa aataaaggta ataaaattat ggtattgtaa aagtatattt2235ttaaggaaaa tcatataacc aatcaaaagt ttatgaagat atacatattg atgttcaaag2295ttactaaaag ttgacttaaa catcacattt tcatcttgac caaagagggt tcatatatat2355actccctcaa ttttaaaata taagcatttc taattatatg catctagaca aatacatata2415aatatacttt attttttaaa gtgagggagt atcaattttg agcatgtagc tagactagat2475tagtgtatgt ctacgcacat atctgttgat ctgcacaaaa ctactactca tctatcctaa2535aatataagaa tttaaaattg gatgggacat accctaatac aatgaatcta gacatggaca2595tatactagta ataccatgta ctatctccat cccaaaataa gttcactttt catccatctc2655atacatatac caatagaaag tactaaaaat ttcggttatt ctctattttc acaaactccg2715atgcaatgat tattttaaaa ataaacttat tttagaataa atggaatgag caaaatataa2775
acttattacg ggactgagga attagagctt tgccagaaag aaatcagcat cgccagcttg2835gacctaccat ccatgcatgc atcatgtggc cattgacaca tcacatagta tgtgctagct2895agctagcttt tgatcatagt tacatgtatc tagctaggct agaagctgga aaccgatgga2955tatgatggat ctctcatgga tgacaggcca gccaaagatc tgtgcgccac tagatacagt3015gcatgcatca gcttgtatgg ttataaccct agctagccag ctttagcaca cacatgcata3075tgcatgatga gcccccatct tttgcaacac gaccgaccaa ctatgttggc catatataga3135tagctagcta gttattccat gcatatacag tttgcatttc ctagctatag cttttgctat3195gtgatccgag aagatcctgc atgcccacac gtgacacgtc acacacacat gtggacaaag3255tactgcctca ctttatcctt gcatgacgtc acgtcgccac ctgtccatcc acgctgctag3315tgctggcaaa attaataact cgatcaaatt tcggtgatct ctctgcaaag aatttgatga3375attttaccaa catatatgct ttaatttctt tgtttgattt tatttgcag agg atg gat3433Arg Met Asp370gtg ctg cgt cgc gag ctg cgg cac gag cgc ggg ttc gtg ttc gcg cag 3481Val Leu Arg Arg Glu Leu Arg His Glu Arg Gly Phe Val Phe Ala Gln375 380 385gac gtg gcg tac gcc ggg ttc ctg gac cgc gtc cac gac ggc gag ctc 3529Asp Val Ala Tyr Ala Gly Phe Leu Asp Arg Val His Asp Gly Glu Leu390 395 400aag ctc cgc gcc gcg ggg ctc tgg gac gtg ccg cac cca tgg ctg aac 3577Lys Leu Arg Ala Ala Gly Leu Trp Asp Val Pro His Pro Trp Leu Asn405 410 415 420ctg ttc ctc ccc cgc tcc ggc gtc ctc gcc ttc gcc gac ggc gtc ttc 3625Leu Phe Leu Pro Arg Ser Gly Val Leu Ala Phe Ala Asp Gly Val Phe425 430 435cac ggc atc ctc agc cgc acc ccc gcc atg ggc ccc gtc ctc atc tac 3673His Gly Ile Leu Ser Arg Thr Pro Ala Met Gly Pro Val Leu Ile Tyr440 445 450ccc atg aac cgc aac aa gtaataataa taataaacag ctttactaca 3720Pro Met Asn Arg Asn Lys455tatacacatg tatataattt ttacggggtg gattttttcg ttcaaaatga cgatccctca3780tattgtgcgt gtcgtctgaa aacttattaa aatgtttaaa taaaaaatta atatgataca3840taaatatatt atatatcact atataaacat tataatctta aactcaactt gcacaagtag3900
taaaaaaaca aatttgactg caaatagtgt gtactaagtt atttatttac ttatgctagt3960atgctacttg aatttaaacg tacatattta tgaagtggta tattatatat ttccagagta4020tttttatggt tcttttnnnn nnnnnnnnnn nnnnnnnnnn nncttgaagg atgaatagac4080tttccttaat tttaacatat atggtggtaa ctaaacatac acacacgtgg atatgtttca4140g g tgg gac agt aac atg tcg gca gtg atc acc gac gac gac ggt gac 4187Trp Asp Ser Asn Met Ser Ala Val Ile Thr Asp Asp Asp Gly Asp460 465 470gag gtg ttc tac acg gtg ggg atc ctg cgg tcg gcg gcg gcg gcc ggc 4235Glu Val Phe Tyr Thr Val Gly Ile Leu Arg Ser Ala Ala Ala Ala Gly475 480 485gac gtg ggg agg ctg gag gag cag aac gac gag atc ttg ggt ttc tgc 4283Asp Val Gly Arg Leu Glu Glu Gln Asn Asp Glu Ile Leu Gly Phe Cys490 495 500 505gag gtg gcc ggg ata gcc tac aag cag tac ctg cct tac tac ggc agc 4331Glu Val Ala Gly Ile Ala Tyr Lys Gln Tyr Leu Pro Tyr Tyr Gly Ser510 515 520cag gca gag tgg cag aag cgg cac ttc ggt gcc aag ctc tgg cca aga 4379Gln Ala Glu Trp Gln Lys Arg His Phe Gly Ala Lys Leu Trp Pro Arg525 530 535ttc gtg cag cgg aag agc aag tat gat cca aag gcc atc ctg tcc cgt 4427Phe Val Gln Arg Lys Ser Lys Tyr Asp Pro Lys Ala Ile Leu Ser Arg540 545 550ggc cag ggg att ttc acg tca cca ctc gca tga aatgacacat gtatgcaaat4480Gly Gln Gly Ile Phe Thr Ser Pro Leu Ala555 560gcatatctac atgcgtatat atacacgtat atatacgtat gtatgcatac acatatgggt4540gtactgtgca tacgttatag cacactgcag ctaattaagc ttgacagggg gagatcgatc4600aatggacaat gctctagtca agctaatata aataatggag tagtagtata tatgtagtgc4660gagataatta agtagtgtgt ttgcctacta aaaggagagg caaagtagta ctgtgatgca4720tgcatgccaa ctaataggtg ataagtacgt gtgtgtggcc gcatgtatga ttagaagaag4780ttggttttta attaattaat taggtcatgt atgtaaatat atagtacagt actacgtact4840actagtgtac taccagccaa tttgcatgca tgcatggatg ccttcatatg catgtcgatc4900tcaaacgtac ggcatgcttg aatgcatcat gatgcatatc tatcgtcgtc ttgtgggtgt4960
aaactaaatt aatcttagtt atatgtatta taagtttgca ata5003<210>5<211>2282<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<400>5gcaagaacac acaaattcac acacacactg acacacacaa attgataatg aagcaagagc60aggtcaggat ggcagtgctc ctcatgctca actgcttcgt caaggccacg gcgccgccgc 120catggccgcc gtcggcttcg tccgcctcct tcctcgacga cctcggcgac ctcggcatcg 180cgccgctcat ccgcgccgac gaggcggcca ccgcgcgcgc ctccgccgac tttggcaacc 240tctccgtcgc cggcgtcggg gcgcctcggc tcgccgccgc cgtgctctac ccgtcgcgcc 300ccgccgacat cgccgcgctg ctgcgcgcgt cgtgcgcacg cccggcgccg ttcgcggtgt 360ccgcgcgggg gtgtggccac tcggtgcgcg gccaggcctc cgcgcccgac ggcgtcgtcg 420tcgacatggc gtcgctcggc cgcctgcagg gcggcggcgc gcggcgcctc gccgtgtcag 480tggaggggcg gtacgtcgac gccggcggcg agcagctgtg ggtggacgtg ctgcgcgcgt 540ccatggcgca cgggctcacg ccggtgtcgt ggacagacta cctccacctc accgtcggcg 600gcacgctgtc caacgccggc atcagcggcc aggccttccg ccatggcccc cagatttcca 660acgtgctaga gctcgacgtc atcaccggtg tcggggagat ggtgacgtgc tcgaaggaga 720aggcgccgga cctgttcgac gcggtgctgg gcgggctggg gcagttcggc gtcatcacgc 780gggcgcgcat cccgctcgcg ccggcgccgg cgagggcgcg gtgggtgcgg ttcgtgtaca 840cgacggcggc ggcgatgacg gccgaccagg agcgcctcat cgccgtcgat cgcgccggcg 900gcgccggcgc ggtgggcggg ctgatggact acgtcgaggg ctcggtccac ctgaaccagg 960gcctggtcga gacctggcgc acgcagccgc agccgccttc gccgtcctcc tcctcctcct 1020catccttctt ctccgacgcc gacgaggccc gcgtcgccgc gctcgccaag gaggccggcg 1080gcgtgctgta tttcctcgag ggcgccatct acttcggcgg cgccgccggg ccgtccgccg 1140ccgacgttga caagaggatg gatgtgctgc gtcgcgagct gcggcacgag cgcgggttcg 1200tgttcgcgca ggacgtggcg tacgccgggt tcctggaccg cgtccacgac ggcgagctca 1260agctccgcgc cgcggggctc tgggacgtgc cgcacccatg gctgaacctg ttcctccccc 1320
gctccggcgt cctcgccttc gccgacggcg tcttccacgg catcctcagc cgcacccccg 1380ccatgggccc cgtcctcatc taccccatga accgcaacaa gtgggacagt aacatgtcgg 1440cagtgatcac cgacgacgac ggtgacgagg tgttctacac ggtggggatc ctgcggtcgg 1500cggcggcggc cggcgacgtg gggaggctgg aggagcagaa cgacgagatc ttgggtttct 1560gcgaggtggc cgggatagcc tacaagcagt acctgcctta ctacggcagc caggcagagt 1620ggcagaagcg gcacttcggt gccaagctct ggccaagatt cgtgcagcgg aagagcaagt 1680atgatccaaa ggccatcctg tcccgtggcc aggggatttt cacgtcacca ctcgcatgaa 1740atgacacatg tatgcaaatg catatctaca tgcgtatata tacacgtata tatacgtatg 1800tatgcataca catatgggtg tactgtgcat acgttatagc acactgcagc taattaagct 1860tgacaggggg agatcgatca atggacaatg ctctagtcaa gctaatataa ataatggagt 1920agtagtatat atgtagtgcg agataattaa gtagtgtgtt tgcctactaa aaggagaggc 1980aaagtagtac tgtgatgcat gcatgccaac taataggtga taagtacgtg tgtgtggccg 2040catgtatgat tagaagaagt tggtttttaa ttaattaatt aggtcatgta tgtaaatata 2100tagtacagta ctacgtacta ctagtgtact accagccaat ttgcatgcat gcatggatgc 2160cttcatatgc atgtcgatct caaacgtacg gcatgcttga atgcatcatg atgcatatct 2220atcgtcgtct tgtgggtgta aactaaatta atcttagtta tatgtattat aagtttgcaa 2280ta 2282<210>6<211>563<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>6Met Lys Gln Glu Gln Val Arg Met Ala Val Leu Leu Met Leu Asn Cys1 5 10 15Phe Val Lys Ala Thr Ala Pro Pro Pro Trp Pro Pro Ser Ala Ser Ser20 25 30Ala Ser Phe Leu Asp Asp Leu Gly Asp Leu Gly Ile Ala Pro Leu Ile35 40 45Arg Ala Asp Glu Ala Ala Thr Ala Arg Ala Ser Ala Asp Phe Gly Asn50 55 60Leu Ser Val Ala Gly Val Gly Ala Pro Arg Leu Ala Ala Ala Val Leu
65 70 75 80Tyr Pro Ser Arg Pro Ala Asp Ile Ala Ala Leu Leu Arg Ala Ser Cys85 90 95Ala Arg Pro Ala Pro Phe Ala Val Ser Ala Arg Gly Cys Gly His Ser100 105 110Val Arg Gly Gln Ala Ser Ala Pro Asp Gly Val Val Val Asp Met Ala115 120 125Ser Leu Gly Arg Leu Gln Gly Gly Gly Ala Arg Arg Leu Ala Val Ser130 135 140Val Glu Gly Arg Tyr Val Asp Ala Gly Gly Glu Gln Leu Trp Val Asp145 150 155 160Val Leu Arg Ala Ser Met Ala His Gly Leu Thr Pro Val Ser Trp Thr165 170 175Asp Tyr Leu His Leu Thr Val Gly Gly Thr Leu Ser Asn Ala Gly Ile180 185 190Ser Gly Gln Ala Phe Arg His Gly Pro Gln Ile Ser Asn Val Leu Glu195 200 205Leu Asp Val Ile Thr Gly Val Gly Glu Met Val Thr Cys Ser Lys Glu210 215 220Lys Ala Pro Asp Leu Phe Asp Ala Val Leu Gly Gly Leu Gly Gln Phe225 230 235 240Gly Val Ile Thr Arg Ala Arg Ile Pro Leu Ala Pro Ala Pro Ala Arg245 250 255Ala Arg Trp Val Arg Phe Val Tyr Thr Thr Ala Ala Ala Met Thr Ala260 265 270Asp Gln Glu Arg Leu Ile Ala Val Asp Arg Ala Gly Gly Ala Gly Ala275 280 285Val Gly Gly Leu Met Asp Tyr Val Glu Gly Ser Val His Leu Asn Gln290 295 300Gly Leu Val Glu Thr Trp Arg Thr Gln Pro Gln Pro Pro Ser Pro Ser305 310 315 320Ser Ser Ser Ser Ser Ser Phe Phe Ser Asp Ala Asp Glu Ala Arg Val325 330 335Ala Ala Leu Ala Lys Glu Ala Gly Gly Val Leu Tyr Phe Leu Glu Gly340 345 350
Ala Ile Tyr Phe Gly Gly Ala Ala Gly Pro Ser Ala Ala Asp Val Asp355 360 365Lys Arg Met Asp Val Leu Arg Arg Glu Leu Arg His Glu Arg Gly Phe370 375 380Val Phe Ala Gln Asp Val Ala Tyr Ala Gly Phe Leu Asp Arg Val His385 390 395 400Asp Gly Glu Leu Lys Leu Arg Ala Ala Gly Leu Trp Asp Val Pro His405 410 415Pro Trp Leu Asn Leu Phe Leu Pro Arg Ser Gly Val Leu Ala Phe Ala420 425 430Asp Gly Val Phe His Gly Ile Leu Ser Arg Thr Pro Ala Met Gly Pro435 440 445Val Leu Ile Tyr Pro Met Asn Arg Asn Lys Trp Asp Ser Asn Met Ser450 455 460Ala Val Ile Thr Asp Asp Asp Gly Asp Glu Val Phe Tyr Thr Val Gly465 470 475 480Ile Leu Arg Ser Ala Ala Ala Ala Gly Asp Val Gly Arg Leu Glu Glu485 490 495Gln Asn Asp Glu Ile Leu Gly Phe Cys Glu Val Ala Gly Ile Ala Tyr500 505 510Lys Gln Tyr Leu Pro Tyr Tyr Gly Ser Gln Ala Glu Trp Gln Lys Arg515 520 525His Phe Gly Ala Lys Leu Trp Pro Arg Phe Val Gln Arg Lys Ser Lys530 535 540Tyr Asp Pro Lys Ala Ile Leu Ser Arg Gly Gln Gly Ile Phe Thr Ser545 550 555 560Pro Leu Ala
權(quán)利要求
1.一種編碼其功能缺失導(dǎo)致植物著粒數(shù)增加的植物來(lái)源蛋白質(zhì)的DNA，其中該DNA是(a)至(d)中的任意一項(xiàng)(a)編碼包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA；(b)包括包含SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的編碼區(qū)的DNA；(c)編碼包括SEQ ID NO3的氨基酸序列的蛋白質(zhì)的DNA，其中已經(jīng)取代、缺失、添加、和/或插入了一個(gè)或多個(gè)氨基酸；以及(d)在嚴(yán)謹(jǐn)條件下與包括SEQ ID NO1或2的核苷酸序列的DNA雜交的DNA。
2.權(quán)利要求1的DNA，其中該DNA來(lái)源于水稻。
3.編碼與權(quán)利要求1或2的DNA的轉(zhuǎn)錄本互補(bǔ)的RNA的DNA。
4.編碼具有特異切割權(quán)利要求1或2的DNA轉(zhuǎn)錄本的核糖酶活性的RNA的DNA。
5.編碼通過(guò)在植物細(xì)胞中表達(dá)時(shí)的共抑制效果而抑制權(quán)利要求1或2的DNA表達(dá)的RNA的DNA。
6.包括權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)DNA的載體。
7.用權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)染的宿主細(xì)胞。
8.用權(quán)利要求6的載體轉(zhuǎn)染的植物細(xì)胞。
9.包括權(quán)利要求8的植物細(xì)胞的轉(zhuǎn)化植物。
1O.權(quán)利要求9的轉(zhuǎn)化植物的后代或克隆的轉(zhuǎn)化植物。
11.權(quán)利要求9或10的轉(zhuǎn)化植物的繁殖材料。
12.用于生產(chǎn)轉(zhuǎn)化植物的方法，其中該方法包括將權(quán)利要求1至5中任意一項(xiàng)DNA導(dǎo)入到植物細(xì)胞中，以及從所述的植物細(xì)胞再生植物體的步驟。
13.由權(quán)利要求1或2的DNA編碼的蛋白質(zhì)。
14.用于生產(chǎn)權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)的方法，其中該方法包括培養(yǎng)權(quán)利要求7的宿主細(xì)胞，以及從所述的細(xì)胞或其培養(yǎng)物上清液收集重組蛋白質(zhì)的步驟。
15.結(jié)合權(quán)利要求13的蛋白質(zhì)的抗體。
16.一種多核苷酸，其包括與SEQ ID NO1或2的核苷酸序列互補(bǔ)的至少15個(gè)連續(xù)核苷酸，或其互補(bǔ)序列。
17.用于增加植物著粒數(shù)的方法，其中該方法包括在植物體的細(xì)胞中表達(dá)權(quán)利要求3至5中任意一項(xiàng)的DNA的步驟。
18.用于改變植物著粒數(shù)的試劑，其中該試劑包括權(quán)利要求1至5的任意一項(xiàng)DNA或權(quán)利要求6的載體作為活性成分。
19.一種用于確定植物著粒數(shù)的方法，其中該方法包括下列步驟(a)從待測(cè)植物體或其再生培養(yǎng)基制備DNA樣品；(b)擴(kuò)增所述DNA樣品的相應(yīng)于權(quán)利要求1的DNA的區(qū)域；以及(c)確定所擴(kuò)增的DNA區(qū)域的核苷酸序列；其中當(dāng)該核苷酸序列編碼其功能缺失導(dǎo)致植物著粒數(shù)增加的蛋白質(zhì)時(shí)，確定該植物是具有小的著粒數(shù)的品種，而當(dāng)沒(méi)有編碼所述的蛋白質(zhì)時(shí)，確定該植物是具有大的著粒數(shù)的品種。
全文摘要
通過(guò)連鎖分析成功地分離和鑒定了調(diào)節(jié)植物著粒數(shù)(包括穎花、果實(shí)和種子)增減的基因。此外也發(fā)現(xiàn)了利用該基因增加植物的著粒數(shù)(包括穎花、果實(shí)和種子)的育種方法。本發(fā)明可用于例如培育改良的植物品種的領(lǐng)域。
文檔編號(hào)C12N5/14GK1742085SQ20038010873
公開(kāi)日2006年3月1日 申請(qǐng)日期2003年11月13日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月13日
發(fā)明者蘆苅基行, 松岡信, 林少揚(yáng), 山本敏央, 西村明日香, 高師知紀(jì) 申請(qǐng)人:本田技研工業(yè)株式會(huì)社