專利名稱：使用熒光聚合物和猝滅劑－系鏈－配體生物綴合物的生物傳感方法
本申請要求申請日為2002年11月14日的美國專利申請系列號60/426,034的優(yōu)先權(quán)，該申請全文在此通過引用并入本申請。
本申請與申請日為2001年5月8日的美國專利申請系列號09/850,074和申請日為2003年7月18日的美國專利申請系列號10/621,311相關(guān)。這些申請全文在此通過引用并入本申請。
根據(jù)Defense Advanced Research Projects Agency(DARPA)授予的MDA972-00-C-006號合同，美國政府擁有本申請已付費(fèi)的許可并在有限情況下具有要求專利權(quán)人許可他人在合理?xiàng)l件下實(shí)施發(fā)明的權(quán)利。
背景技術(shù)：
發(fā)明領(lǐng)域本發(fā)明一般涉及分子傳感器及涉及檢測分子間相互作用的方法。特別地，本發(fā)明涉及熒光聚合物復(fù)合物和在生物傳感應(yīng)用中使用該復(fù)合物的方法。
背景技術(shù)：
酶聯(lián)免疫吸附測定(即ELISA)是鑒別廣泛的蛋白質(zhì)、抗體、細(xì)胞、病毒等的存在和生物學(xué)活性而最普遍使用和公認(rèn)的技術(shù)。ELISA是一種多步驟“夾心分析方法”，其中首先將分析物生物分子與表面附著的一種抗體結(jié)合。然后將第二種抗體與該生物分子結(jié)合。在一些情況中，第二種抗體附著于隨后“產(chǎn)生”擴(kuò)增反應(yīng)的一種催化酶。在其它情況中，該第二種抗體是生物素?；目贵w以結(jié)合第三種蛋白質(zhì)(例如抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素)。這一蛋白質(zhì)附著于一種酶，以產(chǎn)生放大的比色變化的化學(xué)級聯(lián)，或者附著于一個(gè)熒光團(tuán)以進(jìn)行熒光標(biāo)記。
盡管ELISA具有廣泛應(yīng)用，但仍有許多缺點(diǎn)。例如，由于這一多步驟的方法需要精確控制試劑和顯色時(shí)間，因此其耗費(fèi)時(shí)間并趨于“假陽性”。另外，它還要求小心的洗滌以除去非特異性吸附的試劑。
熒光能量共振轉(zhuǎn)移(即FRET)技術(shù)已被用于基于聚合酶鏈反應(yīng)(PCT)的基因測序和免疫分析。FRET使用分析物生物分子的同源結(jié)合以激活在未結(jié)合狀態(tài)(off-state)下呈猝滅狀態(tài)的染料的熒光。在FRET技術(shù)的一個(gè)典型例子中，一種熒光染料與一種抗體(F-Ab)連接，并且這個(gè)二聯(lián)體被結(jié)合到一種與猝滅劑連接的抗原(Ag-Q)上。結(jié)合的復(fù)合物(F-Ab:Ag-Q)通過能量轉(zhuǎn)移猝滅(即無熒光)。在存在與Q(Ag)不相連的相同分析物抗原的情況下，Ag-Q二聯(lián)體被定量置換，如通過[Ag-Q]/[Ag]相對濃度確定的平衡結(jié)合概率確定。這將FRET技術(shù)限制為一種定量分析，其中抗原是已被充分表征的，并且在每種新情況中必須設(shè)計(jì)將抗原與Q連接起來的化學(xué)。
其它FRET底物和分析在US 6,291,201以及如下文章中被公開Anne，et al.，″High Throughput Fluorogenic Assay for Determination ofBotulinum Type B Neurotoxin Protease Activity″，AnalyticalBiochemistry，291，253-261(2001)；culmines.etal.，A Peptide BasedFluorescence Resonance Energy Transfer Assay for BacillusAnthracisLethal Factor Protease″，Proc.Natl.Acad.Scie.99，6603-6606(2002)；及Mock，et al.，″Progress in Rapid Screening of BacillusAnthracis LethalActivity Factor″，Proc.Natl.Acad.Sci.99，6527-6529(2002)。
應(yīng)用分子內(nèi)猝滅的熒光底物的其它分析在如下文章中被公開Zhong.et al.，Development of an Internally Quenched FluorescentSubstrate for Escherichia Coli Leader Peptidase″，AnalyticalBiochemistry 255，66-73(1998)；Rosse.et al.，″Rapid Identification ofSubstrates for Novel Proteases Using a Combinatorial Peptide Library″，J.Comb.Chem.，2，461-466(2000)；及Thomson et al.，″A BODIPYFluorescent Microplate Assay for Measuring Activity of Calpains andOther Proteases″，Analytical Biochemistry，279，170-178(2000)。也已經(jīng)公開了其中熒光偏振中的改變已經(jīng)測定并用于分析物量的量化分析。見例如Levine，et al.，″Measurement of Specific Protease ActivityUtilizing Fluorescence Polarization″，Analytical Biochemistry 247，83-88(1997)。也見例如Schade.et al.，″BODIPY-a-Casein，a pH-IndependentProtein Substrate for Protease Assays Using Fluorescence Polarization″，Analytical Biochemistry 243，1-7(1996)。
然而，仍需要快速和精確地檢測和量化具有高靈敏性的生物相關(guān)分子的技術(shù)。
發(fā)明概述根據(jù)本發(fā)明的第一方面，提供了一種制備用于檢測生物學(xué)識別活動(dòng)的傳感器的方法。所述方法包括將一種生物素?；臒晒饩酆衔锱c一種生物素結(jié)合蛋白在水溶液中組合以形成一種復(fù)合物，其中所述復(fù)合物包含游離的生物素結(jié)合位點(diǎn)。生物素酰化的熒光蛋白(例如藻紅蛋白或藻膽體)可以與生物素?；臒晒饩酆衔锛吧锼亟Y(jié)合蛋白組合。該復(fù)合物可以置于固體支持體(例如微球體，納米顆?；蛑?的表面上。該固體支持體可以是硅基或乳膠微球體。該固體支持體的表面可包含銨官能團(tuán)。該生物素結(jié)合蛋白可以選自由以下所組成的組抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素和中性鏈親和素(neutravidin)。
上述方法可進(jìn)一步包括向溶液中加入一種生物素酰化的生物綴合物，該生物素?；纳锞Y合物包含一種多核苷酸序列，一種肽核酸序列或一種多肽序列，其中所述生物素?；纳锞Y合物與復(fù)合物中游離的生物素結(jié)合位點(diǎn)結(jié)合。根據(jù)一個(gè)實(shí)施方案，生物素?；纳锞Y合物包含一種多核苷酸或肽核酸序列，且生物學(xué)識別活動(dòng)是生物素酰化的生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列與靶分析物的核酸雜交。根據(jù)該實(shí)施方案的方法還可包括向溶液中加入第二種生物綴合物，其包含一種猝滅劑和一種多核苷酸或肽核酸序列，其中所述猝滅劑能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅(amplified super-quenching)，其中第二種生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列能與生物素酰化的生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列雜交。第二種生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列可以與生物素酰化的生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列互補(bǔ)。
根據(jù)另一個(gè)實(shí)施方案，生物素?；纳锞Y合物包含一種多肽序列及能一種導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅的猝滅劑，生物學(xué)識別活動(dòng)是酶誘導(dǎo)的多肽序列的切割。
根據(jù)本發(fā)明的第二方面，提供了一種用于檢測生物學(xué)識別活動(dòng)的傳感器，其包含一種生物素?；臒晒饩酆衔锱c生物素結(jié)合蛋白的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物包含游離的生物素結(jié)合位點(diǎn)。該復(fù)合物可置于固體支持體的表面上(例如微球體，納米顆粒或珠)。該固體支持體可以是一種硅基或乳膠微球體。包含一種多核苷酸序列，一種肽核酸序列或一種多肽序列的生物素酰化的生物綴合物可以與該復(fù)合物結(jié)合。例如，該生物素?；纳锞Y合物可包含一種多核苷酸或肽核酸序列，生物學(xué)識別活動(dòng)可以是生物素?；纳锞Y合物的多核苷酸或肽核酸序列與靶分析物的核酸雜交?；蛘撸撋锼仵；纳锞Y合物可包含一種多肽序列和一種猝滅劑，其中所述猝滅劑能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅，其中生物學(xué)識別活動(dòng)是酶誘導(dǎo)的多肽序列的切割。該生物素結(jié)合蛋白可以是抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素或中性鏈親和素。固體支持體的表面可包含銨官能團(tuán)。該傳感器還可以包括一種生物素?；臒晒獾鞍?例如藻紅蛋白或藻膽體)，其與生物素?；臒晒饩酆衔锖蜕锼亟Y(jié)合蛋白形成一種復(fù)合物。
本發(fā)明還提供了一種傳感器，其包含置于固體支持體上的生物素?；臒晒饩酆衔?、生物素結(jié)合蛋白和生物素酰化的生物綴合物的一種復(fù)合物，其中生物素?；纳锞Y合物包含一種多核苷酸或肽核酸序列，其中生物素?；纳锞Y合物進(jìn)一步包含一種能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅的猝滅劑。根據(jù)這一實(shí)施方案，所述多核苷酸序列位于生物素?；纳锞Y合物上猝滅劑和生物素之間。本發(fā)明還提供了使用如上述傳感器來檢測樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，包括將樣品與傳感器進(jìn)行組合(例如在溶液中)。根據(jù)這一實(shí)施方案，靶分析物包含能與生物素?；纳锞Y合物的多核苷酸或肽核酸序列雜交的多核苷酸序列，并且靶分析物與生物素?；纳锞Y合物的雜交導(dǎo)致猝滅劑與固體支持體表面分離增強(qiáng)并伴隨著熒光增加。
根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，包含如上述被置于固體支持體上的熒光聚合物的所述傳感器可進(jìn)一步包含一種生物素?；纳锞Y合物，所述生物綴合物包含與系鏈(tether)上第一個(gè)和第二個(gè)位置綴合的一種配體和一種生物素組分，其中所述配體包含能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅的一種猝滅劑組分，其中所述配體能參與生物學(xué)識別活動(dòng)。根據(jù)這一實(shí)施方案，在第一個(gè)和第二個(gè)位置之間的系鏈部分具有一定長度和柔性，由此生物學(xué)識別活動(dòng)的發(fā)生導(dǎo)致猝滅劑與固體支持體表面分離并伴隨著熒光增加。該配體可包含一個(gè)多肽序列。第一個(gè)和第二個(gè)位置之間的系鏈部分可包含由如下化學(xué)式表示的一個(gè)重復(fù)單位 其中n是一個(gè)正整數(shù)。本發(fā)明還提供了一種使用上述傳感器來檢測樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量的方法。所述靶分析物可以是孢子，細(xì)胞，細(xì)菌或病毒。本發(fā)明還提供了一種用于檢測生物學(xué)識別活動(dòng)的傳感系統(tǒng)，其包含上述傳感器及第二種固體支持體，該支持體包含置于其表面上的眾多靶組分，其中配體可以與靶組分相互作用使得猝滅劑與熒光劑分離，從而增加熒光聚合物的熒光。第二種固體支持體可以是一種微球體(例如硅基或乳膠微球體)，納米顆?；蛑?。本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括將所述傳感系統(tǒng)與樣品組合，其中靶分析物可以識別配體并與之相互作用，其中靶分析物與配體的相互作用導(dǎo)致熒光降低。所述配體可包含一種多肽，并且生物學(xué)識別活動(dòng)可以是配體的多肽與包含一種多肽的靶分析物之間的相互作用。
根據(jù)本發(fā)明的第三方面，提供了一種檢測樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括將樣品與一種包含一種核苷酸序列、一種肽核酸序列或多肽序列的生物素酰化的生物綴合物及一種包含上述熒光聚合物復(fù)合物的傳感器組合。當(dāng)生物素?；纳锞Y合物包含一種多核苷酸或肽核酸序列時(shí)，所述方法可進(jìn)一步包括將所述樣品與第二種生物綴合物組合，該第二種生物綴合物包含一種猝滅劑及一種多核苷酸或肽核酸序列，其中猝滅劑能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅，且其中第二種生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列能與生物素?；纳锞Y合物的多核苷酸或肽核酸序列雜交。根據(jù)這一實(shí)施方案，靶分析物包含一種多核苷酸序列，其能與生物素酰化的生物綴合物或第二種生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列雜交。例如，第二種生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列可以與生物素酰化的生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列互補(bǔ)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，將傳感器與生物素?；纳锞Y合物組合，由此生物素?；纳锞Y合物與傳感器復(fù)合，隨后將樣品與傳感器/生物素酰化的生物綴合物復(fù)合物一起保溫，接著向保溫的樣品中加入第二種生物綴合物。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，靶分析物的核苷酸序列可包含一個(gè)雙鏈核酸。根據(jù)這個(gè)實(shí)施方案，所述方法進(jìn)一步包括在存在第二種生物綴合物的情況下將保溫的樣品加熱至足以使樣品中雙鏈的核酸解鏈的溫度；冷卻樣品以使得雙鏈體形成。樣品中存在的靶分析物與第二種生物綴合物之間的雙鏈體形成導(dǎo)致熒光增加?；蛘?，生物素?；纳锞Y合物可包含一種多肽序列和一種猝滅劑，并且該靶分析物可以是一種能切割該多肽序列的一種酶(例如β-分泌酶)。
根據(jù)本發(fā)明的第四方面，提供了一種用于檢測靶生物學(xué)物種的傳感器，其包含在其表面上包含受體的眾多配體的細(xì)菌芽孢或病毒；置于細(xì)菌芽孢或病毒表面上的熒光聚合物或熒光聚合物復(fù)合物；及眾多的生物綴合物，其包含一種與配體的受體綴合的猝滅劑，其中所述受體和配體相互作用，并且受體與配體的相互作用導(dǎo)致熒光聚合物的熒光放大的超猝滅。本發(fā)明還提供了一種檢測樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，所述方法包括將樣品與上述傳感器一起保溫，其中靶分析物識別受體并與之相互作用，并且靶分析物與受體的相互作用導(dǎo)致熒光增加。該靶分析物可以是在其表面上包含受體的眾多配體的細(xì)菌芽孢或病毒。
附圖簡述通過參考以下附圖可以更好地理解本發(fā)明。


圖1圖示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)分析，其中含有QTL的DNA被用于檢測具有與含有QTL的DNA互補(bǔ)的堿基序列的靶分析物；圖2A-2C圖示了根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)分析，其中具有一個(gè)柔性系鏈的QTL生物綴合物被用于檢測多價(jià)的分析物；圖3圖示了本發(fā)明的多價(jià)抗原珠(MAB)的合成；圖4圖示了本發(fā)明的熒光聚合物標(biāo)記的失活靶的合成與應(yīng)用；圖5表示根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案的傳感器制作的反應(yīng)方案，其中將中性鏈親和素與聚合物重復(fù)單位的混合物復(fù)合，然后所得的聚合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物通過靜電作用沉積在銨功能化的微球體的表面上；圖6表示一種用于DNA檢測的分析，其中猝滅劑標(biāo)記的靶與傳感微球體的表面上的互補(bǔ)捕獲鏈的靶相互競爭；圖7圖示的是通過各種寡核苷酸及寡核苷酸混合物猝滅PPE熒光；圖8圖示的是具有基于PNA的捕獲鏈的微球體傳感器的錯(cuò)配分析。
發(fā)明詳述US 09/850,074公開了生物綴合物，其包含與猝滅劑(Q)經(jīng)系鏈(T)連接的靶生物分子的配體(L)，所述猝滅劑與熒光聚合物(P)相結(jié)合并使其猝滅，所述文獻(xiàn)在此通過引用將其全文并入本發(fā)明中。這些生物綴合物(稱為QTL生物綴合物)利用熒光聚電解質(zhì)的超猝滅，通過例如電子轉(zhuǎn)移或能量轉(zhuǎn)移猝滅。熒光聚合物(P)可以與QTL生物綴合物形成一種結(jié)合的復(fù)合物，通常具有與所述熒光聚合物相反的電荷。QTL生物綴合物包括一種通過共價(jià)鍵系鏈與特異于特定的生物分子的配體(L)連接的猝滅劑(Q)。QTL生物綴合物的配體與生物分子的結(jié)合將QTL生物綴合物與熒光聚合物分離，或者以可易于檢測的方式修飾其猝滅，由此通過熒光改變而感應(yīng)所述生物分子。以這種方式，生物分子可在非常低的濃度檢測到。
也已經(jīng)論證了將熒光聚合物包被在支持體如乳膠或硅基珠或納米顆粒上可導(dǎo)致超猝滅增加，并由于與大分子如蛋白質(zhì)或核酸的非特異性相互作用而伴隨著熒光變化的降低。結(jié)果，設(shè)計(jì)了這樣的分析，即利用共同位于同一顆粒上的熒光聚合物和受體，由此QTL與熒光聚合物的相互作用通過QTL綴合物的L部分與特異性受體的結(jié)合而介導(dǎo)。這種類型的分析在2002年3月18日提交的美國專利申請US10/098,387中公開，該專利在此處通過引用將其全文并入本發(fā)明。這些分析典型地是競爭分析，其中分析物由表面結(jié)合受體識別的L序列組成或含有該序列。L與受體的結(jié)合因此在聚合物或聚合物集團(tuán)(polymer ensemble)中產(chǎn)生很小的或不產(chǎn)生熒光改變。然而，通過與受體結(jié)合的QTL結(jié)合導(dǎo)致熒光猝滅。
1.用于在溶液中及以位于支持體上的形式進(jìn)行傳感的預(yù)形成聚合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物如上所述，QTL-聚合物超猝滅分析已經(jīng)通過將熒光聚合物如聚陰離子聚亞苯基亞乙炔基(1) 或生物素?；木蹃啽交鶃喴胰不?2)
和一個(gè)受體共同定位于一個(gè)支持體如乳膠或硅基珠或納米顆粒上而構(gòu)建。典型地，所述受體可以是抗體、蛋白質(zhì)、寡核苷酸或其它配體。受體和/或聚合物可以通過生物素-抗生物素蛋白結(jié)合而固定在支持體上。一種生物素結(jié)合蛋白(抗抗生物素蛋白，中性鏈親和素或鏈霉抗生物素)可以在加入聚合物或受體之前與支持體共價(jià)連接。
本發(fā)明提供了另一種共同定位熒光聚合物和受體的方式，包括生物素?；臒晒饩酆衔?例如聚合物2)與生物素結(jié)合蛋白在溶液中的最初復(fù)合。聚合物2含有一些可利用的生物素，然而僅可結(jié)合這些蛋白質(zhì)的每一種所提供的4個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)中的一個(gè)或至多兩個(gè)位點(diǎn)。這部分是由于PPE聚合物的大節(jié)段的“剛性棒”性質(zhì)所致。
然而，向水溶液中的生物素結(jié)合蛋白如中性鏈親和素加入生物素?；臒晒饩酆衔锶缟鲜鼍酆衔?，導(dǎo)致了聚合物通過蛋白質(zhì)而交聯(lián)。就聚合物2而言，這種交聯(lián)伴隨著聚合物熒光的中等增加及如光散射而所顯示出的集團(tuán)大小顯著增加。根據(jù)生物素結(jié)合蛋白與聚合物的比率，以及精確的加入順序，所得生物素?；臒晒饩酆衔锖蜕锼亟Y(jié)合蛋白的集團(tuán)可含有中等數(shù)目的游離生物素結(jié)合位點(diǎn)，其可用于固定特異的生物素?；氖荏w如抗體、蛋白質(zhì)、寡核苷酸或肽。當(dāng)生物素功能化的受體含有一個(gè)猝滅劑時(shí)(作為受體的一部分或作為受體-QTL復(fù)合物)，可以發(fā)生聚合物熒光的有效猝滅。
生物素結(jié)合蛋白/生物素?；臒晒饩酆衔锛瘓F(tuán)可以包被在固體支持體上。例如，將中性鏈親和素聚合物2集團(tuán)(即1中性鏈親和素15聚合物重復(fù)單位)包被在用季銨基團(tuán)功能化的乳膠微球體上。所得微球體是高度熒光性的。這種熒光性可以通過加入生物素-猝滅劑綴合物而特異性猝滅。相反，加入不含有生物素的猝滅劑導(dǎo)致很低的非特異性猝滅。用相同組成的溶液相中性鏈親和素聚合物2集團(tuán)觀測到猝滅略微增強(qiáng)。
因此一種優(yōu)選的聚合物-生物素結(jié)合蛋白復(fù)合物提供了在溶液中或在支持體上的形式傳感應(yīng)用的基礎(chǔ)。在這兩個(gè)“平臺”中，所述復(fù)合物表現(xiàn)出了某些優(yōu)勢。首先，受體與聚合物的密切接近被確定。其次，所述集團(tuán)很少與試劑如蛋白質(zhì)、小的有機(jī)分子和無機(jī)離子非特異性地相互作用。另外，對所述分析進(jìn)行廣泛調(diào)整也是可能的。例如，對如下一或多個(gè)參數(shù)可以改變生物素結(jié)合蛋白與生物素?；木酆衔锏谋嚷?、聚合物上生物素密度、加入順序、或者所使用的特異性生物素結(jié)合蛋白。以這種方式，所述分析可以適合特定應(yīng)用。另外，復(fù)合物的總電荷可以通過改變聚合物上帶電側(cè)鏈基團(tuán)或者通過改變生物素結(jié)合蛋白而調(diào)整。因此可以選擇復(fù)合物以增強(qiáng)或消除與其它蛋白質(zhì)的非特異性結(jié)合，與其它生物分子(例如DNA或PNA)的非特異性結(jié)合，或者與帶電或中性的表面的非特異性結(jié)合。
2.基于熒光聚合物超猝滅的對單鏈和雙鏈DNA的分析用熒光聚合電解質(zhì)進(jìn)行感應(yīng)可用于寡核苷酸-寡核苷酸識別。例如，最近已經(jīng)報(bào)道了基于QTL的單鏈DNA的感應(yīng)[Kushon，etal.，Langmuir，18，7245-7249(2002)]。在最簡單的情況中，單鏈“靶”DNA序列可以與互補(bǔ)的“捕獲”單鏈結(jié)合，由此調(diào)節(jié)(猝滅或增強(qiáng))聚合物或聚合物集團(tuán)的熒光。其中一個(gè)方法包括使用與“靶”序列互補(bǔ)的生物素?；腄NA捕獲鏈。已經(jīng)公開了在存在未知量的靶分析物的情況下，使用已知量的猝滅劑標(biāo)記的靶(DNA-QTL)的競爭分析。在這些分析中，生物素?；牟东@鏈與含有熒光聚合電解質(zhì)和生物素聚合蛋白如抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素或中性鏈親和素的珠支持體結(jié)合。生物素?；牟东@鏈與珠的結(jié)合(通過生物素-抗生物素蛋白結(jié)合)導(dǎo)致很少的聚合物熒光改變或無改變。另外，生物素?；牟东@鏈-靶分析物雙鏈體與珠的結(jié)合導(dǎo)致很少的熒光改變或無改變。然而，生物素酰化的捕獲鏈-DNA-QTL雙鏈體與具有先結(jié)合的生物素?；牟东@鏈的珠或者DNA-QTL的結(jié)合導(dǎo)致聚合物熒光強(qiáng)猝滅。
DNA-QTL與靶分析物之間對預(yù)先與珠結(jié)合的生物素?；牟东@鏈的直接競爭導(dǎo)致低檢測靈敏度，這是因?yàn)镈NA-QTL與捕獲鏈的(動(dòng)力學(xué))結(jié)合(相比于未標(biāo)記的分析物)更快。然而，分析物與珠結(jié)合的捕獲鏈的逐步結(jié)合及隨后加入DNA-QTL提供了一種靈敏而簡便的定量分析方法。通過預(yù)先保溫生物素酰化的捕獲鏈、DNA-QTL及分析物單鏈DNA，及隨后將該混合物暴露于熒光聚合物包被的珠，也獲得了一種相似的靈敏度分析。對于后兩種分析，熒光水平隨著單鏈分析物DNA的濃度增加而增加。
上述分析應(yīng)用單鏈DNA及包括使用含有與靶分析物相同堿基序列的DNA-QTL。另一種分析模式示于圖1。這個(gè)分析模式包括使用具有與靶分析物互補(bǔ)的堿基序列的DNA-QTL。
如圖1所示，能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移猝滅劑可以與所述鏈的一個(gè)末端共價(jià)結(jié)合以產(chǎn)生DNA-QTL。也如圖1所示，具有與靶分析物相同序列的生物素酰化的鏈及在所述鏈的一個(gè)末端上的生物素可用作捕獲鏈。生物素?；牟东@鏈與熒光聚合物包被的珠的結(jié)合導(dǎo)致聚合物的熒光水平很少改變或無改變。然而，DNA-QTL與珠結(jié)合的捕獲鏈之間的雙鏈體形成導(dǎo)致聚合物熒光猝滅，這是因?yàn)榫酆衔锱cDNA-QTL上猝滅劑之間的緊密結(jié)合所致。
為完成單鏈分析物DNA的分析，分析物(未知水平)和DNA-QTL可以與含有生物素酰化的靶的珠懸浮液混和。靶分析物與DNA-QTL之間的雙鏈體形成除去了“游離”DNA-QTL，從而抑制了在沒有靶的情況中將會發(fā)生的聚合物的猝滅。以這種方式，可以提供一種簡便而相似的單鏈分析物的定量分析。
上述分析材料也可以提供一種簡便而相似的模式以讀出以雙鏈體存在的靶分析物。例如，含有分析物及具有與分析物互補(bǔ)的堿基序列的雙鏈體DNA-QTL的樣品可以加至含有共定位的熒光聚合物和生物素?；牟东@試劑的固體支持體(例如珠的懸浮液)，隨后將溫度加熱至足以使雙鏈體“解鏈”的溫度。這在將混合物恢復(fù)至環(huán)境溫度之后，導(dǎo)致DNA-QTL與單鏈分析物配對及與樣品中靶鏈的水平成比例的熒光猝滅的減弱。
與那些先前報(bào)道的及上述相似的分析可以使用肽核酸的生物素酰化的肽核酸捕獲鏈(即生物素?；腜NA)構(gòu)建。生物素?；腜NA在與靶分析物DNA或DNA-QTL的互補(bǔ)序列的配對中呈現(xiàn)相似的選擇性，但提供了更強(qiáng)的雙鏈體，并因此在單鏈靶分析物分析中可提供更高的靈敏性。生物素?；腜NA作為捕獲鏈的一個(gè)優(yōu)勢是DNA-PNA結(jié)合的更高強(qiáng)度提供了對通過鏈入侵而形成的雙鏈靶在環(huán)境溫度進(jìn)行相似分析的基礎(chǔ)。
另一種DNA檢測方法包括使用生物素?；腄NA-QTL。將綴合物中生物素和猝滅劑置于相反端。當(dāng)暴露于攜帶生物素結(jié)合蛋白的聚合物包被的微球體時(shí)，生物素-DNA-QTL變?yōu)橥ㄟ^生物素而附于表面。另外，由于應(yīng)用的猝滅劑的普遍(general)疏水性，猝滅劑標(biāo)記的末端折疊回表面上，使得猝滅劑猝滅表面上的聚合物。然而，在存在靶鏈的情況中，生物素-DNA-QTL雜交成DNA雙鏈體。已知DNA雙鏈體與單鏈DNA相比相對剛性。因此，雙鏈體的形成可導(dǎo)致猝滅劑與表面的距離增加，因?yàn)镈NA易于與靶雜交而導(dǎo)致生物素-DNA-QTL不能折疊回到表面上。結(jié)果，猝滅水平可被降低。
3.基于使用長的柔性系鏈(例如親水性聚合的系鏈)的傳感模式如上所述，基于熒光聚合物的猝滅/非猝滅聚合物或聚合物集團(tuán)的生物傳感中使用的QTL綴合物典型地由三種成分組成猝滅劑(Q)、系鏈(T)及配體或受體(L)。超猝滅的程度，無論通過能量轉(zhuǎn)移還是電子轉(zhuǎn)移，均依賴于猝滅劑與熒光聚合物或聚合物集團(tuán)的接近度。被感應(yīng)的生物學(xué)識別活動(dòng)的靈敏度典型地依賴于識別活動(dòng)與猝滅劑和聚合物集團(tuán)分離距離的變化之間的聯(lián)系。
在最初的基于聚合物/QTL超猝滅相互作用的生物傳感方法中，聚合物(于溶液中，或者與支持體如微球體或納米顆粒結(jié)合)與QTL通過非特異性相互作用而結(jié)合(通常是Coulombic引力和疏水性相互作用的組合)。在熒光“turn-off”分析中，在生物學(xué)識別活動(dòng)中釋放的QTL與聚合物的結(jié)合導(dǎo)致熒光猝滅?；蛘?，QTL與特異性受體的結(jié)合可引起預(yù)結(jié)合的聚合物和QTL分離，并導(dǎo)致熒光“turn-on”傳感。這個(gè)分析平臺根據(jù)靶分析物及合成的QTL而可用于直接分析及競爭分析中。
在另一種傳感平臺中，熒光聚合物和受體(即QTL生物綴合物的配體L的受體)共同位于固體支持體如微米大小的或亞微米大小的乳膠珠、硅基微球體、納米顆?；虮砻嫔?。在這種情況中，QTL與受體的特異性結(jié)合導(dǎo)致熒光猝滅，而QTL的釋放導(dǎo)致熒光的出現(xiàn)(turnon)。在上面討論的兩種傳感方案中，當(dāng)QTL與聚合物或聚合物集團(tuán)結(jié)合時(shí)，QTL綴合物通常應(yīng)用最小長度的系鏈以提供熒光聚合物與猝滅劑和QTL的配體部分的緊密接近。
另一種實(shí)施方案在QTL綴合物中摻入了長的柔性系鏈。如圖2A-2C所示，將生物素“連接器”與攜帶猝滅劑的識別分子分開的“柔性”系鏈的構(gòu)建產(chǎn)生一種QTL，其可以與含有生物素結(jié)合蛋白和熒光聚合物的珠“平臺”結(jié)合。
如圖2A-2C所示，用熒光聚合物包被的并具有可利用的抗生物素蛋白或鏈霉抗生物素受體位點(diǎn)的固體支持體(顯示為珠)，可以與具有長的柔性生物素酰化的系鏈的猝滅劑復(fù)合。結(jié)果熒光被猝滅(圖2B)。然而，結(jié)合識別分子的分析物的存在可以從熒光支持體中除去猝滅劑，導(dǎo)致熒光增加(圖2C)。
柔性系鏈可以許多構(gòu)象存在。在一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案中，柔性系鏈由聚乙二醇(即PEG)線性鏈組成，如圖2A所示。在一個(gè)實(shí)施例中，生物素與受體通過一個(gè)具有～75個(gè)重復(fù)單位的PEG系鏈分開。如果這個(gè)鏈?zhǔn)浅浞稚煺沟臉?gòu)象，則生物素連接器與受體之間的距離是～278埃。
在水介質(zhì)中，PEG鏈應(yīng)略微折疊或者處于折疊或卷曲狀態(tài)，使得猝滅劑標(biāo)記的受體可以與珠結(jié)合的熒光聚合物相對密切接近。這可以引起來自(在珠的表面上)相對遠(yuǎn)離QTL的生物素結(jié)合的生物素結(jié)合蛋白位點(diǎn)的聚合物區(qū)域的熒光猝滅。鏈末端的猝滅劑-受體與表面上的熒光聚合物之間的相互作用程度可以通過改變表面及猝滅劑-受體上的電荷，通過改變猝滅劑-受體的疏水性，或者通過向懸浮液中加入試劑進(jìn)行調(diào)節(jié)。
優(yōu)選的是柔性鏈足夠長，從而當(dāng)其從表面充分伸展出時(shí)，猝滅劑標(biāo)記的受體與聚合物相距太遠(yuǎn)以至于不能顯著使其猝滅。由于珠表面上受體-猝滅劑與熒光聚合物之間的結(jié)合弱，因此加入大的分析物可導(dǎo)致受體-猝滅劑被除去及PEG伸展至聚合物的猝滅半徑外的距離。對于大的多價(jià)分析物，傳感可以通過從同一或多個(gè)珠上除去多個(gè)受體-猝滅劑而放大。因此這個(gè)分析模式特別適于相對大的分析物如孢子、細(xì)胞、細(xì)菌或病毒。
4.作為QTL生物傳感的基礎(chǔ)的多價(jià)抗原珠根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，可以使用同樣的珠和具有上述長的柔性系鏈的綴合物進(jìn)行分析，其進(jìn)一步包含在存在靶蛋白分析物的情況中不同地相互作用的兩種成分。在這種情況中，所述分析特別適于不激發(fā)在上述3中所說的應(yīng)答但可結(jié)合受體-猝滅劑集團(tuán)而不導(dǎo)致其從熒光聚合物中除去的小的蛋白質(zhì)分析物。在這種情況中，成分之一是含有上述3中所述生物素結(jié)合蛋白和生物素-柔性系鏈-受體-猝滅劑“QTL成分”的熒光聚合物包被的珠。第二種成分可以是熒光聚合物珠或微球體，其表面被識別受體的靶抗原的多個(gè)拷貝“裝飾”(即“多價(jià)抗原珠”或MVAB)。MVAB如圖3所示。
如圖3所示，生物素酰化的抗原可以與用生物素結(jié)合蛋白功能化的聚合物珠復(fù)合以形成本發(fā)明的多價(jià)抗原珠。
將多價(jià)抗原珠加入含有生物素-柔性系鏈-受體-猝滅劑的珠的懸浮液中，通過從珠的表面除去猝滅劑-受體而導(dǎo)致從聚合物中開始發(fā)出熒光。隨后加入靶分析物通過競爭受體及置換MVAB而引起熒光猝滅。這個(gè)分析可以直接競爭方式進(jìn)行，其中向含有熒光聚合物的珠懸浮液中同時(shí)加入已知量的MVAB和未知量的靶蛋白質(zhì)分析物。熒光猝滅的水平提供了分析物濃度的直接量度。這個(gè)分析也可以作為置換競爭分析而進(jìn)行，這是通過用靶分析物隨后用MVAB相繼處理熒光聚合物-受體包被的珠進(jìn)行，或者反之。
5.通過熒光聚合物或聚合物-集團(tuán)標(biāo)記的靶的QTL傳感大的和強(qiáng)壯的生物學(xué)物種如細(xì)菌芽孢和病毒在其由抗原性和化學(xué)反應(yīng)性位點(diǎn)組成的表面上具有重復(fù)模式，它們提供了另一種聚合物超猝滅分析。如圖4所示，這個(gè)類型的一個(gè)失活的靶可以被活化以共價(jià)連接于或以其它方式附著于熒光聚合物或熒光聚合物集團(tuán)的表面。
如圖4所示，熒光聚合物可以共價(jià)連接于一個(gè)失活的靶(例如細(xì)菌芽孢)以形成功能化的失活的靶。一個(gè)熒光芽孢如圖4所示。附著水平可以被控制，由此受體與靶的結(jié)合位點(diǎn)保持易接近。
如圖4所示，功能化的失活的靶(即熒光芽孢)是高度熒光的。加入受體-猝滅劑QTL生物綴合物(例如該受體可以是抗體、抗體片段或其它結(jié)合試劑如肽或其它小分子結(jié)合劑)，引起與熒光靶的結(jié)合，同時(shí)猝滅其熒光。如圖4所示，每個(gè)被標(biāo)記的靶均可以接受若干受體-猝滅劑綴合物的分子。也如圖4所示，加入未標(biāo)記的靶導(dǎo)致受體結(jié)合位點(diǎn)的“稀釋”及受體-猝滅劑綴合物從熒光標(biāo)記的靶中除去。結(jié)果，可以觀測到熒光增加。
上述分析的靈敏性可以通過調(diào)節(jié)所述靶上熒光聚合物的包被水平，調(diào)整綴合物的結(jié)構(gòu)及其對被標(biāo)記的和未被標(biāo)記的靶的親和性而調(diào)整。如一些先前的QTL聚合物超猝滅分析所表明，實(shí)際的競爭可以以若干不同的模式進(jìn)行，從預(yù)先保溫標(biāo)記的靶與猝滅劑-結(jié)合劑QTL到直接混和QTL、靶和被標(biāo)記的靶。
用于在溶液中及以在支持體上的形式進(jìn)行傳感的預(yù)形成聚合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物實(shí)施例1在溶液中傳感的聚合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物的制備一種QTL溶液傳感器(傳感器SS)按如下制備將56.5nmol的Avidin(生物素結(jié)合蛋白，BBP)和848nmol的生物素?；腜PE聚合物(1)混合，總體積為11.3mL，并在CRT保溫24小時(shí)。聚合物與BBP通過生物素-抗生物素蛋白相互作用彼此組合以形成穩(wěn)定的整體。由此所制備的溶液傳感器在每次實(shí)驗(yàn)開始時(shí)用緩沖液適當(dāng)稀釋。聚合物(1)的結(jié)構(gòu)如下所示
聚合物1的結(jié)構(gòu)實(shí)施例2在固體-溶液界面?zhèn)鞲械念A(yù)形成蛋白質(zhì)-聚合物復(fù)合物的調(diào)試在這個(gè)實(shí)施例中，通過兩個(gè)步驟程序?qū)⒕酆衔?蛋白質(zhì)集團(tuán)包被在季銨官能化的直徑為0.55微米的聚苯乙烯微球體(MS)上(來自Interfacial Dynamics Corporation)。在第一個(gè)步驟中，將于溶液中的預(yù)定量的聚合物(1)加入中性鏈親和素(另一種BBP)溶液中，以便聚合物重復(fù)單位(PRU)與BBP的最終比率為5∶1。將這個(gè)溶液在環(huán)境溫度條件下保溫30分鐘。在第二個(gè)步驟中，將聚合物/蛋白質(zhì)混合物加入聚苯乙烯微球體中并在pH＝7保溫2小時(shí)，然后滲濾并置換入磷酸鹽緩沖鹽水中。應(yīng)用示差熒光分光鏡以量化聚合物和蛋白質(zhì)包被密度。
對于PPE-B估計(jì)的聚合物包被密度為4.75×106PRU/MS，估計(jì)的蛋白質(zhì)包被密度為9.5×105中性鏈親和素/MS?；诰酆衔?蛋白質(zhì)混合物在微球體表面上的包被，確定球體具有～1.3×105個(gè)生物素結(jié)合位點(diǎn)/球體，這從應(yīng)用熒光素標(biāo)記的生物素衍生物的結(jié)合實(shí)驗(yàn)中確定。
圖5表示的是上述傳感器制作的反應(yīng)方案，其中將中性鏈親和素與熒光聚合物的混合物復(fù)合，并將所得復(fù)合物包被于固體支持體上。如上所述，聚合物重復(fù)單位與中性鏈親和素的比率可以是5∶1。如圖5所示，該復(fù)合物可以通過靜電作用而置于銨官能化的微球體的表面上。
實(shí)施例3使用如實(shí)施例1中制備的QTL溶液傳感器(傳感器SS)對于酶活性的檢測(sensing)向384孔平板中存在于分析緩沖液中的5μL的400nM BSEC-1(結(jié)構(gòu)如下所示)溶液中加入溶解于5μL分析緩沖液中的30ng β-分泌酶。BSEC-1具有如下所示的肽結(jié)構(gòu)(QSY7)-T-E-E-I-S-E-V-N-L-D-A-E-F-(K-生物素)-OH SEQ IDNO1其中“QSY7”和“生物素”如下式所示
一式三份制備混合物并在CRT保溫30分鐘。對照孔僅含有肽而沒有酶。保溫后，將上述溶液傳感器的100倍稀釋液以20μL加入每個(gè)孔中。將平板在微平板讀數(shù)器內(nèi)部搖動(dòng)，并通過使用截?cái)嘀禐?75nm的濾膜在440nm激發(fā)聚合物并在530nm測定發(fā)射強(qiáng)度而對孔加以探測。對照孔的平均RFU值為5,400±200，含有酶的樣品孔的平均RFU值為8,350±200。熒光差異是酶活性的量度標(biāo)準(zhǔn)。
盡管上文公開了BSEC-1，但其它多肽也可用于β-分泌酶活性分析中。例如，根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，BSEC-3可用于β-分泌酶活性分析中。BSEC-3具有如下所示的多肽結(jié)構(gòu)(AZO)-T-E-E-I-S-E-V-N-L-D-A-E-F-(K-生物素)-OH SEQ ID NO2在上述肽結(jié)構(gòu)中，“QSY7”和“生物素”如上述闡明，“AZO”具有下式表示的結(jié)構(gòu) 實(shí)施例4使用可與聚合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物復(fù)合的生物素-R-藻紅蛋白，利用BBP上的額外的生物素結(jié)合位點(diǎn)進(jìn)行分析實(shí)施例3的分析通過摻加一種如實(shí)施例1所述的QTL溶液傳感器及少量的生物素-R-藻紅蛋白(BRPE)而改良。所得溶液傳感器(傳感器YY)是在每次實(shí)驗(yàn)的開始通過保溫“傳感器SS”的母液(masterstock)的200倍稀釋液和BRPE而制成，兩者比率為后者在40μL混合物中為250fmol。向于分析緩沖液中的5μl，300nM的BSEC-3溶液中加入于5μL分析緩沖液中的30ngβ-分泌酶。BSEC-3具有上述多肽結(jié)構(gòu)。將對照和樣品混合物在CRT保溫30分鐘后，向每個(gè)孔中加入40μL摻加的溶液傳感器(傳感器YY)。將平板在平板讀數(shù)器內(nèi)部搖動(dòng)，并通過使用截?cái)嘀禐?75nm(cut-off)的濾膜在440nm處激發(fā)聚合物并在530nm處測定發(fā)射密度而對孔的熒光強(qiáng)度加以探查。對照孔的平均RFU值為5,200±200，含有酶的樣品孔的平均RFU值為14,500±200。觀測到的差異是酶活性的量度標(biāo)準(zhǔn)。
實(shí)施例5基于熒光聚合物超猝滅對單鏈和雙鏈DNA進(jìn)行分析以下數(shù)據(jù)論證了QTL分析對DNA檢測的特異性。所用方法包括猝滅劑標(biāo)記的靶與傳感微球體表面上的互補(bǔ)捕獲鏈的靶的競爭。
圖7圖示的是通過各種寡核苷酸及寡核苷酸混合物對PPE熒光的猝滅。從圖7可以看出，由于DNA-QTL與微球體表面的非特異性相互作用而觀測到很低的猝滅。相反，DNA-QTL綴合物與捕獲鏈的特異性相互作用導(dǎo)致猝滅顯著高于上述非特異性猝滅。所用的捕獲鏈(即ALF-捕獲鏈，結(jié)構(gòu)在下面展示)是生物素?；腄NA捕獲鏈，其攜帶有與編碼炭疽熱致死因子(ALF)的序列的一個(gè)區(qū)域互補(bǔ)的一個(gè)序列。
使用17-mer和20-mer DNA-QTL，結(jié)果示于圖7。圖7所示的所有實(shí)驗(yàn)均是在25℃，在96孔平板中進(jìn)行(200mL Vt/孔)。在每種情況中，均加入20pmole的寡核苷酸或寡核苷酸混合物。
圖7中所述多肽如下ALF-捕獲鏈5′-生物素-TAA ATA CCA TTA AAA ATG CA-3′SEQ ID NO3ALF-靶5′-TGC ATT TTT AAT GGT ATT TA-3′SEQ ID NO4DNA-QTL(20-mer)5′-TGC ATT TTT AAT GGT ATT TA-QSY7-3′SEQ ID NO5DNA-QTL(17-mer)
5′-ATT TTT AAT GGT ATT TA-QSY7-3′SEQ ID NO6其中“生物素”和“QSY7”如上述被定義。非互補(bǔ)的DNA寡核苷酸在圖7中以NC表示。
從圖7中可以看出，ALF-捕獲鏈和DNA-QTL的存在導(dǎo)致猝滅顯著增加。這種猝滅的增加是DNA-QTL與ALF-捕獲鏈的雜交的結(jié)果。另外，生物素酰化的ALF-捕獲鏈與熒光聚合物和生物素結(jié)合蛋白在微球體表面上形成一種復(fù)合物。DNA-QTL與ALF-捕獲鏈雜交，從而使得猝滅劑與熒光聚合物緊密接近，這導(dǎo)致放大的超猝滅。
實(shí)施例6在支持體上的聚合物-蛋白質(zhì)復(fù)合物在檢測單核苷酸DNA錯(cuò)配中的應(yīng)用以下實(shí)施例論證了一種傳感器(例如實(shí)施例2所述的傳感器)可用于檢測甚至單核苷酸的DNA錯(cuò)配。這個(gè)實(shí)施例中使用的方案包括猝滅劑標(biāo)記的靶與傳感微球體表面上互補(bǔ)捕獲鏈的靶的競爭。
圖8圖示的是用具有基于PNA的捕獲鏈(表示為PNA-Cap)的微球體傳感器的錯(cuò)配分析，所述捕獲鏈具有如下結(jié)構(gòu)。實(shí)驗(yàn)在40℃，孔總體積200μl的條件下進(jìn)行。
上述實(shí)驗(yàn)中使用的及圖8所示多肽如下闡明ALF靶5′-TGC ATT TTT AAT GGT ATT TA-3′SEQ ID NO7G-T錯(cuò)配5′-TGC ATT TTT GAT GGT ATT TA-3′SEQ ID NO8T-T錯(cuò)配5′-TGC ATT TTT TAT GGT ATT TA-3′SEQ ID NO9C-T錯(cuò)配5′-TGC ATT TTT CAT GGTATT TA-3′SEQ ID NO10雙錯(cuò)配
5′-TGC ATA TTT AATGGA ATT TA-3′SEQ lD NO11DNA-QTL5′-ATT TTT AAT GGT ATT TA-QSY7-3′SEQ ID NO12PNA-捕獲鏈生物素-TAA ATA CCA TTAAAA-Lys-NH2SEQ ID NO13上式中，“生物素”和“QSY7”如上述定義。
從圖8可以看出，對于除了AA雙錯(cuò)配靶之外的所有靶都觀測到隨著靶的量的增加而相對熒光增加。然而，隨著靶的量的增加而觀測到的增加的熒光量對于完全互補(bǔ)的靶而言更高。
固體支持體可以從適用于生物分析的任何材料制備。固體支持體也可以是任何大小、形狀和形式的。制備固體支持體的材料及固體支持體的大小、形狀和形式可以基于所進(jìn)行的分析的要求而變化。固體支持體例如包括但不限于微球體、納米顆粒和珠。例如，硅基或乳膠微球體可用作固體支持體。
固體支持體的表面可包含官能團(tuán)。固體支持體可從包含官能團(tuán)的材料中制備，或者可以采用本領(lǐng)域公認(rèn)的技術(shù)對不含有這種基團(tuán)的固體支持體的表面官能化以含有這種基團(tuán)。如上所述，固體支持體的表面可包含銨官能團(tuán)(例如固體支持體的表面可以被官能化以包含銨官能團(tuán))。固體支持體表面也可以包含其它官能團(tuán)或被官能化以使其包含其它官能團(tuán)，這些官能團(tuán)包括但不限于帶電反應(yīng)性基團(tuán)、中性反應(yīng)性基團(tuán)、及羧基反應(yīng)性基團(tuán)。
在復(fù)合物中使用的熒光聚合物可以是一種綴合聚合物，該綴合聚合物是中性的、帶正電荷或負(fù)電荷的，或者是兼性離子型的。熒光聚合物也可以是一種包含具有懸垂的熒光染料的未綴合主鏈的側(cè)鏈聚合物，，呈現(xiàn)J-型聚集行為。熒光聚合物的結(jié)構(gòu)例如下式所示
可以吸收熒光聚合物激發(fā)的輻射能以猝滅熒光的任何組分均可以用作猝滅劑。猝滅劑例如包括但不限于如下種類中性、正電荷或負(fù)電荷或兼性離子、非熒光或熒光的、有機(jī)、無機(jī)、有機(jī)金屬、生物或聚合的、或者能量轉(zhuǎn)移或電子轉(zhuǎn)移的種類。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，猝滅劑是一種非熒光性的小分子染料如上述的QSY-7或Azo染料。根據(jù)本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案，猝滅劑可以擴(kuò)大熒光聚合物的猝滅(即超猝滅)。根據(jù)本發(fā)明的另一個(gè)實(shí)施方案，猝滅劑可以作為熒光再次發(fā)射，熒光是從熒光劑吸收的輻射能。
熒光聚合物復(fù)合物可進(jìn)一步包含一種生物素?；臒晒獾鞍?。該生物素酰化的熒光蛋白可結(jié)合到生物素結(jié)合蛋白的游離生物素結(jié)合位點(diǎn)。熒光蛋白例如包括但不限于藻紅蛋白和藻膽體。例如，生物素?；臒晒獾鞍卓梢允巧锼仵；腞-藻紅蛋白(BRPE)。在存在熒光蛋白的情況下，熒光聚合物的激發(fā)的生色團(tuán)可以將其能量轉(zhuǎn)移至復(fù)合物中的熒光蛋白分子。然后熒光蛋白分子可更有效地再次發(fā)射這一能量。例如，包含BPRE的熒光聚合物復(fù)合物的應(yīng)用可產(chǎn)生一種明顯的紅移的熒光信號。然后當(dāng)包含猝滅劑的生物綴合物與復(fù)合物結(jié)合時(shí)，來自復(fù)合物的熒光發(fā)射然后可以被猝滅(例如，當(dāng)包含猝滅劑的生物素?；纳锞Y合物與復(fù)合物結(jié)合時(shí)或當(dāng)包含多核苷酸或肽核酸序列及猝滅劑的第二種生物綴合物與和復(fù)合物結(jié)合的捕獲鏈雜交時(shí))。
前面的說明書教導(dǎo)了本發(fā)明的原理，以提供實(shí)施例的方式加以說明，通過閱讀本發(fā)明的公開內(nèi)容本領(lǐng)域技術(shù)人員將會意識到在不偏離本發(fā)明真正范圍的前提下，可以對本發(fā)明在形式和細(xì)節(jié)上加以各種改變。
權(quán)利要求
1.一種制備檢測生物學(xué)識別活動(dòng)的傳感器的方法，所述方法包括將一種生物素?；臒晒饩酆衔锱c一種生物素結(jié)合蛋白在水溶液中組合以形成一種復(fù)合物，其中所述復(fù)合物包含游離的生物素結(jié)合位點(diǎn)。
2.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將一種生物素?；臒晒獾鞍着c所述生物素酰化的熒光聚合物及生物素結(jié)合蛋白組合。
3.權(quán)利要求2的方法，其中所述熒光蛋白是藻紅蛋白或藻膽體。
4.權(quán)利要求1的方法，其進(jìn)一步包括將該復(fù)合物置于固體支持體的表面上。
5.權(quán)利要求1的方法，其中所述熒光聚合物包含一個(gè)由如下通式表示的重復(fù)單位 其中n是一個(gè)正整數(shù)；其中取代基“R”由下式表示 和/或由下式表示
6.權(quán)利要求4的方法，其中所述固體支持體包含微球體，納米顆?；蛑椤?br> 7.權(quán)利要求4的方法，其中固體支持體的表面包含一個(gè)選自由以下所組成的組的官能團(tuán)銨官能團(tuán)，羧基官能團(tuán)，帶電反應(yīng)性基團(tuán)，及中性反應(yīng)性基團(tuán)。
8.權(quán)利要求1的方法，其中生物素結(jié)合蛋白選自由以下所組成的組抗生物素蛋白，鏈霉抗生物素和中性鏈親和素。
9.權(quán)利要求1的方法，所述方法進(jìn)一步包括向溶液中加入一種包含一種核苷酸序列、一種肽核酸序列或一種多肽序列的生物素?；纳锞Y合物，其中所述生物素?；纳锞Y合物與該復(fù)合物結(jié)合。
10.權(quán)利要求9的方法，其中所述生物素?；纳锞Y合物包含一種多核苷酸或肽核酸序列，且其中生物學(xué)識別活動(dòng)是生物素?；纳锞Y合物的多核苷酸序列或肽核酸與靶分析物的核酸雜交。
11.權(quán)利要求9的方法，其中所述生物素?；纳锞Y合物包含一種多肽序列和一種猝滅劑，其中猝滅劑能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅，且其中生物學(xué)識別活動(dòng)是酶誘導(dǎo)的多肽序列的切割。
12.權(quán)利要求10的方法，其進(jìn)一步包括向溶液中加入包含一種猝滅劑和一種多核苷酸或肽核酸序列的第二種生物綴合物，其中所述猝滅劑能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅，且其中第二種生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列能與生物素?；纳锞Y合物的多核苷酸或肽核酸序列雜交。
13.權(quán)利要求12的方法，其中第二種生物綴合物的多核苷酸序列或肽核酸序列與生物素?；纳锞Y合物的多核苷酸或肽核酸序列互補(bǔ)。
14.權(quán)利要求11的方法，其中所述猝滅劑具有如下式所示的結(jié)構(gòu) 或具有如下式所示的結(jié)構(gòu)
15.權(quán)利要求12的方法，其中所述猝滅劑具有如下式所示的結(jié)構(gòu) 或具有如下式所示的結(jié)構(gòu)
16.一種檢測生物學(xué)識別活動(dòng)的傳感器，其包含一種生物素?；臒晒饩酆衔锖鸵环N生物素結(jié)合蛋白的復(fù)合物，其中所述復(fù)合物包含游離的生物素結(jié)合位點(diǎn)。
17.權(quán)利要求16的傳感器，其進(jìn)一步包含一種固體支持體，其中所述復(fù)合物置于該固體支持體的表面上。
18.權(quán)利要求16的傳感器，其進(jìn)一步包含一種包含一種多核苷酸序列、一種肽核酸序列或多肽序列的生物素酰化的生物綴合物；其中所述生物素?；纳锞Y合物與該復(fù)合物結(jié)合。
19.權(quán)利要求18的傳感器，其中生物素酰化的生物綴合物包含一種多核苷酸序列，且其中生物學(xué)識別活動(dòng)是生物素?；纳锞Y合物的多核苷酸或肽核酸序列與靶分析物的核酸雜交。
20.權(quán)利要求18的傳感器，其中生物素酰化的生物綴合物包含一種多肽序列和一種猝滅劑，其中所述猝滅劑能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅，且其中的生物學(xué)識別活動(dòng)是酶誘導(dǎo)的多肽序列的切割。
21.權(quán)利要求20的傳感器，其中所述猝滅劑具有如下式所示的結(jié)構(gòu) 或具有如下式所示的結(jié)構(gòu)
22.權(quán)利要求16的傳感器，其中所述生物素結(jié)合蛋白選自由以下所組成的組抗生物素蛋白、鏈霉抗生物素和中性鏈親和素。
23.權(quán)利要求17的傳感器，其中所述固體支持體包含微球體、納米顆?；蛑?。
24.權(quán)利要求17的傳感器，其中所述固體支持體的表面包含一個(gè)選自由以下所組成的組的官能團(tuán)銨官能團(tuán)、羧基官能團(tuán)、帶電反應(yīng)性基團(tuán)及中性反應(yīng)性基團(tuán)。
25.權(quán)利要求17的傳感器，其中所述復(fù)合物進(jìn)一步包含一種生物素?；纳锞Y合物，其包含與系鏈的第一個(gè)和第二個(gè)位置綴合的一個(gè)配體和一個(gè)生物素組分；其中所述配體包含一個(gè)猝滅劑組分；其中所述猝滅劑組分能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅；其中所述配體能參與一種生物學(xué)識別活動(dòng)；及其中第一個(gè)和第二個(gè)位置之間的系鏈部分有一定長度和柔性，由此生物學(xué)識別活動(dòng)的發(fā)生導(dǎo)致猝滅劑從固體支持體表面上分離并伴隨著熒光增加。
26.權(quán)利要求25的傳感器，其中所述配體包含一個(gè)多肽序列。
27.權(quán)利要求25的傳感器，其中第一個(gè)和第二個(gè)位置之間的系鏈的部分包含由如下化學(xué)式表示的一個(gè)重復(fù)單位 其中n是一個(gè)正整數(shù)。
28.權(quán)利要求27的傳感器，其中n在70-80之間。
29.權(quán)利要求27的傳感器，其中n是75。
30.權(quán)利要求25的傳感器，其中系鏈的長度在完全伸展的構(gòu)象中為至少250。
31.權(quán)利要求16的傳感器，其進(jìn)一步包含一種生物素?；臒晒獾鞍祝黄渲性撋锼仵；臒晒獾鞍着c所述生物素酰化的熒光聚合物和生物素結(jié)合蛋白形成復(fù)合物。
32.權(quán)利要求31的傳感器，其中所述熒光蛋白是藻紅蛋白或藻膽體。
33.一種檢測樣品中靶分析物存在和/或數(shù)量的方法，包括將樣品與一種生物素?；纳锞Y合物及一種權(quán)利要求16所述的傳感器組合，所述生物素?；纳锞Y合物包含一種多核苷酸序列，一種肽核酸序列或多肽序列。
34.權(quán)利要求33的方法，其中所述生物素酰化的生物綴合物包含一種多核苷酸序列或肽核酸序列，所述方法進(jìn)一步包括將樣品與包含一種猝滅劑和一種多核苷酸或肽核酸序列的第二種生物綴合物進(jìn)行組合，其中所述猝滅劑能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅，其中第二種生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列能與生物素酰化的生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列雜交；且其中所述靶分析物包含能與生物素酰化的生物綴合物或第二種生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列雜交的多核苷酸序列。
35.權(quán)利要求34的方法，其中第二種生物綴合物的多核苷酸或肽核酸序列與生物素?；纳锞Y合物的多核苷酸或肽核酸序列互補(bǔ)。
36.權(quán)利要求33的方法，其中生物素?；纳锞Y合物包含一種多肽序列，并進(jìn)一步包含一種猝滅劑，其中生物素酰化的生物綴合物與所述復(fù)合物的結(jié)合猝滅熒光聚合物的熒光，其中靶分析物是一種能切割多肽序列的酶。
37.一種檢測樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，包括將樣品與權(quán)利要求25的傳感器組合。
38.權(quán)利要求37的方法，其中所述配體包含一個(gè)多肽序列。
39.權(quán)利要求37的方法，其中靶分析物選自由以下所組成的組孢子，細(xì)胞，細(xì)菌或病毒。
40.一種用于檢測生物學(xué)識別活動(dòng)的傳感系統(tǒng)，其包含權(quán)利要求25所述的傳感器，及包含眾多靶組分置于其表面上的第二種固體支持體，其中生物素酰化的生物綴合物的配體與靶組分相互作用，由此猝滅劑與熒光劑分離，從而增加熒光聚合物的熒光。
41.權(quán)利要求40的傳感系統(tǒng)，其中所述配體包含一個(gè)多肽序列。
42.權(quán)利要求40的傳感系統(tǒng)，其中第二種固體支持體是微球體，納米顆粒或珠。
43.一種檢測樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，包括將權(quán)利要求40所述的傳感系統(tǒng)與樣品組合，其中靶分析物可識別配體并與之相互作用，其中靶分析物與配體的相互作用導(dǎo)致熒光降低。
44.權(quán)利要求43的方法，其中所述配體包含一種多肽，及其中生物學(xué)識別活動(dòng)包括配體的多肽與包含一種多肽的靶分析物的相互作用。
45.權(quán)利要求34的方法，其包括將樣品與生物素?；纳锞Y合物及第二種生物綴合物一起保溫，并向保溫的樣品中加入所述傳感器。
46.權(quán)利要求34的方法，其中將所述傳感器與生物素?；纳锞Y合物組合，由此生物素?；纳锞Y合物與傳感器復(fù)合，隨后將樣品與傳感器/生物素?；纳锞Y合物復(fù)合物一起保溫，接著將第二種生物綴合物加入保溫的樣品中。
47.權(quán)利要求46的方法，其中靶分析物的核苷酸序列包含一個(gè)雙鏈核酸，所述方法進(jìn)一步包括在存在第二種生物綴合物的情況下加熱保溫的樣品至足以使樣品中雙鏈核酸解鏈的溫度，并將樣品冷卻以使得雙鏈體形成，其中樣品中存在的靶分析物與第二種生物綴合物之間的雙鏈體形成導(dǎo)致熒光增加。
48.權(quán)利要求46的方法，其中生物素?；纳锞Y合物包含一種肽核酸序列。
49.一種用于檢測靶生物學(xué)物種的傳感器，其包含在其表面上包含受體的眾多配體的細(xì)菌芽孢或病毒；置于細(xì)菌芽孢或病毒表面上的熒光聚合物或熒光聚合物復(fù)合物；包含與配體的受體綴合的猝滅劑的眾多生物綴合物，其中所述受體和配體相互作用及其中受體和配體的相互作用導(dǎo)致熒光聚合物的熒光放大的超猝滅。
50.一種檢測樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括將樣品與權(quán)利要求49所述的傳感器一起保溫；其中樣品中的靶分析物識別受體并與之相互作用，且其中樣品中靶分析物與受體的相互作用導(dǎo)致熒光增加。
51.權(quán)利要求50的方法，其中靶分析物包含一種細(xì)菌芽孢或病毒，該細(xì)菌芽孢或病毒在其一個(gè)表面上包含受體的眾多配體。
52.權(quán)利要求17的傳感器，其中生物素?；纳锞Y合物包含一種多核苷酸或肽核酸序列，其中生物素?；纳锞Y合物進(jìn)一步包含一種能導(dǎo)致熒光聚合物放大的超猝滅的猝滅劑，其中所述多核苷酸序列位于生物素?；纳锞Y合物上的猝滅劑和生物素之間。
53.一種檢測樣品中靶分析物的存在和/或數(shù)量的方法，該方法包括將樣品與權(quán)利要求52所述的傳感器組合，其中靶分析物包含能與輸送?；纳锞Y合物的多核苷酸或肽核酸序列雜交的多核苷酸序列，及所述雜交導(dǎo)致猝滅劑與固體支持體表面分離并伴隨著熒光增加。
54.權(quán)利要求6的方法，其中固體支持體包含硅基或乳膠微球體。
55.權(quán)利要求23的傳感器，其中固體支持體包含硅基或乳膠微球體。
56.權(quán)利要求40的傳感系統(tǒng)，其中第二種固體支持體的表面包含一個(gè)選自由以下所組成的組的官能團(tuán)銨官能團(tuán)、羧基官能團(tuán)、帶電反應(yīng)性基團(tuán)及中性的反應(yīng)性基團(tuán)。
57.權(quán)利要求42的傳感系統(tǒng)，其中第二種固體支持體包含硅基或乳膠微球體。
全文摘要
本發(fā)明描述了由一種生物素?；臒晒饩酆衔锖鸵环N生物素結(jié)合蛋白形成的復(fù)合物以及由熒光聚合物復(fù)合物包被的固體支持體。該復(fù)合物可用作傳感器以檢測生物學(xué)識別活動(dòng)(例如核酸雜交反應(yīng)或酶誘導(dǎo)的多肽切割)。本發(fā)明還描述了生產(chǎn)該復(fù)合物的方法及使用該復(fù)合物檢測樣品中靶分析物的存在和/或量的方法。所述靶分析物可以是酶(例如β－分泌酶)或核酸(例如單鏈或雙鏈核酸)。
文檔編號C12M1/34GK1742201SQ200380108748
公開日2006年3月1日 申請日期2003年11月14日 優(yōu)先權(quán)日2002年11月14日
發(fā)明者戴維·G.·惠滕, 羅伯特·M.·瓊斯, 斯圖爾特·A.·庫肖恩, 凱文·D.·利, 夏文圣, 斯里拉姆·庫馬拉斯瓦米, 鄧肯·W.·麥克布蘭奇 申請人:Qtl生物系統(tǒng)有限公司