專利名稱：胎盤衍生的細胞凋亡因子的制作方法
技術領域：
本發(fā)明涉及一種命名為胎盤衍生的細胞凋亡因子(PlacentaDerived Apoptotic Factor(PDAF))的新穎人類腫瘤-相關抗原及其基因。
背景技術：
許多癌癥-特異性基因標記及腫瘤-相關抗原已被鑒定。且發(fā)現(xiàn)腫瘤相關抗原大部分為表達于腫瘤細胞(而不表達于非腫瘤組織的細胞)的表面分子。已鑒定出腫瘤-相關抗原為膜蛋白質，或為經(jīng)修飾碳水化合物的醣蛋白質及醣脂質的分子。它們使得腫瘤細胞與正常細胞在免疫上得以區(qū)分，因而可作為人類癌癥的診斷或治療標的。
一些腫瘤-相關抗原已被揭示于先前文獻。例如，Takeshi Watanabe等人，1999，Nature Medicine，Vol.5，No.8，第938-942頁描述一種表達于SiSo細胞的受體-結合性癌抗原(RCAS1 i.e.，receptor-binding cancer antigen expressed on SiSo cells)，其具有作為腫瘤-相關抗原的功能。RCAS1基因不會表達于正常細胞，但可表達于子宮頸腺癌、子宮內膜腺癌、卵巢癌及子宮頸鱗狀細胞癌(見Takeshi Watanabe等人，1996，American Cancer Society，第1501-1509頁；以及Hitoo Nakano，1998，Clinical Cancer Research，vol.4，第1517-1520頁)。此外，RCAS1基因亦可表達于食道鱗狀細胞癌、胃腺癌、結腸腺癌及胰臟腺癌。RCAS1為包含213個氨基酸的蛋白質。該蛋白質具有N-端跨膜部份(8-27個氨基酸)及在C-端部分具有卷曲螺旋結構(179-206個氨基酸)，此表示RCAS1為第II型膜蛋白質或具有雙體蛋白質結構的分泌蛋白質。RCAS1系作為配體，以推定受體存于各種人類細胞系，諸如K562(人類慢性骨髓源性白血病)、CCRF-CEM(人類T-淋巴球細胞瘤)及Ramos(Burkitt淋巴瘤)以及正常周圍淋巴球，諸如T、B及NK細胞上。RCAS1可抑制受體-表達性細胞的生長并誘導細胞凋亡。腫瘤細胞可借著表達RCAS1而逃避免疫監(jiān)督及在RCAS1受體-陽性免疫細胞中誘導細胞凋亡。RCAS1在腫瘤相關抗原及誘導免疫細胞的細胞凋亡上皆扮有作用。
發(fā)明人預期相似于腫瘤-相關RCAS1抗原的新穎腫瘤-相關抗原，及編碼該抗原的核酸，能用于診斷、預防及治療免疫疾病、細胞增殖及腫瘤，尤其是癌癥。

發(fā)明內容
本發(fā)明的一目的是提供一種命名為胎盤衍生的細胞凋亡因子(PDAF)的新穎人類腫瘤-相關抗原，其包含SEQ ID NO1的氨基酸序列及其生物功能相等物。
本發(fā)明的一目的是提供一種多肽，其包含SEQ ID NO2的氨基酸序列及其生物功能相等物。
本發(fā)明的一目的為提供一種PDAF的片段，其包含SEQ ID NO3的氨基酸序列及其生物功能相等物。
本發(fā)明的另一目的為提供一種編碼SEQ ID NO1的多肽的SEQ IDNO4的核酸及其簡并序列。再者，本發(fā)明提供一種編碼SEQID NO2的多肽的SEQID NO5的核酸及其簡并序列；以及一種編碼SEQ ID NO3的多肽的SEQ ID NO6的核酸及其簡并序列。
本發(fā)明的另一目的為提供一種包含SEQ ID NO4的核酸的重組載體；一種包含SEQ ID NO5的核酸的重組載體；以及一種含有SEQ ID NO6的核酸的重組載體。此外，本發(fā)明亦提供一種含有SEQ ID NO4的核酸的宿主細胞；一種含有SEQ ID NO5的核酸的宿主細胞；以及一種含有SEQ ID NO6的核酸的宿主細胞。
本發(fā)明的另一目的為提供一種醫(yī)藥組合物，其包含本發(fā)明的PDAF及/或其片段。
本發(fā)明再一目的為提供一種轉基因動物，其被導入含有SEQ IDNO4的核酸序列的基因片段，或含有SEQ ID NO5的核酸序列的基因片段，或含有SEQ ID NO6的核酸序列的基因片段。


圖1A至1D顯示PDAF的氨基酸序列(SEQ ID NO1)及其編碼的核酸序列(SEQ ID NO4)。加框區(qū)為由PDAF蛋白質中的45個氨基酸組成的新穎多肽；陰影區(qū)為ATP-GTP結合位置區(qū)域；以及劃線區(qū)為TM代表的跨膜區(qū)域及DIM代表的蜷曲螺旋結構及二聚區(qū)域。
圖2A顯示RCAS1及PDAF基因的限制圖譜(restriction map)。
圖2B顯示RCAS1及PDAF基因經(jīng)限制酶處理后的電泳結果。第1及5道為未切斷樣本；第2及6道為用EcoRI切斷的樣本；第3及7道為用BglII切斷的樣本；第4及8道為用ApoI切斷的樣本；M1為GeneRulerTM1kb DNALadder；以及M2為GeneRulerTM100bp DNA Ladder Plus。
圖3顯示PDAF的氨基酸185-213與PIG-B的氨基酸256-284(SEQ IDNO9)間的相似性。相同性為34％(10/29)及陽性為58％(17/29)。
圖4顯示PDAF的水親和性分析。
圖5顯示在各種人類腫瘤細胞系中RCAS1及PDAF的表達。M100bpDNA標記；第1至5道樣本分別為MCF細胞系、HT29細胞系、RD細胞系、A375細胞系及胎盤。
圖6顯示重組蛋白質GST-RCAS1、GST-PDAF、pET-PDAF.ECD及pET-RCAS1.ECD的表達。
圖7顯示用RCAS1、PDAF、RCASI.ECD及PDAF.ECD處理后的PBMC細胞系的細胞凋亡率。
圖8顯示用RCAS1、PDAF、RCAS1.ECD及PDAF.ECD處理后的未受刺激的天然(native)B細胞系的細胞凋亡率。
圖9顯示用RCAS1、PDAF、RCAS1.ECD及PDAF.ECD處理后的T細胞系的細胞凋亡率。
圖10顯示用RCAS1及PDAF處理后的杰凱特(Jurkat)細胞系的細胞凋亡率。
圖11顯示用RCAS1及PDAF處理后的TF-1細胞系的細胞凋亡率。
具體實施例方式
本發(fā)明特征為一種新穎腫瘤-相關抗原(此后稱為PDAF)及其基因，發(fā)明人發(fā)現(xiàn)其與RCAS1具有相似性。令人驚異地發(fā)現(xiàn)，相較于RCAS1，本發(fā)明的PDAF可導致腫瘤細胞及免疫細胞呈現(xiàn)較高的細胞凋亡率。
定義在本文中，「核酸序列」一詞是指肽核酸(PNA；The FASEB Journal，2000，14(1041-1060))及聚核苷酸諸如脫氧核醣核酸(DNA)及核醣核酸(RNA)。應了解該詞包括相等物，自核苷酸類似物制得的RNA或DNA類似物，以及，優(yōu)選具體實施方式
所使用者，包括單股及雙股聚核苷酸。
在本文中，「氨基酸序列」一詞是指天然存在的蛋白質分子的氨基酸序列；「氨基酸序列」及類似用詞諸如「多肽」或「蛋白質」并非意欲將氨基酸序列限制為與所述蛋白質分子相關的完整、天然氨基酸序列。氨基酸序列包括寡肽、肽、多肽、或蛋白質序列及其片段或部分，以及天然存在或合成的分子。
在本文中，「變體」一詞是指改變一或多個氨基酸的氨基酸序列。該變體較常見可為「保守性」的改變，其中經(jīng)取代氨基酸具有相似的結構或化學性質，例如以異亮氨酸取代亮氨酸。較罕見則是該變體可具有「非保守性」改變，例如以色氨酸取代甘氨酸。同樣少部分的變體亦可包括氨基酸的刪除或插入，或兩者兼具。
在本文中，「刪除」一詞是指氨基酸或核苷酸序列的改變，其中分別缺乏一或多個氨基酸或核苷酸殘基。
在本文中，「插入」或「添加」一詞是指，與天然產(chǎn)的分子相較，氨基酸或核苷酸序列的改變分別是添加一或多個氨基酸或核苷酸殘基。
在本文中，「衍生物」一詞是指經(jīng)化學修飾的核酸，其包括以烷基、酰基或胺基取代氫原子的核苷酸。該核酸衍生物可編碼保有天然分子的必需生物特性的多肽。
在本文中，「生物功能相等物」一詞是指蛋白質或多肽，其中特定氨基酸殘基系經(jīng)刪除或以其它氨基酸殘基取代、或該蛋白質或多肽系添加其它氨基酸殘基，均不會實質影響該蛋白質或肽的功能(例如，治療細胞增殖疾病或抑制免疫反應、抑制細胞的生長及分化及治療癌癥)，即便是有較少或較大程度的差異。
例如，本發(fā)明的多肽(即，SEQ ID NO1、2或3)的生物功能相等物可在氨基酸序列上具有一些改變，使得該氨基酸序列不同于，但實質上相同于，該多肽(即SEQ ID NO1、2或3)的氨基酸序列，且具有與此處所述的多肽基本上相同的性質，即便是有較少或較大程度的差異。
在本文中，「生物功能相等物的氨基酸序列不同于，但實質上相同于SEQ ID NO1、2或3的多肽的氨基酸序列」或其類似用語，是指該生物功能相等物的氨基酸序列實質上對應于SEQ ID NO1、2或3所列氨基酸序列的一部份，其中相對少數(shù)的氨基酸殘基與SEQ ID NO1、2或3的氨基酸序列的對應位置上的氨基酸殘基并不相同，但該生物功能相等物保留此處所述的SEQ ID NO1、2或3的多肽的性質，即便是有較少或較大程度的差異。
特定言之，「該生物功能相等物的氨基酸序列，其不同于但實質上相同于SEQ ID NO1、2或3的多肽的氨基酸序列」包括一種氨基酸序列，其中約70％至約80％，較佳約81％至約90％，更佳約91％至約99％的氨基酸殘基相同于或相似于在SEQ ID NO1、2或3的氨基酸序列的對應位置上的殘基，且一具有該氨基酸序列的多肽或蛋白質保留此處所述的SEQID NO1、2或3的多肽的性質，即便是有較少或較大程度的差異。
用于制備一多肽或蛋白質的生物功能相等物的方法，例如，是改變氨基酸序列，該方法為本領域所熟知，例如，基因工程技術，諸如，定點突變法，其是用以修飾核苷酸序列或氨基酸序列，以及重組蛋白質的表現(xiàn)。
在本文中，「重組蛋白質」一詞是指編碼目標多肽的一種(第一種)氨基酸序列與另一種(第二種)氨基酸序列的融合物，該另一種(第二種)氨基酸序列對目標蛋白質的任何區(qū)域(domain)而言為外來且并非實質上同源的區(qū)域(例如多肽部分)。
在本文中，「載體」一詞是指一核酸分子，其可輸送另一與其連接的核酸分子。優(yōu)選載體的一類型為游離基因(episome)，即能進行染色體外復制的核酸。優(yōu)選的載體為彼等可自動復制及表達其所連接的核酸者。將一段不相關外來的基因片段插入載體中，以構筑一「重組載體」。一般而言，在重組DNA技術中有用的重組載體通常為「質體」形式，該質體一般是指環(huán)狀雙股DNA環(huán)，在其為載體形式時不與染色體結合。
在本文中，「宿主細胞」一詞是指可被載體(如質體)感染的宿主細胞。適合于本發(fā)明的宿主包括常用者及習用于現(xiàn)有技術者。
在本文中，「轉基因動物」一詞是指任何種類的動物，其中一或多種(優(yōu)選為大體上所有)動物的細胞被導入外來基因。該外來基因是通過習知技術的基因操作(如顯微注射或以重組載體感染)而導入該動物細胞的前驅細胞內，藉此直接或間接地將該外來基因導入動物細胞中。其中基因操作不僅包括傳統(tǒng)的雜交或體外受精，亦包括重組DNA分子的導入，該重組DNA分子可被嵌合于染色體內或可為在染色體外復制的DNA等可由熟習此一技藝者可易于實施的技術。
多肽本發(fā)明的一目的是提供一種命名為胎盤衍生的細胞凋亡因子(PDAF)的多肽，其包含SEQ ID NO1(見圖1A至1D)所示的氨基酸序列以及其生物功能相等物。
在本發(fā)明的具體實施方式
中，SEQ ID NO1的生物功能相等物為與SEQ ID NO1具至少80％，優(yōu)選為90％，更優(yōu)選為95％相似度的氨基酸序列。
PDAF是指得自任何物種(以人類為優(yōu)選)或任何來源(無論是天然、合成、半合成或重組)的實質上經(jīng)純化PDAF的氨基酸序列。
根據(jù)本發(fā)明，PDAF包含258個氨基酸，其中PDAF的213個氨基酸與RCAS1完全相同。該由213個氨基酸組成的序列含有一跨膜區(qū)域及一卷曲-螺旋結構及雙體區(qū)域。本發(fā)明的PDAF可誘導腫瘤細胞及免疫細胞的細胞凋亡。
本發(fā)明的另一目的為提供一種由45個氨基酸所組成的多肽(SEQ IDNO2)及其生物功能相等物。該45個氨基酸位于PDAF的位置175-219(見圖1A至1D)。與RCAS1的序列相較，該45個氨基酸(SEQ ID NO2)系插入RCAS1的氨基酸174與175之間。該45個氨基酸的多肽序列在RCAS1的卷曲-螺旋功能性結構及雙體區(qū)域前形成疏水區(qū)域。因此，該疏水區(qū)域可影響全部蛋白質的結構，所以推斷PDAF較RCAS1具有增加生理功能的功效。此外，頃發(fā)現(xiàn)在SEQ ID NO2中位置210-217的氨基酸與一Ras蛋白質的ATP-GTP結合位置區(qū)域(motif)的序列相似。原-致癌基因Ras為各種類型細胞生長及分化所必需的基因。Ras為GTP結合蛋白質，可藉GTP水解控制訊息傳導。在Ras基因的GTP結合位置中的單點突變占所有Ras突變的90％以上并存在于20％以上的所有固體腫瘤中。所以，對于癌癥治療而言，突變型Ras極有可能發(fā)展成為治療的標的(見Journal ofImmunotherapy，1999，22(2)155-165以及The Journal of Urology，1999，1621519-1526)?；谏鲜?，發(fā)明人可以合理預期包含GTP-ATP結合區(qū)域的SEQ ID NO2在細胞的生長及分化上扮演重要地位，且可被用于治療及診斷疾病。
在本發(fā)明的具體實施方式
中，SEQ ID NO2的生物功能相等物為與SEQ ID NO2具至少80％，優(yōu)選為90％，更優(yōu)選為95％相似度的氨基酸序列。
本發(fā)明的一目的為提供一種由PDAF的位置175-258的氨基酸組成的多肽序列(SEQ ID NO3)及其生物功能相等物。SEQ ID NO3為主要誘導免疫細胞及腫瘤細胞細胞凋亡的功能性片段。在本發(fā)明的具體實施方式
中，SEQ ID NO3的生物功能相等物為與SEQ ID NO3具至少80％，優(yōu)選為90％，更優(yōu)選為95％相似度的氨基酸序列。
本發(fā)明的PDAF包括經(jīng)改變序列或生物功能相等物的PDAF，其可通過前述定義的刪除、插入、或氨基酸殘基的取代而被修飾。
核酸本發(fā)明的另一目的為提供一種多核苷酸序列(SEQ ID NO4)及其經(jīng)修飾的序列，其用于編碼圖1A至1D所示的PDAF(SEQ ID NO1)。PDAF基因與RCAS1基因相似，其在長度上由774 DNAs組成。PDAF基因系擴增自人類胎盤及橫紋肌瘤RD細胞系。
本發(fā)明亦提供一種由135 DNAs組成的多核苷酸序列(SEQ ID NO5)及其經(jīng)修飾的序列，其用于編碼SEQ ID NO2所示的45個氨基酸。該135DNAs序列系插入RCAS1序列的位置522與523之間。該SEQ ID NO5的數(shù)目為3的倍數(shù)且在該區(qū)無翻譯終止密碼子。所以，該區(qū)不會影響接下來氨基酸序列的翻譯及其長度。
本發(fā)明亦提供一種由PDAF DNAs的位置523-774的核酸組成的多核苷酸序列(SEQ ID NO6)及其經(jīng)修飾的序列，其用于編碼SEQ ID NO3的多肽。該序列可能為PDAF的功能性片段。
本發(fā)明包括基于習知的基因密碼的簡并性而衍生的可編碼SEQ IDNO1，2或3的多肽的所有核酸。該等簡并變體可為天然發(fā)生者，或可經(jīng)由例行的分子工程技術的應用而產(chǎn)生的，例如，Sambrook等人(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual，第二版，Cold SpringHarbor Laboratory出版，紐約，冷泉港。
根據(jù)本發(fā)明，編碼SEQ ID NO1，2及3以及其衍生物的DNA序列或其片段可使用熟習此一技藝者可易于實施的方法來制造。或者，其可經(jīng)由化學方法制造。例如，多肽合成可使用各種固相技術進行，而自動化合成可經(jīng)由多肽合成儀(例如ABI 431A多肽合成儀)達成。
本技藝所熟知及一般的DNA定序方法可被用于本發(fā)明的任何優(yōu)選具體實施方式
。該等方法可利用酶(如DNA聚合酶I的克萊勞(Klenow)片段、Taq聚合酶、T7聚合酶、或重組聚合酶的組合及校讀外切核酸酶(proofreading exounclease)(諸如ELONGASE的組合))或市售試劑盒來實施。該方法優(yōu)選以機器自動化進行，這些機器諸如Hamilton MicroLab 2200(Hamilton，Reno，Nev.)，Peltier Thermal Cycler(PTC200；MJ Research Watertown，Mass.)及ABI 377 DNA定序儀(Perkin Elmer)。
本發(fā)明的核酸序列可用熟習此一技藝者可易于實施的方法予以工程化，以修飾PDAF編碼序列，該修飾包括(但非限于)修改基因產(chǎn)物的擴增、生產(chǎn)及/或表達。
重組載體及宿主系統(tǒng)本發(fā)明的另一目的為提供一種重組載體，其含有如SEQ ID NO4、5或6所示的核酸序列。為了表達生物上活性的PDAF，編碼PDAF或其生物功能相等物的核酸序列可被插入適當重組載體(即含有經(jīng)插入編碼序列的轉錄及翻譯所需組件的載體)。根據(jù)本發(fā)明，可使用熟悉此一技藝者可易于實施的方法構筑含PDAF編碼序列以及適當轉錄及翻譯控制組件的重組載體。這些方法包括活體外重組DNA技術、合成技術以及在活體內的基因重組。
本發(fā)明的另一目的為提供一種含有重組載體的宿主細胞，該重組載體含有SEQ ID NO4、5或6所示的核酸序列。根據(jù)本發(fā)明，可使用多種宿主系統(tǒng)以含有及表達編碼PDAF的序列。這些宿主細胞包括(但不限于)微生物(諸如用重組噬菌體、質體或共質體(cosmid)DNA重組載體轉形的細菌)；用酵母菌重組載體轉形的酵母菌；用病毒重組載體感染的昆蟲細胞系統(tǒng)；用病毒重組載體或用細菌重組載體轉形的植物細胞系統(tǒng)；或動物細胞系統(tǒng)。
用途根據(jù)本發(fā)明，驚異地發(fā)現(xiàn)PDAF具有下列特征(1)與RCAS1相較，PDAF對于周圍血液淋巴球、未受刺激的天然B細胞、活化T細胞及血癌細胞系諸如杰凱特(Jurkat)細胞及TF-1能夠誘導較高細胞凋亡率。所以，PDAF可作為治療白血病的細胞毒性劑，及/或在需要抑制反應的病癥中(諸如移植體攻擊宿主癥或自體免疫疾病以及在移植過程中)作為免疫抑制劑。
(2)此外，在胎盤組織中PDAF的表達高于RCAS1的表達。再者，PDAF可誘導免疫細胞的細胞凋亡。根據(jù)David A.Clark，1991，CriticalReviews in Immunology，11(3，4)215-247的教示，發(fā)明人可以合理地預期PDAF能用于降低對精子排斥所造成的不孕以及對于胎兒組織排斥所造成的流產(chǎn)。
(3)PDAF可在腫瘤細胞表達。所以，發(fā)明人可以預期對抗PDAF的抗體可用于殺死表達RCAS1或PDAF的腫瘤細胞。
(4)在一些腫瘤細胞中，PDAF的表達低于RCAS1。所以，與RCAS1的表達相較，PDAF的表達具有較高的組織特異性。因此，發(fā)明人可以預期PDAF可用于診斷癌癥。
(5)習知技藝已知的免疫抑制劑可被用于治療肝炎(見Crit RevImmunol，1991，11(3-4)215-247)。所以，發(fā)明人可以合理預期本發(fā)明的PDAF可用于治療肝炎。
基于上述描述，本發(fā)明的PDAF可用于治療及診斷與細胞增殖及免疫反應相關的疾病。
醫(yī)藥組合物本發(fā)明亦提供一種醫(yī)藥組合物，其包含如SEQ ID NO1、2或3所示的多肽，其特別可用于治療細胞增殖或抑制免疫反應。該醫(yī)藥組合物可含有適當?shù)尼t(yī)藥上可接受的載劑，以及視需要亦可含有賦形劑及輔助劑。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可以習知技藝已知的方式(例如藉習用方法)制造，該習用方法包含混合、溶解、制粒、制錠、磨細、乳化、包膠、包陷及/或冷凍干燥步驟。
本發(fā)明的醫(yī)藥組合物可藉任何途徑投藥，這些途徑包括(但不限于)口服、靜脈內、肌內、動脈內、髓內、鞘內、腦室內、穿皮、皮下、腹膜腔內、鼻內、腸道、局部、舌下或肛門投與。
轉基因動物本發(fā)明亦提供一種轉基因動物，其被導入含有SEQ ID NO4的核酸序列的基因片段、含有SEQ ID NO5的核酸序列的基因片段、或含有SEQID NO6的核酸序列的基因片段。根據(jù)本發(fā)明，轉基因動物可為任何方便使用的動物，諸如非人類哺乳動物，例如實驗室測試方法所使用者，如嚙齒動物(例如小鼠或家鼠)，以及用于產(chǎn)生移植用器官或組織的動物(如豬及馬)。本發(fā)明的轉基因動物系使用習知且方便的基因操作技術(諸如顯微注射或感染重組載體)將本發(fā)明基因導入動物中而易于得到。該基因可借著導入前軀細胞內而被直接或間接導入至動物的一細胞或所有細胞中。基因操作技術包括傳統(tǒng)的雜交養(yǎng)殖，試管受精，或引進重組DNA分子，該重組DNA分子可被整合在染色體中或可為在染色體外復制的DNA。本發(fā)明的基因包括分別含有SEQ ID NO4，5及6的核酸序列的基因片段。
根據(jù)本發(fā)明，轉基因動物由于導入本發(fā)明的基因而具有非特異性免疫抑制活性。所以，轉基因動物可被用作較易被人類接受的移植用器官或組織的來源。
下列實例系被用于舉例說明而非限制本發(fā)明。
實例1 PDAF的制造人類PDAF基因的擴增將胎盤組織磨碎并用玻璃研磨器(匯通公司(Wheaton))在RNAZOLTMB溶液中混合。添加0.1ml氯仿至所得溶液中，然后將該溶液置于冰上5分鐘。將所得溶液于12,000g及4℃下離心15分鐘。取0.5ml的上層水層，并添加0.5ml異丙醇至該層中。完全混合后，將所得溶液放置在冰上15分鐘，然后于12,000g及4℃下離心15分鐘以沉淀出RNA。將1ml的75％乙醇添加至該沉淀物中以移除RNA沉淀物中的鹽。將RNA沉淀物在空氣中自然干燥，然后溶解在適當量的無菌水中。測定OD260以定量RNA。
使用胎盤的全部RNA及寡-d(T)12-18引物進行逆轉錄反應。所得第一股cDNA與RNA互補結合以形成核酸分子。以RNase H處理核酸分子以得到用于合成第二股cDNA的引物。以引物及聚合酶合成該cDNA。所得cDNA粘接入質體pCR3.1。繼而將該質體pCR3.1轉形入宿主細胞大腸桿菌DH5α中。將該宿主細胞移至硝基纖維素膜上并用含強堿及SDS的緩沖液溶裂細胞以釋出質體DNA。將質體DNA用UV處理以將該DNA固定于硝基纖維素膜上。使用ATP-GTP結合位置的多肽序列GXXXXGKS(SEQ ID NO7)的簡并序列做為DNA探針，經(jīng)由雜交反應以選擇含有所欲質體DNA的宿主細胞。培養(yǎng)經(jīng)選擇的宿主細胞，接著萃取該宿主細胞的質體。使用各種限制酶的限制酶定位圖測定法定性DNA，或者使用引物T7及pCR3.1反向引物自動定序雙股DNA。
經(jīng)定序的DNA用DNASIS-Mac v 2.0軟件分析。與基因庫(Genebank)中的序列比較后，發(fā)明人未發(fā)現(xiàn)任何基因序列與本發(fā)明的PDAF的序列相同。然而，頃發(fā)現(xiàn)新穎PDAF基因的蛋白質翻譯區(qū)與RCAS1者相似。如圖1A至1D所示，PDAF基因的蛋白質翻譯區(qū)在長度上具有774核酸(SEQ IDNO4)。再者，PDAF及RCAS1的限制酶定位圖(圖2A及限酶切割的電泳圈(圖2B))證明PDAF基因確實與RCAS1不同。
新穎PDAF基因的蛋白質翻譯區(qū)具有額外的135核酸(SEQ ID NO5)。PDAF基因的其余539核酸與RCAS1完全相同。此外，在基因庫中未發(fā)現(xiàn)與上述135核酸相同的序列。該由135核酸組成的序列被插在RCAS1序列的位置522與523之間。
135核酸的序列用于編碼由45個氨基酸組成的序列(SEQ ID NO2)。查核基因庫后，未發(fā)現(xiàn)相似的序列。只有在內質網(wǎng)(ER)中B類補體的磷脂酰肌醇糖(phosphatidyllinositiol glycon of complementationclass B(PIG-B))的氨基酸256-284的序列與45個氨基酸的序列具低度相似性(圖3)。所以，該45個氨基酸的序列為新穎序列。經(jīng)由DNASIS-Macv 2.0軟件的分析，發(fā)現(xiàn)45個氨基酸的序列為高度疏水性多肽(圖4)。該多肽的氨基酸210-217(GQWSYGKS)與Ras蛋白質的ATP-GTP結合位置區(qū)域的序列((A/G)XX XXGK(S/T))(SEQ ID NO8)具高度相似性。
在腫瘤細胞系中PDAF的表達以人類乳腺腺癌MCF-7、人類結腸直腸腺癌HT29、人類黑色素瘤A375、人類胚胎性橫紋肌瘤RD及人類胎盤細胞測定PDAF的表達。萃取RNA，然后用寡-d(T)12-18作為逆轉錄反應的引物。繼而使用PDAF基因的蛋白質翻譯區(qū)的二終端的序列作為引物，將反應產(chǎn)物進行PCR反應。生成的反應產(chǎn)物經(jīng)由瓊脂醣凝膠電泳分析。如圖5所示，上述腫瘤細胞系主要表達RCAS1。只有RD細胞系表達少量的PDAF。不過，胎盤細胞主要表達PDAF。相反地，胎盤細胞僅表達少量RCAS1。
重組蛋白質的表達及純化pCR3.1質體所含的RCAS1基因片段或PDAF基因片段藉使用限制酶EcoRI切割及用1％瓊脂醣凝膠單離。使用Gene Clean III試劑盒純化被單離的DNA片段。將純化的DNA與pGEX-3X載體(Amersham Pharmacia)粘接，然后將該載體轉形入大腸桿菌。萃取該細胞所含的質體，得到質體pGEX-3X/RCAS1及pGEX-3X/PDAF。將上述二質體轉形入大腸桿菌BL21以表達重組蛋白質。
將含有上述二質體的大腸桿菌細胞在37℃下振蕩培養(yǎng)整夜。將培養(yǎng)溶液接種至新鮮AP/LB培養(yǎng)基并在37℃下振蕩培養(yǎng)4小時。添加0.1mM的IPTG至培養(yǎng)物。然后將培養(yǎng)物于振搖及25℃下培育4小時以誘導重組蛋白質的表達。將該培養(yǎng)物于8000xg及4℃下離心15分鐘以收集細胞。將細胞懸浮在20毫升含1％Triton X-100的PBS緩沖液中。使用音波儀破裂該細胞。在12,000xg及4℃下離心15分鐘以移除不溶的沉淀物。將含有重組蛋白質的上清液加至裝填有麩胱甘肽(glutathione)瓊脂糖4B的親和管柱(Amersham Pharmacia)中。以含20mM還原谷胱甘肽、120mMNaCl及50mM Tris-HCl的緩沖液(pH8.0)沖析GTS-重組蛋白質。將沖析出的溶液于4℃下以PBS緩沖液透析并以Amicon 8010濃縮。所得蛋白質的濃度用BCA蛋白質測定試劑(Pierce)測定。
使用自RCAS1及PDAF的細胞外蛋白質區(qū)域設計的引物進行PCR，以大量得到用于編碼RCAS1及PDAF的細胞外蛋白質區(qū)的基因片段。以限制酶BamHI處理基因片段并黏接至用BamHI預先處理的載體pET32a(+)(Invitrogen)。然后，將該載體轉形入大腸桿菌細胞。經(jīng)由PCR、質體萃取及限制酶定位圖譜測定，得到質體pET32a(+)/RCAS1.ECD及pET32a(+)/PDAF.ECD。以上述二質體轉形入大腸桿菌BL21(DE3)pLysS(Promega)。
將含有質體pET32a(+)/RCAS1.ECD及pET32a(+)/PDAF.ECD的大腸桿菌細胞在37℃下振蕩培養(yǎng)整夜。將培養(yǎng)物接種至新鮮AP/LB培養(yǎng)基，繼而在37℃下振蕩培育3小時。將0.1mM的IPTG加到培養(yǎng)基中以誘導重組蛋白質的大幅表達。將培養(yǎng)物于8000xg及4℃下離心15分鐘以收集細胞。將細胞懸浮在含50mM磷酸鈉(pH8.0)及300mM氯化鈉的緩沖液中并藉超音波使的破裂。在12,000xg及4℃下離心15分鐘以移除不溶的沉淀物。添加含有重組蛋白質的上清液至由Ni-NTA SUPERFLOW(QIAGENE)組成的親和性管柱中。PET重組蛋白質以含有10％甘油及連續(xù)梯度的0-500mM咪唑的緩沖液(pH8.0)沖析。重組蛋白質pET-RCAS1.ECD、pET-PDAF.ECD、GST-RCAS1及GST-PDAF的電泳圖系示于圖6中。將沖析出的溶液于4℃下以PBS緩沖液透析及用AMICON 8010濃縮。所得蛋白質的濃度用BCA蛋白質測定試劑(Pierce)測定。
實例2 PI染色及流式細胞光度測定108的人類周圍血液單核細胞在含10％牛血清的RPMI培養(yǎng)基中在37℃下培育1-2小時。收集懸浮細胞，接著添加至涂覆兔-抗-人類免疫球蛋白IgM抗體(CAPPEL)的24孔培養(yǎng)皿中。將培養(yǎng)皿置于室溫下1小時以進行附著反應。與兔子-抗人類免疫球蛋白IgM抗體接連的淋巴球為未受刺激的天然B細胞。收集懸浮的細胞并添加1×106細胞/毫升/孔至涂覆小鼠-抗人類CD3單株抗體(OKT3；3μg/ml；1ml/孔)的24-孔培養(yǎng)皿中。在培養(yǎng)皿中的淋巴球主要為活性T細胞。將如上述制備的重組蛋白質添加至含上述B及T細胞的24-孔培養(yǎng)皿中，接著將培養(yǎng)皿放置在培育器中，并于5％CO2及37℃下培育64-68小時。將該細胞于2400rpm離心5分鐘。移除上清液并添加低張DNA染色緩沖液(3.5mM檸檬酸鈉，0.3％Triton X-100，pH6.8)至細胞中。再加入800μl的低張DNA染色緩沖液及30μg RNase A及5μg碘化普羅披錠(propidium iodide)。該反應進行30分鐘。染色結果藉流式細胞儀測定。如圖7所示，用GST-PDAF處理的PBMC的細胞凋亡率比用GST-RCAS1處理的PBMC的細胞凋亡率高。
圖8及9顯示與GST-RCAS1相較，GST-PDAF在未受刺激的天然(native)B細胞及活化T細胞中可誘導較高度的細胞凋亡。
人類血癌細胞系、杰凱特(Jurkat)(T淋巴球細胞)及人類紅血球癌細胞系TF-1(ATCC CRL-2003)的PI染色及流式細胞儀測定如上述進行。如圖10所示，用PBS緩沖液或GST蛋白質處理的杰凱特細胞(對照組)的細胞凋亡率分別為3.95％及5.22％。用GST-RCAS1處理的杰凱特細胞的細胞凋亡率為7.9％，略高于用GST蛋白質處理的杰凱特細胞的細胞凋亡率。不過，用GST-PDAF處理的杰凱特細胞的細胞凋亡率遠高于用GST-RCAS1處理或用GST處理的杰凱特細胞的細胞凋亡率?；谏鲜?，本發(fā)明的PDAF與RCAS1相較，能誘導較高的杰凱特細胞細胞凋亡率。
人類白血球癌細胞系TF-1為具低度分化的造血細胞系。如圖11所示，本發(fā)明的PDAF與RCAS1相較，能誘導較高的TF-1細胞細胞凋亡。
序列表<110>華星生物科技股份有限公司<120>胎盤衍生的細胞凋亡因子<130>6653-015<140>09/684,327<141>2000-10-10<160>9<170>FastSEQ for Windows Version 4.0<210>1<211>258<212>PRT<213>PDAF多肽序列<400>1Met Ala Ile Thr Gln Phe Arg Leu Phe Lys Phe Cys Thr Cys Leu Ala1 5 10 15Thr Val Phe Ser Phe Leu Lys Arg Leu Ile Cys Arg Ser Gly Arg Gly20 25 30Arg Lys Leu Ser Gly Asp Gln Ile Thr Leu Pro Thr Thr Val Asp Tyr35 40 45Ser Ser Val Pro Lys Gln Thr Asp Val Glu Glu Trp Thr Ser Trp Asp50 55 60Glu Asp Ala Pro Thr Ser Val Lys Ile Glu Gly Gly Asn Gly Asn Val65 70 75 80Ala Thr Gln Gln Asn Ser Leu Glu Gln Leu Glu Pro Asp Tyr Phe Lys85 90 95Asp Met Thr Pro Thr Ile Arg Lys Thr Gln Lys Ile Val Ile Lys Lys100 105 110Arg Glu Pro Leu Asn Phe Gly Ile Pro Asp GIy Ser Thr Gly Phe Ser115 120 125Ser Arg Leu Ala Ala Thr Gln Asp Leu Pro Phe Ile His Gln Ser Ser130 135 140Glu Leu Gly Asp Leu Asp Thr Trp Gln Glu Ash Thr Asn Ala Trp Glu145 150 15S 160Glu Glu Glu Asp Ala Ala Trp Gln Ala Glu Glu Val Leu Arg Ser Arg165 170 175Thr Asn Val Cys Leu Leu Cys Ser Leu Leu Phe His His Pro Thr Pro180 185 190Thr Ser Thr Pro Tyr Ile Asn Gln Ser Val Lys Ile Glu Arg Val Ser195 200 205Leu Gly Gln Trp Ser Tyr Gly Lys Ser Lys Glu Gln Gln Lys Leu Ala210 215 220Asp Arg Glu Lys Arg Ala Ala Glu Gln Gln Arg Lys Lys Met Glu Lys225 230 235 240Glu Ala Gln Arg Leu Met Lys Lys Glu Gln Asn Lys Ile Gly Val Lys245 250 255Leu Ser<210>2<211>45
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<210>6<211>252<212>DNA<213>PDAF多肽序列<400>6tccaggacca atgtatgttt actctgctct ctcctgtttc atcatcccac tcctacctcc 60actccctaca ttaaccaatc agtaaagata gagagagtga gtctgggtca gtggagttac 120ggaaagagta aggaacagca gaaactagca gacagagaaa agagagcagc cgaacaacaa 180aggaagaaaa tggaaaagga agcacaacgg ctaatgaaga aggaacaaaa caaaattggt 240gtgaaacttt ca 252<210>7<211>8<212>PRT<213>PDAF多肽序列<220>
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<221>變體<222>(1)...(6)<223>Xaa＝任何氨基酸<400>8Xaa Xaa Xaa Xaa Gly Lys1 5<210>9<211>29<212>PRT<213>PIG-B多肽序列<400>9Leu Ile Leu His His Phe Leu Pro Val Gly Phe Val Thr Leu Ser1 5 10 15Leu Ser Leu Met Ile Asp Arg Ile Phe Phe Gly Gln Trp Thr20 2權利要求
1.一種多肽，其特征在于具有含SEQ ID NO1的氨基酸序列或其生物功能相等物。
2.一種多肽，其特征在于包含SEQ ID NO2的氨基酸序列或其生物功能相等物。
3.一種多肽，其特征在于包含SEQ ID NO3的氨基酸序列或其生物功能相等物。
4.根據(jù)權利要求1所述的多肽，其特征在于是用于抑制細胞的生長及分化或抑制免疫反應。
5.根據(jù)權利要求2所述的多肽，其特征在于它用于抑制細胞的生長及分化或抑制免疫反應。
6.根據(jù)權利要求3所述的多肽，其特征在于它用于抑制細胞的生長及分化或抑制免疫反應。
7.根據(jù)權利要求1所述的多肽，其特征在于它用于治療癌癥。
8.根據(jù)權利要求2所述的多肽，其特征在于它用于治療癌癥。
9.根據(jù)權利要求3所述的多肽，其特征在于它用于治療癌癥。
10.一種分離的核酸，其特征在于它用于編碼權利要求1的多肽，及其簡并序列。
11.一種分離的核酸，其特征在于它用于編碼權利要求2的多肽，及其簡并序列。
12.一種分離的核酸，其特征在于它用于編碼權利要求3的多肽，及其簡并序列。
13.根據(jù)權利要求10所述的分離的核酸，其特征在于它為SEQ IDNO4。
14.根據(jù)權利要求11所述的分離的核酸，其特征在于它為SEQ IDNO5。
15.根據(jù)權利要求12所述的分離的核酸，其特征在于它為SEQ IDNO6。
16.一種重組載體，其含有權利要求10的核酸序列。
17.一種重組載體，其含有權利要求11的核酸序列。
18.一種重組載體，其含有權利要求12的核酸序列。
19.一種宿主細胞，其含有權利要求16的載體。
20.一種宿主細胞，其含有權利要求17的載體。
21.一種宿主細胞，其含有權利要求18的載體。
22.一種制造權利要求1的多肽的方法，其包含下列步驟a)在適于表達多肽的條件下，培養(yǎng)權利要求19的宿主細胞；以及b)從宿主細胞培養(yǎng)物回收多肽。
23.一種制造權利要求2的多肽的方法，其包含下列步驟a)在適于表達多肽的條件下，培養(yǎng)權利要求20的宿主細胞；以及b)從宿主細胞培養(yǎng)物回收多肽。
24.一種制造權利要求3的多肽的方法，其包含下列步驟a)在適于表達多肽的條件下，培養(yǎng)權利要求21的宿主細胞；以及b)從宿主細胞培養(yǎng)物回收多肽。
25.一種重組蛋白質，其包括權利要求1的多肽及對該多肽而言為外來且非實質上同源的區(qū)域。
26.一種重組蛋白質，其包括權利要求2的多肽及對該多肽而言為外來且非實質上同源的區(qū)域。
27.一種重組蛋白質，其包括權利要求3的多肽及對該多肽而言為外來且非實質上同源的區(qū)域。
28.一種控制細胞生長的醫(yī)藥組合物，其包含權利要求1的多肽。
29.一種控制細胞生長的醫(yī)藥組合物，其包含權利要求2的多肽。
30.一種控制細胞生長的醫(yī)藥組合物，其包含權利要求3的多肽。
31.根據(jù)權利要求28所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于它用于抑制細胞的生長及分化或抑制免疫反應。
32.根據(jù)權利要求29所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于它用于抑制細胞的生長及分化或抑制免疫反應。
33.根據(jù)權利要求30所述的醫(yī)藥組合物，其特征在于它用于抑制細胞的生長及分化或抑制免疫反應。
34.一種制備轉基因動物的方法，其包括將含有SEQ ID NO4的核酸序列的基因片段導入動物。
35.一種制備轉基因動物的方法，其包括將含有SEQ ID NO5的核酸序列的基因片段導入動物。
36.一種制備轉基因動物的方法，其包括將含有SEQ ID NO6的核酸序列的基因片段導入動物。
全文摘要
本發(fā)明提供一種新穎人類腫瘤－相關抗原(即胎盤衍生的細胞凋亡因子(PDAF))的核酸及氨基酸序列，及這些序列在治療免疫及細胞增殖相關病癥上的用途。
文檔編號C12N15/12GK1640890SQ200410000359
公開日2005年7月20日 申請日期2004年1月9日 優(yōu)先權日2004年1月9日
發(fā)明者羅瑋瑜, 謝世良 申請人:華星生物科技股份有限公司