專(zhuān)利名稱(chēng)：具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的b的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及分子生物學(xué)領(lǐng)域，以及將B12-依賴(lài)型脫水酶用于生產(chǎn)1，3-丙二醇的用途。更具體地講，本發(fā)明描述了用于制備和選擇具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型脫水酶的方法，以便降低酶失活的速率。
背景1，3-丙二醇具有多種用途，包括作為生產(chǎn)聚酯，聚醚和聚氨基甲酸酯的原材料。用于生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法包括傳統(tǒng)化學(xué)方法和生物學(xué)方法。最近業(yè)已描述了用于生產(chǎn)1，3-丙二醇的生物學(xué)方法(Zeng等，Adv.Biochem.Eng.Biotechnol.，74239-259(2002))。通過(guò)生物學(xué)方法生產(chǎn)1，3-丙二醇，需要甘油作為兩個(gè)步驟的順序反應(yīng)的底物。首先，脫水酶(通常是輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶)將甘油轉(zhuǎn)化成中間體——3-羥基丙醛(3-HP)。然后，通過(guò)NADH-(或NADPH)依賴(lài)型氧化還原酶將3-HP還原成1，3-丙二醇(參見(jiàn)反應(yīng)式1和2)。
甘油→3-HP+H2O(反應(yīng)式1)3-HP+NADH+H+→1，3-丙二醇+NAD+(反應(yīng)式2)1，3-丙二醇不能進(jìn)一步代謝，其結(jié)果是以高濃度在培養(yǎng)基中積累。
通常，甘油被用作通過(guò)生物學(xué)方法生產(chǎn)1，3-丙二醇的原材料。不過(guò)，葡萄糖和其他糖類(lèi)也是用于1，3-丙二醇生產(chǎn)的合適底物。具體地講，Laffend等(WO 96/35796；US 5,686,276)公開(kāi)了用于由除了甘油或二羥基丙酮以外的碳底物生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法(例如，特別是用葡萄糖)，其中使用包括脫水酶活性的單一微生物。Emptage等(WO01/012833)描述了通過(guò)非專(zhuān)一性催化活性將3-HP轉(zhuǎn)化成1，3-丙二醇獲得的效價(jià)的顯著提高(克產(chǎn)物/升)(與由dhaT編碼的1，3-丙二醇氧化還原酶不同)。Payne等(US 60/374931)公開(kāi)了用于通過(guò)生物學(xué)方法生產(chǎn)1，3-丙二醇的特殊載體和質(zhì)粒。Cervin等(US 60/416192)公開(kāi)了用于高產(chǎn)量生產(chǎn)1，3-丙二醇的改良的大腸桿菌(E.coli)菌株。在此將WO96/35796，WO 01/012833，US 60/374931和US 60/416192以全文形式引入本說(shuō)明書(shū)作為參考。
負(fù)責(zé)將甘油轉(zhuǎn)化成3-HP的酶主要是輔酶B12-依賴(lài)型酶，被稱(chēng)為輔酶B12-依賴(lài)型甘油脫水酶(E.C.4.2.1.30)和輔酶B12-依賴(lài)型二醇脫水酶(E.C.4.2.1.28)。對(duì)上述不同的，但是相關(guān)的輔酶B12-依賴(lài)型酶在它們的分子和生物化學(xué)特性方面進(jìn)行了充分研究。業(yè)已鑒定了編碼輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶的基因，例如，在肺炎克雷伯氏菌(Klebsiellapneumoniae)，弗氏檸檬酸桿菌(Citrobacter freundii)，巴氏梭菌(Clostridium pasteurianum)，鼠傷寒沙門(mén)氏菌(Salmonellatyphimurium)，產(chǎn)酸克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca)和丘狀菌落乳桿菌(Lactobacillus collinoides)中鑒定(Toraya，T.，InMetalloenzymes Involving Amino Acid-Residue and RelatedRadicals；Sigel，H.和Sigel，A.，Eds.；Metal Ions in BiologicalSystems；Marcel DekkerNew York，1994；Vol.30，pp 217-254；Daniel等，F(xiàn)EMS Microbiology Reviews 22553-566(1999)；和Sauvageot等，F(xiàn)EMS Microbiology Letters 20969-74(2002))。
盡管在文獻(xiàn)中使用的所述基因的名稱(chēng)有多種變化，但在每一種情況下，輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶都是由三個(gè)亞基組成的較大的或“α”亞基，中等的或“β”亞基，和較小的或“γ”亞基。所述亞基組裝成α2β2γ2結(jié)構(gòu)，以便形成脫輔基酶。輔酶B12(活性輔因子種類(lèi))與所述脫輔基酶結(jié)合，以便形成催化活性的全酶。輔酶B12是催化活性所必需的，因?yàn)樗鼌⑴c發(fā)生催化所依賴(lài)的游離基機(jī)理。
在生物化學(xué)方面，輔酶B12-依賴(lài)型甘油和輔酶B12-依賴(lài)型二醇脫水酶已知會(huì)通過(guò)甘油和其他底物發(fā)生基于機(jī)理的自殺失活(Daniel等，同上；Seifert，等，Eur.J.Biochem.2682369-2378(2001))。另外，通過(guò)全酶與高濃度的1，3-丙二醇的相互作用發(fā)生失活。失活涉及輔酶B12輔因子的鈷-碳(Co-C)鍵的裂解，導(dǎo)致了5′-脫氧腺苷和無(wú)活性的鈷胺素種類(lèi)的形成。無(wú)活性的鈷胺素種類(lèi)保持與脫水酶緊密結(jié)合；在沒(méi)有輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶再激活因子(“脫水酶再激活因子”)干預(yù)的情況下，不會(huì)發(fā)生解離。這種失活作用能顯著減弱與3-HP形成相關(guān)的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)，因此間接降低了1，3-丙二醇的生產(chǎn)。
可以部分克服輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶失活的影響。例如，可以通過(guò)依賴(lài)負(fù)責(zé)再激活脫水酶活性的蛋白來(lái)克服失活作用。脫水酶再激活因子業(yè)已描述于以下文獻(xiàn)中WO 98/21341(US 6,013,494)；Daniel等(同上)；Toraya和Mori(J.Biol.Chem.2743372(1999))；和Tobimatsu等(J.Bacteriol.1814110(1999))。再激活是通過(guò)多個(gè)步驟的過(guò)程發(fā)生的。首先，在ATP-依賴(lài)型過(guò)程中，失活的輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶與脫水酶再激活因子相互作用導(dǎo)致緊密結(jié)合的無(wú)活性的鈷胺素種類(lèi)的釋放，以便產(chǎn)生脫輔基酶。然后，脫水酶脫輔基酶可以結(jié)合輔酶B12，以重新形成催化活性的全酶，并且無(wú)活性的鈷胺素種類(lèi)可以再生成(在獨(dú)立的ATP-依賴(lài)型過(guò)程中，通過(guò)酶促作用)輔酶B12。不過(guò)，僅僅依靠脫水酶再激活因子恢復(fù)脫水酶活性固有地是有限的，因?yàn)槊撍冈偌せ詈洼o酶B12再生過(guò)程都需要ATP。所述ATP-依賴(lài)型過(guò)程造成了將甘油轉(zhuǎn)化成3-HP的過(guò)程的顯著的能量負(fù)擔(dān)，特別是如果存在3-HP至1，3-丙二醇的后續(xù)反應(yīng)，并且1，3-丙二醇濃度較高的話(huà)，更是如此。
或者，可能增加在1，3-丙二醇生產(chǎn)期間添加到培養(yǎng)基中的輔酶B12的量，或者用維生素B12(它在體內(nèi)被轉(zhuǎn)化成輔酶B12)補(bǔ)充所述培養(yǎng)基，以便為微生物提供額外的輔酶B12。不過(guò)，在這兩種情況下，所述添加的成本可能顯著干擾工藝的經(jīng)濟(jì)性。
Croux等(WO 01/04324 A1)業(yè)已解決了與輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶相關(guān)的問(wèn)題，這通過(guò)使用能表達(dá)輔酶B12-不依賴(lài)型脫水酶的重組微生物開(kāi)發(fā)了用于生產(chǎn)1，3-丙二醇的方法來(lái)實(shí)現(xiàn)。不過(guò)，該解決方案的有效性可能受到B12-不依賴(lài)型脫水酶在某些優(yōu)選工藝條件下發(fā)揮作用的能力的限制(例如在需氧條件下(Hartmanis和Stadman，Arch.Biochem.Biophys.245144-52(1986))。
原則上講，應(yīng)當(dāng)可能從天然存在的微生物菌株中分離具有較低的失活動(dòng)力學(xué)的輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶。較低的失活動(dòng)力學(xué)能提高輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶在微生物宿主中的轉(zhuǎn)換率(摩爾產(chǎn)物/摩爾全酶)，并因此減少對(duì)脫水酶和輔酶B12的需求。這一方法還能減少保持脫水酶和輔酶B12水平所需要的能量。不過(guò)，在實(shí)踐中，業(yè)已發(fā)現(xiàn)輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶的多樣性在失活動(dòng)力學(xué)方面是有限的。
因此，要解決的問(wèn)題是現(xiàn)有的輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶不能提供用于生產(chǎn)工業(yè)化合物的工業(yè)應(yīng)用所需要的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。
發(fā)明概述申請(qǐng)人業(yè)已提供了用于篩選具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型脫水酶的方法，包括(a)讓B12-依賴(lài)型脫水酶全酶與包括甘油和1，3-丙二醇的混合物接觸，其中，所述1，3-丙二醇至少為25mM；(b)篩選所述B12-依賴(lài)型脫水酶全酶，以便評(píng)估B12-依賴(lài)型脫水酶全酶的轉(zhuǎn)換率。
所述方法的篩選步驟還包括以下步驟a)在不包括甘油的可發(fā)酵的碳底物上生長(zhǎng)細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞不具備輔酶B12，脫水酶再激活因子或內(nèi)源B12-依賴(lài)型脫水酶的來(lái)源；b)透化所述細(xì)胞；c)將輔酶B12，甘油和至少25mM1，3-丙二醇的混合物添加到步驟(b)的透化的細(xì)胞中；d)對(duì)在步驟(c)中產(chǎn)生的3-羥基丙醛進(jìn)行定量，其中，所述定量是選自T1，T2和T(600)的量度。
本發(fā)明還包括選自下列序列的編碼B12-依賴(lài)型突變型脫水酶的核酸序列SEQ ID NO40，44，48，52，56，60，64，68，72，76，80，84，88，92，96，100，104，108，112，116，120，124，128，132，136，140，143，147，151，155，159，163，167，171，175，179，182，186，189，192，195，198，201，204，208，212，215，218，221，225，229，233，237，241，245，249，253，257，261，265，269，273，277，281，285，289，293，297，301，304，307，310，313，316，319，322，325，328，331，334和337。由所述核酸序列編碼的更優(yōu)選的B12-依賴(lài)型突變型脫水酶選自SEQ ID NO40，44，48，52，56，60，64，68，72，76，80，84，88，92，96，100，104，108，112，116，120，124，128，132，136，140，143，147，151，155，159，163，167，171，175，179，182，186，189，192，195，198，201，204，208，212，215，218，221，225，229，233，237，241，245，249，253，257，261，265，269，273，277，281，285，289，293，297，301，304，307，310，313，316，319，322，325，328，331，334和337。編碼B12-依賴(lài)型突變型脫水酶的更優(yōu)選的核酸序列包括選自如下序列的α-β亞基融合體SEQ ID NO140，179，186，189，192，195，198，201，212，215，218，301，304，307，310，313，316，319，322，325，328，331，334和337。編碼B12-依賴(lài)型突變型脫水酶的最優(yōu)選的核酸序列包括選自如下序列的α-β亞基融合體SEQ ID NO313，322和328。
本發(fā)明還包括核酸序列，這些序列還包括位于α-β亞基融合體的α和β亞基之間的接頭序列，其中，所述接頭序列選自SEQ ID NO18和SEQ ID NO19。
本發(fā)明還包括用于制備具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型脫水酶突變體的方法，包括a)讓包括熱點(diǎn)1或熱點(diǎn)2的B12-依賴(lài)型脫水酶全酶與誘變劑接觸；b)篩選在步驟A)中產(chǎn)生的具有改善了的kcat和/或穩(wěn)定性的突變體；和c)重復(fù)步驟a)和b)。
7.本發(fā)明用于鑒定相對(duì)于參考脫水酶而言具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型脫水酶的進(jìn)一步的方法包括a)讓脫水酶全酶與5-10mM甘油和/或10-300mM 1，3-丙二醇接觸；b)在高通量測(cè)定中，在至少兩個(gè)間隔足夠大的時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行測(cè)量以便評(píng)估kcat和總的酶轉(zhuǎn)換；c)選擇相對(duì)于參考脫水酶而言具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型突變體。
本發(fā)明的用于鑒定相對(duì)于參考脫水酶而言具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型脫水酶的另一種方法包括a)讓脫水酶全酶與5-50mM甘油和＞300mM 1，3-丙二醇接觸；b)在高通量測(cè)定中，在相對(duì)于T0的一個(gè)間隔足夠大的時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行測(cè)量，以便評(píng)估總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)；和c)選擇相對(duì)于參考脫水酶而言具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型突變體。
附圖和序列表簡(jiǎn)述

圖1表示在存在甘油或在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下進(jìn)行的一般GDH反應(yīng)的時(shí)程(time course)。
圖2用示意圖表示如實(shí)施例6所描述的一般后續(xù)測(cè)定的結(jié)果。
圖3表示在α-亞基上包括單點(diǎn)突變(相對(duì)于野生型GDH而言)的突變體的分布。
圖4表示在α-亞基上包括多點(diǎn)突變(相對(duì)于野生型GDH而言)的突變體的分布。
圖5表示使用不配對(duì)的引物的重組源(recombinogenic)延伸方法的原理。
申請(qǐng)人業(yè)已提供了346種序列，所述序列符合專(zhuān)利申請(qǐng)中核苷酸和氨基酸序列的標(biāo)準(zhǔn)表示方法規(guī)則(Annexes I and II to the Decisionof the President of the EPO，published in Supplement No.2 to OJEPO，12/1992)，符合37 C.F.R.1.821-1.825和Appendices A and B(Requirements for Application Disclosures ContainingNucleotides and/or Amino Acid Sequences)的規(guī)定，符合世界知識(shí)產(chǎn)權(quán)組織(WIPO)標(biāo)準(zhǔn)ST.25(1998)以及EPO和PCT的序列表要求的規(guī)定(Rules 5.2 and 49.5(a-bis)，and Section 208 and Annex Cof the Administrative Instructions)。所述序列說(shuō)明包括表示核苷酸序列特征的單字母密碼和表示氨基酸的三字母密碼，其定義與描述于以下文獻(xiàn)中的IUPAC-IYUB標(biāo)準(zhǔn)一致Nucleic Acids Research 133021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(2)345-373(1984)，以上文獻(xiàn)被收作本文參考。
SEQ ID NO1是12.1kB的EcoRI-SalI片段，它包括從肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955(Emptage等，WO 01/012833 A2)中分離的野生型GDH。野生型GDH是由α-亞基(bp 7044-8711)，β-亞基(bp 8724-9308)和γ-亞基(bp 9311-9736)編碼的。GDH的α，β和γ-亞基的氨基酸序列分別由SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4提供。
SEQ ID NOs5和6分別編碼引物DHA-F1和DHA-R1，用于克隆來(lái)自質(zhì)粒pGH20的GDH。
SEQ ID NO7編碼反向引物DHA-R2，它被用于克隆GDH的完整的α-亞基和β-亞基的一部分。
SEQ ID NOs8-14分別編碼引物pGD20RM-F1，pGD20RM-R1，TB4BF，TB4BR，pGD20RM-F2，pGD20RM-R2和GD-C，這些引物被用于α-亞基的區(qū)域性隨機(jī)誘變。
SEQ ID NOs15-17分別編碼簡(jiǎn)并引物pGD20RM-F3，TB4B-R1和pGD20RM-R4，這些引物被用于制備區(qū)域性隨機(jī)突變體文庫(kù)。
SEQ ID NO18編碼位于融合蛋白Sma3002的α-和β-亞基之間的接頭。SEQ ID NO19編碼位于融合蛋白Xba3009的α-和β-亞基之間的接頭。
SEQ ID NOs20-25分別編碼引物2-F4-F1，2-F4-R1，12-B1-F1，12-B1-R1，16-H5-F1和16-H5-R1，這些引物被用于合成第二代突變體GDHs。
SEQ ID NOs26-29分別編碼引物1-E1-F1，1-E1-R1，22-G7-F1和22-G7-R1，這些引物被用于制備純的融合突變體1-E1和22-G7。
SEQ ID NOs30-39分別編碼引物7A-C1-F1，7A-C1-R1，7C-A5-F1，7C-A5-R1，8-C9-F1，8-C9-R1，9-D7-F1，9-D7-R1，10-G6-F1和10-G6-R1，這些引物被用于合成Sma3002-衍生的突變體。
根據(jù)它們的相應(yīng)的核酸序列和氨基酸序列將來(lái)自野生型GDH的突變型酶賦予以下SEQ ID Nos(表1)
表1完整長(zhǎng)度的突變體GDHs以及它們各自的SEQ ID NOs
SEQ ID NOS340-342分別編碼引物T53-SM，L509-SM和V224-SM。
SEQ ID Nos343和344分別編碼引物GDHM-F1和GDHM-R1。
SEQ ID Nos345和346分別編碼引物GDHM-F2和GDHM-R2。
發(fā)明詳述本申請(qǐng)人通過(guò)以下方法解決了上述問(wèn)題提供具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的工程化的輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶(即，在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下提供較高的總轉(zhuǎn)換數(shù))，以便用于工業(yè)用途，特別是用于生產(chǎn)3-羥基丙醛和1，3-丙二醇。這些通過(guò)誘變技術(shù)生產(chǎn)的脫水酶以相對(duì)于產(chǎn)生它的野生型酶而言具有提高的kcat和/或降低的酶失活的速率為特征。
本發(fā)明的工程化的輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶能降低失活速率，而又不會(huì)過(guò)度犧牲催化速率。這種解決脫水酶失活問(wèn)題的方案是優(yōu)選的，因?yàn)樗岣吡宋⑸锼拗髦休o酶B12-依賴(lài)型脫水酶的轉(zhuǎn)換率(摩爾產(chǎn)物/摩爾全酶)。提高了的轉(zhuǎn)換率的作用減少對(duì)脫水酶的需求，對(duì)輔酶B12的需求，以及保持脫水酶和輔酶B12的水平的能耗。另外，業(yè)已證實(shí)了輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶可用于在工業(yè)生產(chǎn)條件下有效生產(chǎn)1，3-丙二醇。
除了提供一套突變型脫水酶之外，本發(fā)明還提供了兩種高通量測(cè)定，以便促進(jìn)突變型脫水酶的篩選。這兩種方法依賴(lài)于B12-依賴(lài)型脫水酶以它的脫輔基酶形式在細(xì)胞中的存在，這些細(xì)胞沒(méi)有輔酶B12、脫水酶再激活因子或B12-依賴(lài)型脫水酶的來(lái)源。因此，可能根據(jù)輔酶B12和底物甘油的添加精確地控制脫水酶活性的啟動(dòng)。
具體地講，制備了突變的輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶基因的大型文庫(kù)，并且以高通量形式表達(dá)和篩選在存在甘油和1，3-丙二醇混合物的情況下減少失活的基因產(chǎn)物。所述篩選方法能夠方便快捷地鑒定具有降低的失活速率和提高的甘油催化速率的工程化的輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶。隨后幾輪脫水酶工程改造，使得能夠制備并且鑒定進(jìn)一步改善了的脫水酶變體。
本領(lǐng)域技術(shù)人員可以看出的是，根據(jù)本文的教導(dǎo)，編碼能夠催化甘油向3-HP的轉(zhuǎn)化的B12-依賴(lài)型脫水酶活性的多種基因，應(yīng)該適合作為誘變和篩選的靶，正如在本發(fā)明中所描述的。因此，可以預(yù)料的是通過(guò)本發(fā)明能鑒定具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(即，在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下具有較高的總轉(zhuǎn)換數(shù))的突變型脫水酶。
定義以下縮寫(xiě)和定義被用于解釋本說(shuō)明書(shū)和權(quán)利要求書(shū)。
“聚合酶鏈反應(yīng)”被縮寫(xiě)成PCR。
“3-羥基丙醛”被縮寫(xiě)成3-HP。
術(shù)語(yǔ)“脫水酶”被用于表示能夠?qū)⒏视头肿赢悩?gòu)化或轉(zhuǎn)化為產(chǎn)物3-羥基丙醛的任何酶。正如上文所指出的，某些脫水酶需要輔酶B12作為輔因子。術(shù)語(yǔ)“輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶”和“B12-依賴(lài)型脫水酶”可以互換使用，表示那些需要輔酶B12的脫水酶。輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶包括輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶(E.C.4.2.1.30)和輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶(E.C.4.2.1.28)。或者，脫水酶可以是輔酶B12-不依賴(lài)型的；這些酶不需要輔酶B12作為輔因子，并且被表示為術(shù)語(yǔ)“B12-不依賴(lài)型脫水酶”。對(duì)于本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)，術(shù)語(yǔ)“甘油脫水酶”被專(zhuān)門(mén)用于表示輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶(E.C.4.2.1.30)，而術(shù)語(yǔ)“二醇脫水酶”被專(zhuān)門(mén)用于表示輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶(E.C.4.2.1.28)。(申請(qǐng)人對(duì)名稱(chēng)的精心選擇是為了不與以下文獻(xiàn)中的名稱(chēng)混淆Hartmanis和Stadman，同上，和Crous等，同上，他們將B12-不依賴(lài)型脫水酶分別稱(chēng)作術(shù)語(yǔ)“二醇脫水酶”和“甘油脫水酶”。)術(shù)語(yǔ)“脫輔基酶”表示由蛋白組成的酶的部分。脫輔基酶不包括非蛋白結(jié)構(gòu)，所述非蛋白結(jié)構(gòu)可能是所述酶的功能所必需的；因此，脫輔基酶可能是無(wú)催化活性的。術(shù)語(yǔ)“輔因子”表示脫輔基酶的催化活性所必需的非蛋白結(jié)構(gòu)。術(shù)語(yǔ)“全酶”表示催化活性的蛋白-輔因子復(fù)合物。輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶脫輔基酶需要輔因子輔酶B12以便形成全酶。
術(shù)語(yǔ)“輔酶B12”和“腺苷鈷胺素”可以互換使用，表示5′-脫氧腺苷鈷胺素。
術(shù)語(yǔ)“維生素B12”和“氰鈷胺素”可以互換使用，并且表示輔酶B12的衍生物，其中，上部軸向5′-脫氧-5′-腺苷配體被氰基部分所取代。
“羥鈷胺素”表示輔酶B12的衍生物，其中，上部軸向5′-脫氧腺苷配體被羥基部分所取代。Aquacobalamin是羥鈷胺素的質(zhì)子化形式。
由甘油或1，3-丙二醇對(duì)B12-不依賴(lài)型脫水酶全酶產(chǎn)生的失活作用，導(dǎo)致了無(wú)活性的鈷胺素種類(lèi)的形成，這種鈷胺素失去了上部軸向5′-脫氧-5′-腺苷配體。術(shù)語(yǔ)“輔酶B12前體”表示輔酶B12的衍生物，其中，上部軸向5′-脫氧腺苷配體被取代。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“GDH”專(zhuān)門(mén)表示B12-依賴(lài)型甘油脫水酶，它是從肺炎克雷伯氏菌ATCC 25955中分離的，并且是由SEQ ID NO1的bp7044-8711，bp 8724-9308和bp 9311-9736編碼的。術(shù)語(yǔ)“GDH”被用于表示α，β和γ-亞基組裝的復(fù)合物，并且可以表示脫輔基酶或全酶。述及GDH的個(gè)別亞基時(shí)將指明該亞基，例如“GDH的α-亞基”或“GDHα-亞基”。類(lèi)似地，也可以提到GDH的氨基酸序列，其中可統(tǒng)一地稱(chēng)為α，β和γ-亞基；或提到GDH的個(gè)別亞基。GDH的α，β和γ-亞基的氨基酸序列分別在SEQ ID NO2，SEQ ID NO3和SEQ ID NO4中提供。
對(duì)于本發(fā)明公開(kāi)內(nèi)容的目的來(lái)說(shuō)，GDH被用作DNA和氨基酸序列的參考，與工程化的(突變型)衍生物進(jìn)行比較。GDH還被用作野生型反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的參考，相對(duì)于它測(cè)量通過(guò)本發(fā)明生產(chǎn)的工程化衍生物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。盡管在本發(fā)明中GDH被用作參考材料，但在本發(fā)明中，任何天然存在的輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶(例如，在表2中所列舉的脫水酶)可以與GDH互換使用，相對(duì)于它測(cè)量工程化衍生物的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)。
術(shù)語(yǔ)“遺傳學(xué)改變的”表示通過(guò)轉(zhuǎn)化或突變改變遺傳材料的過(guò)程。
在本文中，術(shù)語(yǔ)“突變體”表示包括業(yè)已通過(guò)突變方法產(chǎn)生的GDH酶或GDH序列的細(xì)菌克隆，質(zhì)粒，文庫(kù)或載體?；蛘撸g(shù)語(yǔ)突變體直接表示業(yè)已通過(guò)突變方法生成的GDH酶，GDH氨基酸序列或GDH DNA序列。因此，突變體GDH不同于(野生型)GDH。
術(shù)語(yǔ)“改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)”表示在存在甘油和/或1，3-丙二醇的條件下，相對(duì)野生型酶而言具有降低的脫水酶失活速率。因此，改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)與在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下的較高的總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)相關(guān)。這可以通過(guò)提高kcat和/或降低酶失活的速率來(lái)實(shí)現(xiàn)。
術(shù)語(yǔ)“催化效率”被定義為酶的kcat/KM?！按呋省北挥糜趯?duì)酶對(duì)底物的特異性的定量。
術(shù)語(yǔ)“kcat”，“KM”和“Ki”為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知，并且描述于以下文獻(xiàn)中(Ferst In Enzyme Structure and Mechanism，2nded.；W.H.FreemanNew York，1985；pp 98-120)。
術(shù)語(yǔ)“kcat”通常被稱(chēng)為“轉(zhuǎn)換數(shù)”。術(shù)語(yǔ)“kcat”被定義為每個(gè)活性位點(diǎn)每個(gè)單位時(shí)間轉(zhuǎn)化成產(chǎn)物的底物分子的最大數(shù)量，或每單位時(shí)間酶轉(zhuǎn)換的次數(shù)。kcat＝Vmax/[E]，其中[E]是酶濃度(Ferst In EnzymeStructure and Mechanism，2nd ed.；W.H.FreemanNew York，1985；pp 98-120)。術(shù)語(yǔ)“總轉(zhuǎn)換”和“總轉(zhuǎn)換數(shù)”在本文中被用于表示通過(guò)B12-依賴(lài)型脫水酶全酶與甘油起反應(yīng)(任選地在存在1，3-丙二醇的條件下)產(chǎn)生的產(chǎn)物的量，所述產(chǎn)物是在反應(yīng)開(kāi)始(T0)和全酶業(yè)已完全失活的時(shí)間點(diǎn)之間產(chǎn)生的。
術(shù)語(yǔ)“Ki”表示1，3-丙二醇的抑制常數(shù)。
術(shù)語(yǔ)“kinact obsd”表示在B12-依賴(lài)型脫水酶全酶和過(guò)量的甘油和/或過(guò)量的1，3-丙二醇反應(yīng)中觀察到的一級(jí)失活速率常數(shù)。在僅存在過(guò)量甘油的條件下，kinact obsd與kinact 甘油相等。在僅存在過(guò)量的1，3-丙二醇的條件下，kinact obsd與kinact 1， 3-丙二醇相等。在同時(shí)存在過(guò)量的甘油和過(guò)量的1，3-丙二醇的條件下，kinact obsd與kinact 甘油和kinact 1，3-丙二醇的函數(shù)相等。
術(shù)語(yǔ)“T1”表示通過(guò)GDH酶反應(yīng)制備的產(chǎn)物量，該產(chǎn)物量是在存在10mM甘油和50mM1，3-丙二醇的條件下在反應(yīng)開(kāi)始之后30秒測(cè)量的。T1與kcat成比例。
術(shù)語(yǔ)“T2”表示通過(guò)GDH酶反應(yīng)制備的產(chǎn)物量，該產(chǎn)物量是在存在10mM甘油和50mM 1，3-丙二醇的條件下在反應(yīng)開(kāi)始之后40分鐘測(cè)量的。T2與kcat/kinact obsd成比例，體現(xiàn)了總的酶總轉(zhuǎn)換數(shù)(total enzyme totalturnover number)。
術(shù)語(yǔ)“T2/T1比例”表示T2與T1的比例。T2/T1比例與1/kinact obsd成比例。
術(shù)語(yǔ)“T2(600)”表示通過(guò)GDH酶反應(yīng)制備的產(chǎn)物量，該產(chǎn)物量是在存在10mM甘油和600mM 1，3-丙二醇的條件下在反應(yīng)開(kāi)始之后40分鐘測(cè)量的。T2(600)與kcat/kinact obsd成比例，反應(yīng)了在存在600mM 1，3-丙二醇的條件下的總的酶總轉(zhuǎn)換數(shù)。
術(shù)語(yǔ)“T(600)”表示通過(guò)GDH酶反應(yīng)制備的產(chǎn)物量，該產(chǎn)物量是在存在10mM甘油和600mM 1，3-丙二醇的條件下在反應(yīng)開(kāi)始之后70分鐘測(cè)定的。T(600)與kcat/kinact obsd成比例。在存在600mM 1，3-丙二醇的條件下，T(600)值提供了比T2(600)更精確的總的酶總轉(zhuǎn)換數(shù)。
術(shù)語(yǔ)“多肽”和“蛋白”可以互換使用。
術(shù)語(yǔ)“宿主細(xì)胞”或“宿主生物”表示能夠接收外源或異源基因并且表達(dá)所述基因以便產(chǎn)生活性基因產(chǎn)物的微生物。
術(shù)語(yǔ)“分離的”表示與和它天然結(jié)合的至少一種成分分離的蛋白或DNA序列。
“分離的核酸分子”是單鏈或雙鏈RNA或DNA聚合物，它任選地含有合成的，非天然的或改變了的核苷酸堿基。DNA聚合物形式的分離的核酸分子可以由cDNA，基因組DNA或合成的DNA的一個(gè)或多個(gè)片段組成。
“基因”表示能表達(dá)特定蛋白并且任選地包括位于編碼序列前面(5′非編碼序列)和后面(3′非編碼序列)的調(diào)控序列的核酸片段。“天然基因”和“野生型基因”表示天然存在的具有它自身的調(diào)控序列的基因。“嵌合基因”表示不是天然基因的任何基因，其包括天然狀態(tài)下不在一起的調(diào)控序列和編碼序列。因此，嵌合基因可以包括來(lái)自不同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，或來(lái)自相同來(lái)源的調(diào)控序列和編碼序列，但是這些序列是以不同于天然狀態(tài)的形式排列的?！皟?nèi)源基因”表示位于生物基因組中的天然位置上的天然基因?！巴庠础被虮硎菊Ｇ闆r下不存在于宿主生物中的基因，但相反，它是通過(guò)基因轉(zhuǎn)移導(dǎo)入宿主生物的。外源基因可以包括插入非天然生物的天然基因，或嵌合基因。“轉(zhuǎn)基因”是業(yè)已通過(guò)轉(zhuǎn)化方法導(dǎo)入基因組的基因。
術(shù)語(yǔ)編碼(“encoding”和“coding”)表示一種過(guò)程，通過(guò)該過(guò)程基因通過(guò)轉(zhuǎn)錄和翻譯機(jī)制產(chǎn)生了氨基酸序列。可以理解的是，編碼特定氨基酸序列的過(guò)程包括可能涉及不會(huì)改變所編碼的氨基酸的堿基改變的DNA序列，或涉及可能改變一個(gè)或多個(gè)氨基酸，但不會(huì)影響由所述DNA序列編碼的蛋白的功能特性的堿基改變的DNA序列。因此，可以理解的是，本發(fā)明包括除了具體示例性序列以外的序列。
術(shù)語(yǔ)“氨基酸”表示蛋白或多肽的基本化學(xué)結(jié)構(gòu)單位。通過(guò)氨基酸的單字母密碼或三字母密碼鑒定的氨基酸與在以下文獻(xiàn)中描述的IUPAC-IYUB標(biāo)準(zhǔn)一致Nucleic Acids Research 133021-3030(1985)和Biochemical Journal 219(2)345-373(1984)，以上文獻(xiàn)被收作本文參考。
對(duì)于特定蛋白來(lái)說(shuō)，在DNA編碼區(qū)內(nèi)的點(diǎn)取代突變以及所得到的氨基酸改變是用下列符號(hào)中的一種相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)DNA和氨基酸序列進(jìn)行說(shuō)明的。例如，對(duì)于GDH上的突變來(lái)說(shuō)，所述突變是使用下面所描述的符號(hào)中的一種說(shuō)明的1.詳細(xì)符號(hào)首先，提供了野生型密碼子的核苷酸序列；隨后是“α”，“β”或“γ”符號(hào)(以便區(qū)分GDH的α-，β-或γ-亞基中的突變)，三字母縮寫(xiě)的特定野生型氨基酸以及它的位置。所述野生型信息之后是存在于所提到的突變中的特定核苷酸和氨基酸修飾。這種符號(hào)的一種例子是GGG(α-Gly63)至GGA(Gly)，其中α-亞基的63位密碼子發(fā)生了沉默突變，使得突變體中的所述核苷酸序列從“GGG”改變成“GGA”。
2.“速記”符號(hào)“α”，“β”或“γ”符號(hào)(用于區(qū)分GDH的α-，β-或γ-亞基中的突變)的后面是單字母縮寫(xiě)的野生型氨基酸，密碼子位置，以及突變型氨基酸的單字母縮寫(xiě)。該符號(hào)的一種例子是α-V224L，表示α-亞基上的224位密碼子的野生型纈氨酸突變成突變體中的亮氨酸。本領(lǐng)域眾所周知的是，導(dǎo)致在給定位點(diǎn)上產(chǎn)生化學(xué)上等同的氨基酸的基因上的改變(但是不會(huì)影響所編碼蛋白的功能特性)是常見(jiàn)的。
“基本上相似”表示核酸分子，其中，一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的改變導(dǎo)致了一個(gè)或多個(gè)氨基酸的取代，但是不會(huì)影響由所述DNA序列編碼的蛋白的功能特性。“基本上相似”還表示核酸分子，其中，在一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基上的改變不會(huì)影響所述核酸分子通過(guò)反義或共抑制技術(shù)介導(dǎo)基因表達(dá)改變的能力。“基本上相似”還表示本發(fā)明核酸分子的修飾(如一個(gè)或多個(gè)核苷酸堿基的缺失或插入)，這種改變不會(huì)明顯影響所得到的轉(zhuǎn)錄物在通過(guò)反義或共抑制技術(shù)介導(dǎo)基因表達(dá)的改變或改變所得到的蛋白分子的功能特性方面的功能特性。本發(fā)明包括除了具體示例性序列以外的序列。
每一個(gè)建議的修飾都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的常規(guī)技術(shù)，所編碼產(chǎn)物的生物學(xué)活性保留的確定也是如此。另外，技術(shù)人員了解本發(fā)明所包含的基本上相似的序列還可以通過(guò)它們?cè)趪?yán)格條件下(0.1X SSC，0.1％SDS，65℃，并且用2X SSC，0.1％SDS洗滌，然后用0.1X SSC，0.1％SDS洗滌)與本文所示例的序列雜交的能力限定。本發(fā)明的優(yōu)選的基本上相似的核酸片段是這樣的核酸片段，它的DNA序列與本文所報(bào)道的核酸片段的DNA序列至少80％相同。更優(yōu)選的核酸片段是這樣的核酸片段，它與本文所報(bào)道的核酸片段的DNA序列至少90％相同。最優(yōu)選的是與本文所報(bào)道的核酸片段的DNA序列至少95％相同的核酸片段。
當(dāng)一種核酸片段的單鏈形式能夠在合適的溫度和溶液離子強(qiáng)度條件下與其他核酸片段退火時(shí)，所述核酸片段就能夠與另一個(gè)核酸片段“雜交”，如cDNA，基因組DNA或RNA。雜交和洗滌條件是眾所周知的并且示例于以下文獻(xiàn)中Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.，Cold Spring HarborLaboratoryCold Spring Harbor，NY(1989)，特別是其中的Chapter11和Table 11.1。
“基本部分”表示氨基酸或核苷酸序列，它包括有關(guān)多肽的足夠的氨基酸序列或基因足夠的核苷酸序列，以便提供對(duì)多肽或基因的推測(cè)性鑒定，這通過(guò)本領(lǐng)域技術(shù)人員對(duì)所述序列進(jìn)行人工評(píng)估或通過(guò)計(jì)算機(jī)自動(dòng)化序列比較和鑒定使用諸如BLAST的算法來(lái)實(shí)現(xiàn)(Basic LocalAlignment Search Tool；Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1993)；還可參見(jiàn)www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST/)。一般，為了推測(cè)性鑒定多肽或核酸序列與已知蛋白或基因同源，需要10個(gè)或10個(gè)以上鄰接的氨基酸或30個(gè)或30個(gè)以上核苷酸的序列。另外，就核苷酸序列而言，可以將包括20-30個(gè)鄰接的核苷酸的基因特異性寡核苷酸探針用于基因鑒定(例如，DNA印跡雜交)和分離(例如，細(xì)菌菌落或噬菌斑的原位雜交)的序列依賴(lài)型方法。另外，可以將具有12-15個(gè)堿基的短的寡核苷酸用作PCR的擴(kuò)增引物，以便獲得包括所述引物的特定核酸分子。因此，核苷酸序列的“基本部分”包括足夠的序列，以便提供對(duì)包括所述序列的核酸分子的特定鑒定和/或分離。本說(shuō)明書(shū)教導(dǎo)了部分或完整的氨基酸序列以及編碼一種或多種特定蛋白的核苷酸序列。本領(lǐng)域技術(shù)人員利用本文所報(bào)道的序列，可以將所公開(kāi)序列的全部或主要部分用于本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知的目的。因此，本發(fā)明包括在所附序列表中所報(bào)道的完整序列，以及上文所定義的那些序列的基本部分。
術(shù)語(yǔ)“互補(bǔ)的”表示雙鏈DNA之間的關(guān)系。例如，對(duì)于DNA來(lái)說(shuō)，腺苷互補(bǔ)于胸腺嘧啶，而胞嘧啶互補(bǔ)于鳥(niǎo)嘌呤。因此，本發(fā)明還包括分離的核酸分子，它互補(bǔ)于在所附序列表中所報(bào)道的完整序列，以及基本上相似的核酸序列。
正如本領(lǐng)域所公知的，術(shù)語(yǔ)“百分比同一性”是兩種或兩種以上多肽序列或兩種或兩種以上多核苷酸序列之間的關(guān)系，如通過(guò)比較所述序列所確定的。在本領(lǐng)域中，“同一性”還表示多肽或多核苷酸序列之間的序列相關(guān)程度，根據(jù)具體情況，正如可以通過(guò)所述序列的串之間的匹配所決定的?！巴恍浴焙汀跋嗨菩浴笨梢酝ㄟ^(guò)已知方法方便地計(jì)算，包括，但不局限于描述于以下文獻(xiàn)中的方法1.)Computational MolecularBiology；Lesk，A.M.，Ed.；Oxford UniversityNew York，1988；2.)BiocomputingInformatics and Genome Projects；Smith，D.W.，Ed.；AcademicNewYork，1993；3.)Computer Analysis of SequenceData，PartI；Griffin，A.M.和Griffin，H.G.，Eds.；HumanaNewJersey，1994；4.)Sequence Analysis in Molecular Biology；vonHeinje，G.，Ed.；AcademicNew York，1987；和5.)Sequence analysisPrimer，Gribskov，M.和Devereux，J.，Eds.；StocktonNew York，1991。設(shè)計(jì)了用于測(cè)定同一性的優(yōu)選方法，以便提供測(cè)試序列之間的最大的匹配。
用于測(cè)定同一性和相似性的方法被編制成可公開(kāi)獲得的計(jì)算機(jī)程序。用于測(cè)定兩種序列之間的同一性和相似性的優(yōu)選的計(jì)算機(jī)程序方法包括，但不局限于在GCG程序包中提供的GCG Pileup程序，其使用Needleman和Wunsch算法，采用它們的標(biāo)準(zhǔn)默認(rèn)值，缺口生成罰分(gapcreation penalty)＝12，缺口延伸罰分(gap extension penalty)＝4(Devereux等人，Nucleic Acids Res.12387-395(1984))，BLASTP，BLASTN和FASTA(Pearson等，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 852444-2448(1988))。BLASTX程序可以從NCBI和其他來(lái)源公開(kāi)獲得(BLASTManual，Altschul等，Natl.Cent.Biotechnol.Inf.，Natl.LibraryMed.(NCBI NLM)NIH，Bethesda，MD；Altschul等，J.Mol.Biol.215403-410(1990)；Altschul等，Nucleic Acids Res.253389-3402(1997))。用于確定百分比同一性的另一種優(yōu)選方法是通過(guò)DNASTAR蛋白比對(duì)方案的方法，該方法使用了Jotun-Hein算法(Hein等，MethodsEnzymol.183626-645(1990))。用于比對(duì)的Jotun-Hein方法的默認(rèn)參數(shù)是1.)對(duì)于多重比對(duì)來(lái)說(shuō)缺口罰分＝11，缺口長(zhǎng)度罰分＝3；和2.)對(duì)于成對(duì)比對(duì)來(lái)說(shuō)ktuple＝6。作為一種解釋?zhuān)哂信c參考核苷酸序列至少，例如，95％“同一性”的核苷酸序列的多核苷酸被認(rèn)為是所述多核苷酸的核苷酸序列與所述參考序列相同，所不同的是，所述多核苷酸序列可能包括在參考核苷酸序列的每100個(gè)核苷酸的最多5個(gè)點(diǎn)突變。換句話(huà)說(shuō)，為了獲得具有與參考核苷酸序列至少95％同一性的核苷酸序列的多核苷酸，所述參考序列中的最多5％的核苷酸可以缺失或者用另一種核苷酸取代，或者可以將參考序列的所有核苷酸的最多5％的核苷酸插入所述參考序列。參考序列上的這些突變可能出現(xiàn)在參考核苷酸序列的5′或3′末端位置，或位于所述末端位置之間的任何地方，單獨(dú)分散在參考序列的核苷酸之間或分布在參考序列中的一個(gè)或多個(gè)鄰接組中。類(lèi)似地，具有與參考氨基酸序列至少，例如，95％同一性的氨基酸序列的多肽被認(rèn)為所述多肽的氨基酸序列是與所述參考序列相同的，所不同的是，所述多肽序列可能包括所述參考氨基酸的每100個(gè)氨基酸的最多5個(gè)氨基酸的改變。換句話(huà)說(shuō)，為了獲得具有與參考氨基酸序列至少95％相同的氨基酸序列的多肽，所述參考序列中的最多5％的氨基酸殘基可以缺失或用另一種氨基酸取代，或可以將參考序列中的總氨基酸殘基的最多5％的氨基酸插入所述參考序列。所述參考序列的這些改變可以發(fā)生在參考氨基酸序列的氨基或羧基末端位置，或位于所述末端位置之間的任何位置，單獨(dú)分散在參考序列的殘基之間或分布在參考序列中的一個(gè)或多個(gè)鄰接組之中。
術(shù)語(yǔ)“同源的”表示給定宿主細(xì)胞天然的或天然存在的蛋白或多肽。本發(fā)明包括能通過(guò)重組DNA技術(shù)產(chǎn)生同源蛋白的微生物。
術(shù)語(yǔ)“百分比同源性”表示多肽之間的氨基酸序列同一性的程度。當(dāng)?shù)谝环N氨基酸序列與第二種氨基酸序列相同時(shí)，所述第一和第二種氨基酸序列具有100％的同源性。任何兩種多肽之間的同源性是在任一序列給定位置上匹配的氨基酸的總數(shù)的直接函數(shù)，例如，如果在兩種序列任一個(gè)的氨基酸總數(shù)的一半是相同的話(huà)，這兩種序列就被說(shuō)成具有50％同源性。
“密碼子簡(jiǎn)并性”表示遺傳密碼中允許核苷酸序列改變，而又不影響所編碼多肽的氨基酸序列的趨異。技術(shù)人員熟知在用核苷酸密碼子表述給定氨基酸時(shí)由特定宿主細(xì)胞所表現(xiàn)出來(lái)的“密碼子偏倚”。
還預(yù)期序列的修飾，如序列中的缺失，插入或取代，這些修飾能產(chǎn)生沉默改變，這種改變不會(huì)明顯影響所得到的蛋白分子的功能特性。例如，預(yù)期基因序列上的改變，這種改變體現(xiàn)了遺傳密碼的簡(jiǎn)并性，或?qū)е铝嗽诮o定位點(diǎn)上化學(xué)等同的氨基酸的產(chǎn)生。在某些場(chǎng)合下，可能實(shí)際上需要制備序列的突變體，以便研究有關(guān)改變對(duì)所述蛋白的生物學(xué)活性的影響。所建議的每一種修飾都是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的，確定在所編碼的產(chǎn)物中保留的生物學(xué)活性也是如此。
術(shù)語(yǔ)“表達(dá)”表示由編碼基因產(chǎn)物的序列的基因轉(zhuǎn)錄并且翻譯為所述基因產(chǎn)物。
術(shù)語(yǔ)“質(zhì)?！保拜d體”和“盒”表示染色體外元件，通常攜帶有不是細(xì)胞中心代謝的一部分的基因，并且通常是環(huán)狀雙鏈DNA分子形式的。所述元件可以是自主復(fù)制序列，基因組整合序列，噬菌體或核苷酸序列，線(xiàn)性的或環(huán)狀的單鏈或雙鏈DNA或RNA，其來(lái)自任何來(lái)源，其中的多個(gè)核苷酸序列業(yè)已連接或重組成獨(dú)特結(jié)構(gòu)，這種結(jié)構(gòu)能夠?qū)?dòng)子片段和編碼選擇的基因產(chǎn)物的DNA序列連同合適的3′非翻譯序列導(dǎo)入細(xì)胞?！稗D(zhuǎn)化盒”表示特定載體，其包括外源基因，并且除了所述外源基因之外還具有能促進(jìn)特定宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的元件?！氨磉_(dá)盒”表示特定載體，其包括外源基因，并且除了所述外源基因之外還具有能增強(qiáng)該基因在外源宿主中表達(dá)的元件。
術(shù)語(yǔ)“重組”表示形成在親本模板分子中不存在的遺傳組合的過(guò)程，這是通過(guò)交換或自由組合過(guò)程實(shí)現(xiàn)的。因此，重組包括可以由親本模板分子獲得的遺傳序列的所有組合(以便新產(chǎn)生的“重組產(chǎn)物”的每一個(gè)核苷酸位置能夠由特定核苷酸位置上的任何親本模板產(chǎn)生)；此外，重組包括導(dǎo)入新的突變(即，缺失，取代，插入)。
術(shù)語(yǔ)“重組多肽”表示由重組基因或DNA編碼的多肽。重組多肽通常具有改變了的或增強(qiáng)了的特性。
術(shù)語(yǔ)“改變了的特性”在用于多肽或蛋白時(shí)，表示可以通過(guò)測(cè)定方法測(cè)量的與由核苷酸序列編碼的蛋白相關(guān)的特征，其中，所述特征與和天然序列相關(guān)的特征相比增強(qiáng)了或減弱了?？梢愿淖兊拿傅膬?yōu)選特性的例子包括酶的活性，底物特異性，針對(duì)抑制劑的穩(wěn)定性，熱穩(wěn)定性，蛋白酶穩(wěn)定性，溶劑穩(wěn)定性，去污劑穩(wěn)定性，以及折疊特性?！霸鰪?qiáng)了的生物學(xué)特性”表示比與天然序列相關(guān)的特性更強(qiáng)的改變了的特性?！皽p弱了的生物學(xué)特性”是比與天然序列相關(guān)的特性更弱的改變了的特性。
術(shù)語(yǔ)“模板”或“親本模板”表示由DNA或RNA聚合酶按照沃森-克里克(Watson-Crick)堿基配對(duì)規(guī)則拷貝的核酸分子，以便產(chǎn)生新的DNA或RNA鏈。保留了所述模板(或“模型”)中的序列信息，因?yàn)橛赡０宸肿赢a(chǎn)生的第一個(gè)拷貝具有互補(bǔ)序列。模板分子可以是單鏈或雙鏈的，并且可來(lái)自任何來(lái)源。
“復(fù)制”是“模板核酸”的核酸鏈的互補(bǔ)拷貝通過(guò)聚合酶合成的過(guò)程。在“引物-指導(dǎo)的”復(fù)制中，該過(guò)程需要位于“雙鏈”“寡核苷酸”的末端核苷酸的(脫氧)核糖部分的3′位置的羥基(OH)來(lái)啟動(dòng)復(fù)制。
可以將核酸的“5′區(qū)”和“3′區(qū)”用作關(guān)于期望進(jìn)行重組的核苷酸區(qū)的相對(duì)術(shù)語(yǔ)。這些區(qū)可以位于模板分子內(nèi)或位于與模板分子連接的側(cè)翼DNA序列中。不配對(duì)的引物能夠與所述5′和3′區(qū)的一部分退火。
“側(cè)翼序列”或“側(cè)翼DNA片段”表示與模板分子的5′或3’區(qū)連接的DNA的短的片段，以便提供不配對(duì)的引物可以與它退火的獨(dú)特的核苷酸序列(相對(duì)模板分子而言)。
“全長(zhǎng)延伸產(chǎn)物”是通過(guò)引物指導(dǎo)的復(fù)制產(chǎn)生的核苷酸序列，它的長(zhǎng)度與在親本模板的5′和3’區(qū)之間所包含的部分的長(zhǎng)度非常類(lèi)似(大約100個(gè)堿基以?xún)?nèi))。
“擴(kuò)增”是以循環(huán)方式重復(fù)進(jìn)行復(fù)制的過(guò)程，以便“模板核酸”的拷貝數(shù)以線(xiàn)性或?qū)?shù)形式增加。
術(shù)語(yǔ)“引物”表示寡核苷酸(合成的或天然存在的)，它能夠起著在通過(guò)聚合酶催化互補(bǔ)鏈合成的條件下沿互補(bǔ)鏈的核酸合成或復(fù)制的起點(diǎn)的作用。所述引物必須具有與互補(bǔ)鏈退火的能力，這種能力是基于引物本身和核酸的互補(bǔ)鏈之間的序列互補(bǔ)性，不過(guò)，某些堿基錯(cuò)配是可以耐受的。在下面將對(duì)引物大小，堿基序列，互補(bǔ)性和目標(biāo)相互作用的要求作更詳細(xì)的討論。同樣，術(shù)語(yǔ)“引物”在本文中被申請(qǐng)人一般性地使用，包括任何結(jié)合序列的寡核苷酸，它起著啟動(dòng)核酸復(fù)制過(guò)程的作用(即，能夠引發(fā)合成)。
術(shù)語(yǔ)“正向引物”表示能夠在雙鏈模板分子的有義鏈的5’區(qū)引發(fā)合成的引物，或能夠在單鏈模板分子的5’區(qū)引發(fā)合成的引物。
術(shù)語(yǔ)“反向引物”表示能夠在雙鏈模板分子的反義鏈的5’區(qū)引發(fā)合成或者能夠在單鏈模板分子的5’區(qū)引發(fā)合成的引物，該單鏈模板分子是雙鏈模板分子的反義鏈。
術(shù)語(yǔ)“配對(duì)的引物”表示一對(duì)引物，由正向和反向引物組成，它被設(shè)計(jì)成與一個(gè)模板分子退火，并且能夠通過(guò)引物指導(dǎo)的核酸擴(kuò)增過(guò)程合成所述模板的精確拷貝。對(duì)于雙鏈模板分子來(lái)說(shuō)，正向和反向引物能夠合成雙鏈模板的精確拷貝，因?yàn)樗稣蛞锂a(chǎn)生了反義鏈的精確拷貝(它是用作模板的有義鏈的互補(bǔ)拷貝)，而所述反向引物產(chǎn)生了有義鏈的精確拷貝(它是用作模板的反義鏈的互補(bǔ)拷貝)。相反，當(dāng)模板分子是單鏈時(shí)，采用引物指導(dǎo)的核酸擴(kuò)增過(guò)程產(chǎn)生了所述模板的精確拷貝。
術(shù)語(yǔ)“不配對(duì)的引物”表示由正向和反向引物組成的一對(duì)引物，它們沒(méi)有被設(shè)計(jì)成能與一個(gè)模板分子退火，并且通過(guò)引物指導(dǎo)的核酸擴(kuò)增過(guò)程合成所述模板的精確拷貝。相反，所述正向引物能夠與第一模板分子退火，而不能與第二模板分子退火。反向引物能夠與在序列上與第一模板分子不同的第二模板分子退火，并且仍然不能與第一模板分子退火。不配對(duì)的引物的這種獨(dú)特設(shè)計(jì)確保單鏈或雙鏈模板分子不能通過(guò)引物指導(dǎo)的核酸擴(kuò)增過(guò)程擴(kuò)增，除非在復(fù)制期間通過(guò)模板轉(zhuǎn)換發(fā)生了重組。
術(shù)語(yǔ)“引物指導(dǎo)的延伸”表示本領(lǐng)域所公知的任何方法，其中，引物被用于在核酸分子的線(xiàn)性或?qū)?shù)擴(kuò)增中啟動(dòng)核酸序列的復(fù)制。例如，引物指導(dǎo)的延伸可以通過(guò)本領(lǐng)域已知的若干方案中的任意一種實(shí)現(xiàn)，包括，但不局限于聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)，連接酶鏈反應(yīng)(LCR)和鏈置換擴(kuò)增(SDA)。
GDH和編碼基因?qū)τ诟视拖?-HP的轉(zhuǎn)化來(lái)說(shuō)，負(fù)責(zé)催化該反應(yīng)的脫水酶可以是B12-依賴(lài)型脫水酶或B12-不依賴(lài)型脫水酶。不過(guò)，對(duì)于本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)，所述脫水酶是B12-依賴(lài)型脫水酶。這種B12-依賴(lài)型脫水酶可以是GDH，即甘油脫水酶(E.C.4.2.1.30)，或二醇脫水酶(E.C.4.2.1.28)。上述每一種酶都具有α2β2γ2結(jié)構(gòu)。為了清楚起見(jiàn)，由于在文獻(xiàn)中使用了各種不同的基因名稱(chēng)，在表2中提供了表示肺炎克雷伯氏菌，弗氏檸檬酸桿菌，巴氏梭菌，鼠傷寒沙門(mén)氏菌，丘狀菌落乳桿菌和產(chǎn)酸克雷伯氏菌的脫水酶基因的基因名稱(chēng)和GeneBank編號(hào)的比較表，以便于辨別。所述基因還描述于以下文獻(xiàn)中，例如，Daniel等(FEMS Microbiol.Rev.22553(1999))和Toraya和Mori(J.Biol.Chem.2743372(1999))。
表2脫水酶的基因名稱(chēng)和GenBank編號(hào)的比較表
對(duì)于本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)，將由肺炎克雷伯氏菌(WO01/012833A2)的dhaB1，dhaB2和dhaB3編碼的GDH(分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，3和4)用作誘變的靶。這種酶是一種甘油脫水酶，具有甘油的優(yōu)選底物，并且已知由兩個(gè)63kDa的α亞基，兩個(gè)21kDa的β亞基和兩個(gè)16kDa的γ亞基組成。不過(guò)，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解的是，弗氏檸檬酸桿菌，巴氏梭菌或其他肺炎克雷伯氏菌菌株的甘油脫水酶；或鼠傷寒沙門(mén)氏菌，產(chǎn)酸克雷伯氏菌或肺炎克雷伯氏菌的二醇脫水酶也適合本文所描述的技術(shù)。類(lèi)似的，編碼B12-依賴(lài)型脫水酶活性的，其中所述活性能夠催化甘油向3-HP轉(zhuǎn)化的任何基因都適合作為本發(fā)明的靶，包括含有不改變GDH酶的功能的氨基酸取代，缺失或添加的任何氨基酸序列。因此，本領(lǐng)域技術(shù)人員可以了解的是，從其他來(lái)源分離的編碼GDH的基因也適用于本發(fā)明。
在存在甘油或1，3-丙二醇條件下的B12-依賴(lài)型脫水酶失活催化期間通過(guò)甘油或通過(guò)與1，3-丙二醇相互作用使B12-依賴(lài)型脫水酶發(fā)生了不可逆的失活。失活涉及輔酶B12輔因子的鈷-碳(Co-C)鍵的裂解，導(dǎo)致了5′-脫氧腺苷和無(wú)活性的鈷胺素種類(lèi)的形成。所述無(wú)活性的鈷胺素種類(lèi)保持與脫水酶緊密結(jié)合；在沒(méi)有輔酶B12-依賴(lài)型脫水酶再激活因子干預(yù)的情況下不會(huì)發(fā)生解離。
圖1表示與GDH失活相關(guān)的一般時(shí)程。所述酶活性測(cè)定是使用由肺炎克雷伯氏菌(WO01/012833A2)的dhaB1，dhaB2和dhaB3編碼的GDH(分別為SEQ ID NO1和SEQ ID NO2，3和4)進(jìn)行的。圖1中的上部軌跡表示用10mM甘油(Km大約0.5mM)作底物的GDH反應(yīng)的時(shí)程，而下部軌跡表示在測(cè)定中包括50mM 1，3-丙二醇(Ki大約15mM)的效果。很顯然，根據(jù)一級(jí)失活速率常數(shù)(kinact obsd)，隨著失活的發(fā)生，3-HP產(chǎn)物形成的速率隨時(shí)間推移迅速減少。
具有改進(jìn)了的活性的突變體GDH根據(jù)觀察到的GDH失活，制備了相對(duì)于野生型GDH而言具有降低了的失活速率的一系列突變體GDHs。通常，所述方法涉及制備和分離在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下具有提高的總轉(zhuǎn)換數(shù)的突變型酶。這可以通過(guò)提高kcat和/或降低酶失活的速率實(shí)現(xiàn)。
提高GDH活性的方法涉及包括GDH基因的表達(dá)載體的構(gòu)建，GDH編碼序列的誘變，以及具有降低的失活速率的變體的最終分離。隨后幾輪誘變使得GDH編碼序列能夠進(jìn)化。
可以用任何野生型(或基本上相似)的B12-依賴(lài)型脫水酶作為誘變的原材料制備突變型B12-依賴(lài)型脫水酶文庫(kù)。
B12-依賴(lài)型脫水酶誘變的傳統(tǒng)方法可以將多種方法用于B12-依賴(lài)型脫水酶的誘變。本發(fā)明所使用的兩種合適方法包括易錯(cuò)PCR(Leung等，Techniques，111-15(1989)；Zhou等，Nucleic Acids Res.196052-6052(1991)；和Spee等，NucleicAcids Res.21777-778(1993))和體內(nèi)誘變。
易錯(cuò)PCR的主要優(yōu)點(diǎn)是通過(guò)該方法導(dǎo)入的所有突變都在B12-依賴(lài)型脫水酶基因上，并且任何改變都可以通過(guò)改變PCR條件方便地控制?；蛘撸梢圆捎皿w內(nèi)誘變，其中使用可通過(guò)商業(yè)渠道獲得的材料，如大腸桿菌XL1-Red菌株和Epicurian coli XL1-Red突變菌株，這些菌株來(lái)自Stratagene(La Jolla，CA；還可參見(jiàn)Greener和Callahan，Strategies732-34(1994))。該菌株在三個(gè)主要DNA修復(fù)途徑中是缺陷型的(mutS，mutD和mutT)，導(dǎo)致了突變率比野生型提高了5000倍。體內(nèi)誘變不依賴(lài)于連接效率(與易錯(cuò)PCR類(lèi)似)；不過(guò)，突變可以在載體的任何區(qū)域發(fā)生，并且突變率通常更低。
或者，預(yù)期可以使用“基因改組(shuffling)”方法(US 5,605,793；US 5,811,238；US 5,830,721和US 5,837,458)或促進(jìn)核酸之間的重組源活性的任何類(lèi)似方法構(gòu)建具有降低的失活速率的突變型B12-依賴(lài)型脫水酶。這種基因改組方法由于它便于實(shí)施和高的誘變率而特別有吸引力。所述基因改組方法涉及在存在與感興趣的基因相似(或不同)的DNA區(qū)的額外群體的條件下將感興趣的基因限制成特定大小的片段。然后對(duì)該片段庫(kù)進(jìn)行變性，并且重新退火，以便產(chǎn)生突變的基因。然后篩選具有改變了的活性的突變基因。
野生型B12-依賴(lài)型脫水酶序列可以通過(guò)該方法突變并篩選改變了的或增強(qiáng)了的活性。所述序列應(yīng)當(dāng)是雙鏈，并且可以具有從50bp到10kB的各種長(zhǎng)度?？梢允褂帽绢I(lǐng)域所熟知的限制性?xún)?nèi)切核酸酶將所述序列隨機(jī)消化成大約10bp-1000bp的片段(Maniatis，同上)。除了全長(zhǎng)序列之外，還可以添加能夠與所述序列的全部(或部分)雜交的片段群體。類(lèi)似的，還可以添加不能與野生型序列雜交的片段群體。通常，所述額外的片段群體是以與總核酸相比按重量計(jì)算超出10倍至20倍的量添加的。一般來(lái)說(shuō)，該方法可以在混合物中產(chǎn)生大約100-1000個(gè)不同的特定核酸片段。對(duì)所述隨機(jī)核酸片段的混合群體進(jìn)行變性，以便形成單鏈核酸片段并且然后重新退火。只有那些具有與其他單鏈核酸片段同源的區(qū)域的單鏈核酸片段能夠重新退火。可以通過(guò)加熱使所述隨機(jī)核酸片段變性。本領(lǐng)域技術(shù)人員可以確定使雙鏈核酸完全變性所需要的條件。所述溫度優(yōu)選為大約80℃-100℃?？梢酝ㄟ^(guò)冷卻使所述核酸片段重新退火。所述溫度優(yōu)選為大約20℃-75℃。通過(guò)添加聚乙二醇(“PEG”)或鹽可以加快復(fù)性。鹽的濃度優(yōu)選為0mM-200mM。然后在存在核酸聚合酶和dNTP′s(即，dATP，dCTP，dGTP和dTTP)的條件下溫育退火的核酸片段。所述核酸聚合酶可以是克列諾(Klenow)片段，Taq聚合酶或本領(lǐng)域已知的任何其他DNA聚合酶。可以在退火之前、在退火同時(shí)或在退火之后將所述聚合酶添加到隨機(jī)核酸片段中。將在存在聚合酶的條件下進(jìn)行的變性，復(fù)性和溫育的循環(huán)重復(fù)需要的次數(shù)。優(yōu)選將所述循環(huán)重復(fù)2-50次，更優(yōu)選將所述循環(huán)重復(fù)10-40次。所得到的核酸是長(zhǎng)度為大約50bp-大約100kB的較大的雙鏈多核苷酸，并且可以通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)克隆和表達(dá)方法篩選表達(dá)和改變的活性(Maniatis，同上)。
除了上述示例的方法之外(這些方法被設(shè)計(jì)成直接誘變編碼B12-依賴(lài)型脫水酶的基因)，還可以將制備突變體的傳統(tǒng)方法用于本文所描述的目的。例如，可以讓具有B12-依賴(lài)型脫水酶活性的野生型細(xì)胞接觸多種試劑，如輻射或化學(xué)誘變劑，然后篩選需要的表型。在通過(guò)輻射產(chǎn)生突變時(shí)，紫外線(xiàn)(UV)或電離輻射都可以使用。用于遺傳突變的合適的短波UV波長(zhǎng)在200nm-300nm范圍內(nèi)，其中254nm是優(yōu)選的。在該波長(zhǎng)下的UV輻射主要會(huì)導(dǎo)致核酸序列中的從胍和胞嘧啶到腺嘌呤和胸苷的改變。由于所有細(xì)胞都具備DNA修復(fù)機(jī)制，這種機(jī)制能夠修復(fù)大部分UV誘導(dǎo)的突變，所以可以添加諸如咖啡因和其他抑制劑的試劑，以便阻斷所述修復(fù)過(guò)程，并且使有效突變的數(shù)量最大化。使用波長(zhǎng)為300nm-400nm的長(zhǎng)波UV突變也是可行的；不過(guò)，該范圍通常不如短波UV光有效，除非與各種能與DNA相互作用的激活劑(如補(bǔ)骨脂素染料)組合使用。類(lèi)似的，用化學(xué)試劑進(jìn)行的誘變也能有效產(chǎn)生突變體，并且常用的物質(zhì)包括能影響非復(fù)制DNA的化學(xué)制劑(如HNO2和NH2OH)，以及能影響復(fù)制中的DNA的試劑(如吖啶染料，主要是導(dǎo)致移碼突變)。使用輻射或化學(xué)試劑制備突變體的具體方法在現(xiàn)有技術(shù)中有大量報(bào)道。參見(jiàn)例如，ThomasD.Brock in BiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology，2nded.；Sinauer AssociatesSunderland，MA(1989)；或Deshpande，Mukund V.，Appl.Biochem.Biotechnol.36227(1992)。
無(wú)論采用什么樣的誘變方法，基因都可能發(fā)生進(jìn)化，以便所述酶在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下具有提高的總轉(zhuǎn)換數(shù)。這一目的可以通過(guò)提高kcat和/或降低酶失活的速率而實(shí)現(xiàn)。
通過(guò)重組源延伸方法使用不配對(duì)的引物誘變B12-依賴(lài)型脫水酶圖5表示使用不配對(duì)的引物的重組源延伸方法的原理，該方法基于兩個(gè)基因之間的重組。該方法需要親本基因在其5′和3′末端具有不同的DNA序列。如果親本基因具有相同的5′和3′序列的話(huà)，則必須通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)PCR將短的側(cè)翼DNA片段連接在所述基因的5′或3′末端(如圖5的步驟A所示)。
然后，可以將所述PCR產(chǎn)物用作重組源延伸方法的模板，之前設(shè)計(jì)用于熱循環(huán)的兩種不配對(duì)的引物。引物-1能與模板-1的5’末端退火，但是不能與模板-2的5’末端結(jié)合。引物-2能與模板-2的3’末端退火，但是不能與模板-1的3’末端結(jié)合(步驟B)。由此確保了任意一個(gè)親本模板都不能通過(guò)熱循環(huán)反應(yīng)擴(kuò)增。
進(jìn)行了短的退火和合成循環(huán)，以便制備一系列短的DNA片段(步驟C)。在具有足夠同源性的情況下，上述某些DNA片段在隨后的退火循環(huán)(步驟D)中能夠與不同的模板退火(即，“模板轉(zhuǎn)換”)。然后，可以按圖5所示制備重組DNA片段。最終，可以制備具有模板-1的5’末端和模板-2的3’末端的重組DNA基因(步驟E)。
此時(shí)，以前不配對(duì)的引物-1和引物-2變成新產(chǎn)生的重組基因的配對(duì)的引物。進(jìn)一步的退火和合成循環(huán)能擴(kuò)增具有模板1的5’末端和模板-2的3’末端的重組DNA基因的庫(kù)(圖5的步驟F)。在所述擴(kuò)增步驟中，所述重組DNA基因還可以重組，這能夠增加重組DNA基因交換的數(shù)目。理論上講，所有擴(kuò)增的產(chǎn)物都應(yīng)當(dāng)是重組DNA產(chǎn)物。所述重組產(chǎn)物可以是由親本模板分子直接衍生的，或可以將額外的突變(例如，插入，缺失和取代)整合到最終的重組源產(chǎn)物中。親本模板在最終反應(yīng)混合物中的污染作用是可以忽略的。
有關(guān)這種方法的細(xì)節(jié)公開(kāi)于被收作本文參考的U.S.0/374366中。
鑒定具有改善了的動(dòng)力學(xué)性能的B12-依賴(lài)型脫水酶變體為了鑒定具有改善了的動(dòng)力學(xué)性能的B12-依賴(lài)型脫水酶變體(從大的群體中鑒定)，高通量測(cè)定方法的開(kāi)發(fā)能大大促進(jìn)篩選。本文公開(kāi)了一種簡(jiǎn)單的篩選方法，該方法依賴(lài)于兩種測(cè)量，以便提供對(duì)脫水酶變體相對(duì)于標(biāo)準(zhǔn)物(例如，野生型GDH)的kcat和/或總轉(zhuǎn)換數(shù)改善的評(píng)估。具體地講，GDH突變基因文庫(kù)通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)方法克隆到大腸桿菌中，以便進(jìn)行GDH表達(dá)，獲得分離物，并且在Lennox Broth中生長(zhǎng)，透化，并且測(cè)定GDH活性。盡管所述篩選方法是針對(duì)完整細(xì)胞中所含GDH進(jìn)行說(shuō)明的，但技術(shù)人員可以了解的是，所述方法可方便地進(jìn)行修飾，以便可應(yīng)用于粗制或純化制劑中的酶。
本發(fā)明所開(kāi)發(fā)的GDH測(cè)定依賴(lài)于GDH酶以它的脫輔基酶形式在不具有輔酶B12，脫水酶再激活因子或B12-依賴(lài)型脫水酶的來(lái)源的細(xì)胞中的存在。具有催化活性的GDH全酶只能在向培養(yǎng)基中添加輔酶B12時(shí)形成。因此，通過(guò)添加輔酶B12和底物甘油，能夠以很高的精度有效“開(kāi)啟”GDH反應(yīng)。這樣能夠精確控制GDH活性的持續(xù)時(shí)間(計(jì)時(shí))，并因此控制GDH活性測(cè)量的精確性。所述反應(yīng)是在零時(shí)間(時(shí)間＝t0)開(kāi)始的，并且測(cè)定在所述反應(yīng)開(kāi)始階段形成的產(chǎn)物(在緊接t0之后和之后和發(fā)生酶失活之前，時(shí)間＝t1)。另外，產(chǎn)物形成是在較長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)測(cè)定的(緊接t0之后一直到酶失活完成，時(shí)間＝t2)。產(chǎn)物(3-HP)形成的測(cè)定是基于比色醛測(cè)定的(Zurek G.，和U.Karst.Analytica Chimica Acta，351247-257(1997))。
對(duì)于GDH來(lái)說(shuō)，在存在飽和輔酶B12和甘油濃度的條件下，隨著時(shí)間推移產(chǎn)生的3-HP的量(y)是通過(guò)下式估算的y＝T0+AMP(1-exp(-kinact obsd*時(shí)間))，其中T0是在t0處的3-HP的量(背景)，AMP是在t0和GDH完全失活之間產(chǎn)生的3-HP的量(總轉(zhuǎn)換數(shù))，而kinact obsd是觀察到的一級(jí)失活速率常數(shù)。由于不存在1，3-丙二醇，所以kinact obsd完全是由kinact 甘油導(dǎo)致的(由甘油造成的一級(jí)失活速率常數(shù))(參見(jiàn)圖1的上部軌跡。AMP＝[GDH]*kcat/kinact obsd)。將該時(shí)程用于建立固定濃度的GDH，輔酶B12和甘油的合適的時(shí)間(t1和t2)。在校正T0之后，將在t1處形成的產(chǎn)物的量(T1，在酶失活發(fā)生之前)用于評(píng)估[GDH]*kcat；并且將在t2處形成的產(chǎn)物(T2，酶失活完成之后)用于評(píng)估總轉(zhuǎn)換數(shù)和[GDH]*kcat/kinact obsd。因此，T1值與kcat成正比，T2值與kcat/kinact obsd成正比，而T2/T1得出了1/kinact obsd。
在對(duì)固定濃度的野生型GDH，輔酶B12和甘油確定了適當(dāng)時(shí)間(t1和t2)之后(在沒(méi)有1，3-丙二醇的條件下)，在相同的測(cè)定條件下重新測(cè)定了T1和T2值，不過(guò)，添加了1，3-丙二醇(圖1，下部軌跡)。在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下，發(fā)生了競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用；并且，kinact obsd是kgly(由于甘油造成的一級(jí)失活速率常數(shù))和k1，3-丙二醇(由于1，3-丙二醇造成的一級(jí)失活速率常數(shù))的函數(shù)。在合適的1，3-丙二醇濃度下，T1值相對(duì)于在沒(méi)有1，3-丙二醇的條件下的值有可測(cè)量的降低(體現(xiàn)了1，3-丙二醇和甘油的競(jìng)爭(zhēng)性抑制作用)，并且T2值相對(duì)于在沒(méi)有1，3-丙二醇的條件下的值大大降低了(體現(xiàn)了k1，3-丙二醇＞kgly這一事實(shí))。對(duì)于兩點(diǎn)測(cè)定來(lái)說(shuō)，甘油存在的濃度為5-50mM，優(yōu)選10mM；并且1，3-丙二醇存在的濃度為10-300mM，優(yōu)選50mM。
申請(qǐng)人業(yè)已建立了在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下檢查野生型GDH對(duì)突變型變體的條件。在微觀水平上，向GDH中導(dǎo)入突變可能影響kcat，所述酶對(duì)甘油和/或1，3-丙二醇的親和力，以及相應(yīng)的kinact值。盡管最初無(wú)法確保所述親和力和速率常數(shù)是彼此獨(dú)立地改變的，但考慮所述參數(shù)的變化如何能夠影響在存在10mM甘油和50mM1，3-丙二醇的條件下進(jìn)行的兩點(diǎn)(T1和T2)測(cè)定的結(jié)果是有用的。具體地講，緩慢失活(kinact obsd的降低)導(dǎo)致了T2/T1比例的增加。另一方面，T1或T2的改變可能是由于所述酶的內(nèi)在特性改變所導(dǎo)致的。例如，在給定對(duì)甘油和1，3-丙二醇的恒定相對(duì)親和力的條件下，如果kcat和kinact值成比例地降低的話(huà)，那么T2/T1將會(huì)增加，不過(guò)T1會(huì)較低。另一方面，能與甘油正常的相互作用，不過(guò)，對(duì)1，3-丙二醇具有降低的相對(duì)親和力，或?qū)?，3-丙二醇失活具有更低的速率常數(shù)的突變體會(huì)表現(xiàn)出大致正常的T1，提高的T2和更高的T2/T1比例。具有正常的甘油和1，3-丙二醇親和力，但是對(duì)上述化合物都具有降低的kinact的突變體同樣表現(xiàn)出正常的T1，但是具有提高的T2和T2/T1比例。不會(huì)導(dǎo)致kinact或底物或1，3-丙二醇親和力的改變的kcat的增加，能夠提高T1和T2，但是不能提高T2/T1比例。盡管上面描述了多種改變，不過(guò)，本發(fā)明研究工作的最終目的是在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下提高GDH酶的總轉(zhuǎn)換數(shù)。這可以通過(guò)提高kcat和/或降低酶失活的速率實(shí)現(xiàn)。因此，與野生型相比，表現(xiàn)出選自下列的至少一種改進(jìn)的突變體被認(rèn)為具有改善了的特征更高的T1和/或更高的T2和/或更高的T2/T1值，或上述參數(shù)的任意組合。
當(dāng)與1，3-丙二醇濃度相比甘油的濃度較小時(shí)，不可能測(cè)量T1(以便評(píng)估kcat)，因此通過(guò)1，3-丙二醇發(fā)生了顯著失活。這種條件是相關(guān)的，因?yàn)楦叩?，3-丙二醇濃度和低的甘油濃度是生產(chǎn)1，3-丙二醇的過(guò)程所需要的?？紤]到所述問(wèn)題的這一方面，提供了上文所述的單點(diǎn)測(cè)定，所不同的是甘油是以xx至yymM的濃度提供的，優(yōu)選10mM；而1，3-丙二醇是以超過(guò)300mM的濃度，優(yōu)選600mM的濃度提供的。在該單點(diǎn)測(cè)定中，所述時(shí)間用tend表示，而所產(chǎn)生的3-HP的量用T(XXX)表示，其中，XXX是1，3-丙二醇的濃度(mM)。
影響輔酶B12失活的關(guān)鍵氨基酸的鑒定申請(qǐng)人描述了多種突變型GDH酶，所述酶與野生型基因相比，具有降低了的輔酶B12失活速率。所述突變體是采用上文所述的誘變和篩選方法鑒定的。所述突變體，改變了的氨基酸殘基，1/kinact obsd活性(以T2/T1形式測(cè)量)以及T2總結(jié)在表1中。在表格的第一欄中提供了所述酶的DNA序列的SEQ ID NO。
表3GDH突變體總結(jié)，以T2/T1為特征
在下面的表4中總結(jié)了同樣用上文所描述的誘變和篩選方法鑒定的其他突變體。該表格提供了有關(guān)每一種突變體，改變了的氨基酸殘基和T(600)活性的信息。在該表格的第一欄中提供了所述酶的DNA序列的SEQ ID NO。
表4GDH突變體的總結(jié)，以T(600)為特征
上面所公開(kāi)的多種突變型GDH酶具有降低的輔酶B12失活速率。本發(fā)明的優(yōu)選的突變體包括SEQ ID NOs40，44，48，52，56，60，64，68，72，76，80，84，88，92，96，100，104，108，112，116，120，124，128，132，136，140，143，147，151，155，159，163，167，171，175，179，182，186，189，192，195，198，201，204，208，212，215，218，221，225，229，233，237，241，245，249，253，257，261，265，269，273，277，281，285，289，293，297，301，304，307，310，313，316，319，322，325，328，331，334和337。本發(fā)明的更優(yōu)選的突變體是SEQ ID NOs140，179，186，189，192，195，198，201，212，215，218，301，304，307，310，313，316，319，322，325，328，331，334和337。本發(fā)明的最優(yōu)選的突變體是SEQ ID NOs313，322和328。
除了上述突變體之外，還可以合成具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的大型突變體庫(kù)，每一種突變體還具有在表2和3中所列舉的突變的一些組合。例如，具有多點(diǎn)突變的突變體GDH上的每一種突變可以針對(duì)改善所述酶的總體反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的理想作用進(jìn)行評(píng)估。如果需要的話(huà)，不能增強(qiáng)反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的任何突變都能夠恢復(fù)成野生型序列。同樣，上文所列舉的只具有單點(diǎn)突變的GDH突變體可以與上文所公開(kāi)的另一種突變組合，以便進(jìn)一步提高所述酶的活性。申請(qǐng)人公開(kāi)了GDH酶中的以下有用的突變，這些突變以多種組合形式用于生產(chǎn)其他突變型GDH酶，這些酶與野生型基因相比具有降低的輔酶B12失活速率。這些突變包括1.在α-亞基中TCA(α-Ser41)至TCG(Ser)；GTG(α-Val44)至GCG(Ala)；GTG(α-Val44)至GAG(Glu)；GGT(α-Gly47)至GGC(Gly)；CAG(α-Gln59)至CGG(Arg)；ATG(α-Met62)至GTG(Val)；ATG(α-Met62)至ACG(Thr)；ATG(α-Met62)至CTG(Leu)；ATC(α-Ile63)至GTC(Val)；GGG(α-Gly63)至GGA(Gly)；CGA(α-Arg65)至CAA(Gln)；ATC(α-Ile67)至GTC(Val)；TAC(α-Tyr70)至AAC(Asn)；GTT(α-Val74)至GTC(Val)；GTT(α-Val74)至ATT(Ile)；ACG(α-Thr77)至GCG(Ala)；GTG(α-Val86)至GAG(Glu)；CAC(α-His96)至CAT(His)；ATC(α-Ile102)至ACC(Thr)；ATC(α-Ile102)至GTC(Val)；ATC(α-Ile105)至ATT(Ile)；GTC(α-Val115)至GCC(Ala)；GAG(α-Glu116)至GAA(Glu)；GCG(α-Ala119)至ACG(Thr)；GTG(α-Val124)至GCG(Ala)；CGT(α-Arg134)至CGC(Arg)；CGG(α-Arg137)至AGG(Arg)；AAC(α-Asn141)至ATC(Ile)；TGC(α-Cys143)至TGT(Cys)；CTC(α-Leu148)至CGC(Arg)；AAA(α-Lys149)至AGA(Arg)；AAA(α-Lys149)至CAA(Gln)；GAT(α-Asp150)至CAT(His)；GAT(α-Asp150)至GAC(Asp)；AAT(α-Asn151)至AAC(Asn)；CCG(α-Pro152)至CCC(Pro)；TCA(α-Ser168)至CCA(Pro)；TGC(α-Cys193)至AGC(Ser)；GAG(α-Glu209)至GAA(Glu)；ATG(α-Met214)至TTG(Leu)；GGC(α-Gly216)至GGG(Gly)；TTA(α-Leu217)至GTA(Val)；AGC(α-Ser219)至AAC(Asn)；GTG(α-Val224)至CTG(Leu)；GTG(α-Val224)至ATG(Met)；GTG(α-Val224)至TTG(Leu)；GTC(α-Val226)至GCC(Ala)；GCG(α-Ala231)至ACG(Thr)；TTT(α-Phe233)至CTT(Leu)；GGC(αGly236)至AGC(Ser)；GAG(α-Glu240)至GAA(Glu)；CAG(α-Gln242)至CAA(Gln)；ATG(α-Met257)至GTG(Val)；ATG(α-Met257)至ACG(Thr)；CTG(α-Leu268)至CTA(Leu)；TAT(α-Tyr271)至TGT(Cys)；ACT(α-Asn288)至ACC(Asn)； GTG(α-Val301)至GTA(Val)；ATG(α-Met306)至CTG(Leu)；ATG(α-Met306)至TTG(Leu)；GCT(α-Ala309)至GCC(Ala)；ATT(α-Ile314)至GTT(Val)；CTG(α-Leu318)至TTG(Leu)；CAG(α-Gln337)至CAA(Gln)；TTC(α-Phe339)至GTC(Val)；CGC(α-Arg346)至CGG(Arg)；ACC(α-Thr350)至GCC(Ala)；GCC(α-Ala376)至GCT(Ala)；GTT(α-Val423)至ATT(Ile)；CGC(α-Arg425)至CGT(Arg)；CCG(α-Pro430)至TCG(Ser)；AAC(α-Asn447)至AAT(Asn)；CCG(α-Pro450)至CCA(Pro)；GCG(α-Ala460)至GCA(Ala)；GTG(α-Val461)至GGG(Gly)；GAA(α-Glu462)至GAG(Glu)；AAC(α-Asn468)至AAT(Asn)；ACC(α-Thr470)至GCC(Ala)；AGC(α-Ser481)至AGT(Ser)；AAT(α-Asn489)至AGT(Ser)；ACC(α-Thr499)至GCC(Ala)；TAC(α-Tyr502)至CAC(His)；CTC(α-Leu509)至TTC(Phe)；CTC(α-Leu509)至TTT(Phe)；TTC(α-Phe513)至CTC(Leu)；AAC(α-Asn520)至AGC(Ser)；CGC(α-Arg533)至GGC(Gly)；GTT(α-Val549)至GCT(Ala)；ACC(α-Thr553)至ACG(Thr)；TAA(α的終止)至CAA(Gln)；TAA(α-的終止)至GAA(Glu)；2.在β-亞基中CAA(β-Gln2)至CGA(Arg)；TTT(β-Phe11)至TTA(Leu)；TTT(β-Phe11)至TTC(Phe)；CTG(β-Leu13)至CCG(Pro)；AAA(β-Lys14)至AGA(Arg)；GGG(β-Gly19)至GAG(Glu)；GAT(β-Asp24至GGT(Gly)；GAT(β-Asp24)至GAA(Glu)；GAA(β-Glu25)至GAG(Glu)；GCC(β-Ala27)至TCC(Ser)；GAA(β-Glu29)至GAG(Glu)；ACT(β-Thr45)至GCT(Ala)；GCG(β-Ala53)至GTG(Val)；AAA(β-Lys56)至AGA(Arg)；CTG(β-Leu58)至CTT(Leu)；GAA(β-Glu64)至GAG(Glu)；CTT(β-Leu67)至CTC(Leu)；CGG(β-Arg70)至CGA(Arg)；GCC(β-Ala88)至GCT(Ala)；GAT(β-Asp111)至GAA(Glu)；CTG(β-Leu113)至CCG(Pro)；TCT(β-Ser122)至CCC(Pro)；GAG(β-Glu130)至GGG(Gly)；CCG(β-Pro152)至ACG(Thr)；CCG(β-Pro152)至TCG(Ser)；AAC(β-Asn155)至AGC(Ser)；AAC(β-Asn155)至AAG(Lys)；AAA(β-Lys166)至AGA(Arg)；AAA(β-Lys173)至GAA(Glu)；GAC(β-Asp181)至GGC(Gly)；CCC(β-Pro184)至CCT(Pro)；和3.在γ-亞基中AAA(γ-Lys4)至AAG(Lys)；ATC(γ-Ile21)至ACC(Thr)；AAA(γ-Lys27)至AGA(Arg)；GAG(γ-Glu35)至AAG(Lys)；ATC(γ-Ile49)至ACC(Thr)；ACC(γ-Thr53)至GCC(Ala)；ACC(γ-Thr53)至TCC(Ser)；ACC(γ-Thr53)至TGT(Cys)；CAT(γ-His67)至TAT(Tyr)；AAT(γ-Asn72)至AGT(Ser)；CAG(γ-Gln101)至CGG(Arg)；ACC(γ-Thr114)至TCC(Ser)；ACC(γ-Thr114)至GCC(Ala)；GCC(γ-Ala122)至GTC(Val)；GCG(γ-Ala128)至GTG(Val)；和CTG(γ-Leu137)至CTA(Leu)。
可以在除了野生型GDH之外的其他B12-依賴(lài)型脫水酶中產(chǎn)生類(lèi)似的核苷酸和氨基酸突變。感興趣的B12-依賴(lài)型脫水酶與GDH的比對(duì)能夠表明需要突變的精確核苷酸/堿基位置。
本發(fā)明不僅包含上面所描述的具體突變，而且還包括能夠產(chǎn)生化學(xué)上等同的氨基酸取代的突變。因此，例如，用脂族，非極性氨基酸丙氨酸進(jìn)行氨基酸取代時(shí)，預(yù)期相同的位點(diǎn)可能被化學(xué)上等同的氨基酸絲氨酸所取代。
脫水酶的蛋白工程現(xiàn)在可能通過(guò)將有關(guān)三維結(jié)構(gòu)的信息和經(jīng)典的蛋白化學(xué)與遺傳工程和分子作圖的方法組合在一起，即蛋白工程，來(lái)嘗試改變蛋白的多種特性。這種用于獲得具有改變了的活性的酶的方法首先依賴(lài)于模型分子的產(chǎn)生，或使用與未知結(jié)構(gòu)具有類(lèi)似序列的已知結(jié)構(gòu)。
對(duì)于本發(fā)明的目的來(lái)說(shuō)，以前業(yè)已通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)測(cè)定了無(wú)底物形式的B12-依賴(lài)型甘油脫水酶的三維晶體結(jié)構(gòu)(Liao等，J.InorganicBiochem.(in press))；另外，業(yè)已報(bào)道了在與1，2-丙二醇形成的復(fù)合物中的酶的結(jié)構(gòu)(Yamanishi等，Eur.J.Biochem.2694484-4494(2002))。通過(guò)B12-依賴(lài)型甘油脫水酶的這些三維模型，以及對(duì)突變的“熱點(diǎn)”通常位于在反應(yīng)動(dòng)力學(xué)方面表現(xiàn)出提高的活性的脫水酶的什么位置的理解(以便降低自殺失活的速率)，人們能夠靶定脫水酶結(jié)構(gòu)中的區(qū)域，在這里，結(jié)構(gòu)中的其他修飾可能造成所述蛋白特性的理想的變化。因此，例如，針對(duì)以下野生型殘基的區(qū)域定點(diǎn)誘變預(yù)期會(huì)產(chǎn)生具有改善了的催化活性的其他脫水酶變體1.)62-70位殘基(包括來(lái)自α-亞基N-末端的第二個(gè)α螺旋)；和/或2.)219-236位殘基(位于活性位點(diǎn)附近的區(qū)域，包括α-亞基的TIM桶的第四β-鏈的一部分以及隨后的環(huán)和一個(gè)短的螺旋)。
重組脫水酶在宿主細(xì)胞中的表達(dá)用于通過(guò)表達(dá)編碼脫水酶的基因重組生產(chǎn)3-HP和1，3-丙二醇的合適的宿主細(xì)胞可以是原核細(xì)胞或真核細(xì)胞，并且僅僅受它們表達(dá)活性酶的能力的限制。優(yōu)選的宿主是一般用于生產(chǎn)3-HP或1，3-丙二醇的宿主，如檸檬酸桿菌屬(Citrobacter)，腸桿菌屬(Enterobacter)，梭菌屬(Clostridium)，克雷伯氏菌屬(Klebsiella)，氣桿菌屬(Aerobacter)，乳桿菌屬(Lactobacillas)，曲霉屬(Aspergillus)，糖酵母屬(Saccharomyces)，裂殖糖酵母屬(Schizosaccharomyces)，接合糖酵母屬(Zygosaccharomyces)，畢赤氏酵母屬(Pichia)，克魯維氏酵母屬(Kluyveromyces)，假絲酵母屬(Candida)，漢遜氏酵母屬(Hansenula)，德巴利氏酵母屬(Debarymyces)，毛霉屬(Mucor)，球擬酵母屬(Torulopsis)，甲基細(xì)菌屬(Methylobacter)，埃希氏菌屬(Escherichia)，沙門(mén)氏菌屬(Salmonella)，芽孢桿菌屬(Bacillus)，鏈霉菌屬(Streptomyces)和假單胞菌屬(Pseudomonas)。在本發(fā)明中更優(yōu)選的是大腸桿菌，蟑螂埃希氏菌(E.blattae)，克雷伯氏菌屬，檸檬酸桿菌屬和氣桿菌屬。
適合將編碼合適的脫水酶的基因克隆，轉(zhuǎn)化和表達(dá)進(jìn)宿主細(xì)胞的載體，轉(zhuǎn)化方法和表達(dá)盒為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。合適的載體是與被用作宿主細(xì)胞的細(xì)菌相容的載體。因此，合適的載體可來(lái)自，例如，細(xì)菌，病毒(例如，噬菌體T7或M-13衍生的噬菌體)，粘粒，酵母或植物。用于獲得和使用所述載體的方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所知(Sambrook等，同上)。
通常，載體或盒包括指導(dǎo)相關(guān)基因轉(zhuǎn)錄和翻譯的序列，選擇標(biāo)記和允許自主復(fù)制或進(jìn)行染色體整合的序列。合適的載體包括具有轉(zhuǎn)錄起始控制的基因5′的區(qū)域和控制轉(zhuǎn)錄終止的DNA片段3′的區(qū)域。最優(yōu)選的是，兩個(gè)控制區(qū)都來(lái)自與轉(zhuǎn)化的宿主細(xì)胞同源的基因，盡管應(yīng)當(dāng)理解的是，所述控制區(qū)不一定來(lái)自被選擇用作生產(chǎn)宿主的特定物種的天然基因。
用于驅(qū)動(dòng)本發(fā)明的相關(guān)基因在理想的宿主細(xì)胞中表達(dá)的起始控制區(qū)(或啟動(dòng)子)有很多種，并且是本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟悉的。實(shí)際上，能夠驅(qū)動(dòng)所述基因的任何啟動(dòng)子都是適合本發(fā)明的，包括，但不局限于CYC1，HIS3，GAL1，GAL10，ADH1，PGK，PHO5，GAPDH，ADC1，TRP1，URA3，LEU2，ENO，TPI(用于在糖酵母屬中表達(dá))；AOX1(用于在畢赤氏酵母屬中表達(dá))；和lac，trp，λPL，λPR，T7，tac和trc(用于在大腸桿菌中表達(dá))。
終止控制區(qū)也可來(lái)自所述優(yōu)選宿主的多種天然基因。終止位點(diǎn)任選地不是必需的；不過(guò)，如果包括終止位點(diǎn)的話(huà)是最優(yōu)選的。
一旦構(gòu)建了合適的盒，就將其用于轉(zhuǎn)化合適的宿主細(xì)胞。將包括編碼突變型脫水酶的基因的盒導(dǎo)入宿主細(xì)胞可以通過(guò)已知方法實(shí)現(xiàn)，如通過(guò)轉(zhuǎn)化(例如，使用鈣-透化的細(xì)胞，電穿孔)，或通過(guò)使用重組噬菌體病毒轉(zhuǎn)染(Sambrook等，同上)。
通過(guò)發(fā)酵進(jìn)行的工業(yè)生產(chǎn)本發(fā)明的發(fā)酵培養(yǎng)基必須包括合適的碳底物。合適的底物為發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所公知。優(yōu)選的碳底物是甘油，二羥基丙酮，單糖，寡糖，多糖和一碳底物。更優(yōu)選的是糖類(lèi)(例如，葡萄糖，果糖，蔗糖)和單碳底物(例如，甲醇和二氧化碳)。最優(yōu)選的是葡萄糖。
除了合適的碳源之外，發(fā)酵培養(yǎng)基必須包括本領(lǐng)域技術(shù)人員所知的合適的礦物質(zhì)，鹽，輔因子，緩沖液和其他成分，這些成分適合培養(yǎng)物的生長(zhǎng)，并且適于促進(jìn)3-HP和1，3-丙二醇生產(chǎn)所必需的酶促途徑。要特別關(guān)注的是Co(II)鹽和/或維生素B12或它的前體。
通常，細(xì)胞是在30℃在合適培養(yǎng)基中生長(zhǎng)的。本發(fā)明優(yōu)選的生長(zhǎng)培養(yǎng)基是常見(jiàn)的商業(yè)化制備的培養(yǎng)基，如Luria Bertani(LB)培養(yǎng)液，沙氏葡糖(Sabouraud Dextrose)(SD)培養(yǎng)液或酵母麥芽汁(YM)培養(yǎng)液。還可以使用其他確定的或合成的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，并且適合生長(zhǎng)特定微生物的培養(yǎng)基是微生物學(xué)或發(fā)酵科學(xué)領(lǐng)域的技術(shù)人員所知的。
預(yù)期本發(fā)明可以使用分批，補(bǔ)料分批或連續(xù)方法實(shí)施，并且任何已知的發(fā)酵模式都是合適的(Brock詳細(xì)介紹了多種方法，同上)。另外，預(yù)期可以將細(xì)胞作為完整的細(xì)胞催化劑固定在底物上，并且接受3-HP或1，3-丙二醇生產(chǎn)的發(fā)酵條件。
預(yù)期改善了的B12-依賴(lài)型脫水酶突變體可用于用多種方法中生產(chǎn)3-HP和1，3-丙二醇，不依賴(lài)于所使用的碳底物(US 5686276，甘油至3-HPA)。相關(guān)菌株的重組體可以由US 10/420587(DuPont 2002)的質(zhì)粒中所描述的脫水酶交換得到，該文獻(xiàn)被收作本文參考。
在下面的實(shí)施例中將對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的限定。應(yīng)當(dāng)理解的是，這些實(shí)施例盡管表明了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方案，但是僅僅是以說(shuō)明形式提供的。根據(jù)上述討論和這些實(shí)施例，本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠確定本發(fā)明的實(shí)質(zhì)性特征，并且在不超出本發(fā)明精神和范圍的前提下，可對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改變和修飾，以便使它適應(yīng)各種用途和條件。
實(shí)施例一般方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增，用內(nèi)切核酸酶和外切核酸酶進(jìn)行DNA修飾(用于產(chǎn)生克隆DNA和連接所需要的末端)，以及細(xì)菌轉(zhuǎn)化所需要的方法為本領(lǐng)域所公知。本發(fā)明采用了標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)，并且描述于以下文獻(xiàn)中Sambrook，J.，F(xiàn)ritsch，E.F.和Maniatis，T.in Molecular CloningA Laboratory Manual，2nd ed.(Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring Harbor，NY，1989；下文稱(chēng)為“Maniatis”)；Silhavy，T.J.，Bennan，M.L.和Enquist，L.W.in Experiments with GeneFusions(Cold Spring Harbor LaboratoryCold Spring，NY，1984)；和Ausubel等in Current Protocols in Molecular Biology(GreenePublishing and Wiley-Interscience；1987)。
適合細(xì)菌培養(yǎng)物維持和生長(zhǎng)的材料和方法為本領(lǐng)域所公知。適用于下面的實(shí)施例中的技術(shù)可以從以下文獻(xiàn)中查閱到1.)Manual ofMethods for General Bacteriology(Phillipp Gerhardt，R.G.E.Murray，Ralph N.Costilow，Eugene W.Nester，Willis A.Wood，Noel R.Krieg和G.Briggs Phillips，Eds.，American Society forMicrobiologyWashington，D.C.，1994)；或2.)Brock，T.D.inBiotechnologyA Textbook of Industrial Microbiology，2nd ed.(Sinauer AssociatesSunderland，MA，1989)。用于生長(zhǎng)和維持細(xì)菌細(xì)胞的所有試劑，限制酶和材料都是從Aldrich Chemicals(Milwaukee，WI)，DIFCO Laboratories(Detroit，MI)，GIBCO/BRL(Gaithersburg，MD)，Sigma Chemical Company(St.Louis，MO)，或Promega(Madison，WI)獲得的，除非另有說(shuō)明。PCR反應(yīng)是在GeneAMPPCR系統(tǒng)9700上進(jìn)行的，其中使用Amplitaq或Amplitaq Gold酶(PEApplied Biosystems，F(xiàn)oster City，CA)，除非另有說(shuō)明。循環(huán)條件和反應(yīng)是按照生產(chǎn)商的說(shuō)明標(biāo)準(zhǔn)化的，除了在本文中另有說(shuō)明。
DNA測(cè)序反應(yīng)是在ABI 377自動(dòng)測(cè)序儀(PE Applied Biosystems)或在PTC-200 DNA Engine(MJ Research，Waltham，MA)上進(jìn)行的，其中使用Expand High Fidelity PCR System(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)，除非另有說(shuō)明。同樣，數(shù)據(jù)是使用Vector NTI程序(InforMax，Inc.，Bethesda，MD)或DNAstar程序(DNASTAR Inc.，Madison，WI)處理的。
縮寫(xiě)的含義如下縮寫(xiě)的含義如下“sec”表示秒，“min”表示分鐘，“hr”表示小時(shí)，“d”表示天，“μL”表示微升，“mL”表示毫升，“L”表示升，“mm”表示毫米，“μm”表示微米，“nm”表示納米，“mM”表示毫摩爾的，“μM”微摩爾的，“nM”表示納摩爾的，“M”表示摩爾的，“mmol”表示毫摩爾，“μmol”表示微摩爾，“ng”表示納克，“mg”表示毫克，“g”表示克，“kB”表示千堿基，“mU”表示毫單位，且“U”表示單位。
菌株，載體和培養(yǎng)條件將大腸桿菌BL21(DE3)細(xì)胞用于酶超表達(dá)(Shuster，B.和Retey，J.，F(xiàn)EBS Lett.349252-254(1994))。大腸桿菌XL1-Blue細(xì)胞是從Stratagene(La Jolla，CA)購(gòu)買(mǎi)的。野生型大腸桿菌5K最初是從ColiGenetic Stock Center(CGSC #4510；Yale University，New Haven，CT)獲得的，并且用λDE3使它溶原化(5K(DE3))。載體pBluescriptII SK+是從Stratagene購(gòu)買(mǎi)的。
用于分子生物學(xué)用途的所有試劑盒都是按照生產(chǎn)商的說(shuō)明使用的，除非另有說(shuō)明。
實(shí)施例1構(gòu)建“Xba-文庫(kù)”靶向GDH的α-，β-和γ-亞基的隨機(jī)誘變采用易錯(cuò)PCR擴(kuò)增，制備了靶向肺炎克雷伯氏菌dhaB1，dhaB2和dhaB3基因的隨機(jī)突變體文庫(kù)。對(duì)所述文庫(kù)進(jìn)行的代表性序列分析證實(shí)了每kB具有大約4.2個(gè)點(diǎn)突變；酶活性測(cè)量確定該文庫(kù)中大約15-25％的突變體是活性的。
易錯(cuò)PCR擴(kuò)增Emptage等(WO01/12833)描述了質(zhì)粒pDT2的構(gòu)建，它包括肺炎克雷伯氏菌dhaB1，dhaB2和dhaB3基因(SEQ ID NO1)。質(zhì)粒pGD20是通過(guò)將pDT2的HindIII/XbaI片段(包括dhaB1，dhaB2，和dhaB3)插入pBluescript II SK+(Stratagene)中構(gòu)建的，它將GDH基因的表達(dá)置于T7啟動(dòng)子的控制之下。
制備了靶向GDH的所有三個(gè)基因的隨機(jī)產(chǎn)生的突變體文庫(kù)。首先，通過(guò)易錯(cuò)PCR，由pGD20擴(kuò)增包括dhaB1(1668bp)，dhaB2(585bp)和dhaB3(426bp)的序列，其中使用了以下引物DHA-F1(SEQ ID NO5)和DHA-R1(SEQ ID NO6)。將Clontech誘變?cè)噭┖?ClontechLaboratories，Inc.，Palo Alto，CA)用于實(shí)施易錯(cuò)PCR。反應(yīng)混合物由以下成分組成38μl PCR級(jí)水，5μl 10x AdvanTaq Plus緩沖液，2μl MnSO4(8mM)，1μl dGTP(2mM)，1μl 50x多樣化dNTP混合物，1μl引物混合物，1μl模板DNA和1μl AdvanTaq Plus聚合酶。熱循環(huán)反應(yīng)是按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行的。用Hind III/XbaI消化2.7kB PCR產(chǎn)物，并且制備用于連接。
突變體文庫(kù)構(gòu)建盡管使用HindIII和XbaI消化能夠從pGD20構(gòu)建體上除去包括GDH的所有三個(gè)基因的整個(gè)插入片段，但所述插入片段的大小大約為2.7kB，而所述載體的大小大約為2.9kB。為了方便在瓊脂糖凝膠上分離這兩種片段，用HindIII，XbaI和PstI消化pGD20。PstI不能切割所述載體，相反，只能在三個(gè)位置上切割所述插入片段，從而由所述插入片段產(chǎn)生了四個(gè)小的片段。因此，消化過(guò)的載體以大約2.9kB的大小在瓊脂糖凝膠上遷移，而不會(huì)受到其他DNA片段的污染。然后將HindIII/XbaI/PstI-消化過(guò)的載體與HindIII/XbaI-消化過(guò)的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物連接。在乙醇沉淀之后，連接混合物可用于轉(zhuǎn)化。
連接混合物的轉(zhuǎn)化由于T7啟動(dòng)子被用于所述突變體文庫(kù)，將用λDE3溶原化的大腸桿菌細(xì)胞用作宿主細(xì)胞，以進(jìn)行突變型酶的表達(dá)。具體地講，將5K(DE3)大腸桿菌菌株用于突變體文庫(kù)構(gòu)建。首先，按以下方法制備電穿孔感受態(tài)5K(DE3)細(xì)胞將2.5mL的過(guò)夜細(xì)胞培養(yǎng)物添加到裝在2L無(wú)菌燒瓶中的500mL的LB培養(yǎng)液中。在37℃下，在搖床上溫育所述培養(yǎng)物，直到OD600達(dá)到0.5-0.8。然后在冰上溫育所述細(xì)胞10分鐘，然后在4℃下離心10分鐘。在用500mL冰冷的水洗滌所述細(xì)胞1次之后，將所述細(xì)胞重新懸浮到1-2mL的10％冰冷的甘油中。在無(wú)菌eppendorf管中制備等分試樣(50μL)，并且馬上在干冰中冷凍。所述感受態(tài)細(xì)胞在-80℃下保存。
為了進(jìn)行轉(zhuǎn)化，將1μL的連接混合物添加到40μL的感受態(tài)細(xì)胞中，并且將所述樣品轉(zhuǎn)移到電穿孔杯中，所述杯具有0.1cm的間隙。將1.7kv/cm的電壓用于電穿孔。將所述細(xì)胞鋪平板到含有氨芐青霉素的LB平板上，并且在37℃下溫育過(guò)夜。
“Xba”突變體文庫(kù)的DNA序列分析隨機(jī)挑取9個(gè)突變菌落進(jìn)行DNA測(cè)序分析。在測(cè)序之后，分析每一個(gè)突變體所產(chǎn)生的突變的數(shù)量，突變的位置，以及所觀察到的突變的特定類(lèi)型。所述分析發(fā)現(xiàn)了在突變體中出現(xiàn)了所有類(lèi)型的堿基置換，表明了缺乏對(duì)特定突變類(lèi)型的偏倚。另外，在9個(gè)分析過(guò)的突變克隆中只觀察到了一種缺失突變；沒(méi)有鑒定到堿基插入突變。這表明了在所述突變體文庫(kù)中缺失和插入的頻率是非常低的。每kB的平均突變率為4.2個(gè)點(diǎn)突變。GDH活性測(cè)量表明了在所述文庫(kù)中大約有15-25％的突變體是活性的。
實(shí)施例 2“Sma-文庫(kù)”的構(gòu)建靶向GDH的α-亞基和β-亞基的一部分的隨機(jī)誘變生成了主要靶向肺炎克雷伯氏菌dhaB1基因的第二種隨機(jī)突變體文庫(kù)。對(duì)所述文庫(kù)進(jìn)行的代表性序列分析證實(shí)了每kB存在大約4.5個(gè)點(diǎn)突變；酶活性測(cè)量確定了該文庫(kù)中大約15-25％的突變體是活性的。
易錯(cuò)PCR擴(kuò)增和突變體文庫(kù)構(gòu)建通過(guò)易錯(cuò)PCR，用pGD20作模板將以下引物用于擴(kuò)增完整的dhaB1基因和dhaB2基因的大約200bp的部分DHA-F1(SEQ ID NO5)和DHA-R2(SEQ ID NO7)。易錯(cuò)PCR反應(yīng)是使用Clontech誘變?cè)噭┖羞M(jìn)行的，正如在實(shí)施例1中所描述的。然后用HindIII和SmaI消化1.9kBPCR產(chǎn)物。
為了制備載體，用HindIII和SmaI消化pGD20質(zhì)粒(以便除掉野生型dhaB1基因和dhaB2基因的一部分)，并且然后從瓊脂糖凝膠上純化。將HindIII/SmaI-消化的易錯(cuò)PCR產(chǎn)物與HindIII/SmaI-消化的pGD20載體連接。通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌5K(DE3)，與實(shí)施例1中所描述的制備突變體文庫(kù)的方法類(lèi)似。
“Sma”突變體文庫(kù)的DNA序列分析隨機(jī)挑取10個(gè)突變菌落進(jìn)行DNA測(cè)序分析，以便檢查所述文庫(kù)的完整性。對(duì)于每一種突變體來(lái)說(shuō)，測(cè)定了所產(chǎn)生的突變的數(shù)量，突變的位置，以及觀察到的突變的特定類(lèi)型。根據(jù)以上結(jié)果，確定Sma-文庫(kù)中的平均突變率為每kB4.5個(gè)點(diǎn)突變。不存在對(duì)任何特定突變類(lèi)型的明顯偏倚，并且在所述突變體文庫(kù)中缺失和插入的頻率非常低。酶活性測(cè)量發(fā)現(xiàn)該文庫(kù)中大約15-25％的突變體是活性的。
實(shí)施例3靶向GDH的α-亞基的氨基酸No.141-152(“PpuMI-文庫(kù)”)、219-226(“4BR1-文庫(kù)”)和330-342(“RsrII-文庫(kù)”)的區(qū)域隨機(jī)誘變根據(jù)GDH的晶體結(jié)構(gòu)(Liao等，J Inorganic Biochem.93(1-2)84-91(2003)；Yamanishi等，Eur.J.Biochem.2694484-4494(2002))，靶向GDH的α-亞基的下述區(qū)域進(jìn)行區(qū)域隨機(jī)誘變1)氨基酸No.141-152；2)氨基酸No.219-226；和3)氨基酸No.330-342。由于這些區(qū)域中的每一個(gè)的長(zhǎng)度都相當(dāng)短，將寡核苷酸指導(dǎo)的誘變方法用于制備這三種突變體文庫(kù)。該方法涉及到多步驟過(guò)程，其中，首先產(chǎn)生了相應(yīng)于要突變的每一個(gè)區(qū)域的上游或下游的唯一限制位點(diǎn)的沉默突變，以便于克隆。然后，制備簡(jiǎn)并寡核苷酸引物，并用于PCR反應(yīng)，以便誘變?chǔ)?亞基的所述靶區(qū)域。然后將所述誘變的PCR片段克隆到大腸桿菌中，以便產(chǎn)生“PpuMI-文庫(kù)”，“4BR1-文庫(kù)”和“RsrII-文庫(kù)”。
在pGD20中導(dǎo)入沉默突變?cè)诿恳粋€(gè)靶區(qū)域的上游或下游產(chǎn)生一個(gè)沉默突變，以便在質(zhì)粒pGD20上產(chǎn)生唯一的限制位點(diǎn)。使用以下引物對(duì)在每一個(gè)區(qū)域產(chǎn)生點(diǎn)突變。在每一個(gè)引物中用大寫(xiě)的粗體字母表示的核苷酸表示要引入特定突變的位置。
表5靶氨基酸中沉默突變的形成
誘變實(shí)驗(yàn)是使用Stratagene′s QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?LaJolla，CA)，按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行的。在誘變之后，從每一種突變克隆中純化質(zhì)粒。通過(guò)限制酶消化證實(shí)所述點(diǎn)突變，然后進(jìn)行直接DNA序列分析。
寡核苷酸指導(dǎo)的誘變?yōu)榱酥苽鋮^(qū)域性隨機(jī)突變體文庫(kù)，合成了三種簡(jiǎn)并寡核苷酸(pGD20RM-F3，TB4B-R1和GD20RM-R4，如下面所示出)。將正常條件用于寡核苷酸合成，合成用大寫(xiě)字母表示的核苷酸。相反，用小寫(xiě)的粗體字母表示的核苷酸在合成期間使用了在每一種引物下面所示出的簡(jiǎn)并核苷酸混合物。因此，預(yù)期1-2個(gè)點(diǎn)突變產(chǎn)生了所述引物的每一個(gè)“簡(jiǎn)并區(qū)”。
pGD20RM-F3(用于a.a.141-a.a.152區(qū)-“PpuMI文庫(kù)”)
5’-GCC CGC AGG ACC CCC TCC aac cag tgc cac gtc acc aatctc aaa gat aat ccg GTG CAG ATT-3’(SEQ ID NO15)a＝94％A與2％G，2％C和2％T混合；g＝94％G與2％A，2％C和2％T混合；c＝94％C與2％G，2％A和2％T混合；t＝94％T與2％G，2％C和2％A混合。
TB4B-R1(用于a.a.219-a.a.226區(qū)-“4BR1文庫(kù)”)5’-GCGTGG GTT AAC cag cta cgc cga gac ggt gtc ggt cta cGGCAC CGA AGC GGT ATT TAC C-3’ (SEQ ID NO16)a＝94％A與2％G，2％C和2％T混合；g＝94％G與2％A，2％C和2％T混合；c＝94％C與2％A，2％T和2％G混合；t＝94％T與2％A，2％G和2％C混合。
pGD20RM-R4(用于a.a.330-a.a.342區(qū)-“RsrII文庫(kù)”)5’-GGT GCG CGC GGT GCG GCG AAT ATC cga gtg gga gaa agtctg gtc gtt ggc gga cgc cac ttc GAG GTC GAG-3’(SEQ ID NO17)a＝95％A與1.66％G，1.66％C和1.66％T混合；g＝95％G與1.66％A，1.66％C和1.66％T混合；c＝95％C與1.66％G，1.66％A和1.66％T混合；t＝95％T與1.66％G，1.66％C和1.66％A混合。
然后進(jìn)行了高保真度PCR反應(yīng)，以便使用以下引物對(duì)產(chǎn)生誘變PCR片段·PpuMI-文庫(kù)pGD20RM-F3和DHA-R2(SEQ ID NOs15和7)；·4BR-1文庫(kù)TB4B-R1和GD-C(SEQ ID NOs16和14)；·RsrII-文庫(kù)DHA-F1和pGD20RM-R4(SEQ ID NOs5和17)。
從瓊脂糖凝膠中純化PCR片段，然后分別用PpuMI/XbaI(用于PpuMI-文庫(kù))，HpaI/XbaI(用于4BR-1文庫(kù))和HindIII/RsrII(用于RsrII-文庫(kù))消化。
突變體文庫(kù)構(gòu)建分別用PpuMI/XbaI，HpaI/XbaI或HindIII/RsrII消化突變的pGD20構(gòu)建體(其中，業(yè)已通過(guò)定點(diǎn)誘變向其中導(dǎo)入了PpuMI，Hpal或RsrII唯一的限制酶消化位點(diǎn)。從瓊脂糖凝膠中純化線(xiàn)性化的載體，然后與限制酶-消化的PCR產(chǎn)物連接。通過(guò)將所述連接混合物電穿孔轉(zhuǎn)移到大腸桿菌菌株5K(DE3)中制備突變體文庫(kù)，如在實(shí)施例1中所描述的。
區(qū)域文庫(kù)的測(cè)序分析從每一個(gè)區(qū)域文庫(kù)中隨機(jī)挑取9-10個(gè)突變菌落進(jìn)行DNA測(cè)序分析。對(duì)于PpuMI-文庫(kù)來(lái)說(shuō)，每個(gè)突變體的平均突變率為2.8個(gè)突變(n＝9)。在4BR1-文庫(kù)中，每個(gè)突變體的平均突變率為2.0個(gè)突變(n＝8)。最后，來(lái)自RsrII文庫(kù)的測(cè)序數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)了每個(gè)突變體的平均突變率為2.2個(gè)突變(n＝10)。在這三種文庫(kù)中的任意一個(gè)上都沒(méi)有發(fā)現(xiàn)插入或缺失。但是檢測(cè)到了所有類(lèi)型的堿基置換，表明了缺乏對(duì)任何特定突變類(lèi)型的偏倚。
實(shí)施例4篩選測(cè)定的開(kāi)發(fā)開(kāi)發(fā)了篩選測(cè)定，其中，可以通過(guò)添加B12輔酶和底物(甘油)人工“啟動(dòng)”B12-依賴(lài)型脫水酶反應(yīng)。通過(guò)比色醛測(cè)定檢測(cè)脫水酶反應(yīng)產(chǎn)物3-HP。使用這種測(cè)定，在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下對(duì)一般的B12-依賴(lài)型脫水酶反應(yīng)的時(shí)程進(jìn)行的初步分析使得能夠開(kāi)發(fā)快速的理論技術(shù)，以便評(píng)估所述反應(yīng)的起始速率v以及觀察到的酶失活速率kinact obsd。
篩選測(cè)定基本原理能表達(dá)野生型B12-依賴(lài)型脫水酶或突變型B12-依賴(lài)型脫水酶的培養(yǎng)物，如果它們沒(méi)有所述酶的輔因子，輔酶B12的話(huà)，會(huì)產(chǎn)生脫輔基-B12-依賴(lài)型脫水酶。相反，如果將輔酶添加到甲苯-和去污劑透化的完整細(xì)胞中的話(huà)，會(huì)自發(fā)形成全酶。因此，可以通過(guò)向所述細(xì)胞中添加輔酶和底物“啟動(dòng)”B12-依賴(lài)型脫水酶反應(yīng)?？梢酝ㄟ^(guò)比色醛測(cè)定檢測(cè)反應(yīng)產(chǎn)物3-HP(Zurek，G.，Karst，U.Analytica Chimica Acta，351247-257(1997))，其中使用試劑3-甲基-2-苯并噻唑啉酮(MBTH)和氧化劑氯化鐵。
用于檢查一般的GDH反應(yīng)的時(shí)程的初步測(cè)定(有和沒(méi)有1，3-丙二醇)在37℃下，在Innova 4300培養(yǎng)箱中(New Brunswick Scientific，New Brunswick，NJ)振蕩(250rpm)，在15％Lennox培養(yǎng)液(通過(guò)用85體積的0.5％NaCl稀釋15體積的Lennox培養(yǎng)液(Gibco-BRL，Rockville，MD)然后滅菌來(lái)制備)中生長(zhǎng)能產(chǎn)生野生型GDH的細(xì)胞過(guò)夜。按以下方法透化細(xì)胞將培養(yǎng)物的等分試樣(0.3mL)分配到聚丙烯深孔平板(Beckman-Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)的方形孔中，并且將10μL含有2.5％(v/v)TritonX-100去污劑的甲苯添加到每一個(gè)孔中。然后在IKA MTS4搖床(IKA-Werke Gmbh.，Staufen，德國(guó))上以最高速率振蕩10分鐘。在紅色燈光下操作，以便保護(hù)輔酶B12，通過(guò)將5體積的底物溶液添加到1體積的透化細(xì)胞懸浮液中啟動(dòng)反應(yīng)。所述底物溶液含有溶于0.1M K-Hepes，pH8中的12mM甘油和24μM輔酶B12。在定時(shí)的時(shí)間間隔，將所述反應(yīng)的12.5μl等分試樣添加到96-孔平板的孔中，所述孔容納有12.5μl溶于0.4M甘氨酸-HCl，pH2.7中的3mg/mLMBTH。在采樣之后至少20分鐘，將125μL溶于10mM HCl中的5.5mMFeCl3添加到每一種含有MBTH的樣品中。再經(jīng)過(guò)20分鐘或更長(zhǎng)時(shí)間之后，使用Spectramax 160平板讀數(shù)器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)以在670nm的吸收度形式對(duì)與GDH活性相關(guān)的藍(lán)色進(jìn)行定量。進(jìn)行類(lèi)似的實(shí)驗(yàn)，其中，在底物溶液中補(bǔ)充了50mM 1，3-丙二醇。
測(cè)定結(jié)果的理論分析如圖1所示，以時(shí)間對(duì)OD670的形式對(duì)來(lái)自所述時(shí)程反應(yīng)的數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖。具體地講，圖1中的上部軌跡表示GDH反應(yīng)的時(shí)程(室溫，在0.1MK-HEPES，pH8中)，用10mM甘油(Km大約0.5mM)作底物。由于失活的發(fā)生，產(chǎn)物形成的速率隨著時(shí)間推移迅速降低。通過(guò)將三種參數(shù)擬合入下式，通過(guò)有關(guān)點(diǎn)繪制出了理論曲線(xiàn)y＝T0+amp(1-exp(-kinact obsd*時(shí)間))。所述參數(shù)是1.)用于分析的背景(t＝0(T0))值；2.)在所述測(cè)定期間產(chǎn)生的有限的總吸收度的幅度值(amp)；和3.)一級(jí)失活速率常數(shù)(kinact obsd)，它控制曲率。所述擬合的參數(shù)與反應(yīng)的動(dòng)力學(xué)性質(zhì)相關(guān)，如下文所述所述幅度等于所述反應(yīng)的起始速率(v)除以觀察到的酶失活速率(kinact obsd)。起始速率為[GDH][gly]kcat/(Km+[gly])。如果扣除所述測(cè)定背景的話(huà)，進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)1.只能用在反應(yīng)期間采集的兩種樣品評(píng)估v和kinact obsd用于評(píng)估v的早期點(diǎn)(T1)和用于評(píng)估幅度的晚期點(diǎn)(T2)；和2.可以將1/kinact obsd估算為T(mén)2/T1。
圖1的下部軌跡表示在測(cè)定中包括50mM 1，3-丙二醇的作用(Ki大約15mM)。所述反應(yīng)的起始速率只降低了大約20％，不過(guò)失活加速了大約3倍。這是因?yàn)楸M管所述競(jìng)爭(zhēng)性抑制是適度的，但酶-1，3-丙二醇復(fù)合物失活的速率常數(shù)(kinact 1，3-丙二醇)大于酶-甘油復(fù)合物失活的速率常數(shù)(kinact 甘油)。
下面示出了動(dòng)力學(xué)方案，它整合了兩種失活過(guò)程。
實(shí)施例5兩點(diǎn)高通量篩選測(cè)定采用高通量篩選測(cè)定方案檢查在實(shí)施例1，2和3中制備的突變菌落，該方法是以實(shí)施例4中描述的方法為基礎(chǔ)的。該測(cè)定專(zhuān)門(mén)在該測(cè)定期間的兩個(gè)時(shí)間點(diǎn)上測(cè)量GDH反應(yīng)產(chǎn)物T1，在T0之后30秒測(cè)量；和T2，在T0之后40分鐘測(cè)量。
將來(lái)自鋪平板的文庫(kù)的菌落挑取到標(biāo)準(zhǔn)96孔微量滴定板的94個(gè)孔中，這些孔中含有0.15mL/孔的15％Lennox培養(yǎng)液。其余的兩個(gè)孔接種能產(chǎn)生野生型GDH的細(xì)胞，并且讓所述細(xì)胞在37℃下，在靜止培養(yǎng)箱中生長(zhǎng)4-6小時(shí)?；蛘?，如果在篩選之前將挑取的細(xì)胞放置在-80℃下保存是理想的，那么所述培養(yǎng)基還添加有甘油(10％v/v)，并且讓挑取的細(xì)胞在保存之前生長(zhǎng)過(guò)夜。在篩選之前，用96針接種器(V&PScientific，San Diego，CA)將以前冷凍的細(xì)胞轉(zhuǎn)移到新的96-孔平板上，該平板裝有不含甘油的15％Lennox培養(yǎng)液，并且在不振蕩的條件下在37℃下讓它生長(zhǎng)6-16小時(shí)。
為了進(jìn)行GDH突變體篩選，細(xì)胞生長(zhǎng)方案如下將15％Lennox培養(yǎng)液培養(yǎng)基分配(0.3mL/孔)到聚丙烯深孔96-孔平板(Beckman-Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)的孔中。將來(lái)自淺的96-孔平板的細(xì)胞接種到深孔中，其中使用96針長(zhǎng)針接種器(V&P Scientific)，并且用3″寬的微孔手術(shù)膠帶(3M Health Care，St.Paul，MN)覆蓋所述平板。將淺的96-孔平板在4℃下保存直到測(cè)定完成，此時(shí)它們被用作活細(xì)胞的來(lái)源，用于進(jìn)一步檢查被鑒定為可能改善了的細(xì)胞系。讓所述深-孔平板中的細(xì)胞在37℃振蕩(250rpm)生長(zhǎng)過(guò)夜。用放置在塑料托盤(pán)中的濕海綿對(duì)培養(yǎng)箱(Innova 4300，New Brunswick Scientific，NewBrunswick，NJ)中的空氣加濕。
通過(guò)向每一個(gè)孔中添加10μL含有2.5％(v/v)TritonX-100去污劑的甲苯對(duì)96-孔平板上的細(xì)胞進(jìn)行透化。然后在IKA MTS4搖床(IKA-Werke Gmbh.，Staufen，德國(guó))上以最高速率振蕩平板10分鐘。使用Biomek 2000機(jī)器人(Beckman-Coulter)將透化細(xì)胞的等分試樣(8μL)轉(zhuǎn)移到96-孔反應(yīng)平板上，所述平板放置在Plexiglas(Rohm and Haas，Philadelphia，PA)外罩中，上面用紅色塑料膜覆蓋，以便使底物混合物免受室內(nèi)白色光線(xiàn)的照射。通過(guò)用機(jī)器人向所述細(xì)胞中添加40μL的底物混合物(在紅色光線(xiàn)下制備，并且在-20℃下用箔包裝的容器中保存直到使用)啟動(dòng)在室溫下的反應(yīng)，所述混合物含有溶于0.1M鉀-HEPES緩沖液，pH8中的24μM輔酶B12，12mM甘油和50mM1，3-丙二醇。在添加底物30秒之后，將該反應(yīng)的12.5μL等分試樣(T1樣品)轉(zhuǎn)移到第二個(gè)平板上，在該平板的孔中容納有12.5μL溶于0.4M甘氨酸-HCl，pH2.7中的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮(MBTH)。在添加底物之后大約40分鐘，將該反應(yīng)的類(lèi)似等分試樣(T2樣品)轉(zhuǎn)移到裝有MBTH的第三個(gè)平板上。在該轉(zhuǎn)移之后至少20分鐘，將125μL溶于10mM HCl中的5.5mM FeCl3溶液添加到第二和第三(含有MBTH)個(gè)平板的每一個(gè)孔中。再過(guò)20-60分鐘之后，使用Spectramax 160平板讀數(shù)器(MolecularDevices，Sunnyvale，CA)，以在670nm的吸收度對(duì)與GDH活性相關(guān)的藍(lán)色進(jìn)行定量。
將來(lái)自平板讀數(shù)器的數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)移到修改過(guò)的Microsoft(Redmond，WA)Excel計(jì)算機(jī)程序中。該程序被設(shè)計(jì)成將來(lái)自每一個(gè)反應(yīng)平板的第一(T1)和第二(T2)樣品進(jìn)行匹配，以便制備表格形式的結(jié)果，這些結(jié)果表示每一種反應(yīng)的平板，在平板上的位置，和T1，T2以及T2/T1比例。對(duì)樣品的數(shù)據(jù)進(jìn)行檢查，尋找顯示額外高的T1，T2或T2/T1比例值的樣品。這通過(guò)所述程序能夠根據(jù)任何所述參數(shù)對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行分類(lèi)的能力而得到了加強(qiáng)。用來(lái)自保留的淺的96-孔平板的最有希望的候選物進(jìn)行劃線(xiàn)培養(yǎng)，以便進(jìn)一步檢查。
實(shí)施例6篩選GDH突變體文庫(kù)并且鑒定陽(yáng)性命中物(hit)使用例實(shí)施例5所描述的自動(dòng)化高通量測(cè)定，對(duì)來(lái)自5個(gè)突變體文庫(kù)的大約100,000突變菌落進(jìn)行篩選。所述文庫(kù)包括1.)Xba文庫(kù)，靶向α-，β-和γ-亞基(DhaB1，DhaB2和DhaB3)，如實(shí)施例1所述；2.)Sma文庫(kù)，靶向α-亞基和β-亞基的一小部分，如實(shí)施例2所述；3.)PpuM1文庫(kù)，靶向α-亞基的a.a.141-a.a.152，如實(shí)施例3所述；4.)4BR1文庫(kù)，靶向α-亞基的a.a.219-a.a.226，如實(shí)施例3所述；和5.)RsrII文庫(kù)，靶向α-亞基的a.a.330-a.a.342，如實(shí)施例3所述。
所有獨(dú)立的分離物都來(lái)自上述5個(gè)文庫(kù)之一。大部分獨(dú)立的分離物都是通過(guò)表示來(lái)源文庫(kù)的標(biāo)記和隨后的編號(hào)進(jìn)行唯一識(shí)別的(例如“Xba3010”)。來(lái)自第一次篩選的所有推測(cè)的“命中物”都在隨后的測(cè)定中驗(yàn)證。大部分突變作用都是按照基于下面所描述的動(dòng)力學(xué)參數(shù)的四種大的類(lèi)型進(jìn)行分類(lèi)的。突變基因的序列分析，隨后與野生型基因進(jìn)行比較，能夠確定存在于每一個(gè)突變基因上的特定點(diǎn)突變。
篩選突變體文庫(kù)并且證實(shí)命中物在對(duì)大約100,000突變體進(jìn)行初步篩選之后，通過(guò)隨后的驗(yàn)證測(cè)定證實(shí)了推測(cè)的命中物。簡(jiǎn)單地講，在8個(gè)孔中對(duì)每一個(gè)推測(cè)的命中物進(jìn)行再測(cè)定。對(duì)來(lái)自單獨(dú)的克隆的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以便獲得T1(在30秒時(shí)測(cè)量的醛的量)和T2(在40分鐘時(shí)測(cè)量的醛的量)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。將以上結(jié)果與野生型酶的結(jié)果進(jìn)行比較。
圖2表示一般的后續(xù)測(cè)定結(jié)果，其中將x軸上的測(cè)定數(shù)對(duì)y軸上的OD670nm進(jìn)行作圖。提供了克隆Xba3010和野生型的每一個(gè)單獨(dú)測(cè)定(n＝8)在T1和T2處的結(jié)果。平均值以水平線(xiàn)的形式圖示，并且在括號(hào)中以+/-標(biāo)準(zhǔn)差的形式用數(shù)字表示。一般，標(biāo)準(zhǔn)差為大約10-15％。
篩選結(jié)果表6總結(jié)了命中物的后續(xù)測(cè)定結(jié)果，這些命中物的T2/T1比例大于野生型的T2/T1比例，或者其T2大于野生型的T2，或者同時(shí)具備這兩種特征。T2/T1比例提供了在40分鐘反應(yīng)期間酶穩(wěn)定性的指示，該反應(yīng)是在存在1，3-丙二醇和甘油的條件下進(jìn)行的。T2表明了在它完全失活之前所述酶的總轉(zhuǎn)換數(shù)。T2/T1比例越高，酶的穩(wěn)定性越好。因此，與野生型酶相比，具有改善了的穩(wěn)定性的突變型酶在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下具有較降低的失活速率。
在表6中報(bào)道了來(lái)自后續(xù)測(cè)定的T1和T2的平均值，之前已經(jīng)將它們相對(duì)于野生型結(jié)果進(jìn)行了標(biāo)準(zhǔn)化。大部分突變型酶可以根據(jù)以下定義劃分成1型、2型、3型或4型突變體·1型突變體T2/T1比例相對(duì)于野生型提高了，同時(shí)T2絕對(duì)值降低了；·2型突變體與野生型相比T2/T1比例和T2值都提高了，不過(guò)T2的提高程度低于T2/T1比例的提高程度；·3型突變體與野生型相比，T2/T1比例和T2都提高了，并且這兩者的提高程度是相似的；和·4型突變體與野生型相比T2/T1比例相當(dāng)或降低，不過(guò)T2提高了。
表6同樣總結(jié)了在每一種突變體中鑒定的特定點(diǎn)突變。在該表格的第一欄中提供了酶的DNA序列的SEQ ID NO。
表61型、2型、3型和4型突變體的總結(jié)
*T2/T1比例和T2值是相對(duì)于野生型進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化之后的相對(duì)數(shù)值。
從測(cè)序結(jié)果中可以看出，大部分突變是作為氨基酸取代鑒定的(沉默突變除外)。不過(guò)，兩種突變體(Sma3002[SEQ ID NO140]和Xba3009[SEQ ID NO179])是融合蛋白。具體地講，編碼α-亞基的基因(dhaB1)的終止密碼子(TAA)分別變成了Sma3002和Xba3009中的CAA(Gln)或GAA(Glu)。由于在編碼β-亞基的基因(dhaB2)的終止密碼子和起始密碼子之間存在15bp，所以這兩種融合蛋白都不會(huì)導(dǎo)致在β-亞基中發(fā)生移碼。這使得兩種突變型酶都保留了活性。β-亞基的起始密碼子(GTG)通常是由fMet-tRNA識(shí)別的；不過(guò)，在所述融合突變體中，該密碼子應(yīng)該由Val-tRNA識(shí)別。Sma3002融合蛋白包括接頭，該接頭由6個(gè)氨基酸殘基組成Gln-Gly-Gly-Ile-Pro-Val(SEQ ID NO18)。對(duì)于Xba3009融合蛋白來(lái)說(shuō)，所述接頭是Glu-Gly-Gly-Ile-Pro-Val(SEQ ID NO19)。
實(shí)施例7使用純化的酶對(duì)突變體進(jìn)行生物化學(xué)分析對(duì)五種突變體和野生型GDH的更好的表征是在對(duì)每一種酶進(jìn)行超表達(dá)和純化之后進(jìn)行的。
超表達(dá)和純化選擇Xba3007(1型；SEQ ID NO40)，Sma3002(2型；SEQ ID NO140)，Xba3010(3型；SEQ ID NO175)，Xba3009(4型；SEQ ID NO179)和4BR1001(2型；SEQ ID NO171))作進(jìn)一步的生物化學(xué)分析，同時(shí)使用野生型酶。首先，從5K(DE3)大腸桿菌宿主菌株中純化質(zhì)粒，并且轉(zhuǎn)化入大腸桿菌BL21(DE3)。讓所述細(xì)胞在含有氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中生長(zhǎng)到OD600為0.6-1.0，然后添加1.0mM IPTG。在37℃下誘導(dǎo)3小時(shí)之后，通過(guò)離心收獲細(xì)胞，并且用20mM HEPES-KOH緩沖液(pH8.0)洗滌1次。細(xì)胞沉淀物在-80℃下保存。
為了進(jìn)行酶純化，首先將細(xì)胞沉淀物重新懸浮在20mM HEPES-KOH緩沖液(pH8.0)中，該緩沖液含有完全的Mini蛋白酶抑制劑混合物片劑(Roche，Polo Alto，CA)和0.5mM EDTA。通過(guò)超聲處理破碎所述細(xì)胞(Branson model 450；20％輸出，50％脈沖，在冰浴中處理4分鐘)，然后進(jìn)行離心(40,000xg，30分鐘，4℃)。再次對(duì)清澈的上清液進(jìn)行離心(110,000xg，1小時(shí)，4℃)，并且在冰上將(NH4)2SO4緩慢添加到上清液中，使該溶液達(dá)到50％的飽和度。在冰上攪拌該溶液25分鐘，然后離心(40,000xg，30分鐘，4℃)。將沉淀物重新懸浮在2mL運(yùn)行緩沖液(running buffer)(100mM HEPES-KOH(pH8.2)，100mM1，2-丙二醇和1mM DTT)中，然后加樣到用運(yùn)行緩沖液平衡的16/60 HiloadSuperdex200大小排阻柱(Pharmacia Biotech，Piscataway，NJ)上。
所述酶用運(yùn)行緩沖液以0.25mL/分鐘的流速洗脫，并且用級(jí)分收集器(3mL/級(jí)分)收集洗脫液。采用實(shí)施例5中描述的測(cè)定來(lái)測(cè)定級(jí)分中的酶活性，然后合并活性級(jí)分，并且用Centricon YM100(Milipore，Bedford，MA)濃縮。讓濃縮的酶再次通過(guò)相同的柱，使用新的運(yùn)行緩沖液，該緩沖液由100mM HEPES-KOH(pH8.2)和1mM DTT組成。純化的酶的純度為75-95％，該純度是通過(guò)SDS-PAGE電泳判斷的，電泳中使用了10-20％梯度凝膠和考馬斯藍(lán)染色。
突變型GDH酶的生物化學(xué)表征使用純化的野生型和突變型GDH酶進(jìn)行了詳細(xì)的酶動(dòng)力學(xué)分析。酶活性是通過(guò)用MBTH-比色醛測(cè)定(Zurek，G.，Karst，U.AnalyticaChimica Acta，351247-257(1997))測(cè)量產(chǎn)物形成而確定的，并根據(jù)Lineweaver-Burke曲線(xiàn)測(cè)定KM和Vmax。kcat是根據(jù)Vmax計(jì)算的。在表7中示出了測(cè)定的所述酶的KM和kcat。
表7野生型和選擇的突變型GDH酶的KM和kcat
最后，對(duì)每一種突變型酶的失活特性進(jìn)行了詳細(xì)分析。按實(shí)施例4所述方法測(cè)量了甘油失活速率常數(shù)。為了測(cè)量空氣失活速率常數(shù)，用含有21μM輔酶B12的0.1M K-HEPES緩沖液(pH8)將所述酶稀釋到27μg/mL，然后在室溫下在空氣中溫育。在溫育0.25，0.5，1，2，5，10，15，20和30分鐘之后測(cè)量總轉(zhuǎn)換數(shù)。為了測(cè)量總轉(zhuǎn)換數(shù)，將10μL酶溶液添加到含有200mM甘油，24mM輔酶B12和0.1M K-HEPES緩沖液(pH8)的190μL-反應(yīng)溶液中，并且在室溫下溫育反應(yīng)混合物2小時(shí)。通過(guò)使用MBTH-比色醛測(cè)定(Zurek，G.和Karst，U.，同上)來(lái)測(cè)定3-HP濃度從而估算總轉(zhuǎn)換數(shù)。以時(shí)間對(duì)總轉(zhuǎn)換數(shù)形式對(duì)數(shù)據(jù)進(jìn)行作圖，并且通過(guò)曲線(xiàn)擬合使用下式估算空氣失活速率常數(shù)A＝A0exp(-k空氣t)，其中“A”是總轉(zhuǎn)換數(shù)，“A0”是在零時(shí)間的總轉(zhuǎn)換數(shù)，“k空氣”是空氣失活速率常數(shù)，而“t”是時(shí)間。
為了測(cè)量1，3-丙二醇失活，用含有21μM輔酶B12和各種濃度的1，3-丙二醇(即，1，20，100和300mM)的0.1M K-HEPES緩沖液(pH8)將所述酶稀釋到27μg/mL。對(duì)每一種1，3-丙二醇濃度來(lái)說(shuō)，通過(guò)用于測(cè)量空氣失活速率常數(shù)的方法估算失活速率常數(shù)。將所述失活速率常數(shù)對(duì)1，3-丙二醇濃度作圖，并且根據(jù)曲線(xiàn)估算由1，3-丙二醇產(chǎn)生的最大失活速率常數(shù)。1，3-丙二醇的離解常數(shù)是當(dāng)所述失活速率常數(shù)為最大失活速率常數(shù)的1/2時(shí)的1，3-丙二醇濃度。
在下面的表8中示出了來(lái)自該失活特性分析的結(jié)果。在沒(méi)有甘油或1，3-丙二醇或光照，但是存在空氣(氧)的條件下，B12-依賴(lài)型脫水酶全酶的失活是以雙相動(dòng)力學(xué)形式發(fā)生的。kgly是在存在10mM甘油，而沒(méi)有1，3-丙二醇的條件下測(cè)量的失活速率常數(shù)。所有突變型和野生型脫水酶都表現(xiàn)出雙相空氣失活；因此，k空氣，F(xiàn)是快速相的空氣失活速率常數(shù)，而k空氣，s是慢速相的空氣失活速率常數(shù)。k1，3丙二醇是1，3-丙二醇產(chǎn)生的最大失活速率常數(shù)。Kd是1，3丙二醇的離解常數(shù)。
表8選擇的突變型酶的失活特性
實(shí)施例8通過(guò)選擇的第一代突變體的組合進(jìn)行第二輪誘變?yōu)榱诉M(jìn)一步改善通過(guò)第一輪誘變獲得的突變體，進(jìn)行了第二輪誘變，以便合并來(lái)自幾個(gè)第一代突變體的突變。
為了制備第二代突變體，首先從宿主細(xì)胞中純化了來(lái)自包括多個(gè)突變的幾個(gè)第一代突變體(例如，Sma3002或Xba3009)的質(zhì)粒。然后將存在于Xba3007，Xba3029或4BR1001中的單點(diǎn)突變導(dǎo)入所述質(zhì)粒，以便產(chǎn)生第二代突變體2-F4，12-B1，13-B7和16-H5。表9總結(jié)了有關(guān)每一種突變體和用于生產(chǎn)它們的引物的詳細(xì)情況。在每一個(gè)引物中用大寫(xiě)的粗體字母表示的核苷酸表示要導(dǎo)入的特定突變的位置。
表9第二代突變體的合成
按實(shí)施例3所述，使用Stratagene QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)。
測(cè)定了第二代突變體中每一個(gè)的T2/T1比例和T2值，正如前文在實(shí)施例5中所描述的。以上結(jié)果在下面的表10中示出。在該表的第一欄提供了有關(guān)酶的DNA序列的SEQ ID NO。
表10第二代突變體的T2/T1比例和T2值
*T2/T1比例和T2值是相對(duì)于野生型酶標(biāo)準(zhǔn)化之后的相對(duì)數(shù)值。用粗體字符表示的突變體是第二代突變體。
實(shí)施例9純的融合突變體的構(gòu)建和分析在實(shí)施例6中描述了兩種融合突變體Xba3009(SEQ ID NO179)和Sma3002(SEQ ID NO140)。這兩者除了融合體本身之外都包括其他突變。為了研究α-和β-融合體的作用，構(gòu)建了兩種純的融合突變體(1E1和20G7)。
純的融合突變體的構(gòu)建α-亞基(TAA)的終止密碼子改變?yōu)镃AA(1E1)或GAA(22-G7)。這種修飾是通過(guò)將單點(diǎn)突變導(dǎo)入野生型GDH質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)的。將以下兩對(duì)引物用于制備點(diǎn)突變對(duì)于1-E1突變體來(lái)說(shuō)1-E1-F15’-gac acc att gaa Caa ggc ggt att cct-3’(SEQ ID NO26)1-E1-R15’-agg aat acc gcc ttG ttc aat ggt gtc-3’(SEQ ID NO27)對(duì)于22-G7突變體來(lái)說(shuō)22-G7-F15’-ccc gac acc att gaa Gaa ggc ggt att cct gtg-3’(SEQ ID NO28)22-G7-R15’-cac agg aat ac gcc ttC ttc aat ggt gtc ggg-3’(SEQ ID NO29)在每一個(gè)引物中用大寫(xiě)的粗體字母表示的核苷酸表示要引入的特定突變的位置。
按照實(shí)施例3所述方法用Stratagene QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)。按照實(shí)施例5所描述的方法測(cè)量這兩種突變體的T2/T1比例和T2值。結(jié)果如表11所示。在該表的第一欄提供了有關(guān)酶的DNA序列的SEQ ID NO。
表11純的融合突變體的T2/T1比例和T2值
*T2/T1比例和T2值是相對(duì)于野生型酶標(biāo)準(zhǔn)化之后的相對(duì)數(shù)值。
實(shí)施例10存在于突變體Sma3002中的突變的分析在實(shí)施例6中鑒定的第一代突變體Sma3002(SEQ ID NO140)在T2/T1比例和T2值兩方面都有顯著的提高。它包括四個(gè)點(diǎn)突變，其中之一包括在實(shí)施例9中詳細(xì)研究的融合突變。為了單獨(dú)研究這些突變的作用，構(gòu)建了另外兩種突變體(α-Y271C和β-Q2R)。
采用以前所使用的方法，將單點(diǎn)突變導(dǎo)入野生型質(zhì)粒，其中使用下面所示出的唯一地設(shè)計(jì)的引物。與前面的實(shí)施例一樣，在每一個(gè)引物中用大寫(xiě)的粗體字母表示的核苷酸，表示要引入的特定突變的位置。
表12Sma3002-衍生的突變體的合成，每一種突變體包括存在于Sma3002中的單點(diǎn)突變
按照實(shí)施例3所描述的方法，用Stratagene QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)。按照實(shí)施例5所描述的方法測(cè)量這些突變體的T2/T1比例和T2值。表13表示結(jié)果。在該表的第一欄提供了有關(guān)酶的DNA序列的SEQ ID NO。
表13Sma3002-衍生的突變體的T2/T1比例和T2值，每一種突變體包括相對(duì)于Sma3002的單點(diǎn)突變
*T2/T1比例和T2值是相對(duì)于野生型酶標(biāo)準(zhǔn)化之后的相對(duì)數(shù)值。用粗體字符表示的突變體包括來(lái)自Sma3002的單點(diǎn)突變。
α-Y271C突變降低了T2值，但是未能改變T2/T1比例。因此，該突變降低了所述酶的kcat。另一種突變?chǔ)?Q2R似乎不會(huì)顯著影響T2或T2/T1比例。
為了確定Sma3002(SEQ ID NO140)中的三種非融合突變中的任何一個(gè)是否能夠在存在1，3-丙二醇和甘油的情況下起著共同提高所述酶的穩(wěn)定性的作用，制備了三種其他的突變體。在這些突變體中的每一個(gè)中，通過(guò)以單點(diǎn)突變的形式導(dǎo)入野生型DNA序列將Sma3002上的三個(gè)非融合突變之一(α-Y271C，α-Y502H或β-Q2R)去除了。由此產(chǎn)生了三種Sma3002-衍生的突變體，各自包括最初存在于Sma3002中的非融合突變中的兩個(gè)。按照實(shí)施例3所述方法，將單點(diǎn)突變導(dǎo)入Sma3002質(zhì)粒，其中使用Stratagene QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖校以谙旅娴谋?4中示出引物。
表14Sma3002-衍生的突變體的合成，每一種突變體包括存在于Sma3002中的四個(gè)點(diǎn)突變
按實(shí)施例5所描述的方法測(cè)量所述突變體的T2/T1比例和T2值。表15示出了該分析的結(jié)果。在該表的第一欄提供了有關(guān)酶的DNA序列的SEQ ID NO。
表15Sma3002-衍生的突變體的T2/T1比例和T2值，每一種突變體包括四個(gè)點(diǎn)突變
*T2/T1比例是相對(duì)于野生型酶標(biāo)準(zhǔn)化之后的相對(duì)數(shù)值。用粗體字符表示的的突變體包括三個(gè)突變，并且來(lái)自Sma3002。
實(shí)施例11通過(guò)將某些第一代突變添加到第二代突變體中進(jìn)行第三輪誘變盡管在前面的實(shí)施例中為了提高GDH酶的總轉(zhuǎn)換而進(jìn)行了顯著改進(jìn)，如通過(guò)這里所報(bào)道的T2形式的值所衡量的，但仍然進(jìn)行了第三輪誘變。在這些反應(yīng)中，將從第一代突變體中選擇的點(diǎn)突變導(dǎo)入在T2值方面表現(xiàn)出最大提高的兩個(gè)第二代突變體(即，1-E1和8-C9)。這是通過(guò)首先由宿主細(xì)胞純化1-E1和8-C9突變質(zhì)粒實(shí)現(xiàn)的。然后將存在于Xba3007，Xba3029或4BR1001中的單氨基酸取代的突變導(dǎo)入所述質(zhì)粒，其中使用在下面的表16中所示出的引物和Stratagene QuikChange定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)，按照實(shí)施例3所述方法進(jìn)行。
表16第三代突變體的合成
按照實(shí)施例5所描述的方法測(cè)量第三代突變體的T2/T1比例和T2值。表17中示出了結(jié)果。在該表的第一欄提供了有關(guān)酶的DNA序列的SEQ ID NO。
表17第三代突變體的T2/T1比例和T2值
*T2/T1比例和T2值是相對(duì)于野生型酶標(biāo)準(zhǔn)化之后的相對(duì)數(shù)值。用粗體字符表示的突變體是第三代突變體。
總體上講，第三代突變體在酶穩(wěn)定性方面有顯著的提高。與最好的第一代突變體(即，Sma3002(SEQ ID NO140))相比，所有突變體都具有提高了的穩(wěn)定性(T2/T1比例)和總轉(zhuǎn)換數(shù)(T2)。實(shí)際上，突變體20-B9和21-D10的T2值大于以前所制備的所有突變體的相應(yīng)值。
實(shí)施例12某些第二和第三代突變體的生物化學(xué)表征為了進(jìn)一步表征選擇的第二和第三代突變體，在存在10mM甘油和50mM1，3-丙二醇的條件下測(cè)定了這些突變體的失活速率常數(shù)，其中使用實(shí)施例4所描述的方法。結(jié)果總結(jié)在下面示出的表18中。
表18某些第二和第三代突變體的失活速率常數(shù)
正如所預(yù)料的，以上結(jié)果與T2/T1比例量度吻合。
由于改進(jìn)的GDHs的一種用途是用于1，3-丙二醇的生物生產(chǎn)，重要的是確定在存在高濃度的1，3-丙二醇的條件下所述突變體的總轉(zhuǎn)換數(shù)。上述測(cè)定是在僅存在50mM的條件下進(jìn)行的。在用于1，3-丙二醇生物生產(chǎn)的發(fā)酵的晚期階段，1，3-丙二醇的濃度可以最高達(dá)到1M；因此，進(jìn)行了第二次兩點(diǎn)測(cè)定。具體地講，還在存在10mM甘油和600mM 1，3-丙二醇的條件下對(duì)若干有希望的突變體的T2值進(jìn)行了測(cè)量。表19總結(jié)了有關(guān)結(jié)果
表19在存在600mM 1，3-丙二醇的條件下測(cè)量了選擇的第二和第三代突變體的T2值
結(jié)果與T2(50mM)所獲得的結(jié)果有些類(lèi)似，不過(guò)一些突變體表現(xiàn)的比預(yù)測(cè)的要好。Sma3002的T2(600mM)比野生型酶的相應(yīng)值高3.3倍。第三代突變體中的每一個(gè)(15-E4，18-D7，20-B9和21-D10)表現(xiàn)出T2(600mM)相對(duì)Sma3002的進(jìn)一步提高。以上結(jié)果表明，具有更高T2(600mM)的第三代突變體更能抵抗較高濃度的1，3-丙二醇。預(yù)期這些突變體對(duì)于1，3-丙二醇的生物生產(chǎn)來(lái)說(shuō)是非常有用的。
實(shí)施例13用于在存在高濃度的1，3-丙二醇的條件下測(cè)量總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)的一點(diǎn)高通量篩選測(cè)定當(dāng)1，3-丙二醇濃度高于大約300mM時(shí)，GDH的失活幾乎是在反應(yīng)開(kāi)始之后馬上出現(xiàn)的。在上述條件下，不可以使用在實(shí)施例4和5中所描述的高通量篩選測(cè)定來(lái)篩選突變體，因?yàn)椴荒芫_測(cè)量T1。在存在高濃度的1，3-丙二醇的條件下的總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)是本發(fā)明希望改善的關(guān)鍵酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)之一。通過(guò)降低失活速率或提高kcat，可以提高總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)。為了篩選在存在高濃度的1，3-丙二醇的條件下具有提高了的總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)的突變體，開(kāi)發(fā)了一種改進(jìn)的高通量篩選測(cè)定方法。
簡(jiǎn)單地講，按實(shí)施例5所描述的方法在96-孔平板上生長(zhǎng)和透化突變細(xì)胞。使用Biomek 2000機(jī)器人(Beckman-Coulter，F(xiàn)ullerton，CA)將透化的細(xì)胞的等分試樣(8μL)轉(zhuǎn)移到96-孔反應(yīng)平板上。通過(guò)向所述細(xì)胞中添加40μL含有溶于0.1M鉀-HEPES緩沖液，pH8中的24μM輔酶B12，12mM甘油和720mM1，3-丙二醇的底物在室溫下啟動(dòng)反應(yīng)，其中使用Qfill2(Genetix，New Mitlon，Hampshire，英國(guó))。在室溫下溫育所述平板大約70分鐘之后，將該反應(yīng)的12.5μL等分試樣轉(zhuǎn)移到第二個(gè)平板上，該平板的孔裝有12.5μL溶于0.4M甘氨酸-HCl，pH2.7中的3-甲基-2-苯并噻唑啉酮(MBTH)，其中使用Biomek 2000機(jī)器人(Beckman-Coulter)。70分鐘的反應(yīng)時(shí)間能夠精確測(cè)量總轉(zhuǎn)換數(shù)。按照實(shí)施例5所描述的方法測(cè)定產(chǎn)物3-HP的濃度。通過(guò)使用Spectramax 160平板讀數(shù)器(Molecular Devices，Sunnyvale，CA)，通過(guò)測(cè)量在670nm的吸收度估算總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)(T(600))。
這種一點(diǎn)比色測(cè)定執(zhí)行起來(lái)很簡(jiǎn)單，因?yàn)镼fill2能夠在15秒之內(nèi)將底物添加到一個(gè)96-孔平板上。另外，相對(duì)于實(shí)施例4和5所描述的測(cè)定而言，這種測(cè)定能夠提供更高通量的能力。在表20中示出了按照在實(shí)施例5和本實(shí)施例中對(duì)野生型GDH和幾種具有不同酶動(dòng)力學(xué)參數(shù)的突變體進(jìn)行測(cè)定的比較結(jié)果。
表20T2/T1和T(600)值的比較
所述結(jié)果表明了每一種測(cè)定能篩選不同的動(dòng)力學(xué)參數(shù)。通過(guò)本實(shí)施例所描述的篩選測(cè)定鑒定的突變體能夠抵抗更高濃度的1，3-丙二醇，并且通常具有更高的穩(wěn)定性和合理的kcat值。
實(shí)施例14酶結(jié)構(gòu)和突變之間的相關(guān)性在本實(shí)施例中，檢查了相對(duì)于野生型GDH而言具有較高T2和較高T2/T1比例的突變關(guān)于GDH的三維晶體結(jié)構(gòu)的位置。由此可以鑒定脫水酶內(nèi)的可以被視為突變“熱點(diǎn)”的區(qū)域，其中，所述突變通常會(huì)導(dǎo)致改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)(使得失活速率降低)。在這些區(qū)域中的其他序列修飾同樣可能導(dǎo)致具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的其他突變體。
關(guān)于三維結(jié)構(gòu)的突變的位置業(yè)已通過(guò)X射線(xiàn)晶體學(xué)測(cè)定了無(wú)底物形式的脫水酶的三維晶體結(jié)構(gòu)(Liao等，J.Inorganic Biochem.93(1-2)84-91(2003))；另外，業(yè)已報(bào)道了與1，2-丙二醇形成的復(fù)合物中所述酶的結(jié)構(gòu)(Yamanishi等，Eur.J.Biochem.2694484-4494(2002))。根據(jù)所述結(jié)構(gòu)，將導(dǎo)致T2/T1比例或T2提高的突變(來(lái)自實(shí)施例6-12)在每一種GDH亞基的示意圖上作圖。更具體地講，圖3表示在α-亞基上包括單點(diǎn)突變(相對(duì)于野生型GDH而言)的突變體的分布(占所有單點(diǎn)突變的88％)。相反，圖4表示在α-亞基上包括多點(diǎn)突變(相對(duì)于野生型GDH而言)的突變體的分布；該亞基含有所有多點(diǎn)突變的58％，其余的突變分別分布在β-(31％)和γ-(11％)亞基之間。
根據(jù)陽(yáng)性命中物確定的熱點(diǎn)盡管單點(diǎn)和多點(diǎn)突變體中的突變位于GDH的所有三個(gè)亞基上，并且分布在整個(gè)大的α-亞基上，但包括單點(diǎn)突變的突變體和包括多點(diǎn)突變的突變體在α-亞基中表現(xiàn)出兩個(gè)共同的熱點(diǎn)。
一個(gè)突變熱點(diǎn)位于從α-亞基的N-末端數(shù)起的第二個(gè)α螺旋上(62-70位殘基)。在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)了五種單點(diǎn)突變體其中的三個(gè)具有位于62位殘基上的突變，這些突變具有不同的氨基酸取代，一個(gè)具有位于65位殘基上的突變，以及一個(gè)具有位于70位殘基上的突變(圖3)。來(lái)自多點(diǎn)突變體的6個(gè)突變位點(diǎn)也位于該螺旋上其中的3個(gè)位于62位殘基上，在63，67和70位殘基上各有一個(gè)(圖4)。
第二個(gè)熱點(diǎn)是包括α-亞基的TIM桶的第四個(gè)β-鏈的一部分和隨后的環(huán)和短的螺旋(224-236位殘基)的區(qū)域。該熱點(diǎn)位于活性位點(diǎn)附近。在該區(qū)域發(fā)現(xiàn)了五個(gè)單點(diǎn)突變。殘基224在兩種突變體中具有不同的氨基酸取代。226位殘基是兩種相同突變體的突變位點(diǎn)。一種突變體是在233位殘基上。另外，所述多點(diǎn)突變體的三個(gè)突變位點(diǎn)位于該區(qū)域(226，231和236位殘基)。
實(shí)施例15GDH突變體的位點(diǎn)飽和誘變對(duì)在實(shí)施例9中表征的突變體中存在的三個(gè)突變位點(diǎn)進(jìn)行位點(diǎn)飽和誘變。具體地講，這些位點(diǎn)是γ-Thr53(存在于突變體Xba3009中)，α-Leu509(存在于突變體Xba3029中)和α-Va1224(存在于突變體4BR1001中)。為了制備飽和誘變文庫(kù)，從它們的宿主細(xì)胞中純化1-E1和8-C9突變體(分別為實(shí)施例9和10)，并且用作模板，且與在下面的表21中所示出的簡(jiǎn)并引物一起使用。
表21飽和誘變文庫(kù)
使用Stratagene QuikChange多位點(diǎn)定點(diǎn)誘變?cè)噭┖?Stratagene，La Jolla，CA)按照生產(chǎn)商的說(shuō)明進(jìn)行誘變實(shí)驗(yàn)，以便制備GDH-SM1，GDH-SM2，GDH-SM3和GDH-SM4文庫(kù)。在將質(zhì)粒電穿孔轉(zhuǎn)移到大腸桿菌菌株5K(DE3)(如實(shí)施例1所述)中之后，使用一點(diǎn)GDH測(cè)定篩選了來(lái)自每一個(gè)文庫(kù)的88個(gè)突變菌落，以便評(píng)估在存在高濃度的1，3-丙二醇的條件下的總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)。然后對(duì)來(lái)自每一次篩選的最佳命中物進(jìn)行DNA序列分析。結(jié)果在下面的表中示出。在該表的第一欄提供了有關(guān)酶的DNA序列的SEQ ID NO。
表22在四種飽和突變體中的T(600)值和突變
*T(600)值是相對(duì)于野生型酶標(biāo)準(zhǔn)化之后的相對(duì)數(shù)值。用粗體字符表示的突變體是飽和突變體。
與產(chǎn)生它們的親本突變基因相比，所有四種飽和突變體(GDH-SM1-G11，GSH-SM2-B11，GDH-SM3-D2和GDH-SM4-H2[用粗體字符表示])表現(xiàn)出T(600)的進(jìn)一步提高。有趣的是，在突變體GDH-SM4-H2中，鑒定了三個(gè)堿基的變化(即，ACC(γ-Thr53)至TGT(Cys))。這種類(lèi)型的突變使用易錯(cuò)PCR是非常難以產(chǎn)生的。
實(shí)施例16使用不配對(duì)的引物的重組源延伸方法生成GDH突變體盡管使用隨機(jī)誘變，合理化設(shè)計(jì)誘變和飽和誘變顯著提高了在存在甘油和1，3-丙二醇的條件下GDH的失活速率(實(shí)施例6，8-11和15)，但對(duì)于工業(yè)應(yīng)用來(lái)說(shuō)進(jìn)一步提高是理想的。因此，在單一重組源延伸反應(yīng)中將來(lái)自實(shí)施例6，9，10和15的24種甘油脫水酶突變體用作親本模板，其中使用不配對(duì)的引物方法(U.S. 60/360279)。
將短的側(cè)翼DNA片段連接在親本基因的5′或3′末端通過(guò)PCR將短的側(cè)翼DNA片段連接在親本基因的5′或3′末端，然后將它用作使用不配對(duì)的引物的重組源延伸方法的結(jié)合位點(diǎn)。從宿主細(xì)胞中純化含有GDHs的質(zhì)粒，并且用作模板。
具體地講，將正向引物GDHM-F1(SEQ ID NO343)和反向引物GDHM-R1(SEQ ID NO344)用于通過(guò)標(biāo)準(zhǔn)高保真度PCR反應(yīng)擴(kuò)增以下模板基因，其中用Expand High Fidelity PCR System(Roche Applied Science，Indianapolis，IN)1-E1(SEQ ID NO198)，野生型GDH(SEQ ID NO1)，Xba3023(SEQ ID NO182)，Xba3010(SEQ ID NO175)，8-C9(SEQID NO212)，4BR1001(SEQ ID NO171)，Xba3015(SEQ ID NO147)，Xba3008(SEQ ID NO151)，Sma3003(SEQ ID NO143)，Xba3016(SEQID NO155)和Xba3020(SEQ ID NO159)。然后將所得到的PCR產(chǎn)物以等摩爾比例混合，并且被稱(chēng)作“混合物-1”。
以類(lèi)似方法將正向引物GDHM-F2(SEQ ID NO345)和反向引物GDHM-R2(SEQ ID NO346)用于擴(kuò)增以下基因Xba3007(SEQ ID NO40)，Xba3029(SEQ ID NO44)，Xba3025(SEQ ID NO52)，Sma3009(SEQ ID NO179)，Sma3010(SEQ ID NO175)，Sma3008(SEQ ID NO151)，RsrII001(SEQ ID NO136)，PpuMI002(SEQ ID NO128)，KG005(SEQ ID NO253)，GDH-SM1-G11(SEQ ID NO301)，GDH-SM2-B11(SEQID NO304)，GDH-SM3-D2(SEQ ID NO307)和GDH-SM4-H2(SEQ ID NO310)。將所得到的PCR產(chǎn)物以等摩爾比例混合，并且稱(chēng)作“混合物-2”。
使用Qiagen DNA提取試劑盒(Qiagen，Valencia，CA)從瓊脂糖凝膠中純化擴(kuò)增的產(chǎn)物，并且然后用作親本模板，用于使用不配對(duì)的引物的重組源延伸方法。
使用不配對(duì)的引物方法制備重組源突變體產(chǎn)物用上述24種親本模板制備重組源產(chǎn)物(即，GDH突變基因)，其中使用兩種引物PADH316F1(SEQ ID NO29)和T7T(SEQ ID NO30)。PADH316F1與“混合物-1”中的模板(即，1-E1，野生型GDH，Xba3023，Xba3010，8-C9，4BR1001，Xba3015，Xba3008，Sma3003，Xba3016和Xba3020)的5′末端退火，這是因?yàn)樘砑恿送ㄟ^(guò)SEQ ID NO343生產(chǎn)的短的5′DNA片段。不過(guò)，引物PADH316F1不能結(jié)合“混合物-2”模板的5′末端。類(lèi)似的，引物T7T與“混合物-2”模板(即，Xba3007，Xba3029，Xba3025，Sma3009，Sma3010，Sma3008，RsrII001，PpuMI002，KG005，GDH-SM1-G11，GDH-SM2-B11，GDH-SM3-D2和GDH-SM4-H2)的3′末端退火，但是不能結(jié)合“混合物-1”模板的3′末端。
配制以下反應(yīng)混合物用于反應(yīng)10ng“混合物-1”，10ng“混合物-2”，各200μM的dNTP，1×PCR緩沖液(具有最終濃度為1.5mM的MgCl2)，286nM pADH316F1，286nM T7T，0.625 U HotStarTaq(Qiagen，Valencia，CA)和dH2O至25μl。熱循環(huán)條件為95℃變性2分鐘；然后進(jìn)行60輪以下循環(huán)95℃ 30秒，在63-69℃的梯度上每一輪1秒+1秒；72℃最終延伸7分鐘；并且保持在4℃。將Eppendorf Mastercycler梯度5331(Eppendorf Scientific，Inc.，Westbury，NY)用于熱循環(huán)反應(yīng)。
由于在該反應(yīng)中使用的兩種引物不能同時(shí)與任何模板的5′和3′末端匹配，因此沒(méi)有一種親本模板能夠在該反應(yīng)期被擴(kuò)增。不過(guò)，具有5′和3′末端的任何重組DNA產(chǎn)物都能在隨后的熱循環(huán)中擴(kuò)增。在所述不配對(duì)的引物反應(yīng)之后，將反應(yīng)混合物加樣到瓊脂糖凝膠上。在大約66-67℃下，獲得了來(lái)自所述不配對(duì)的引物反應(yīng)的大量2.7kB PCR產(chǎn)物。這種大小的產(chǎn)物是期望的，因?yàn)楸挥米髂０宓脑加H本分子本身大約為2.7kB。
制備和篩選重組源GDH突變體文庫(kù)使用Qiagen DNA提取試劑盒從凝膠中純化重組GDH DNA產(chǎn)物(大約2.7kB)，用XbaI和HindIII消化，然后連接到Xba1-HindIII-消化的pGD20載體上(實(shí)施例1)。按照實(shí)施例1所述方法通過(guò)電穿孔將連接混合物轉(zhuǎn)化入大腸桿菌菌株5K(DE3)獲得突變體文庫(kù)。所述文庫(kù)的大小為每個(gè)連接反應(yīng)超過(guò)0.3百萬(wàn)個(gè)菌落。
從瓊脂糖平板上挑取6,000-7,000個(gè)突變菌落，并且采用一點(diǎn)高通量篩選測(cè)定進(jìn)行篩選，如實(shí)施例13所述。在初步篩選之后，通過(guò)后續(xù)的驗(yàn)證測(cè)定證實(shí)推測(cè)的命中物。簡(jiǎn)單地講，在8個(gè)孔中對(duì)每一個(gè)推測(cè)的命中物進(jìn)行再次測(cè)定。對(duì)來(lái)自每一個(gè)單獨(dú)克隆的結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以便獲得T(600)的平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。將所述結(jié)果與野生型GDH酶進(jìn)行比較。
另外，用兩點(diǎn)測(cè)定(實(shí)施例5)對(duì)若干命中物作進(jìn)一步的研究，以便大致估算這些命中物的起始反應(yīng)速率和失活的變化。
表23總結(jié)了對(duì)若干重組源GDH突變體進(jìn)行各種測(cè)定的結(jié)果。
表23用不配對(duì)的引物的重組源延伸方法獲得的重組GDH突變體的表征
*T(600)，T1，T2和T2/T1比例是相對(duì)于野生型酶標(biāo)準(zhǔn)化之后的相對(duì)數(shù)值。用粗體字符表示的突變體是通過(guò)使用不配對(duì)的引物的重組源延伸方法制備的。
盡管不同的重組GDH突變體表現(xiàn)出不同的酶動(dòng)力學(xué)(盡管具有類(lèi)似的T(600)值)，但這僅僅體現(xiàn)了每一種測(cè)定所測(cè)量的參數(shù)的差別。例如，突變體SHGDH24和SHGDH43具有相同的T(600)值，但是，與野生型相比，SHGDH24在T1值僅略有提高，而SHGDH43具有大大降低了的T1。對(duì)于SHGDH24來(lái)說(shuō)，所述酶的kcat沒(méi)有降低。相反，SHGDH43的kcat大大降低了。在上述場(chǎng)合下，SHGDH24和SHGDH43的GDH酶穩(wěn)定性都提高了，因此能夠提高總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)。
在這些突變體中，SHGDH51表現(xiàn)出穩(wěn)定性方面的最大改進(jìn)，不過(guò)，該突變體不具備最高的總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)，因?yàn)樗膋cat大大降低了。在這些突變體中，SHGDH37表現(xiàn)出在T(600)方面的最大提高，不過(guò)它的T2值低于SHGDH12的，表明了SHGDH37比SHGDH12更能抵抗高濃度的1，3-丙二醇。
不過(guò)，在任何場(chǎng)合下，以上結(jié)果都明確地證實(shí)了GDH穩(wěn)定性方面的顯著提高，這是因?yàn)橥ㄟ^(guò)不配對(duì)的引物方法產(chǎn)生了新的突變體。具體地講，通過(guò)隨機(jī)誘變獲得的最佳突變體的T(600)為3.3(即，突變體Sma3002；SEQ ID NO140)；通過(guò)隨機(jī)誘變和篩選鑒定的突變體的合理的組合或使用位點(diǎn)飽和誘變的所述突變的半隨機(jī)組合產(chǎn)生了具有4.3的最大T(600)的突變體(即，突變體GDH-SM1-G11；SEQ ID NO301)。因此，得出的結(jié)論是，使用不配對(duì)的引物的重組源延伸方法的隨機(jī)重組方法是比以前的合理化和半隨機(jī)方法更有效的技術(shù)。
突變基因的序列分析從在表23中所列舉的重組GDH突變體中純化質(zhì)粒DNA，并且對(duì)每一種的完整的GDH基因序列進(jìn)行測(cè)序。對(duì)突變體進(jìn)行分析，然后與原始野生型GDH基因進(jìn)行比較，表明了這些重組突變基因包括單堿基置換突變(點(diǎn)突變)，這些突變?cè)诒?4中示出。在該表的第一欄提供了有關(guān)酶的DNA序列的SEQ ID NO。
表24重組源GDH突變體的DNA序列分析
有趣的是，所有突變體(SEQ ID NOs313，316，319，322，325，328，331，334，337)都包括α-β融合體突變(正如最初在Sma3002和Xba3009突變體中所發(fā)現(xiàn)的[實(shí)施例6])，表明了該突變對(duì)于T(600)值的提高來(lái)說(shuō)是非常重要的。除了四種新產(chǎn)生的突變之外，SHGDH43包括來(lái)自四種不同親本基因的突變(即，4BR1001，1-E1，Xba3008和GDH-SM1-G11)。這表明在重組源PCR期間，在四種不同的親本基因之間至少發(fā)生了四次交換。除了若干種新產(chǎn)生的突變之外，SHGDH25和SHGDH51包括來(lái)自三種親本基因的突變(即，對(duì)于SHGDH25來(lái)說(shuō)，Sma3003，4BR1001和1-E1；對(duì)于SHGDH51來(lái)說(shuō)，RsrII001，1-E1和Xba3007)。
權(quán)利要求
1.一種篩選具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型脫水酶的方法，包括(c)讓B12-依賴(lài)型脫水酶全酶與包括甘油和1，3-丙二醇的混合物接觸，其中，所述1，3-丙二醇至少為25mM；(d)篩選所述B12-依賴(lài)型脫水酶全酶，以便評(píng)估所述B12-依賴(lài)型脫水酶的轉(zhuǎn)換率。
2.如權(quán)利要求1的方法，其中，篩選步驟(b)包括以下步驟e)在不包括甘油的可發(fā)酵的碳底物上生長(zhǎng)細(xì)胞，其中，所述細(xì)胞不具備輔酶B12、脫水酶再激活因子或內(nèi)源B12-依賴(lài)型脫水酶的來(lái)源；f)透化所述細(xì)胞；g)將輔酶B12甘油和至少25mM 1，3-丙二醇的混合物添加到步驟(b)的透化的細(xì)胞中；h)定量在步驟(c)中產(chǎn)生的3-羥基丙醛，其中，所述定量是選自T1、T2和T(600)的量度。
3.編碼B12-依賴(lài)型突變型脫水酶的核酸序列，該序列選自SEQ IDNos40，44，48，52，56，60，64，68，72，76，80，84，88，92，96，100，104，108，112，116，120，124，128，132，136，140，143，147，151，155，159，163，167，171，175，179，182，186，189，192，195，198，201，204，208，212，215，218，221，225，229，233，237，241，245，249，253，257，261，265，269，273，277，281，285，289，293，297，301，304，307，310，313，316，319，322，325，328，331，334和337。
4.由選自下列的核酸序列編碼的B12-依賴(lài)型突變型脫水酶SEQ IDNO40，44，48，52，56，60，64，68，72，76，80，84，88，92，96，100，104，108，112，116，120，124，128，132，136，140，143，147，151，155，159，163，167，171，175，179，182，186，189，192，195，198，201，204，208，212，215，218，221，225，229，233，237，241，245，249，253，257，261，265，269，273，277，281，285，289，293，297，301，304，307，310，313，316，319，322，325，328，331，334和337。
5.編碼包括α-β亞基融合體的B12-依賴(lài)型突變型脫水酶的核酸序列，該序列選自SEQ ID NOs140，179，186，189，192，195，198，201，212，215，218，301，304，307，310，313，316，319，322，325，328，331，334和337。
6.編碼包括α-β亞基融合體的B12-依賴(lài)型突變型脫水酶的核酸序列，該序列選自SEQ ID NOs313，322和328。
7.如權(quán)利要求5的核酸序列，還包括位于α-β亞基融合體的α和β亞基之間的接頭序列，其中，所述接頭序列選自SEQ ID NO18和SEQID NO19。
8.一種用于制備具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型脫水酶突變體的方法，包括d)讓包括熱點(diǎn)1或熱點(diǎn)2的B12-依賴(lài)型脫水酶全酶與誘變劑接觸；e)篩選在步驟A)中產(chǎn)生的具有改善了的kcat和/或穩(wěn)定性的突變體；和f)重復(fù)步驟a)和b)。
9.一種鑒定相對(duì)于參考脫水酶而言具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型脫水酶的方法，包括d)讓脫水酶全酶與5-10mM甘油和/或10-300mM 1，3-丙二醇接觸；e)在高通量測(cè)定中，在至少兩個(gè)間隔足夠大的時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行測(cè)量，以便評(píng)估kcat和總的酶轉(zhuǎn)換；f)選擇相對(duì)于參考脫水酶而言具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型突變體。
10.一種鑒定相對(duì)于參考脫水酶而言具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型脫水酶的方法，包括d)讓脫水酶全酶與5-50mM甘油和＞300mM 1，3-丙二醇接觸；e)在高通量測(cè)定中，在相對(duì)于T0的一個(gè)間隔足夠大的時(shí)間點(diǎn)上進(jìn)行測(cè)量，以便評(píng)估總的酶轉(zhuǎn)換數(shù)；和f)選擇相對(duì)于參考脫水酶而言具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B12-依賴(lài)型突變體。
全文摘要
提供了具有改善了的反應(yīng)動(dòng)力學(xué)的B
文檔編號(hào)C12N9/02GK1965088SQ200380109760
公開(kāi)日2007年5月16日 申請(qǐng)日期2003年12月16日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月16日
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