專利名稱：檢測和分析病原體的方法和設(shè)備的制作方法
有關(guān)政府贊助研究的聲明本發(fā)明的技術(shù)和機(jī)構(gòu)是在政府支持下，通過美國能源部的DEFG91ER61125號合同，根據(jù)NASA許可No.NAG 5-9659，以及NIH許可HG01399和P01 CA 77664而實施的。
背景技術(shù)：
本發(fā)明涉及病原體的檢測和分析。在一個實施例中，本發(fā)明提供了利用微流控構(gòu)造實現(xiàn)的樣品制備、處理、檢測、以及分析的系統(tǒng)。在另一個實施例中，本發(fā)明提供了制造用于高通量分析應(yīng)用的流控元件密集陣列的強(qiáng)大技術(shù)。
常規(guī)的微流控分析機(jī)構(gòu)具有局限性。一些現(xiàn)有的機(jī)構(gòu)包括單通道分離裝置和多通道分離裝置。另一些包括集成了一些樣品制備和分析措施的分析裝置。然而，許多具有流控能力的微流控分析裝置對許多化學(xué)或生化測定試驗不具有化學(xué)或物理相容性。而且，由于制作過程、耐用性和/或設(shè)計上的限制，許多微流控元件難以制成密集的陣列。許多常規(guī)的裝置需要持續(xù)驅(qū)動以維持流控。將采用這種閥的微流控裝置從其控制系統(tǒng)中去除之后會失去對裝置中流動成分的控制能力。此外，許多微流控分析的技術(shù)和機(jī)構(gòu)還缺乏靈敏度、特異性或者定量分析的能力。尤其是，對于系統(tǒng)例如病原體檢測器和分析儀的系統(tǒng)來說，常規(guī)的微流控分析機(jī)構(gòu)缺乏有效實現(xiàn)樣品制備的功能和能力。
因此人們希望能提供改進(jìn)的方法和設(shè)備來實現(xiàn)微流控的控制機(jī)構(gòu)，例如閥、泵、選路器、反應(yīng)器等等，以便在微流控裝置中能夠有效地集成樣品的引入、制備、處理以及分析的功能。在一個實例中，優(yōu)選提供具有微細(xì)加工效能的微流控裝置，其既可以用于實現(xiàn)單通道系統(tǒng)又可以用于實現(xiàn)基于陣列的系統(tǒng)，其中所述系統(tǒng)可用作病原體檢測器和分析儀以提供假陽性結(jié)果很少、高通量和廉價的連續(xù)監(jiān)測。
發(fā)明簡述提供了實現(xiàn)微流控分析裝置的方法和設(shè)備。與集成的充氣集管相伴隨的整體彈性膜件可以設(shè)置有并驅(qū)動多種流控結(jié)構(gòu)(例如用于隔離、選路、混合、分流和存儲流體量的結(jié)構(gòu))的密集陣列。該流控結(jié)構(gòu)可用于實現(xiàn)病原體的監(jiān)測和分析系統(tǒng)，包括集成式免疫親和性捕獲和分析，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和毛細(xì)管電泳(CE)分析。將分析物溶液引入并且泵壓通過微細(xì)加工腔室中的一系列免疫親和性捕獲基質(zhì)，其中具有靶向各類微生物有機(jī)體的抗體，例如細(xì)菌、病毒和細(xì)菌芽孢的抗體。該免疫親和性腔室能夠捕獲、純化和富集目標(biāo)物以便進(jìn)行進(jìn)一步的分析步驟。
在一種實施方式中，提供了一種病原體檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括集成在微流控裝置上的免疫捕獲腔室。該免疫捕獲腔室可用于捕獲通過微流控通道提供給免疫捕獲腔室的目標(biāo)物。該系通還包括與免疫捕獲腔室相伴隨的DNA分析機(jī)構(gòu)。該DNA分析機(jī)構(gòu)集成在該微流控裝置上。該DNA分析機(jī)構(gòu)可用于對目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析。
在另一種實施方式中，提供了一種位于整體裝置上的病原體檢測系統(tǒng)。該系統(tǒng)包括集成在整體裝置上的多個免疫捕獲腔室。該免疫捕獲腔室可用于捕獲通過微流控通道提供給免疫捕獲腔室的目標(biāo)物。該系統(tǒng)還包括與免疫捕獲腔室相伴隨的多個DNA分析機(jī)構(gòu)。所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)集成在該整體裝置上。所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)可用于對目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析。
在另一種實施方式中，提供了一種用于病原體分析的方法。通過集成在整體裝置上的微流控通道將流體分析物提供給多個免疫捕獲腔室。與該流體分析物相關(guān)的目標(biāo)物在免疫捕獲腔室中被捕獲。利用與多個免疫捕獲腔室相伴隨的多個DNA分析機(jī)構(gòu)對目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析。所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)集成在所述整體裝置上。
在以下的發(fā)明說明和附圖中，將更加詳細(xì)地介紹本發(fā)明的這些以及其它的特點和優(yōu)點，其中通過實例來說明了本發(fā)明的原理。
附圖簡述結(jié)合附圖參考以下說明，本發(fā)明將更容易理解，其中附圖表示了本發(fā)明的特殊實施方式。


圖1A-1E表示一種適合于實現(xiàn)本發(fā)明技術(shù)的微流控裝置上的機(jī)構(gòu)圖示。
圖2是描繪一種隔膜泵的圖示。
圖3是表示一種流控選路器的平面圖示。
圖4是表示一種混合環(huán)路的平面圖示。
圖5A-5D是表示一種流體儲液池的圖示。
圖6是表示總線閥(bus valve)的圖示。
圖7是一種病原體檢測系統(tǒng)的圖示。
圖8是描繪免疫親和性捕獲閥機(jī)構(gòu)的圖示。
圖9是表示免疫親和性捕獲閥機(jī)構(gòu)的圖示。
圖10A和10B表示免疫親和性捕獲的分析物的捕獲和選路的圖示。
圖11表示可與免疫親和性捕獲構(gòu)造集成的PCR和CE的圖示。
圖12是表示聯(lián)合免疫捕獲和PCR腔室的圖示。
圖13A是一種病原體檢測系統(tǒng)的圖示。
圖13B是表示一種微細(xì)加工階段的圖示。
圖14是一種病原體檢測系統(tǒng)的徑向陣列圖示。
特殊實施方式詳述現(xiàn)在將詳細(xì)介紹一些本發(fā)明的特殊實施方式，包括發(fā)明者認(rèn)為的實施本發(fā)明最佳的實施方式。附圖中表示了這些實施方式的例子。盡管本發(fā)明是結(jié)合這些特殊的實施方式進(jìn)行說明的，但應(yīng)當(dāng)明白這并不意味著本發(fā)明僅限于所描述的實施方式。相反，其包括那些落在本發(fā)明實質(zhì)和范圍之內(nèi)的可選擇方案、改良方案以及等價方案，如在所附的權(quán)利要求中所限定。例如，文中將以玻璃微流控裝置來描述本發(fā)明的技術(shù)方案，盡管也可以采用其它的裝置，例如塑料裝置。
應(yīng)當(dāng)指出的是，適用于玻璃微流控裝置的流控構(gòu)造可以應(yīng)用于各種微流控裝置中。在利用流控構(gòu)造優(yōu)點的一種可能的應(yīng)用中，病原體檢測系統(tǒng)就是一個很好的例子。在以下說明中，列出了許多特殊的細(xì)節(jié)以便提供對本發(fā)明的全面理解。本發(fā)明可以在不具有部分或全部這些特殊細(xì)節(jié)的情況下實施。在其它情況下，沒有對公知的處理操作進(jìn)行詳細(xì)描述以免與本發(fā)明發(fā)生不必要的混淆。
從最早的單通道隔離裝置以來，微流控分析技術(shù)領(lǐng)域就發(fā)展很快。一些裝置含有用于高通量分析的多通道隔離裝置和在單個芯片上集成了樣品制備和分析功能的分析器。同時結(jié)合了多通道分析和集成化樣品制備的裝置能夠減少進(jìn)行多個測定試驗所需的資源和成本量。在基因組學(xué)領(lǐng)域可以找到一個例證在單個裝置中集成測序樣品的制備、純化和電泳分析可以使測定時間和成本降低并且提高測定的通量效率和耐用性。在所有情況下，微流控裝置中高水平的集成度都需要芯片機(jī)構(gòu)具有耐用性以便分離、選路、混合、分流、和儲存大量的流體。
用于硅、玻璃硅、聚合物、和彈性微流控裝置中的一些閥技術(shù)以有限的方式滿足了這些需要。然而，許多這些技術(shù)與許多化學(xué)或生化測定試驗在化學(xué)或物理性質(zhì)上不兼容。而且，對現(xiàn)有的玻璃微流控裝置來說，許多技術(shù)缺乏耐用表面修飾的各種化學(xué)性質(zhì)。此外，典型地制造單個微流控閥是采用單獨的膜件，其通常保持打開。具有通常為打開的閥就需要持續(xù)驅(qū)動以保持對流動的控制。采用這種閥的微流控裝置不能夠從控制系統(tǒng)中去掉，否則會失去對裝置中流動成分的控制能力。此外，一些典型的裝置采用單獨設(shè)置的乳膠膜件。單獨設(shè)置的氣動乳膠膜件雖然有所發(fā)展，但這種制造方法阻礙了大規(guī)模集成化為多通道、高通量的分析裝置。
另一些微流控裝置是利用陽極結(jié)合的硅和玻璃晶片制成，并通過壓電驅(qū)動。然而，由于硅的導(dǎo)電性和化學(xué)相容性造成其在分析裝置中的應(yīng)用較復(fù)雜。結(jié)合或者沉積在硅上的薄膜只能部分地減少其導(dǎo)電性和化學(xué)相容性。
人們還試驗了彈性裝置。然而，彈性材料的疏水性和多孔性使得彈性裝置與許多化學(xué)和生化測定試驗不相容。因此人們希望與彈性體表面的流體接觸最小化。復(fù)雜的制作、化學(xué)相容性、不可靠的流體操控性以及其它的問題造成了現(xiàn)有的流體操控技術(shù)不適合于集成到大規(guī)模、高通量的芯片式實驗室(lab-on-a-chip)裝置上。
因此，本發(fā)明的技術(shù)和機(jī)構(gòu)提供了一種適合于高密度集成到微流控裝置上的整體膜件閥結(jié)構(gòu)。還提供了各種基于該整體膜件閥結(jié)構(gòu)的流控構(gòu)造。
具有整體膜件的微流控裝置是特別適合在芯片上實現(xiàn)病原體檢測系統(tǒng)的裝置的一個實例。根據(jù)多種實施方式，病原體檢測系統(tǒng)包括免疫捕獲和DNA分析機(jī)構(gòu)，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)，和毛細(xì)管電泳(CE)機(jī)構(gòu)。在一個實施例中，該病原體檢測系統(tǒng)可以在具有各種流控構(gòu)造的玻璃微流控裝置上實現(xiàn)。
圖1A-1E是可以在玻璃微流控裝置上實現(xiàn)的整體膜件閥的圖示。圖1A為整體膜件閥的頂視示。圖1B為具有該閥的三層式裝置的側(cè)視示。圖1C為具有該閥的四層式裝置的側(cè)視示。圖1D為三層式裝置的一種打開式閥的側(cè)視示。圖1E為四層式裝置的一種打開式閥的側(cè)視示。根據(jù)圖1A和1B中所示的各種實施方式，三層式玻璃微流控裝置包括夾在兩個玻璃晶片101和105之間的彈性膜件111。在一個實施例中，該彈性膜件為聚二甲基硅氧烷(PDMS)膜件，購自Bisco Silicons of Elk Grove，IL，254um厚的HT-6135和HT-6240型膜件。也可以采用其它的柔性膜件。彈性膜件111使得晶片之間的結(jié)合可逆而牢固。
在結(jié)合之前，晶片中蝕刻了流體通道103用于承載流體。類似地蝕刻出集管通道107和閥區(qū)域109用以在壓力或真空下運送空氣或其它工作流體以驅(qū)動該閥。典型的是，該充氣通道107和109位于一個晶片105上，這里稱之為充氣晶片，而流體通道蝕刻在第二晶片101上，這里稱為流體晶片。這些蝕刻的通道特征可直接與膜件接觸并形成混合式玻璃/彈性體通道，如圖1B所示。
或者，膜件可位于熱接合的全玻璃流體晶片夾層(XY)與充氣晶片159之間，如圖1C的四層式裝置150中所示。具有全玻璃的通道可以讓裝置受益于玻璃的良好物理和化學(xué)性質(zhì)。任何具有良好物理和化學(xué)性質(zhì)的層被稱作化學(xué)惰性層。該化學(xué)惰性層可用于制造XY。在一個實施例中，構(gòu)成XY的151和155夾層就由玻璃制成。
四層式裝置的例子包括熱粘合到連結(jié)晶片155上的流體晶片151。小直徑的通孔設(shè)置在流體通道153中的間斷點上。彈性膜件157粘附在該流體/連結(jié)晶片夾層XZ的連接晶片155一側(cè)。閥偏流腔室161蝕刻在集管晶片159中并與膜件157粘合，完成了該四層式裝置150。這樣，流體通道153保持了全玻璃化學(xué)上有益的構(gòu)造，同時可以實現(xiàn)大規(guī)模集成化的流控構(gòu)造。在一些實施方式中，圖1C中所示的四層式裝置相比較三層式裝置具有相當(dāng)?shù)膬?yōu)點，因為其減小了樣品和彈性膜件之間的接觸。
根據(jù)多種實施方式，整體膜件裝置內(nèi)的各種流控成分是通過向充氣晶片上的孔施加壓力或真空來驅(qū)動的。這里將任何單個的膜件稱為整體膜件。具有整體膜件的任何單個裝置在此被稱為整體裝置。用于向與充氣晶片相伴隨的蝕刻通道施加壓力或真空的機(jī)構(gòu)在此被稱為氣口或充氣口。在三層式裝置中，充氣晶片中的蝕刻通道將驅(qū)動真空分散于彈性膜件111的閥區(qū)域109內(nèi)。通過閥區(qū)域109處的集管通道施加的真空推動膜件遠(yuǎn)離通道的間斷點，并為流體流動提供了穿過該間斷點的路徑，從而打開閥，如圖1D所示。利用充氣壓力可開關(guān)的閥在此被稱為可開關(guān)閥或氣動開關(guān)閥。
施加充氣壓力包括加壓或者施加真空的情況。因而膜件157能夠調(diào)節(jié)附近流體通道中的流體流動，如圖1D中所示。在圖1D中，通過與充氣晶片105相伴隨的蝕刻通道向閥區(qū)域109施加真空來打開流體通道103。當(dāng)不再向閥區(qū)域109施加真空或者吸力時，膜件111關(guān)閉流體通道103，如圖1B所示。圖1E表示了一種四層式裝置。該四層式裝置包括通道層151、通道153、連接層155、膜件層157，以及充氣層159。如上所述，該四層式裝置比三層式裝置具有相當(dāng)?shù)暮锰帲驗槠涫箻悠放c彈性膜件之間的接觸最小化，在一些情況下只在閥區(qū)域161處有接觸。
應(yīng)當(dāng)注意，所示構(gòu)造可以朝著任何方向。在一些實施例中，閥可以在裝置上倒置。充氣層可以位于流動層的上方或下方。本發(fā)明的技術(shù)方案允許朝著各種方向，因為重力并不會對該膜件閥造成不利的影響。
流控構(gòu)造具有多種優(yōu)點。例如，整體膜件閥通常為關(guān)閉的閥，也就是說該閥即使在裝置不與驅(qū)動壓力源連接時也保持關(guān)閉狀態(tài)?，F(xiàn)有的通常為打開式的微流控閥需更持續(xù)驅(qū)動以保持對裝置流動成分的控制能力。而且，不像形狀記憶合金的結(jié)構(gòu)，該閥構(gòu)造的開關(guān)溫度都是處于環(huán)境溫度之下，這有利于在水溶液的生物流體情況下工作。
在許多典型的實施方式中，微流控裝置之間需要許多接口以便操控各種流控機(jī)構(gòu)。然而，根據(jù)本發(fā)明的多種實施方式，膜件的多個區(qū)域可以通過連接它們的充氣控制通道來并行驅(qū)動。在一個實施例中，利用單個充氣口就可以控制一系列閥。因此，僅使用有限數(shù)量的外部接口或充氣口就能夠控制相當(dāng)多的閥。這就簡化了實現(xiàn)過程并最小化了裝置接口的問題。根據(jù)各種實施方式，以這種方式控制閥能夠?qū)φw膜件進(jìn)行大量并行的充氣驅(qū)動，用以操控閥、泵、儲液池、選路器、以及裝置內(nèi)的其它流控構(gòu)造。
膜件閥可用于構(gòu)成各種流控機(jī)構(gòu)。圖2A和2B為采用膜件閥構(gòu)成的泵的圖示。根據(jù)圖2A和2B中所示的多種實施方式，串聯(lián)設(shè)置的三個閥構(gòu)成了隔膜泵210。按照五個步驟的循環(huán)驅(qū)動這些閥就可以實現(xiàn)抽吸過程。圖2A表示了一種三層式整體膜件隔膜泵的頂視圖。圖2B表示了該三層式整體膜件隔膜泵的側(cè)視圖。該隔膜泵包括輸入閥201、隔膜閥203和輸出閥205。應(yīng)當(dāng)注意該隔膜泵在兩個方向上都可以工作，因而輸入閥和輸出閥的指定為任意的。該泵包括具有蝕刻的流體通道211的流動層209，整體膜件207，以及集管層213。閥的氣密特征使該泵能自動充滿并且除了其它氣體和流體之外還能夠抽吸空氣。
根據(jù)各種實施方式，抽吸過程可通過一系列階段來實施。第一步，輸出閥205關(guān)閉，輸入閥201打開。第二步，隔膜閥203打開。第三步，輸入閥201關(guān)閉。第四步，輸出閥205打開。第五步，隔膜閥203關(guān)閉，通過打開的輸出閥205抽吸分析物流體。
每次循環(huán)抽吸的量取決于打開的隔膜閥內(nèi)所包含的容積，該容積又依次取決于隔膜閥中充氣腔室的大小。因此，可以通過調(diào)節(jié)隔膜閥充氣腔室的大小來制造為了測量已知在納升至微升規(guī)格的流體量而設(shè)計的泵。該隔膜泵能自動充滿并且能夠向前抽吸流體或者通過反向運行所述驅(qū)動循環(huán)過程向后抽吸流體。還應(yīng)當(dāng)注意的是，膜件接觸玻璃密封表面處的閥所在位置可以蝕刻成具有凸脊或者其它的表面修飾，以控制膜件與玻璃表面的粘著性。
整體閥還可以用于形成選路器、混合器和分流器。應(yīng)當(dāng)注意的是，盡管以下構(gòu)造將通過三層式構(gòu)造的文字來說明，但該構(gòu)造也可以用于四層或更多層式的結(jié)構(gòu)。圖3為一種選路器300的圖示。該選路器包括閥301、303、305和317，充氣通道331、333、335、337和339，流體通道321、323、325和327，以及隔膜閥309。該選路器將流體從任一輸入口抽吸到任一輸出口，其取決于在該抽吸循環(huán)過程中在什么部位驅(qū)動了哪個輸入/輸出閥。同時驅(qū)動兩個或多個輸入閥可在輸出閥處將幾股不同的流體流混合成一股流。相反，同時驅(qū)動兩個或多個輸出閥可在輸出閥處將單股流體流分流成幾股不同的液流。
例如，為使流體以通道327選路到通道321，閥301和305要保持關(guān)閉。然后如上面所述用閥317、309和303做為泵。選路器包括混合和分流流體通道的功能。為將流體從通道325和327混合到通道323，閥303要保持關(guān)閉。為將流體從通道321分流到通道323和327，閥301要保持關(guān)閉。而在另一個實施例中，為將經(jīng)通道327引入的流體選路到通道325，閥303和305要保持關(guān)閉。打開閥317和301以使流體通過通道327流到通道325。各種設(shè)置方式皆有可能。
利用整體閥還可以形成混合環(huán)路。在一個實施例中，通過流體在裝置的兩個區(qū)域之間流動可實現(xiàn)混合過程?；旌线^程可用于實現(xiàn)在芯片上進(jìn)行的所有類型的操作。圖4為一種混合環(huán)路400的圖示。該混合環(huán)路或混合器包括閥401、403和405，流體通道411、413和415，以及充氣通道421、423和425。該環(huán)路上連接著其它的有閥的通道，向流體提供通向或來自混合器的路徑。通過通道413和415可使兩種或多種流量的流體進(jìn)入該混合環(huán)路中，并且如上所述，將其抽吸到循環(huán)中直到這些流體通過擴(kuò)散作用而混合。再將該混合物抽吸出該混合環(huán)路?；旌线^程還可以通過使流體在兩個儲液池之間來回流動而實現(xiàn)。
圖5A-5C為儲液池500的圖示。圖5A為具有蝕刻的排液腔室的儲液池頂視圖。圖5B為該儲液池的側(cè)視圖。圖5C為表示注滿后的儲液池的側(cè)視圖。圖5D為具有鉆孔排液腔室和用于自發(fā)填注/分配過程的泵的大容量儲液池的側(cè)視圖。該儲液池包含在充氣晶片513上，其中膜件505夾在該充氣晶片513與流體晶片511之間。通過通道501儲液池可以注滿或排空。根據(jù)多種實施方式，閥區(qū)域503中打開的整體膜件閥起著儲液池的作用以用于芯片上流體的儲存。充氣晶片513中腔室的大小決定了儲存在儲液池內(nèi)的流體體積，當(dāng)施加真空時該儲液池填滿，施加壓力時其排空。
根據(jù)多種實施方式，制造用于儲存大量流體的儲液池時可以用鉆孔來代替蝕刻充氣腔室，并可直接向該鉆孔施加驅(qū)動壓力或真空。或者，可以將儲液池連接到隔膜泵上來制造不具有直接充氣連接的儲液池。圖5D表示了一種連接到泵上的儲液池503。該儲液池根據(jù)抽吸的方向被注滿或抽空，其具有可變?nèi)莘e的優(yōu)點。在一個實施例中，泵例如閥531、533和535可用于對儲液池503進(jìn)行填注或分配流體。
具有一個或多個流體輸入口的整體膜件儲液池起到芯片反應(yīng)器的作用。如同儲液池一樣，該反應(yīng)器可以利用通過充氣集管晶片施加的直接壓力或真空來直接引入反應(yīng)物或排出產(chǎn)物。或者，該反應(yīng)器可以利用集成的泵、混合器、和/或選路器構(gòu)造來間接引入反應(yīng)物或排出產(chǎn)物。根據(jù)多種實施方式，由于反應(yīng)器的容積受到充氣晶片中腔室503的尺寸限制，在不大幅改變流體晶片內(nèi)結(jié)構(gòu)設(shè)計的情況下，在裝置的任何部位都可以具有任意容積的反應(yīng)器。而且，根據(jù)芯片上涉及不同體積反應(yīng)物的反應(yīng)需要，可以部分填注該反應(yīng)器。
大多數(shù)彈性膜件為透氣性的，因而這種性質(zhì)目前被利用以簡化所有彈性裝置的流體注入過程。
根據(jù)多種實施方式，膜件的透氣性可消除氣泡或著氣穴。當(dāng)向整體膜件反應(yīng)器或其它流動結(jié)構(gòu)施加驅(qū)動真空時，來自于產(chǎn)生氣體的反應(yīng)中的氣泡可以被消除。例如，透氣性膜件可減少PCR反應(yīng)物在芯片上的熱循環(huán)過程中形成的氣泡，該氣泡會導(dǎo)致反應(yīng)混合物含量的損耗。
復(fù)雜的微流控裝置可包括一些與流動總線相連接的獨立模塊。在一個實施例中，向多個不同的流體通道提供分析物流體很有用處。在另一個實施例中，可將能獲得的多種試劑引入微流控裝置中。圖6是可用于分配分析物流體的總線閥600的圖示。該總線閥600包括閥601、603、605和607，其被制成使流體從流體總線通道611選路到流體通道621、623、625和627中。充氣通道631、633、635和637分管控制流體分配的閥。典型的總線閥在總線一側(cè)具有死體積。死體積造成難以徹底沖洗流體選路操作之間的總線。根據(jù)多種實施方式，本發(fā)明的技術(shù)提供的總線閥在總線側(cè)的死體積很少或者沒有。這使得流體選路操作之間的總線能夠被徹底地沖洗，并且防止了在裝置操作過程中不同流體之間的混合或交叉污染。
微流控裝置機(jī)構(gòu)可以采用各種技術(shù)來制造。根據(jù)多種實施方式，通道特征被蝕刻進(jìn)玻璃晶片，例如，利用標(biāo)準(zhǔn)的濕法化學(xué)蝕刻技術(shù)。玻璃晶片(厚度1.1mm，直徑100mm)用硫酸/過氧化氫(piranha)清洗(20∶1)并利用LPCVD爐或濺射系統(tǒng)來涂覆犧牲層(200nm)多晶硅蝕刻掩摸層。將Borofloat玻璃晶片或者Schott D263硅酸硼玻璃晶片用于所述具有三層式或四層式設(shè)計的裝置。多晶硅沉積之后，用陽性光刻膠旋涂該晶片，溫和烘烤并用接觸式對準(zhǔn)機(jī)制成圖案。用Microposit顯影劑去除光刻膠的紫外線曝光區(qū)域。通過在SF6等離子中進(jìn)行蝕刻去除多晶硅的曝光區(qū)域。在HF溶液中(49％的HF用于Borofloat晶片，1∶1∶2的HF∶HCl∶H2O用于D263晶片)以7um/min的速度等向蝕刻晶片，直到達(dá)到所需的蝕刻深度。
根據(jù)多種實施方式，三層式裝置的流體通道晶片蝕刻成20um深，而四層式裝置蝕刻成40um深。三層式裝置的集管晶片蝕刻70um深，而四層式裝置在閥位置鉆孔。然后分別用PRS-3000和SF等離子將剩余的光刻膠和多晶硅從晶片上剝?nèi)ァｃ@出貫穿流體和集管晶片的通孔并再次用硫酸/過氧化氫清潔該晶片。
在一些實施例中，采用三層式設(shè)計的裝置的組裝是通過將PDMS膜件(254um厚的HT-6135和HT-6240，Bisco Silicones，Elk Grove，IL)加到流體通道晶片中的蝕刻構(gòu)造上，并且無論集管上鉆孔或蝕刻排液腔室是如何朝向的，都直接按壓具有閥的集管混合玻璃-PDMS流體通道從閥位置橫過PDMS膜。采用四層式設(shè)計的裝置的組裝是通過首先將流體通道晶片熱粘合到具有直徑為254um的成對鉆孔通孔的210um厚的D263連接晶片上，其中該通孔位置對應(yīng)通道間隙的位置。該流體通道和連接晶片在真空爐(J.M.Ney，Yucaipa，CA)中以570℃加熱3.5h而粘合。然后將得到的含有全玻璃通道的兩層式結(jié)構(gòu)粘合在PDMS膜和集管晶片上。這樣形成的玻璃-PDMS鍵合是可逆的，但仍然足夠牢固以承受施加到該裝置上的真空和壓力范圍。任選地，在組裝之前通過在UV臭氧清潔器(Jelight Company Inc.，Irvine，CA)中清潔集管晶片和PDMS膜可獲得不可逆的玻璃-PDMS鍵合。
上述的微流控裝置的機(jī)構(gòu)可用于實現(xiàn)各種裝置?？梢造`活地設(shè)置包括閥和泵的構(gòu)造以提供多通道的芯片式實驗室儀器，使其能夠在單個裝置上集成樣品制備和分析步驟。該微流控平臺特別適合于用作一個能夠?qū)崿F(xiàn)集成化病原體檢測系統(tǒng)的裝置。
常規(guī)的快速病原體檢測系統(tǒng)采用酶聯(lián)免疫吸附測定法(ELISA)或熒光免疫測定法(FIA)來進(jìn)行檢測。典型地，檢測會涉及到分析物特異性抗體的固定、與樣品溶液的溫育、連接著酶或熒光團(tuán)的夾心抗體的識別，然后是顯色和檢測過程。也可以使用免疫熒光檢測測定法。然而，每一種測定法都相對具有檢測局限性。
采用各種形式的基于PCR的基因檢測和類型測定也很普遍，因為其具有高度的特異性和獲得量。然而，盡管基于DNA的PCR方法功能強(qiáng)大，但它們對活和死的病原體都呈陽性反應(yīng)，這就有可能產(chǎn)生假陽性的結(jié)果。因而可優(yōu)選對RNA目標(biāo)物進(jìn)行檢測，因為其能夠很快地降解，也就意味著需要活的目標(biāo)物才能夠被檢測出。
人們還提出了多種可選擇的檢測方法。已開發(fā)出質(zhì)譜分析法通過檢測中性脂質(zhì)體、極性質(zhì)脂體和芽孢特異性生物標(biāo)記來檢測病原體、芽孢以及其它生物試劑。然而，質(zhì)譜分析法的速度、通量和便攜性并不出色而且其特異性還未得到證實。
對來自于土壤、空氣等的芽孢(例如炭疽)的檢測是個難題，因為其具有高度的傳染性(在10個孢子/L下可在10分鐘內(nèi)達(dá)到吸入10000個芽孢的劑量)。大多數(shù)先進(jìn)的檢測原理是利用在具有薄膜加熱器和集成熒光激發(fā)和檢測過程的硅制微型反應(yīng)器中對PCR產(chǎn)物進(jìn)行實時檢測的。該系統(tǒng)后來被擴(kuò)展到了一種十通道的高級核酸分析儀(ANAA)以及一種便攜的形式。該系統(tǒng)的各種形式還被開發(fā)用于軍事上和郵局中。還開發(fā)出了一種具有集成(多微升)樣品處理過程的GeneXpert樣品制備系統(tǒng)用于進(jìn)行實時PCR分析。
開發(fā)出能夠快速實施自動和復(fù)雜的前述化學(xué)反應(yīng)并定量病原體濃度和抗生素抗性的便攜式分析儀是一個很大的進(jìn)步。類似地，當(dāng)需要篩選大量樣品或者可能存在的受感染個體時，能夠在高通量、多樣品篩選應(yīng)用中快速地檢測和測定大量樣品的類型并且假陽性率非常低也很有用處。這類自動化臨床分析儀的發(fā)展也有所進(jìn)步。在一個實施例中，開發(fā)出了大致為普通自動分析儀的微型形式的復(fù)雜微流控回路系統(tǒng)用于血液臨床分析。還開發(fā)出了一種全面集成的分析儀(微升體積規(guī)格)，可用于血液樣品制備用以在微陣列上進(jìn)行HIV分析。該系統(tǒng)可進(jìn)行包括多個核酸步驟的復(fù)雜測定，并且采用了＞100nL的死體積充氣膜件閥，該閥將在下面作更詳細(xì)的論述。
已經(jīng)開發(fā)出透明塑料(lucite)微流控管用于控制溶液在六個不同的免疫陣列傳感器上流動，該傳感器以小型便攜式系統(tǒng)的形式控制流體，其具有簡單的減壓系統(tǒng)從而有利于其免疫測定的性能。所開發(fā)的這種形式的系統(tǒng)如，利用集成式流動系統(tǒng)和纖維光學(xué)生物傳感器毛細(xì)管的Raptor便攜式分析儀，可在十分鐘的操作時間內(nèi)分析四種不同的試劑。人們已經(jīng)認(rèn)識了可尋址陣列的獨特性質(zhì)從而開發(fā)出一種集成式的疊層微型實驗室，其可以實現(xiàn)自動化電場驅(qū)動免疫捕獲和DNA雜交陣列分析。例如，隨后免疫捕獲細(xì)菌被釋放出用于鏈置換擴(kuò)增(SDA)，然后進(jìn)行擴(kuò)增志賀樣(Shiga like)毒素基因的雜交分析。然而，其不能進(jìn)行多樣品分析也設(shè)有研究過檢測的局限性。
盡管常規(guī)的微細(xì)加工是在硅上進(jìn)行的，但人們已發(fā)現(xiàn)對于化學(xué)和生化分析來說，玻璃微流控結(jié)構(gòu)呈現(xiàn)出優(yōu)選的化學(xué)和電泳性能，并且塑料結(jié)構(gòu)的范圍也在不斷擴(kuò)展。在高通量應(yīng)用中，本發(fā)明的技術(shù)具有徑向的通道設(shè)計，其能夠快速并行地分析96至384個片段大小或者平行地進(jìn)行測序分離。在芯片上直接集成PCR與CE分析并具有DNA酶切和親和捕獲的功能。
根據(jù)多種實施方式，本發(fā)明的微流控裝置機(jī)構(gòu)可以形成復(fù)雜的通道構(gòu)造，其能夠制成腔室、閥和CE分析通道的復(fù)雜陣列。這些小型的CE通道與交叉注射器一起使用有助于實現(xiàn)十分快速的高分辨率電泳分離。基本上在色譜柱或毛細(xì)管中進(jìn)行的所有操作也都減小到了芯片的形式，所需的樣品量隨之減少，分析時間和靈敏性得到了提高。
根據(jù)多種實施方式，本發(fā)明的病原體檢測系統(tǒng)具有靈敏性與特異性和定量能力相結(jié)合的特征，從而提供了一種特別有用的測定方法。許多病原體在攝入細(xì)菌量＞103時具有感染性，而V.cholera(霍亂病毒)在經(jīng)口攝入量低于105時都不會引起癥狀，或者B.anthracis(炭疽桿菌)在量低得多的水平上也被認(rèn)為具有影響力。識別菌株以便將致病菌株與非致病菌株區(qū)分開來，以及鑒定特異性毒素或抗生素抗性基因的存在對于鑒定危險性和確定治療方法來說也很關(guān)鍵。此外，能夠確定細(xì)菌的濃度或劑量并且隨著所述鑒定結(jié)果一起進(jìn)行定量報告不同于背景技術(shù)的激發(fā)測定試驗，能提供重要激發(fā)測定試驗結(jié)果。
圖7為一種病原體檢測系統(tǒng)700的一個實施例圖示。分析物通過通道701引入到免疫親和性捕獲腔室703、713和723中，通道731處收集殘余物。根據(jù)多種實施方式，免疫親和性試劑用于將輸入的細(xì)菌混合物捕獲、集中并分層到一系列分離的免疫腔室703、713和723中。該便易的過程將重要的大型界面處理為微小界面，原先它們是應(yīng)用微流控系統(tǒng)進(jìn)行痕量病原體檢測的一個障礙。免疫捕獲的第一階段還在提高測定的特異性方面起到了重要的作用。為達(dá)到較高的靈敏度，病原體檢測系統(tǒng)的使用者可接著對存在試劑進(jìn)行基于PCR的重復(fù)確認(rèn)，還開發(fā)出了利用DNA分析機(jī)構(gòu)705、715和725進(jìn)行的基于特定引物的方法或者更普通的測定基因類型的方法，例如PCR，用以鑒定特定的菌株、毒素基因的存在以及抗生物素抗性標(biāo)記的存在。在一個實施例中，DNA分析機(jī)構(gòu)705、715和725包括PCR和CE。
根據(jù)多種實施方式，免疫親和性捕獲腔室703、713和723與PCR腔室集成，但CE機(jī)構(gòu)保持獨立。聯(lián)合免疫捕獲與核酸分析大大提高了個體測定試驗的靈敏度和特異性。
從遺傳學(xué)上區(qū)分病原體和非病原體在許多應(yīng)用中很重要。聯(lián)合免疫捕獲作為PCR分析的上游端對輸入的細(xì)菌種群具有重要的純化作用，可以處理通常存在于不純的復(fù)雜“現(xiàn)實”樣品中的PCR抑制物。根據(jù)多種實施方式，病原體檢測系統(tǒng)將建立起實施低循環(huán)數(shù)(非漸近的)方案的PCR，這樣可保持并報告輸入的目標(biāo)種群的數(shù)量。在許多實施例中，處理的樣品可接著供以CE分析。使用現(xiàn)代微流控技術(shù)可以制造廉價、快速和耐用的測定系統(tǒng)，其體積小、便于攜帶、并且只需要很少的能量、資源和操作技能。
病原體分析儀中包含了集成式免疫親和捕獲腔室。可以使用各種捕獲機(jī)構(gòu)，例如熔塊、微珠、凝膠、整體件(monoliths)、以及聚合物。圖8和圖9是表示利用二氧化硅熔塊和微珠實現(xiàn)的免疫捕獲腔室圖示。根據(jù)多種實施方式，免疫捕獲腔室包括一系列用二氧化硅粉和硅酸鈉粘結(jié)劑的混合物填充晶片孔而制成的二氧化硅熔塊。經(jīng)過脫水和沖洗，該硅酸鹽凝結(jié)成硅膠并且在801、803、805和807處形成了不溶的二氧化硅熔塊。
根據(jù)多種實施方式，在1.1mm厚的玻璃晶片中形成的每個硅熔塊直徑為1mm。免疫捕獲腔室與用于引入和排出分析物的通道821相伴隨。晶片內(nèi)的熔塊很容易集成到含有膜件811和813以及閥和泵結(jié)構(gòu)的裝置上。在圖8中，四個硅熔塊801、803、805和807通過膜件811和813封閉住。每個熔塊的較大硅表面適合于通過各種有機(jī)硅烷試劑來化學(xué)地衍生。為進(jìn)一步簡化裝置的制造，在PDMS非熱粘合到其余裝置上之前可以化學(xué)衍生所述整體晶片。
在一個實施例中，諸如熔塊或1.5um的微珠這樣的機(jī)構(gòu)被加入捕獲腔室中以便能夠捕獲許多大的物質(zhì)種類，例如芽孢和細(xì)菌。固相捕獲許多大的物質(zhì)種類對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，并且其特征曾描述于Weimer，B.C.，M.K.Walsh，C.Beer，R.Koka，以及X.Wang，2001 Solid Phase Capture OfProteins，Spores，and Bacteria.Appl Environ.Microbiology，671300-1307。在一些實施例中，為采用微珠試劑進(jìn)行捕獲，要用圍堰結(jié)構(gòu)來修飾腔室以便提供微珠的止動件以及微珠的引入通道。電動式微珠床裝填與圍堰微珠捕獲對于本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的?；蛘撸梢詫⒕哂忻庖吖δ艿拇判晕⒅橐霙]有圍堰的腔室中。
圖9是表示具有不再密封的整體件的打開閥圖示。根據(jù)多種實施方式，在區(qū)域901、903、905、907和909處施加氣動真空以使得分析物沿著通道921流動通過熔塊931、933、935和937。在所制造的裝置中可以含有任何數(shù)量的熔塊。
圖10A是表示分析物捕獲的圖示。根據(jù)多種實施方式，包括三個膜件閥1001、1003和1005的泵1000用于抽吸含有寡核苷酸、蛋白質(zhì)、細(xì)胞等的分析物溶液通過一系列免疫捕獲腔室。
腔室可使用各種機(jī)構(gòu)來捕獲感興趣的目標(biāo)物。在免疫捕獲腔室中捕獲的任何感興趣的物質(zhì)在此被稱為目標(biāo)物。攜帶目標(biāo)物的流體或物質(zhì)在此被稱為分析物。在一個實施例中，目標(biāo)物為流體分析物中攜帶的沙門氏菌或利斯特氏菌(Listeria)。
在另一個實施例中，每個捕獲腔室填充了含有寡核苷酸探針的粘性聚合物基質(zhì)，以便選擇性地結(jié)合目標(biāo)物分子。在DNA分析時，Sanger DNA序列延伸產(chǎn)物，包括高鹽濃度中的引物和聚合酶試劑，電泳通過免疫捕獲腔室，其中該免疫捕獲腔室中包含了含有共價寡核苷酸探針的固定化丙烯酰胺基質(zhì)。捕獲的序列是這樣選擇的，使只有DNA擴(kuò)增產(chǎn)物被探針捕獲，而引物和聚合酶試劑隨同鹽一起流過該裝置。這就像需要從分析時遇到的復(fù)雜、不純的混合物中純化目標(biāo)物分子那樣。
制備具有功能性聚合物捕獲基質(zhì)的微捕獲腔室的一個可選擇方法包括制備具有10-20um范圍的孔的整體件，以及制備具有較大的、表面修飾了功能性薄交聯(lián)聚合物層的微細(xì)加工元件(大約100um)的腔室。該方法很有用，因為有時候微珠難于填裝到捕獲腔室中并且微珠床對于常規(guī)操作常常缺乏足夠的機(jī)械穩(wěn)定性。根據(jù)多種實施方式，多孔(10-20um)的表面功能性聚合物整體件的成型塊是通過含有單體和孔生(porogenic)溶劑的前體混合物光聚合反應(yīng)而直接形成在捕獲腔室中的。
由于聚合過程是利用UV光來實現(xiàn)的，通過光刻法可以在微流控裝置的任何需要區(qū)域形成多孔聚合物。利用填充有前體混合物的玻璃芯片的這種“微刻法”聚合過程的動力學(xué)對本領(lǐng)域技術(shù)人員來說是已知的，例如描述于Yu，C.，F(xiàn).Svec，和J.M.J.Frechet 2000中的Towards stationary phases forchromatography on a microchipMolded porous polymer monolithsprepared in capillaries by photoinitiated in situ polymerization asseparation media for electrochromatography.(在微芯片上進(jìn)行的固相色譜技術(shù)通過光起始原位聚合反應(yīng)在毛細(xì)管中制備成型的多孔聚合物整體件作為電色譜隔離介質(zhì))，Electrophoresis，21120-127，以及Yu，C.，M.Xu，F(xiàn).Svec，和J.M.J.Frechet 2002中的Preparation of monolithic polymerswith controlled porous properties for microfluidic chip applicationsusing photoinitated free radial polymerization.(利用光起始自由基聚合反應(yīng)制備具有可控多孔特征的整體件聚合物用于微流控芯片應(yīng)用)，J.Polymer Sci.，40755。類似地，可以控制裝置上整體件材料的精確位置以及其表面化學(xué)性質(zhì)，這對于本領(lǐng)域技術(shù)人員也是已知的，如描述于Rohr，T.C，C.Yu，H.M.Davey，F(xiàn).Svec，和J.M.J.Frechet 2001.Simple and efficientmixers prepared by direct polymerization in the channels ofmicrofluidic chips.(通過在微流控芯片的通道中的直接聚合反應(yīng)制備簡單而有效的混合物)，Electrophoresis，223959。整體件聚合物的多孔特性可以通過調(diào)節(jié)致孔溶劑的組分來實現(xiàn)。
無論使用具有微細(xì)加工元件的整體件還是表面，都可以使用同樣的接合方法來引入所需的接合元件。由于目的在于將抗體固定在這些整體件的孔表面上，因此接合的化學(xué)物質(zhì)特別易于與生物聚合物發(fā)生反應(yīng)。在一個實施例中，加入表面接合物的2-乙烯-4，4-二甲基吖內(nèi)酯可以與蛋白質(zhì)迅速反應(yīng)。這樣的機(jī)構(gòu)對本領(lǐng)域技術(shù)人員是已知的，如描述于Peterson，D.S.，T.Rohr，F(xiàn).Svec，和J.M.J.Frechet，2002中所述，Enzymatic microreactor-on-a-chipprotein Mapping using trypsin immobilized on porous polymer monolithsmolded in channels of microfluidic devices.(酶芯片微反應(yīng)器利用微流控裝置通道中成型的多孔聚合物整體件上固定的胰島素作蛋白質(zhì)圖譜)，Anal.Chem.，7440814088。可將要修飾的表面(多孔整體件，或者微細(xì)加工元件)浸入單體溶液中，并且用UV光輻射裝置從而在于選定區(qū)域上實現(xiàn)接合過程。表面功能化的程度由反應(yīng)溶液中單體的濃度、輻射時間，和UV光的強(qiáng)度控制。
在另一個實施例中，胰島素被固定在由2-乙烯-4，4-二甲基吖內(nèi)酯、二甲基丙烯酸乙酯和丙烯酰胺或2-甲基丙烯酸羥乙酯構(gòu)成的多孔聚合物整體件上。吖內(nèi)酯的功能是容易與酶的胺和硫醇基反應(yīng)形成穩(wěn)定的共價鍵。在一些實施例中，整體件優(yōu)化的多孔性特征形成了非常低的背壓，使得能夠使用簡單的機(jī)構(gòu)進(jìn)行抽吸來既實現(xiàn)從溶液中固定酶又實現(xiàn)隨后的底物溶液分析。反應(yīng)器的Michealls-Menten動力學(xué)特征可以利用低分子量的底物，如N-a-苯甲酰-L-精氨酸乙酯來檢測。
人們詳細(xì)研究了固定化變量，例如溶液中胰島素濃度和吖內(nèi)酯的百分比在整體件中的泛函性作用，以及反應(yīng)時間對酶活性的作用，和過程變量如底物流速和在反應(yīng)器中的停流時間的作用。芯片上酶微反應(yīng)器的蛋白水解活性在不同流速下隨著作為底物的熒光標(biāo)記酪蛋白的裂解而得到證實。該整體微反應(yīng)器的優(yōu)良特性還可以通過快速流動速率為0.5uL/min時的肌紅蛋白消化作用來證實，其中停留時間僅為11.7s。然后利用MALDI-TOFMS來表征消化物，在153條可能的肽片斷中識別了102條，序列覆蓋率達(dá)67％。
已經(jīng)作出了巨大的努力來開發(fā)新型的微細(xì)加工分析裝置及其集成化，以制成微型全面分析系統(tǒng)(Ptas)。這些系統(tǒng)提供了比原尺寸儀器具有更高通量、更少的樣品和試劑消耗量、更小尺寸以及更低操作成本的可能性。在微流控裝置的各種應(yīng)用中，分析技術(shù)，例如電泳、電色譜、涉及酶的測定法，以及免疫測定法都通過這種方式得到了證實。盡管微流控芯片技術(shù)不可否認(rèn)取得了成功，但仍存在一些問題。例如，大多數(shù)的微流控芯片特征是開放的通道構(gòu)造。因此，這些通道的表面積與體積比相當(dāng)小。在依賴于與固相表面發(fā)生反應(yīng)的應(yīng)用中，例如在色譜分離、固相提取和多相催化中，其可能成為嚴(yán)重的問題。由于只有通道壁可以用于提供所需的相互作用，所述微型裝置只能處理微量的化合物。
圖10B是表示使用二維分析系統(tǒng)的圖示。在整體件1027捕獲了由具有閥1001、1003和1005的泵提供的目標(biāo)物之后，整體件1027封閉。在一個實施例中，每個腔室隨后被加熱以熔化雙鏈DNA并分離出單鏈DNA產(chǎn)物。根據(jù)多種實施方式，純化作用發(fā)生在120秒內(nèi)，可以從最初的3uL達(dá)到僅僅20nL的200倍濃縮物。每條管線1011、1013、1015、1017、1019和1021都包括用于控制或抽吸被捕獲目標(biāo)物的閥以用于進(jìn)一步的分析步驟。
在一個實施例中，測試裝置上提供了捕獲的目標(biāo)物用于PCR和CE分析。利用諸如加熱或改變pH值的機(jī)構(gòu)可以釋放被捕獲的目標(biāo)物用于DNA分析。這種集成測試裝置的基本特征包括1)免疫捕獲腔室，其蝕刻進(jìn)具有微細(xì)加工的加熱器和溫度傳感器的玻璃基板；2)100-300nL的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)腔室，用于擴(kuò)增從目標(biāo)細(xì)胞裂解所獲得的DNA；以及3)毛細(xì)管電泳微通道，其蝕刻進(jìn)用于分離和檢測PCR擴(kuò)增子的玻璃基板。
任選的第四條特征，集成DNA預(yù)濃縮/純化腔室也可以加到該裝置上，用于純化釋放的病原體基因組DNA或者，在注入CE微通道之前如果需要的話用于預(yù)濃縮擴(kuò)增的DNA。盡管先前的研究表明，為進(jìn)行成功的分析，將PCR擴(kuò)增子直接注入CE微通道上，可以避免需要這樣額外的復(fù)雜性，但是要獲得高質(zhì)量的電泳圖譜這種純化過程是必要的。利用寡核苷酸捕獲基質(zhì)的化學(xué)性質(zhì)可以實現(xiàn)擴(kuò)增子的純化過程。如果需要純化基因組DNA，可以在純化腔室中填充羧化的二氧化硅微珠，并在PCR之前用作全面捕獲細(xì)菌DNA的基質(zhì)。
集成化的一種方法是在玻璃芯片上僅僅制造免疫捕獲、模版純化、PCR、擴(kuò)增子純化、以及CE的單獨模塊。再利用微通道和各種PDMS閥結(jié)構(gòu)將這些模塊彼此相接。圖11中給出了一種被制成具有單獨的免疫捕獲和PCR反應(yīng)器的病原體分析芯片的示意圖。該集成化病原體檢測系統(tǒng)包括免疫親和性捕獲腔室1101。分析物通過該免疫親和性捕獲腔室1101引入到該病原體檢測系統(tǒng)中。PCR腔室1103與該免疫親和性捕獲腔室1101偶聯(lián)并接收由該免疫親和性捕獲腔室1101捕獲的目標(biāo)物。CE通道1105與該P(yáng)CR腔室1103偶聯(lián)用以進(jìn)行進(jìn)一步的分析。微細(xì)加工的電極1113可用于提供電勢差。還可以具有一個與該免疫捕獲腔室和/或PCR腔室偶聯(lián)的加熱器(未畫出)。各種閥控制了分析物流動通過該集成化系統(tǒng)。根據(jù)多種實施方式，這些閥為整體閥。
盡管在裝置上提供免疫捕獲、PCR、CE和純化單獨模塊是一個合理的方案，但根據(jù)多種實施方式建議使用為更簡單的裝置，以便有利于捕獲效率、PCR效率以及DNA片段的高靈敏度分離和檢測。盡管免疫捕獲和PCR可以在單獨的腔室中進(jìn)行，但在一個實施例中，免疫捕獲和PCR可以相結(jié)合以便簡化裝置和處理過程。在該實施例中，PCR可以成功地從固體基質(zhì)和固相免疫捕獲試劑中引發(fā)。在一個實施例中，PCR可以利用免疫標(biāo)記的微珠來進(jìn)行。
圖12是表示聯(lián)合免疫捕獲和PCR腔室1201的圖示。根據(jù)多種實施方式，該聯(lián)合腔室具有在該納升級腔室內(nèi)制造的集成電阻加熱機(jī)構(gòu)(未畫出)和電阻式溫度檢測器(RTD)1205。在一些實施例中，分析物通過輸入口1211并通過膜件閥1221引入。利用壓力驅(qū)動流體流動將目標(biāo)病原體固定在腔室1201內(nèi)，而廢液通過閥1223在出口1213處被收集起來。病原體固定之后，用緩沖液沖洗該腔室1201以去除松弛附著的細(xì)胞或者非特異性結(jié)合的試劑。
PCR緩沖液要么通過原始的樣品入口1211引入，要么通過單獨的專用入口來引入。根據(jù)腔室1201中的目標(biāo)病原體，化學(xué)裂解劑可直接包含在該P(yáng)CR緩沖液中。引入裂解試劑和/或PCR緩沖液之后，用捕獲/PCR腔室中的集成式加熱器1203將樣品溫度升高到一溫度下，使得病原體從捕獲基質(zhì)中同時釋放出并且根據(jù)試劑種類而發(fā)生溶菌。
最簡單但通常是最有效的裂解方法是僅僅進(jìn)行加熱/冷卻循環(huán)。只加熱或者在低濃度的化學(xué)裂解溶劑下加熱時，革蘭氏陰性細(xì)菌和一些具有較薄外部細(xì)胞膜的真核細(xì)胞更易于裂解。在一些情況下，例如對于芽孢或者革蘭氏陽性細(xì)菌來說，就可能需要使用能干擾PCR反應(yīng)的較強(qiáng)的裂解試劑。例如，通常需要將溶菌酶、蛋白酶K、溶葡萄球菌素、和變?nèi)芫貑为毣蛳群蟮丶尤?，以裂解一些頑固的革蘭氏陽性葡萄球菌和&葡萄球菌菌株。在這些情況下，使用單獨的免疫捕獲腔室再加上純化/預(yù)濃縮腔室可以使在細(xì)胞裂解之后PCR擴(kuò)增之前進(jìn)行DNA的中間捕獲過程。
在該方案的捕獲和裂解之后，提取的DNA可以通過電泳而驅(qū)動進(jìn)入純化腔室，由羧基微珠吸收而存儲下來。利用加熱或者改變離子強(qiáng)度可以將純化的DNA從該純化腔室中釋放出來，并通過電泳輸送到PCR腔室中用于擴(kuò)增。一旦來自于裂解細(xì)胞的DNA出現(xiàn)在具有PCR緩沖液的腔室中，利用微細(xì)加工的加熱器和溫度傳感器，就可以在該釋放的基因物質(zhì)上直接進(jìn)行PCR了。
應(yīng)當(dāng)注意在一些情況下，由于其復(fù)雜性或?qū)CR的抑制性，兼有捕獲和PCR用途的單個腔室會出現(xiàn)問題。在這些特殊的情況下，僅僅需要將這兩個階段分開進(jìn)行。在一些實施例中，如果存在的捕獲基質(zhì)或微珠抑制了PCR反應(yīng)或者如果輸入的樣品引入了不能洗去或中和的PCR抑制劑時，就應(yīng)該這樣做。這樣，釋放的DNA可以從捕獲腔室中的裂解細(xì)菌中被抽吸到或者電泳到單獨的PCR反應(yīng)器中用于分析。
一旦完成了PCR，可以將擴(kuò)增子直接注入到CE微通道中用于分離和檢測，根據(jù)所需的分辨率，可采用在分離基質(zhì)中的嵌入染料或者熒光標(biāo)記的引物并變性分離基質(zhì)。在一些情況下，在注入CE微通道之前，可引入DNA純化腔室以便脫鹽和濃縮擴(kuò)增的DNA。通過將擴(kuò)增的DNA電泳進(jìn)入純化腔室，其中它結(jié)合到羧化微殊或者寡核苷酸捕獲基質(zhì)(與所需目標(biāo)物互補(bǔ)的捕獲寡核苷酸)，實現(xiàn)了純化過程。結(jié)合之后進(jìn)行洗滌并利用微加熱器來進(jìn)行溫度相關(guān)的釋放，然后通過注入CE微通道的十字，對濃縮和脫鹽化的PCR擴(kuò)增子進(jìn)行電泳用以分離和檢測。
采用整體膜件閥建立病原體檢測和分析系統(tǒng)的裝置構(gòu)造可以有很大的變化。圖13A是表示一種病原體檢測和分析系統(tǒng)設(shè)計的一個實施例圖示。該設(shè)計包括三個玻璃層，包括通道層1303，連接層1305，和集管層1309。連接層1305與集管層1309之間設(shè)置了一PDMS膜件層。集管層1309包括了可以向膜件1307施加真空的機(jī)構(gòu)用以控制閥機(jī)構(gòu)。
層1301上設(shè)置了電源接頭，層1311上具有集管卡盤層。通道層1303包括免疫捕獲/PCR/純化腔室和CE微通道，以及位于該晶片的上表面的加熱器。根據(jù)多種實施方式，通道層1303與含有玻璃鉆孔作為閥連接的薄玻璃晶片1305熱鍵合。PDMS閥/泵膜件1307可逆或者不可逆地與該多層疊層結(jié)構(gòu)相鍵合。底部蝕刻的集管層1309將真空或壓力傳遞給裝置上的閥和泵。
利用現(xiàn)有的薄膜技術(shù)制造溫控元件提供了構(gòu)建測試裝置的第一種可行途徑。然而，通過采用氧化銦錫(ITO)加熱器可降低該裝置的加工難度。ITO加熱器以其低電阻率、任選的透明度、以及與玻璃基板的兼容性而著稱。這些加熱器可以沉積在同一個晶片上作為溫度傳感器，以避免需要背面加工和電鍍形成加熱器。加熱器可以直接設(shè)置在腔室內(nèi)用于任選的熱傳遞，或者其可以設(shè)置成抵靠在腔室上以便通過玻璃晶片傳導(dǎo)熱能。ITO的任選的透明度也使得可以在流體微通道的上方選擇電加熱器引線的路線，而不會妨礙樣品或PCR擴(kuò)增子的可視效果或檢測。
圖13B是表示根據(jù)多種實施方式的微細(xì)加工過程圖示。1381和1383表示了微細(xì)加工過程。在一些實施例中，先清潔玻璃晶片(550μm厚的D263，購自Schottof Yonkers，NY)，然后通過直流磁控濺射系統(tǒng)(購自于UHV Sputtering of SanJose，CA)將2000的無定形硅層沉積在該晶片的一面。利用購自Karl Sussof Waterbury Center，VT的接觸式對準(zhǔn)機(jī)將購自Shipley 1818 ofMarlborough，MA的光刻膠旋涂上并形成光刻圖案，然后利用購自Plasma Thermof St.Petersburg，F(xiàn)L的平行板反應(yīng)離子蝕刻(RIE)系統(tǒng)中的SF6將底層硅蝕刻掩模有選擇地去除掉。
在一些實施例中，流體通道、電泳通道、和PCR腔室在49％的氫氟酸中被蝕刻成36μm的深度。用購自Flashcut CNC of Menlo Park，CA、具有金剛石鉆頭的CNC磨機(jī)鉆出PDMS閥的儲液池入孔(直徑1.5mm)和流動通孔(直徑0.020”)。然后用晶片劃片機(jī)將晶片切割成兩個20mm×75mm的滑片。
要形成RTD和電極，首先可將200的Ti和2000的Pt(UHV)濺涂在550μm厚的D263晶片上。利用購自Suss Microtec of Waterbury Center，VT的接觸式對準(zhǔn)機(jī)將購自Shipley(SJR 5740)of Marlborough，MA的厚光刻膠旋涂上并形成圖案。根據(jù)多種實施方式，在70℃下將光刻膠烤干2小時。利用熱王水(3∶1的HCl∶HNO3，90℃)蝕刻金屬可形成RTD元件。集成式加熱器的形成是通過首先利用購自于Perkin Elmer of Wellesley，MA的RF濺射系統(tǒng)將200的Ti和2000的Pt的多層薄膜沉積在RTD晶片的背面。將厚光刻膠旋涂在該面，利用背面接觸式對準(zhǔn)機(jī)(Suss)使該晶片形成圖案，然后烤干。利用購自Technic(TG 25 E)of Anaheim，CA的亞硫酸金電鍍液以4.3mA/cm2的電流密度將金電鍍在所述Ti/Pt種層上23分鐘，厚度達(dá)5μm，從而制成加熱器導(dǎo)線。
根據(jù)多種實施方式，去除光刻膠并利用厚光刻膠在背面重新形成圖案。利用購自Veeco Instruments of Plainview，NY的離子束蝕刻系統(tǒng)將加熱元件蝕刻成Ti/Pt種層。將RTD/加熱器晶片切割成兩個25mm×75mm的滑片(Disco)。在一些實施例中，利用購自Centurion VPM，J.M.Ney，of Yucaipa，CA的可編程真空爐將鉆孔通道晶片與RTD/加熱器晶片熱鍵合。
盡管基板上可以包括單個的免疫捕獲、PCR、和CE系統(tǒng)，但本發(fā)明的技術(shù)認(rèn)識到，開發(fā)用于臨床診斷的并行免疫捕獲、PCR、和CE系統(tǒng)也是有效的。在一個實施例中，一種便攜式病原體分析儀包括三個連續(xù)的免疫捕獲/PCR系統(tǒng)，目標(biāo)在于檢測樣品中的三種不同的病原體。直接并行排列了流控系統(tǒng)、加熱器電路、溫度傳感器以及用于三個系統(tǒng)的電泳裝置，單個顯微載玻片具有足夠的表面積來制造三個完全并行的系統(tǒng)。
在另一個實施例中，提供了用于臨床診斷的整體并行免疫捕獲/PCR系統(tǒng)。這種能夠分析來自多個個體或者成組個體的多種不同試劑的能力提供了一種強(qiáng)有力的方法來鑒別和在疫病學(xué)上追蹤感染物。圖14是一種徑向平行的免疫捕獲/PCR裝置1400的部分圖示。圍繞圓環(huán)軸排列的任何具有多個免疫捕獲和DNA分析機(jī)構(gòu)的系統(tǒng)或裝置在此被稱為徑向平行裝置。
根據(jù)多種實施方式，該設(shè)計包括成對的分析器陣列，每個分析器含有一個與CE分析器集成的免疫捕獲/PCR腔室1423。樣品連續(xù)地通過裝置的給定小單元內(nèi)的所有腔室，使得連續(xù)捕獲多種試劑。裝置的單個小單元1401、1403、1405、1407、1409、1411能夠并行地分析不同的物質(zhì)。儲液池1447和1445提供了微珠的輸入和微珠的排出。儲液池1443和1441分別為常規(guī)的毛細(xì)管電泳的陰極儲液池和廢液儲液池。
將腔室相互連接用于級聯(lián)式免疫親和捕獲。閥1431和1433在級聯(lián)環(huán)路上封閉了所述腔室。閥1435和1437從微珠引入和廢液通道處封閉了腔室。CE微通道連接著常規(guī)的中心陽極，以利用現(xiàn)有的旋轉(zhuǎn)共焦熒光掃描儀(未畫出)進(jìn)行檢測。提供了聯(lián)合捕獲腔室1423的平行陣列和具有引線1451的加熱器，以及改進(jìn)的閥和泵的耐用陣列。由于與腔室1423相伴隨的加熱器和溫度傳感器在分析通道上平行工作，使用簡單的環(huán)形加熱器就綽綽有余了。因而不再需要單個的加熱器和溫度傳感器，從而提供了經(jīng)濟(jì)和有效的平行病原體檢測系統(tǒng)。
盡管上面為簡便起見以單數(shù)形式描述了許多元件和加工方法，但本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)明白，也可以使用多個元件和重復(fù)的過程來實踐本發(fā)明的技術(shù)。
盡管本發(fā)明是根據(jù)其特定的實施方式來繪制和說明的，但本領(lǐng)域技術(shù)人員工應(yīng)明白在不偏離發(fā)明實質(zhì)和范圍的情況下，可以對所公開的實施方式的形式和細(xì)節(jié)作出改變。例如，上述實施方式可以利用各種材料來實現(xiàn)。因此，本發(fā)明的范圍應(yīng)當(dāng)參考所附的權(quán)利要求來確定。
權(quán)利要求
1.一種病原體檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括集成在微流控裝置上的免疫捕獲腔室，該免疫捕獲腔室可用于捕獲通過微流控通道提供給所述免疫捕獲腔室的目標(biāo)物；與所述免疫捕獲腔室相伴隨的DNA分析機(jī)構(gòu)，該DNA分析機(jī)構(gòu)集成在所述微流控裝置上，所述DNA分析機(jī)構(gòu)可用于對目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析。
2.權(quán)利要求1所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述DNA分析機(jī)構(gòu)包括PCR和CE。
3.權(quán)利要求2所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中PCR包含在與所述免疫捕獲腔室相分離的腔室中。
4.權(quán)利要求2所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中PCR包含在所述免疫捕獲腔室中。
5.權(quán)利要求2所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述PCR的腔室用于擴(kuò)增從所需目標(biāo)物裂解所得到的DNA。
6.權(quán)利要求3所述的病原體檢測系統(tǒng)，進(jìn)一步包括蝕刻的毛細(xì)管電泳微通道，用于分離和檢測PCR擴(kuò)增子。
7.權(quán)利要求6所述的病原體檢測系統(tǒng)，進(jìn)一步包括DNA預(yù)濃縮與純化腔室，用于純化釋放的病原體基因組DNA，或者在注入CE微通道上之前用于脫鹽和預(yù)濃縮擴(kuò)增的DNA。
8.一種病原體檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括集成在微流控裝置上的免疫捕獲裝置，該免疫捕獲裝置可用于捕獲通過微流控通道提供的目標(biāo)物；與所述免疫捕獲裝置相伴隨的DNA分析裝置，該DNA分析裝置集成在所述微流控裝置上，所述DNA分析裝置可用于對目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析。
9.權(quán)利要求8所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述DNA分析裝置包括與所述免疫捕獲裝置相分離的PCR腔室。
10.權(quán)利要求9所述的病原體檢測系統(tǒng)，所述PCR的腔室用于擴(kuò)增從所需目標(biāo)物裂解所得到的DNA。
11.位于整體裝置上的病原體檢測系統(tǒng)，該系統(tǒng)包括集成在該整體裝置上的多個免疫捕獲腔室，該免疫捕獲腔室可用于捕獲通過微流控通道提供給所述免疫捕獲腔室的目標(biāo)物；與所述免疫捕獲腔室相伴隨的多個DNA分析機(jī)構(gòu)，所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)集成在該整體裝置上，所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)可用于對目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析。
12.權(quán)利要求11所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)包括PCR和CE。
13.權(quán)利要求11所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中PCR是在與所述多個免疫捕獲腔室相分離的腔室中進(jìn)行的。
14.權(quán)利要求13所述的病原體檢測系統(tǒng)，進(jìn)一步包括多個蝕刻的毛細(xì)管電泳微通道，用于分離和檢測PCR擴(kuò)增子。
15.權(quán)利要求14所述的病原體檢測系統(tǒng)，進(jìn)一步包括多個集成的DNA預(yù)濃縮與純化腔室，用于純化釋放的病原體基因組DNA，或者在注入CE微通道上之前用于脫鹽和預(yù)濃縮擴(kuò)增的DNA。
16.權(quán)利要求11所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述免疫捕獲腔室進(jìn)一步可用于純化和濃縮目標(biāo)物。
17.權(quán)利要求11所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述多個微細(xì)加工的免疫捕獲腔室被制成以保持所選擇的抗體。
18.權(quán)利要求17所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所選擇的抗體由微珠、熔塊、溶膠凝膠、凝膠、或者聚合物整體件所保持。
19.權(quán)利要求17所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所選擇的抗體由直接形成在捕獲腔室內(nèi)的多孔、表面功能化聚合物成型塊所保持。
20.權(quán)利要求19所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述成型塊是通過含有單體和致孔溶劑的前體混合物的光聚合反應(yīng)而形成的。
21.權(quán)利要求17所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述多個免疫捕獲腔室被制成徑向平行的方式。
22.權(quán)利要求21所述的病原體檢測系統(tǒng)，進(jìn)一步包括與所述多個免疫捕獲腔室偶聯(lián)的環(huán)形加熱器，該環(huán)形加熱器可用于加熱所述多個免疫捕獲腔室以釋放所捕獲的目標(biāo)物。
23.權(quán)利要求17所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述多個免疫捕獲腔室在玻璃層上制成。
24.權(quán)利要求23所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述玻璃層與整體膜件層偶聯(lián)。
25.權(quán)利要求23所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述玻璃層包括多個蝕刻通道，該蝕刻通道可用于提供流體流動的路徑。
26.權(quán)利要求25所述的病原體檢測系統(tǒng)，其中所述玻璃層和充氣層夾著所述膜件層。
27.一種用于病原體分析的方法，該方法包括通過集成在整體裝置上的微流控通道將流體分析物提供給多個免疫捕獲腔室；在免疫捕獲腔室中捕獲與所述流體分析物相關(guān)的目標(biāo)物；以及利用與多個免疫捕獲腔室相伴隨的多個DNA分析機(jī)構(gòu)對所述目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析，所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)集成在所述整體裝置上。
28.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)包括PCR和CE。
29.權(quán)利要求27所述的方法，其中PCR機(jī)構(gòu)包含在與所述多個免疫捕獲腔室相分離的腔室中。
30.權(quán)利要求29所述的方法，其中所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)包括PCR的腔室，用于擴(kuò)增從所需目標(biāo)物裂解所得到的DNA。
31.權(quán)利要求29所述的方法，進(jìn)一步包括多個蝕刻的毛細(xì)管電泳微通道，用于分離和檢測PCR擴(kuò)增子。
32.權(quán)利要求31所述的方法，進(jìn)一步包括多個集成的DNA預(yù)濃縮/純化腔室，用于純化釋放的病原體基因組DNA，或者在注入CE微通道上之前用于脫鹽和預(yù)濃縮擴(kuò)增的DNA。
33.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述免疫捕獲腔室進(jìn)一步可用于純化和濃縮目標(biāo)物。
34.權(quán)利要求27所述的方法，其中所述多個微細(xì)加工的免疫捕獲腔室被制成以保持著所選擇的抗體。
35.權(quán)利要求34所述的方法，其中所選擇的抗體由微珠、熔塊、溶膠凝膠、凝膠、或者聚合物整體件所保持。
36.權(quán)利要求34所述的方法，其中所選擇的抗體由直接形成在捕獲腔室內(nèi)的多孔、表面功能化聚合物成型塊所保持。
37.一種用于檢測病原體的設(shè)備，該設(shè)備包括通過集成在整體裝置上的微流控通道將流體分析物提供給多個免疫捕獲腔室的裝置；用于捕獲與所述流體分析物相關(guān)的目標(biāo)物的裝置；以及利用與多個免疫捕獲腔室相伴隨的多個DNA分析機(jī)構(gòu)對所述目標(biāo)物進(jìn)行DNA分析的裝置，所述多個DNA分析機(jī)構(gòu)集成在所述整體裝置上。
全文摘要
本發(fā)明提供了用于實現(xiàn)微流控分析裝置的方法和設(shè)備。與集成的充氣集管相伴隨的整體彈性膜件可以設(shè)置有和驅(qū)動多種流控結(jié)構(gòu)的密集陣列，例如用于隔離、選路、混合、分流和存儲流體量的結(jié)構(gòu)。該流控結(jié)構(gòu)可用于實施病原體的監(jiān)測和分析系統(tǒng)，包括集成式免疫親和性捕獲和分析，例如聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)和毛細(xì)管電泳(CE)分析。將分析物溶液引入并且泵壓通過微細(xì)加工腔室中的一系列免疫親和性捕獲基質(zhì)，其中具有靶向各類微生物有機(jī)體的抗體，例如細(xì)菌、病毒和細(xì)菌芽孢的抗體。該免疫親和性腔室能夠捕獲、純化和富集目標(biāo)物以便進(jìn)行進(jìn)一步的分析步驟。
文檔編號C12Q1/68GK1791509SQ200380110066
公開日2006年6月21日 申請日期2003年12月29日 優(yōu)先權(quán)日2002年12月30日
發(fā)明者R·A·馬蒂斯, W·H·格羅弗, B·佩格爾, A·斯克利, C·N·劉, E·拉加利, R·布拉澤 申請人:加州大學(xué)評議會