專利名稱：微生物木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(xet)的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及微生物木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(xyloglucanendotransglycosylase，XET)，其生產(chǎn)方法和用途。
背景技術(shù)：
木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(XET)是一種已知來自于植物的酶。就我們所知，還沒有報(bào)導(dǎo)過來源于微生物的XET。
Stephen C.Fry等在生物化學(xué)雜志(1992年，282，821-828頁)中暗示XET負(fù)責(zé)切割和再連接微絲間(intermicrofibrillar)木糖葡聚糖鏈，因此XET能導(dǎo)致植物細(xì)胞膨脹所需要的細(xì)胞壁松弛。
XET已被提議用于調(diào)控植物形態(tài)(參見EP562836中21、27-28頁)。
人們相信XET存在于所有植物，特別是所有的陸生植物中。已從雙子葉植物、單子葉植物，具體說是禾本科單子葉植物和百合科單子葉植物，以及苔類和蘚類植物中提取到了XET(文獻(xiàn)可參考生物化學(xué)雜志(1992)282，823頁)。
在共同未決的專利申請(qǐng)PCT/DK96/00538(WO97/23683)中，我們已指出，用XET酶處理后，纖維素材料可以獲得改善的強(qiáng)度特性和/或提高的保形性能和/或更好的抗皺性能。
XET酶有一些很有趣的應(yīng)用，因此本發(fā)明的一個(gè)目的是提供可用于諸如以上用途的微生物來源的木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶。微生物來源的木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶應(yīng)該具有易于大量生產(chǎn)的優(yōu)勢(shì)。
發(fā)明概述通過篩選分析發(fā)現(xiàn)了大批在系統(tǒng)發(fā)生上比較分散的微生物能產(chǎn)生XET活性。
因此，本發(fā)明涉及一種能夠由培養(yǎng)表達(dá)XET的微生物而得到的木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶制劑；具體說本發(fā)明涉及一種木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶的生產(chǎn)方法，它包括a)在適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，有利于XET酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)表達(dá)微生物XET的微生物，以及b)隨后從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中純化XET酶。
另外，本發(fā)明還涉及本發(fā)明的XET制劑用于處理纖維素材料的用途，同時(shí)涉及微生物XET制劑。
附圖簡(jiǎn)述結(jié)合以下附圖進(jìn)一步闡述本發(fā)明，其中

圖1顯示根據(jù)實(shí)施例5得到的Dichotomocladium hesseltinei，Tiarosporella phaseolina和淡黑假黑盤菌(Pseudoplectanianigrella)的XET活性的pH曲線(△Tiarosporella phaseolina；□淡黑假黑盤菌；◆Dichotomocladium hesseltinei)。
圖2顯示根據(jù)實(shí)施例5得到的木糖葡聚糖酶活性的pH曲線(△Tiarosporella phaseolina；□淡黑假黑盤菌；◆Dichotomocladium hesseltinei)。
發(fā)明詳述本發(fā)明涉及一種能夠由微生物培養(yǎng)而得到的木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶制劑。
在本申請(qǐng)中表明XET可由真菌和細(xì)菌產(chǎn)生，預(yù)計(jì)酵母也能產(chǎn)生XET。
可用“XET試紙”鑒定產(chǎn)XET的微生物。這種“XET試紙”在共同未決的專利申請(qǐng)PCT/GB96/02351(WO97/11193)中有述；它是在標(biāo)記了的寡糖中浸泡過的涂覆木糖葡聚糖的試紙。
通過以下方法制備標(biāo)記的寡糖、浸透了木糖葡聚糖的試紙，并進(jìn)行點(diǎn)印跡檢測(cè)XET活性。
標(biāo)記寡糖的制備將還原性寡糖4-O-[4-O-[4-O-[6-O-α-D-吡喃木糖-β-D-吡喃葡萄糖]-6-O-(2-O-β-D-吡喃半乳糖)-α-D-吡喃木糖-β-D-吡喃葡萄糖]-6-O-(2-O-β-D-吡喃半乳糖)-α-D-吡喃木糖-β-D-吡喃葡萄糖]-D-葡萄糖(‘XLLG’)(1克)溶于25ml含1克氰氫硼化鈉(NaCNBH3)的碳酸氫銨飽和水溶液中，25℃置暗處，保持7天進(jìn)行還原性胺化。干燥除去碳酸氫銨，純化XLLG的(水合茚三酮反應(yīng)性)胺化衍生物(例如通過凝膠過濾層析或陽離子交換層析)。產(chǎn)物應(yīng)是寡糖基-1-氨基-1-脫氧多羥基醇(deoxyalditol)，即XLLG的還原性末端D-葡萄糖部分被1-氨基-1-脫氧-D-葡糖醇取代了的衍生物。
將寡糖基-1-氨基-1-脫氧多羥基醇(50mg)溶于3ml 3％硼砂(四硼酸二鈉；pH＝9.0-9.5)中，攪拌下逐漸加入0.75ml含有10mg麗絲胺若丹明磺酰氯(購自Molecular Probes Inc.，USA)的干二甲基甲酰胺(DMF)新鮮配制的溶液，混合溶液置暗處過夜。再加入0.75ml含10mg麗絲胺若丹明磺酰氯的DMF，混合溶液再放置8小時(shí)。經(jīng)凝膠過濾層析，然后在C18-硅膠柱子上進(jìn)行反相層析，純化鮮粉色的寡糖基-1-氨基-1-脫氧多羥基醇-麗絲胺若丹明偶聯(lián)物(XLLGol-SR)。用水清洗后一個(gè)柱子后，采用甲醇梯度，在大約50％甲醇中洗脫下XLLGol-SR。
制備浸透木糖葡聚糖的試紙用1％木糖葡聚糖水溶液濕潤(rùn)Whatman 1號(hào)濾紙，將濾紙干燥。將XLLGo1-SR制劑稀釋在足量的75％丙酮水溶液中，使580nm處的光吸收值(A580)為0.2；然后將涂覆了木糖葡聚糖的Whatman 1號(hào)濾紙浸在該溶液中，并再次干燥；產(chǎn)品稱為XET試紙。用非水性粘合劑將適當(dāng)大小的XET試紙片(例如72×108mm)粘在非吸收性介質(zhì)(如透明醋酸纖維素紙)上。
XET活性的點(diǎn)印跡檢測(cè)
i)將待進(jìn)行XET活性檢測(cè)的液滴用吸液管點(diǎn)在一張XET試紙的標(biāo)記位置上。如果斑點(diǎn)是4μl，樣品之間的距離可以是9mm(圓心到圓心，即象在標(biāo)準(zhǔn)的96孔檢測(cè)盤中的式樣)。
ii)然后迅速(在斑點(diǎn)干燥以前)將XET試紙夾在兩張塑料(例如象空中投影儀中所用的醋酸纖維素膠片)之間，進(jìn)行保溫(例如20℃，1小時(shí))。
iii)將保溫過的XET試紙及其塑料底襯放置(試紙側(cè)朝下)在含有150ml溶劑(例如現(xiàn)配的乙醇/蟻酸/水(體積比1∶1∶1))的盤子中，溶劑能將未反應(yīng)的XLLGol-SR從試紙上除去，由于XET催化的轉(zhuǎn)糖基作用而結(jié)合至木糖葡聚糖的XLLGol-SR則不會(huì)被除去。這時(shí)可將試紙與塑料底襯分離。
iv)將試紙?jiān)诹魉衅?分鐘，然后在大約100ml丙酮中洗5分鐘，再徹底干燥。如果需要，可以在80℃烤箱中烤5分鐘，以加快干燥處理。
v)然后在短波長(zhǎng)紫外燈(例如，254nm發(fā)射光；佩帶適當(dāng)?shù)难劬推つw保護(hù)裝置)下檢查試紙。粉色(橙色熒光)斑點(diǎn)指示有活性XET，可以用掃描熒光分光計(jì)進(jìn)行定量測(cè)定。
XET酶我們已經(jīng)發(fā)現(xiàn)，具有XET活性的微生物酶可以是轉(zhuǎn)糖基酶(意味著它們?nèi)鄙偎饣钚曰蛑挥泻艿偷乃饣钚?，或者它們能同時(shí)催化木糖葡聚糖的轉(zhuǎn)糖基作用和水解。
從植物中得到的同時(shí)具有轉(zhuǎn)糖基活性和水解活性的XET酶也有描述(參見植物生理學(xué)植物分子生物學(xué)年度綜述，1995，46509頁)。
系統(tǒng)分類本文所用的系統(tǒng)分類主要根據(jù)NIH數(shù)據(jù)庫(Entrez，versionspring 1996)中使用的系統(tǒng)(可從全球通網(wǎng)絡(luò)(http//www3.ncbi.nlm.nih.gov/htbin/ef/entrezTAX)得到)。
對(duì)于Entrez數(shù)據(jù)庫未收錄的微生物分類，使用了以下常用并在世界范圍內(nèi)接受的參考書對(duì)子囊菌綱(Ascomycetes)，參考Eriksson，O.E.&Hawksworth，D.L.Systema Ascomycetum，12卷(1993)。
對(duì)擔(dān)子菌綱(Basidiomycetes)，參考Julich，W.Higher Taxaof Basidiomycetes，Bibliotheca Mycologia，85，485頁(1981).
對(duì)接合菌綱(Zygomycetes)，參考O’Donnell，K.Zygomycetesin culture，University of Georgia，US，257頁(1979).
常用真菌參考書Hawksworth，D.L.，Kirk，P.M.Sutton，B.C.和Pegler，D.N.真菌詞典，國(guó)際真菌學(xué)會(huì)，616頁(1995)；Von Arx，J.A.培養(yǎng)中會(huì)形成孢子的各個(gè)真菌屬(The generaof fungi sporulating in culture)，424頁(1981).
優(yōu)選真菌本發(fā)明的一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，XET制劑是通過培養(yǎng)真菌，具體說是擔(dān)子菌(Basidiomycota)，接合菌(Zygomycota)，子囊菌(Ascomycota)或有絲分裂孢子真菌(Mitosporic fugus)生產(chǎn)的。
優(yōu)選的擔(dān)子菌菌株是屬于革蓋菌目(Coriolales)，裂褶菌目(Schizophyllales)，韌革菌目(Stereales)或Xenasmatales各目的層菌綱(Hymenomycetes)菌株；具體說是屬于革蓋菌科(Coriolaceae)，伏革菌科(Corticiaceae)，裂褶菌科(Schizophyllaceae)，韌革菌科(Stereaceae)或Tubulicrinaceae各科的菌株。優(yōu)選以下各屬栓菌屬(Trametes)，伏革菌屬(Corticium)，裂褶菌屬(Schizophyllum)或Tubulicrinis。優(yōu)選的種是毛栓菌(Trametes hirsuta)、玫瑰色伏革菌(Corticium roseum)、裂褶菌屬之種、毛韌革菌(Stereumhirsutum)或Tubulicrinis subulatus。
優(yōu)選的子囊菌菌株是屬于腔菌綱(Loculoascomycetes)，盤菌綱(Discomycetes)，核菌綱(Pyrenomycetes)或不整囊菌綱(Plectmycetes)的菌株，優(yōu)選屬于座囊菌目(Dothideales)，斑痣盤菌目(Rhytismatales)，盤菌目(Pezizales)，錘舌菌目(Leotiales)，炭角菌目(Xylariales)，肉座菌目(Hypocreales)，海殼目(Halosphaeriales)，黑痣菌目(Phyllachorales)，腐皮殼菌目(Diaporthales)和散囊菌目(Eurotiales)各目的菌株。
優(yōu)選的菌株是屬于葡萄座腔菌科(Botryosphaeriaceae)，小穴殼菌科(Dothioraceae)，球腔菌科(Mycosphaerellaceae)，毛筒殼科(Tubeuffiaceae)，格孢腔菌科(Pleosporeceae)，小球腔菌科(Leptosphaeriaceae)，斑痣盤菌科(Rhytismataceae)，肉盤菌科(Sarcosomataceae)，火絲菌科(Pyronemataceae)，糞盤菌科(Ascobolaceae)，核盤菌科(Sclerotiniaceae)，圓孔殼科(Amphisphaeriaceae)，炭角菌科(Xylariaceae)，肉座菌科(Hypocreaceae)，海殼科(Halosphaeriaceae)，黑痣菌科(Phyllachoraceae)，黑腐皮殼科(Valsaceae)，黑盤孢科(Melanconidaceae)，和發(fā)菌科(Trichocomataceae)各科的菌株；特別是屬于二孢屬(Diplodia)，Plowrightia，葉點(diǎn)霉屬(Phyllosticta)，殼針孢屬(Septoria)，毛筒殼屬(Tubeufia)，鏈格孢屬(Alternaria)，盾殼霉屬(Coniothyrium)，莖點(diǎn)霉屬(Phoma)，Embellisia，Tiarosporella，Galiella，假黑盤菌屬(Pseudoplectania)，火絲菌屬(Pyronema)，珠頭霉屬(Oedocephalum)，葡萄孢屬(Botrytis)，外殼孢屬(Aposphaeria)，盤多毛孢屬(Pestalotia)，多毛菌屬(Pestalotiopsis)，孔座殼屬(Poronia)，Nodulisporium，炭角菌屬(Xylaria)，鐮孢屬(Fusarium)，輪枝孢屬(Verticillium)，周刺座霉屬(Volutella)，Chaetapiospora，Lulwothia，刺盤孢屬(Colletotrichum)，殼囊孢屬(Cytospora)，座盤孢屬(Discula)，擬莖點(diǎn)霉屬(Phomopsis)，棒盤孢屬(Coryneum)，Seimatosporium，曲霉屬(Aspergillus)，散囊菌屬(Eurotium)，正青霉屬(Eupenicillium)，青霉屬(Penicillium)，Petromyces和踝節(jié)菌屬(Talaromyces)各屬的菌株。
優(yōu)選的種是棉色二孢(Diplodia gossypina)Plowrightiaribesia；葉點(diǎn)霉屬之種；殼針孢屬之種Tubeufiaamazonensis.；鏈格孢屬之種；Embellisia hyacinthi；新莖點(diǎn)霉(Phoma neoloba)；熱帶莖點(diǎn)霉(Phoma tropica)；盾殼霉屬之種；橄欖色盾殼霉(Coniothyrium olivaceoum)；當(dāng)克盾殼霉(Coniothyrium dunckii)；Tiarosporella sp.；Tiarosporellaphaseolina；Galiella celebica；淡黑假黑盤菌(Pseudoplectanianigrella)；磚火絲菌(Pyronema domesticum)；珠頭霉屬之種；灰色葡萄孢(Botrytis cinerea)；外殼孢屬之種；盤多毛孢屬之種；多毛菌屬之種；點(diǎn)孔座殼(Poronia punctata)；炭角菌屬之種；Nodulisporium sp.；腐皮鐮孢(Fusarium solani)；輪枝孢屬之種；巴西周刺座霉(Volutella buxi)；Chaetapiosporarhododendri；Lulworthia uniseptata；棘孢刺盤孢(Colletotrichum aculatum)；Colletotrichum crassipes；殼囊孢屬之種；座盤孢屬之種(Discula sp.)；Phomopsis ilicis；Phomopsis cirsii；栗棒盤孢(Coryneum castaneicola)；Seimatosporium lichenicola；塔木里氏曲霉(Aspergillustamarii)；Eurotium chevalieri；爪哇正青霉(Eupenicilliumjavanicum)；膠囊青霉(Penicillium capsulatum)；奧爾森氏青霉(Penicillium olsonii)；嗜松青霉(Penicillium pinophilum)；婁格法爾特氏青霉(Penicillium roqueforti)；意大利青霉(Penicillium italicum)；變灰青霉(Penicillium canescens)；疣孢青霉(Penicillium verruculosum)；Petromyces alliaceus和黃色踝節(jié)菌(Talaromyces flavus)各種的菌株.
有用的接合菌菌株是屬于毛霉目(Mucorales)的菌株，優(yōu)選屬于絲枝霉科(Chaetocladiaceae)和毛霉科(Mucoraceae)的菌株。
優(yōu)選的菌株屬于Dichotomocladium，放射毛霉屬(Actinomucor)，球托霉屬(Gongronella)，Sporodiniella和毛霉屬(Mucor)，具體是Dichotomocladium hesseltinei、雅致放射毛霉(Actinomucor elegans)、卵形孢球托霉(Gongronella butleri)、Sporodiniella umbellata和米赫毛霉minor變種(Mucor mieheivar minor)等種。
分類不確定的菌株的例子是Vialaea insculpta。
屬于有絲分裂孢子真菌菌株的例子是Acrodontiumcrateriforme、出芽短梗霉(Aureobasidium pullulans)、Circinotrichum sp.、Cryptocline sp.、Ellisiopsis sp.、黑色附球菌(Epicoccum nigrum)、粘帚霉屬之種(Gliocladium sp.)、Helicorhoidion irregulare.、殼蠕孢屬各種(Hendersonia spp.)、Mariannaea sp.、Microsphaeropsis sp.、柱隔孢屬之種(Ramulariasp.)、Sarcopodium sp.、Spadicoides sto.、Speiropsispedatospora.、Sporotrichum exile.、桿霉屬之種(Stilbellasp.)、單端孢屬之種(Trichothecium sp.)、Trimmatostromaabietes.、Tubakia dryina.、Wiesneriomyces sp.和美索尼氏接柄孢(Zygosporium masonii)。
優(yōu)選的細(xì)菌本發(fā)明另一方面涉及一種可通過培養(yǎng)細(xì)菌產(chǎn)生的新型XET制劑。
優(yōu)選的細(xì)菌是革蘭氏陰性或革蘭氏陽性細(xì)菌。
產(chǎn)XET的革蘭氏陽性細(xì)菌的例子有屬于芽孢桿菌屬的菌株。
優(yōu)選的菌株已發(fā)現(xiàn)以下菌株是XET陽性的1.Dichotomocladium hesseltinei。菌株保藏號(hào)CBS164.61；分類接合菌，毛霉目，絲枝霉科。
2.雅致放射毛霉。菌株保藏號(hào)CBS154.86；分類接合菌，毛霉目，絲枝霉科。
3.米赫毛霉minor變種。菌株保藏號(hào)ATCC36018；分類接合菌，毛霉目，毛霉科。
4.卵形孢球托霉。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年1月28日將一株卵形孢球托霉保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號(hào)CBS448.97；分類接合菌，毛霉目，絲枝霉科。
5.Sporodiniella umbellata。菌株保藏號(hào)CBS195.77分類；接合菌，毛霉目，毛霉科。
6.葉點(diǎn)霉屬之種。分離自中國(guó)的一株P(guān)ithecolobium sp.，分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目(Dothidiales)，球腔菌科(Mycosphaellaceae)。
7.殼針孢屬之種。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1995年12月22日將一株殼針孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)。保藏號(hào)CBS831.95；分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，球腔菌科。
8.棉色二孢。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1996年3月12日將一株棉色二孢保藏在Centraalvureauvoor Schimmelcultures(CBS)。保藏號(hào)CBS274.96；分類子囊菌，腔菌綱(Loculoascomycetes)，座囊菌目，葡萄座腔菌科(Botrysphaeriaceae)。
9.Plowrightia ribesia。分離自丹麥Ribes sp.，分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，小穴殼菌科(Dothioraceae)。
10.Tubeufia amazonensis。菌種保藏號(hào)ACTT42524；分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，毛筒殼科。
11.鏈格孢屬之種。分類子囊菌，腔菌綱(Loculoascomycetes)，座囊菌目，格孢腔菌科。
12.Embellisia hyacinthi。菌種保藏號(hào)IMI211561；分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，格孢腔菌科。
13.新莖點(diǎn)霉。分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，格孢腔菌科。
14.熱帶莖點(diǎn)霉。菌種保藏號(hào)CBS537.66；分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，格孢腔菌科。
15.盾殼霉屬之種。分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，小球腔菌科。
16.橄欖色盾殼霉。菌種保藏號(hào)CBS304.68。分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，小球腔菌科。
17.當(dāng)克盾殼霉。分類子囊菌，腔菌綱，座囊菌目，小球腔菌科。
18.Tiarosporella phaseolina。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年1月28日將一株Tiarosporellaphaseolina保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號(hào)CBS446.97；分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，斑痣盤菌目，斑痣盤菌科。
19.Tiarosporella sp.。分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，斑痣盤菌目，斑痣盤菌科。
20.Galiella celebica。分離自在日本采集的樣品，分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales)，肉盤菌科。
21.淡黑假黑盤菌。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年1月28日將一株淡黑假黑盤菌保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號(hào)CBS444.97；分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales)，肉盤菌科。
22.磚火絲菌。分離自挪威的樣品。分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales)，火絲菌科。
23.珠頭霉屬之種。分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，盤菌目(Pezizales)，糞盤菌科。
24.灰色葡萄孢。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年1月28日將一株灰色葡萄孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號(hào)CBS447.97，分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，錘舌菌目(Leotiales)，核盤菌科。
25.外殼孢屬之種。分類子囊菌，盤菌綱(Discomycetes)，錘舌菌目，核盤菌科。
26.盤多毛孢屬之種。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年1月28日將一株盤多毛孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號(hào)CBS445.97。分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，圓孔殼科。
27.多毛菌屬之種。分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，圓孔殼科。
28.點(diǎn)孔座殼。分離自瑞典的樣品，分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，炭角菌科。
29.炭角菌屬之種。分離自生長(zhǎng)在Mona，Jamaica的棕櫚Sabaljamaicensis葉子。分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，炭角菌科。
30.Nodulisporium sp。分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，炭角菌科。
31.腐皮鐮孢。分離自印度玉米粒樣品，分類子囊菌，核菌綱，肉座菌目，肉座菌科。
32.輪枝孢屬之種。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1995年12月22日將一株輪枝孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號(hào)CBS830.95；分類子囊菌，核菌綱，肉座菌目，肉座菌科。
33.巴西周刺座霉。菌株保藏號(hào)IMI049467，分類子囊菌，核菌綱，肉座菌目，肉座菌科。
34.Chaetapiospora rhododendri。分類子囊菌，核菌綱，炭角菌目，炭角菌科，亞赤殼科(Hyponectriaceae)。
35.Lulworthia uniseptata。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年1月28日將一株殼囊孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號(hào)CBS442.97，分類子囊菌，核菌綱，海殼目，海殼科。
36.棘孢刺盤孢。分類子囊菌，核菌綱，黑痣菌目，黑痣菌科。
37.Colletotrichum crassipes。分類子囊菌，核菌綱，黑痣菌目，黑痣菌科。
38.殼囊孢屬各種。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年1月23日將一株殼囊孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號(hào)CBS424.97，分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑腐皮殼科。
39.殼囊孢屬之種。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年1月23日將一株殼囊孢保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號(hào)CBS425.97，分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑腐皮殼科。
40.座盤孢屬之種。分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑腐皮殼科。
41.Phomopsis ilicis。分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑腐皮殼科。
42.Phomopsis cirsii。分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑腐皮殼科。
43.栗棒盤孢。分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑盤孢科。
44.Seimatosporium lichenicola。分類子囊菌，核菌綱，腐皮殼菌目，黑盤孢科。
45.塔木里氏曲霉。菌株保藏號(hào)CBS821.72，分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
46.Eurotium chevalieri。菌株保藏號(hào)CBS472.91，分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
47.膠囊青霉。菌株保藏號(hào)CBS273.86，分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
48.奧爾森氏青霉。菌株保藏號(hào)CBS523.89。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
49.嗜松青霉。菌株保藏號(hào)CBS440.89。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
50.婁格法爾特氏青霉。菌株保藏號(hào)CBS167.91。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
51.意大利青霉。菌株保藏號(hào)IMI078681。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
52.變灰青霉。菌株保藏號(hào)CBS579.70，分離自埃及的一個(gè)鹽礦。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
53.爪哇正青霉。菌株保藏號(hào)CBS448.74。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
54.疣孢青霉。菌株保藏號(hào)CBS563.92。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
55.黃色踝節(jié)菌。菌株保藏號(hào)ATCC52201。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
56.Petromyces alliaceus。菌株保藏號(hào)CBS511.69。分類子囊菌，不整囊菌綱，散囊菌目，發(fā)菌科。
57.毛栓菌(Trametes hirsuta)。分離自在丹麥采集的樣品，分類擔(dān)子菌，層菌綱，革蓋菌目，革蓋菌科。
58.裂褶菌屬之種。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年1月28日將一株裂褶菌保藏在Centraalvureau voor Schimmelcultures(CBS)，保藏號(hào)CBS443.97。分類擔(dān)子菌，層菌綱，裂褶菌目，裂褶菌科。
59.玫瑰色伏革菌。分離自在丹麥采集的樣品，分類擔(dān)子菌，層菌綱，盤革菌目(Aleurodiscales)，伏革菌科(Cortiaceae)。
60.Tubulicrinis subulatus。分離自在丹麥采集的樣品，分類擔(dān)子菌，層菌綱，Xenasmatales，Tubulicrinaceae。
61.毛韌革菌。分離自在丹麥采集的樣品，分類擔(dān)子菌，層菌綱，韌革菌目，韌革菌科。
62.Acrodontium crateriforme。分類有絲分裂孢子真菌。
63.出芽短梗霉。分類有絲分裂孢子真菌。
64.Circinotrichum sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
65.Cryptocline sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
66.Ellisiopsis sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
67.黑色附球菌。分類有絲分裂孢子真菌。
68.粘帚霉屬之種。分類有絲分裂孢子真菌。
69.Helicorhoidion irregulare。分類有絲分裂孢子真菌。
70.殼蠕孢屬之種。分類有絲分裂孢子真菌。
71.Mariannaea sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
72.Microsphaeropsis sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
73.柱隔孢屬之種。分類分類有絲分裂孢子真菌。
74.Sarcopodium sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
75.Spadicoides sto。保藏號(hào)IMI203428，分類有絲分裂孢子真菌。
76.Speiropsis pedatospora。分類有絲分裂孢子真菌。
77.Sporotrichum exile。保藏號(hào)CBS350.47，分類有絲分裂孢子真菌。
78.桿霉屬之種。分類有絲分裂孢子真菌。
79.單端孢屬之種。分類有絲分裂孢子真菌。
80.Trimmatostroma abietes。分類有絲分裂孢子真菌。
81.Tubakia dryina。分類有絲分裂孢子真菌。
82.Wiesneriomyces sp.。分類有絲分裂孢子真菌。
83.美索尼氏接柄孢。分類有絲分裂孢子真菌。
84.Vialaea insculpta。分類未定。
85.嗜堿芽孢桿菌。根據(jù)國(guó)際承認(rèn)用于專利程序的微生物保藏布達(dá)佩斯條約，于1997年2月12日將一株嗜堿芽孢桿菌保藏在Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen GmbH，保藏號(hào)DSM11404。
生產(chǎn)XET可以通過在含有合適碳氮源的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基(這種培養(yǎng)基是本領(lǐng)域已知的)上有氧培養(yǎng)上述微生物菌株生產(chǎn)本發(fā)明的XET酶。
或者，可以通過對(duì)含有來自上述菌株之一的適當(dāng)遺傳信息的轉(zhuǎn)化宿主微生物進(jìn)行有氧培養(yǎng)來生產(chǎn)本發(fā)明的XET酶。因此，本發(fā)明還涉及木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(XET)的生產(chǎn)方法，該方法包括a)在適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，有利于XET酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)表達(dá)微生物XET的轉(zhuǎn)化宿主微生物，以及b)隨后從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中純化XET酶。
可以用本領(lǐng)域已知方法制備和培養(yǎng)這種轉(zhuǎn)化子。
克隆編碼XET的DNA序列可以用本領(lǐng)域的各種公知方法，從任何能產(chǎn)生所述XET的微生物中分離編碼本發(fā)明XET酶的DNA序列。
首先，用能產(chǎn)生待研究的XET的生物體之染色體DNA或信使RNA構(gòu)建基因組DNA和/或cDNA文庫。然后，如果該XET的氨基酸序列是已知的，則可以合成出同源的標(biāo)記寡核苷酸探針，用它從制備自所述微生物的基因組文庫或cDNA文庫中鑒定出XET編碼克隆?；蛘?，可以用含有已知XET基因的同源序列的標(biāo)記寡核苷酸探針作為探針，使用低嚴(yán)謹(jǐn)度的雜交和清洗條件，鑒定XET編碼克隆。
還有另一種XET編碼克隆的鑒定方法，包括將基因組DNA或cDNA片段插入表達(dá)載體(例如質(zhì)粒)中，用得到的DNA文庫轉(zhuǎn)化XET陰性宿主生物體，然后將轉(zhuǎn)化細(xì)胞鋪到瓊脂平板上，利用上面描述的方法鑒定出表達(dá)XET的克隆。
或者，可以用已確立的標(biāo)準(zhǔn)方法合成制備編碼該酶的DNA序列，例如，S.L.Beaucage和M.H.Caruthers(四面體通訊22，1981，1859-1869頁)描述的磷酸胺(phosphoamidite)法，或Matthes等(EMBO雜志3，1984，801-805頁)描述的方法。在磷酸胺法中，寡核苷酸被合成(例如用自動(dòng)DNA儀)、純化、退火、連接并克隆到合適的載體中。
最后，DNA序列可以是按照標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)，通過將合成的、基因組或cDNA來源的片段(確切地說，諸片段對(duì)應(yīng)于整個(gè)DNA序列的不同部分)連接起來而制備的基因組和合成混合來源的、合成和cDNA混合來源的、或者基因組和cDNA混合來源的。正如US4683202或R.K.Saiki等(科學(xué)239，1988，487-491頁)描述的，還可以用特異引物通過聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(PCR)制備DNA序列。
表達(dá)XET根據(jù)本發(fā)明，可以用通常包括調(diào)控序列(編碼啟動(dòng)子、操縱子、核糖體結(jié)合位點(diǎn)、翻譯起始信號(hào)和任選的抑制基因或者各種激活子基因)的表達(dá)載體，將通過上述方法或本領(lǐng)域已知的任何可替代方法產(chǎn)生的XET編碼DNA序列表達(dá)為酶的形式。
攜帶編碼本發(fā)明XET酶的DNA序列的重組表達(dá)載體可以是任何能夠方便地進(jìn)行重組DNA操作的載體，載體的選擇經(jīng)常取決于它將要導(dǎo)入的宿主細(xì)胞。因此，載體可以是自主復(fù)制的載體(即以染色體外實(shí)體存在的載體，其復(fù)制獨(dú)立于染色體復(fù)制的載體)，例如質(zhì)粒，噬菌體或染色體外成分，微小染色體或者人工染色體?；蛘?，載體可以是這樣一種類型，當(dāng)它被導(dǎo)入宿主細(xì)胞時(shí)，載體會(huì)整合到宿主細(xì)胞基因組，并與它所整合的染色體一起復(fù)制。
在載體中，DNA序列應(yīng)與合適的啟動(dòng)子序列可操縱地連接。啟動(dòng)子可以是在所選宿主細(xì)胞中表現(xiàn)出轉(zhuǎn)錄活性的任何DNA序列，并可以來源于編碼宿主細(xì)胞同源或異源蛋白質(zhì)的基因。適用于指導(dǎo)本發(fā)明XET編碼DNA序列轉(zhuǎn)錄的啟動(dòng)子(特別是在細(xì)菌宿主中)的實(shí)例有大腸桿菌lac操縱子的啟動(dòng)子，天藍(lán)色鏈霉菌瓊脂糖酶基因dagA啟動(dòng)子，地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyL)的啟動(dòng)子，嗜熱脂肪芽孢桿菌麥芽糖原淀粉酶基因(amyM)的啟動(dòng)子，解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyQ)的啟動(dòng)子，枯草芽孢桿菌xylA和xylB基因的啟動(dòng)子。為了在真菌宿主中轉(zhuǎn)錄，適用啟動(dòng)子的例子有來源于編碼米曲霉TATA淀粉酶，Rhizomucor miehei天冬氨酸蛋白酶，黑色曲霉中性α-淀粉酶，黑色曲霉酸穩(wěn)定的α-淀粉酶，黑色曲霉葡糖淀粉酶，Rhizomucor miehei脂酶，米曲霉堿性蛋白酶，米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶或者構(gòu)巢曲霉乙酰胺酶等的基因的啟動(dòng)子。
本發(fā)明的表達(dá)載體還可以包含合適的轉(zhuǎn)錄終止子，在真核細(xì)胞中，還可以包含與編碼本發(fā)明XET酶的DNA序列可操縱連接的多聚腺苷酸化序列。終止序列和多聚腺苷酸化序列可以適當(dāng)?shù)貜膯?dòng)子相同來源得到。
載體另外可以包含能使載體在所述宿主細(xì)胞中復(fù)制的DNA序列。這種序列的例子是質(zhì)粒pUC19，pACYC177，pUB110，pE194，pAMB1以及pIJ702的復(fù)制起點(diǎn)。
載體還可以包含選擇標(biāo)記，例如其產(chǎn)物能補(bǔ)償宿主細(xì)胞缺陷的基因(如枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因)，或者賦予抗生素抗性(如氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素或四環(huán)素抗性)的基因。另外，載體可以包含曲霉選擇標(biāo)記(如amdS，argB，niaD和產(chǎn)生潮霉素抗性的標(biāo)記sc)，或者通過共轉(zhuǎn)化來實(shí)現(xiàn)選擇(例如，WO91/17243所描述的)。
盡管胞內(nèi)表達(dá)在一些方面具有優(yōu)勢(shì)(例如，當(dāng)用某些細(xì)菌作宿主細(xì)胞時(shí))，但通常優(yōu)選胞外表達(dá)。
構(gòu)建編碼XET酶并含有啟動(dòng)子、終止子和其它元件的本發(fā)明載體的適用步驟對(duì)本領(lǐng)域技術(shù)人員是眾所周知的(參考，例如Sambrook等，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，第二版，Cold Spring Harbor，1989)。
包含以上定義的本發(fā)明DNA構(gòu)建體或表達(dá)載體的本發(fā)明細(xì)胞是重組生產(chǎn)本發(fā)明XET的優(yōu)選宿主細(xì)胞?？梢酝ㄟ^將DNA構(gòu)建體(以單拷貝或多拷貝)整合到宿主染色體內(nèi)，用本發(fā)明編碼XET的DNA構(gòu)建體方便地轉(zhuǎn)化細(xì)胞。通常認(rèn)為發(fā)生這種整合比較有利，因?yàn)檫@樣DNA序列便更可能穩(wěn)定地保留在細(xì)胞內(nèi)。可以按照常規(guī)方法(例如同源或異源重組)將DNA構(gòu)建體整合到宿主染色體內(nèi)?；蛘?，可以用以上描述的與不同類型宿主細(xì)胞相聯(lián)系的表達(dá)載體轉(zhuǎn)化細(xì)胞。
本發(fā)明的細(xì)胞可以是高等生物體細(xì)胞，例如哺乳動(dòng)物或昆蟲細(xì)胞，但優(yōu)選微生物細(xì)胞，例如細(xì)菌或真菌(包括酵母)細(xì)胞。
合適的細(xì)菌的例子是革蘭氏陽性細(xì)菌，如枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、遲緩芽孢桿菌、短芽孢桿菌、嗜熱脂肪芽孢桿菌、嗜堿芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌、環(huán)狀芽孢桿菌、燦爛芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌或蘇云金芽孢桿菌；或淺青紫鏈霉菌，或鼠灰鏈霉菌；或革蘭氏陰性細(xì)菌，如大腸桿菌。細(xì)菌的轉(zhuǎn)化可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化或依照已知方式用感受態(tài)細(xì)胞進(jìn)行。
酵母細(xì)胞可以從酵母屬或裂殖酵母屬(例如釀酒酵母)中選擇。絲狀真菌以屬于曲霉屬之種為好(例如米曲霉或黑曲霉)。轉(zhuǎn)化真菌細(xì)胞可以通過已知方式(包括原生質(zhì)體形成和原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化及隨后細(xì)胞壁再生的過程)進(jìn)行。適用于曲霉屬宿主細(xì)胞轉(zhuǎn)化的步驟在EP238023中有描述。
本發(fā)明還有一個(gè)方面涉及本發(fā)明XET酶的生產(chǎn)方法，該方法包括在利于產(chǎn)生XET的條件下培養(yǎng)上述宿主細(xì)胞，并從細(xì)胞中和/或培養(yǎng)基中回收XET。
用于培養(yǎng)細(xì)胞的培養(yǎng)基可以是任何適于所用宿主細(xì)胞生長(zhǎng)并表達(dá)本發(fā)明XET的常規(guī)培養(yǎng)基。合適的培養(yǎng)基可以購買到或者可以根據(jù)公開配方(例如，在美國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心的目錄描述的)制備。
可以通過眾所周知的操作從培養(yǎng)基中方便地純化宿主細(xì)胞分泌出來的XET，包括通過離心或過濾分離培養(yǎng)基中的細(xì)胞，鹽析沉淀培養(yǎng)基中的蛋白質(zhì)成分(例如用硫酸銨)，隨后利用層析操作(如離子交換層析、親和層析等)。
工業(yè)應(yīng)用根據(jù)本發(fā)明，用XET酶處理后，纖維素材料可以獲得改善的強(qiáng)度特性和/或提高的保形性能和/或更好的抗皺性能。XET酶能將以氫鍵結(jié)合到纖維素纖維上的木糖葡聚糖分子重排并連接，從而獲得上述性能。
為了增強(qiáng)XET酶的效能，在某些情況下，將木糖葡聚糖加入纖維素材料中的做法是有益的，這樣酶可以將更多纖維素材料連接在一起。
可以在水中用XET酶處理纖維素材料，或者在有某些成分(如緩沖液和/或潤(rùn)濕劑和/或穩(wěn)定劑和/或聚合物和/或降低水活度的有機(jī)成分(如DMSO))的水中進(jìn)行。
合適的緩沖液可以是磷酸鹽、硼酸鹽、檸檬酸鹽、醋酸鹽、己二酸鹽，三乙醇胺，單乙醇胺，二乙醇胺，碳酸鹽(特別是堿金屬或堿土金屬碳酸鹽，具體說是碳酸鈉或碳酸鉀，或銨和HCl鹽)，二胺，特別是二氨基乙烷，咪唑，Tris或氨基酸緩沖液。
潤(rùn)濕劑用于提高纖維素材料的濕度。潤(rùn)濕劑優(yōu)選非離子表面活性劑類型。
穩(wěn)定劑可以是能穩(wěn)定XET酶的一種試劑。
根據(jù)本發(fā)明，XET在水性介質(zhì)中的濃度可以在0.01-1000μg酶蛋白/g纖維素材料，優(yōu)選0.05-100μg酶蛋白/g纖維素材料。
通常要將反應(yīng)介質(zhì)(含有纖維素材料和XET酶)保溫至少幾分鐘。從1分鐘到20小時(shí)的保溫時(shí)間通常都是合適的，具體地說，常常優(yōu)選保溫時(shí)間為30分鐘到10小時(shí)。
本發(fā)明方法中的反應(yīng)介質(zhì)溫度在10-90℃的范圍內(nèi)比較合適，具體說對(duì)所述XET酶以15-70℃為宜。
通過以下非限定性實(shí)施例進(jìn)一步闡述本發(fā)明。
實(shí)施例1篩選XET陽性菌株培養(yǎng)基PD瓊脂39g馬鈴薯葡萄糖瓊脂，DIFCO 0013；加入去離子水至1000ml，121℃高壓蒸氣滅菌15-20分鐘。
YPG瓊脂4g酵母提取物(DIFCO 0127)，1g KH2PO4(Merck4873)，0.5g MgSO4·7H2O(Merck5886)，15g葡萄糖(Roquette101-0441)，20g瓊脂(Merck1614)，去離子水補(bǔ)至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15-20分鐘。
MEA20g麥芽浸膏粉(DIFCO0186)，1g蛋白胨(DIFCO0118)，20g葡萄糖(Roquette France 1010441)，20g瓊脂(Merck1614)，去離子水補(bǔ)至1000ml，121℃高壓蒸汽滅菌15分鐘。
培養(yǎng)基A(每瓶)30g麥麩，45ml下述溶液10g rofec(Roquette101-0441)，10g NH4NO3(Merck1187)，10g KH2PO4(Merck 4873)，40gSolcafloc(Dicacel，購自Dicalite-Europe-Nord，9000Gent，Belgium)，0.75g MgSO4·7H2O(Merck 5886)，15g CaCO3，自來水補(bǔ)至1000ml，pH調(diào)至6.5，121℃高壓蒸汽滅菌40分鐘。
培養(yǎng)基B20g大豆餅，5g maltodex01(Roquette101-7845)，15g麥麩，3g蛋白胨(DIFCO0118)，10g微晶纖維素(Merck2331)，0.2ml pluronic(PE-6100，101-3068)，1g橄欖油，去離子水補(bǔ)至1000ml。
取100ml裝入帶有兩個(gè)擋板的500ml Erlenmeyer瓶中，121℃高壓蒸汽滅菌40分鐘。
培養(yǎng)基C100g蔗糖，40g大豆餅，10g Na2HPO4·12H2O(Merck6579)，0.1ml pluronic(PE-6100，101-3068)，自來水補(bǔ)至1000ml。裝有100ml培養(yǎng)基的帶兩個(gè)擋板的Erlenmeyer瓶中加入0.5g CaCO3。121℃高壓蒸汽滅菌40分鐘。臨用前，每100ml培養(yǎng)基加10ml 1M NaHCO3(pH9)。
發(fā)酵步驟將真菌菌株保存在瓊脂培養(yǎng)皿(9cm)中，或者PDA、YPG、MEA斜面(參見培養(yǎng)基列表)上。每個(gè)瓊脂斜面用10ml無菌蒸餾水洗，每個(gè)搖瓶接種3ml。
真菌菌株在搖瓶中于如下生長(zhǎng)條件下培養(yǎng)培養(yǎng)基A和B(參見培養(yǎng)基列表)。
溫度26℃RPMA靜止B125-200培養(yǎng)時(shí)間A6到30天B2-21天細(xì)菌分離物保存在TY瓊脂(pH9)斜面上，TY瓊脂包含
20g胰蛋白胨，5g酵母提取物，0.7ml 1％FeCl2·4H2O溶液，0.1ml1％MnCl2·4H2O溶液，1.5ml 1％MgSO4·7H2O溶液，20g瓊脂，去離子水補(bǔ)至1000ml。121℃高壓蒸汽滅菌20分鐘。傾注平板前，向100ml瓊脂中加入10ml無菌1M NaHCO3(pH9)。
斜面于30℃保溫4天，每個(gè)瓊脂斜面用10ml無菌水洗下，每個(gè)搖瓶接種3ml。
細(xì)菌在含有培養(yǎng)基C的搖瓶中，于30℃、300rpm培養(yǎng)4天。
活性檢測(cè)將B和C中獲得的培養(yǎng)液于10000rpm離心10分鐘。檢測(cè)上清的XET活性。
向每個(gè)含有麥麩及已充分生長(zhǎng)的培養(yǎng)物的搖瓶中加入200ml自來水，于200rpm振蕩2小時(shí)。然后離心培養(yǎng)液，上清用于檢測(cè)XET活性。
XET分析用前面描述的點(diǎn)印跡方法分析樣品。
結(jié)果用前面描述的方法，發(fā)現(xiàn)1種芽孢桿菌和幾種屬于不同分類群的真菌是陽性的。結(jié)果示于下表。
嗜堿芽孢桿菌在培養(yǎng)基C(pH9)(見培養(yǎng)基列表)中于30℃、300rpm生長(zhǎng)4天后呈陽性。
真菌分離物 培養(yǎng)基A養(yǎng)基B雅致放射毛霉+ -Dichotomocladium hesseltinei+ +卵形孢球托霉未作 +米赫毛霉minor變種 + +
Sporodiniella umbellata - +鏈格孢屬之種+ -外殼孢屬之種未作+塔木里氏曲霉+ +灰色葡萄孢 + +Chaetapiospora rhododendri - +棘孢刺盤孢 + -Colletotrichum crassipes+ -當(dāng)克盾殼霉 + +橄欖色盾殼霉+ -盾殼霉屬各種- +栗棒盤孢- +殼囊孢屬之種+ +棉色二孢+ +座盤孢屬之種+ +Embellisia hyacinthi+ -爪哇正青霉 + -Eurotium chevalieri - +腐皮鐮孢+ -Galiella celebica + +Lulworthia uniseptata + +Nodulisporium sp. + -珠頭霉屬之種- +變灰青霉+ -膠囊青霉+ -意大利青霉 未作+奧爾森氏青霉+ -嗜松青霉+ 未作婁格法爾特氏青霉+ +
疣孢青霉 + +盤多毛孢屬之種 未作 +多毛菌屬之種 + +Petromyces alliaceus + +新莖點(diǎn)霉 + -熱帶莖點(diǎn)霉 + +Phomopsis cirsii - +Phomopsis ilicis + +葉點(diǎn)霉屬之種 + -Plowrightia ribesia+ +點(diǎn)孔座殼 + +淡黑假黑盤菌 + +磚火絲菌 + +柱隔孢屬之種 + -Seimatosporium lichenicola + -殼針孢屬之種 + 未作黃色踝節(jié)菌 + +Tubeufia amazonensis + -Tiarosporella phaseolina + +Tiarosporella sp. - +輪枝孢屬之種 + +巴西周刺座霉 + -炭角菌屬之種 + +玫瑰色伏革菌 + +裂褶菌屬之種 + +毛韌革菌 + +毛栓菌 + +Tubulicrinis subulatus + +Acrodontium crateriforme + -
出芽短梗霉 + -Circinotrichum sp. - +Cryptocline sp.+ -Ellisiopsis sp.+ -黑色附球菌 - +粘帚霉屬之種 + -Helicorhoidion irregulare + +殼蠕孢屬各種 + +Mariannaea sp. + -Microsphaeropsis sp. + -柱隔孢屬之種 + -Sarcopodium sp.+ -Spadicoides sp.- +Speiropsis pedatospora + -Sporotrichum exile + +桿霉屬之種 + -單端孢屬之種 + +Trimmatostroma abietes + +Tubakia dryina + +Wiesneriomyces sp. + -美索尼氏接柄孢 + +Vialaea+ 未作+陽性，-陰性實(shí)施例2Dichotomocladium hesseltinei XET的純化和鑒定在15個(gè)PDA瓊脂斜面接種Dichotomocladium hesseltinei(CBS164.61)，于26℃培養(yǎng)7天。用含有0.1％Tween80的約250ml無菌蒸餾水洗下菌體，用來接種80個(gè)含有培養(yǎng)基B(2-3ml/瓶)的搖瓶。搖瓶于26℃，200rpm振蕩培養(yǎng)5天，到時(shí)后，4000rpm離心培養(yǎng)液15分鐘。
用以下方法純化含有木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(XET)的上清液向經(jīng)濾布過濾的培養(yǎng)液中加入助濾劑，將該溶液進(jìn)一步用蔡氏深度濾盤過濾得到澄清溶液。調(diào)節(jié)濾液的pH至pH8.0，用去離子水稀釋濾液達(dá)到與20mM Tris/HCl(pH8.0)相同的導(dǎo)電率。
將XET酶上樣到用20mM Tris/HCl(pH8.0)平衡過的Q-SepharoseFF柱子中，采用線性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脫酶。XET活性物洗脫得到單個(gè)峰。匯集的XET經(jīng)SephadexG25柱子換入20mM Tris/HCl(pH8.0)緩沖液中，再在經(jīng)20mM Tris/HCl(pH8)平衡過的Q-SepharoseFF柱子層析。用線性增加的NaCl梯度(0→0.2M)洗脫柱子。匯集含XET的流分，加入(NH4)2SO4至終濃度為1.4M。在1.4M(NH4)2SO4，10mM琥珀酸(pH7.0)中平衡PhenylToyopearl 650S柱子，將XET酶上樣到這個(gè)柱子中，用線性降低的(NH4)2SO4梯度(1.4→0M)洗脫。匯集含XET的流分，在帶有再生纖維素膜(截留分子量10kDa)的超濾池上進(jìn)行濃縮。將濃縮的酶上樣到在100mM H3BO3、10mM二甲基戊二酸、2mM CaCl2(pH7.0)中平衡過的Superdex200體積排阻層析柱子中。通過SDS-PAGE分析從Superdex200柱子洗脫下來的流分，匯集各純XET流分。
Dichotomocladium hesseltinei XET在SDS-PAGE上遷移形成Mr＝24kDa的一條帶。作SDS-PAGE并電印跡到PVDF膜上后，測(cè)定24kDa組分的N-末端氨基酸序列。推斷出如下N-末端氨基酸序列(SEQ ID NO.1)Ala-Glu-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Thr-Gln-Thr-Val-Gly-Asn-Tyr-Ile-Val-Tyr-Asn-Asn-Leu-Leu-Gly-Ala-Gly-Ser-Ala.
本發(fā)明還涉及含有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列的微生物XET酶，或與SEQ ID NO.1氨基酸序列至少80％同源、優(yōu)選至少85％同源、更優(yōu)選至少90％同源，還要更優(yōu)選至少95％同源，特別是至少98％同源的XET。
如果通過已知的算法(例如Lipman和Pearson在科學(xué)227(1985，1435頁)中描述的那種算法)將多肽與親本XET的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比較后顯示有X％相同，則認(rèn)為它們之間的同源性為X％。
另外，對(duì)Dichotomocladium hesseltinei XET進(jìn)行質(zhì)譜分析得到其分子量為23006Da。
實(shí)施例3Tiarosporella phaseolina XET的純化和鑒定在15個(gè)PDA瓊脂斜面上接種Tiarosporella phaseolina(CBS446.97)，于26℃培養(yǎng)7天。用含有0.1％Tween80的約250ml無菌蒸餾水洗斜面，用來接種80個(gè)含有培養(yǎng)基B(2-3ml/瓶)的搖瓶。搖瓶于26℃，200rpm振蕩培養(yǎng)7天，到時(shí)后，于4000rpm離心培養(yǎng)液15分鐘。
用以下方法純化含有木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(XET)的上清液向經(jīng)濾布過濾的培養(yǎng)液中加入助濾劑，將該溶液進(jìn)一步用蔡氏深度濾盤過濾得到澄清溶液。濾液在截留分子量為3Kda的聚醚砜(polyethersulfone)膜上超濾濃縮，隨后用蒸餾水透析以降低導(dǎo)電率。將濃縮酶的pH調(diào)節(jié)至pH5.0。濃縮酶的導(dǎo)電率為1.7mS/cm。
將XET酶上樣到在20mM CH3COOH/NaOH(pH5.0)中平衡過的S-Sepharose FF柱子中，用線性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脫酶。XET活性成分以單一峰形式洗脫下來。匯集的XET經(jīng)透析轉(zhuǎn)換緩沖液至20mM CH3COOH/NaOH(pH4.0)。將透析過的酶上樣到在20mMCH3COOH/NaOH(pH4.0)中平衡過的SOURCE 30S柱子中。柱子洗后，用線性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脫XET活性成分。匯集有XET活性的流分，對(duì)20mM Tris/HCl(pH8)進(jìn)行透析。透析過的酶上樣到在20mM Tris/HCl(pH8)中平衡過的SOURCE 30Q柱子中。柱子洗后，用線性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脫XET活性成分。匯集有XET活性的流分，在帶有再生纖維素膜(截留分子量10kDa)的超濾池上進(jìn)行濃縮。將濃縮過的酶上樣到在100mM H3BO3、10mM二甲基戊二酸、2mM CaCl2(pH7.0)中平衡過的Superdex200體積排阻柱子中。通過SDS-PAGE分析從Superdex200柱子中洗脫下的流分，匯集純XET流分。
Tiarosporella phaseolina XET在SDS-PAGE上遷移形成Mr＝24kDa的一條帶。作SDS-PAGE并電印跡到PVDF膜上后，測(cè)定該24kDa組分的N-端氨基酸序列。推斷出如下N-端氨基酸序列(SEQ IDNO2)Xaa-Asp-Phe-Cys-Gly-Gln-Trp-Asp-Asn-Val-Lys-Asn-Gly-Pro-Tyr-Thr-Leu-Tyr-Asn-Asn-Leu-Gly-Gly-Lys本發(fā)明還涉及含有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列的微生物XET酶或與SEQ ID NO.2氨基酸序列至少80％同源、優(yōu)選至少85％同源、更優(yōu)選至少90％同源、還要更優(yōu)選至少95％同源、特別是至少98％同源的XET。
如果通過已知的算法(例如Lipman和Pearson在科學(xué)227(1985，1435頁)中描述的那種算法)將多肽與親本XET的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比較后顯示有X％相同，則認(rèn)為它們之間的同源性為X％。
實(shí)施例4淡黑假黑盤菌XET的純化和鑒定在15個(gè)PDA瓊脂斜面上接種淡黑假黑盤菌(CBS444.97)，于26℃培養(yǎng)7天。用含有0.1％Tween80的約250ml無菌蒸餾水洗斜面，用來接種80個(gè)含有培養(yǎng)基B(2-3ml/瓶)的搖瓶。搖瓶于26℃，200rpm振蕩培養(yǎng)7天，到時(shí)后，于4000rpm離心培養(yǎng)液15分鐘。
用以下方法純化含有木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(XET)的上清液向經(jīng)濾布過濾的培養(yǎng)液中加入助濾劑，將該溶液進(jìn)一步用蔡氏深度濾盤過濾得到澄清溶液。將濾液調(diào)節(jié)至pH5.0，并用去離子水稀釋濾液，使其與20mM CH3COOH/NaOH(pH5.0)導(dǎo)電率相同。
將XET酶上樣到在20mM CH3COOH/NaOH(pH5.0)中平衡過的S-Sepharose FF柱子中，以線性增加的NaCl梯度(0→0.25M)洗脫該酶。XET活性成分以單一峰形式洗脫下來。收集的XET經(jīng)SephadexG25柱子轉(zhuǎn)換緩沖液至20mM Hepes/NaOH(pH7.0)中，上樣到在20mM Hepes/NaOH(pH7.0)平衡過的S-Sepharose FF柱子中。以線性增加的NaCl梯度(0→0.5M)洗脫柱子。匯集有XET活性的流分，經(jīng)透析轉(zhuǎn)換緩沖液至20mM CH3COOH/NaOH(pH5.0)中。將SOURCE15S柱子在20mM CH3COOH/NaOH(pH5.0)中平衡，上樣透析過的酶。柱子洗后，以線性增加的NaCl梯度(0→0.2M)洗脫XET酶。匯集含XET的流分，在帶有再生纖維素膜(截留分子量10kDa)的超濾池上進(jìn)行濃縮。將經(jīng)過濃縮的酶上樣到在20mM CH3COOH/NaOH、100mMNaCl(pH5.0)中平衡過的Superdex200體積排阻柱子中。通過SDS-PAGE分析從Superdex200柱子洗脫下的流分，匯集純XET級(jí)分。
淡黑假黑盤菌XET在SDS-PAGE上遷移形成Mr＝58kDa的一條帶。作SDS-PAGE并電印跡到PVDF膜上后，發(fā)現(xiàn)該58kDa組分具有中斷的N-末端。
將高度純化的淡黑假黑盤菌XET制劑還原并烷基化。然后用Lys-C降解酶樣品。在SMART系統(tǒng)中，用TFA/AN在長(zhǎng)Vydac C18上經(jīng)RP-HPLC分離肽，并在TFA/異丙醇中重新純化。通過Edman降解分析選出的肽。
表1列出了所得8種肽的序列。發(fā)現(xiàn)兩種肽與葡聚糖酶樣和木聚糖酶樣酶同源，但大多未顯示出與已知序列有任何同源性或只有不相關(guān)的同源性。
表1淡黑假黑盤菌XET的Lys-C肽的序列
實(shí)施例5Dichotomocladium hesseltinei，Tiarosporellaphaseolina，淡黑假黑盤菌XET及木糖葡聚糖酶的pH曲線檢驗(yàn)Dichotomocladium hesseltinei，Tiarosporellaphaseolina和淡黑假黑盤菌的木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶的pH曲線。用pH3.0到11.0的緩沖液稀釋純酶，使最終稀釋液中的蛋白質(zhì)濃度相同(即A280＝0.004)。用XET點(diǎn)印跡檢測(cè)(前面已描述)分析樣品中的XET。目測(cè)熒光斑點(diǎn)，評(píng)定為0-10級(jí)。因此圖1中所用單位是不定單位。
從圖1中可看到，在pH3到pH11范圍內(nèi)，特別是pH4到pH9 XET都有活性。
檢測(cè)具有XET活性的所有分離物的木糖葡聚糖酶活性。兩種酶的比活在各分離物中是不同的。為了作出XET的pH活性曲線，將酶在相同的緩沖液中稀釋至相同的蛋白質(zhì)終濃度，并檢測(cè)木糖葡聚糖酶活性。檢測(cè)中使用AZCL木糖葡聚糖。所用的木糖葡聚糖方法如下底物懸浮于脫鹽水中的0.4％AZCL-木糖葡聚糖。
緩沖液100mM H3BO3，10mM二甲基戊二酸，2mM CaCl2(pH7)分析-將Eppendorf恒溫器旋到40℃。
-將500μl 0.4％AZCL-木糖葡聚糖與500μl緩沖液混合，置冰上。
-加入20μl酶，在Eppendorf恒溫器中保溫，直到產(chǎn)生合適的顏色。
-再將樣品放回冰浴以防止樣品在0℃離心時(shí)進(jìn)一步反應(yīng)。
-將200μl樣品轉(zhuǎn)入微量滴定板中，于650nm測(cè)量藍(lán)色。
結(jié)果示于圖2。
實(shí)施例6來自Tiarosporella phaseolina(CBS編號(hào)446.97)的木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(XET)的克隆和表達(dá)保藏微生物Tiarosporella phaseolina CBS編號(hào)446.97。
其它菌株酵母菌株所用釀酒酵母為W3124(van den Hazel，H.B；Kielland-Brandt，M.C；Winter J.R；歐洲生物化學(xué)雜志207，277-283，1992；(MATa；ura3-52；leu2-3，112；his3-D200；pep4-1137；prc1∷HIS3；prb1∷LEU2；cir+))。大腸桿菌菌株DH10B(Life Technologies)質(zhì)粒
曲霉表達(dá)載體pHD414是質(zhì)粒p775(EP238023有描述)的一個(gè)衍生物。pHD414的構(gòu)建在WO93/11249中有進(jìn)一步描述。
pYES2.0(Invitrogen)培養(yǎng)基YPD10g酵母提取物，20g蛋白胨，加水至900ml。高壓蒸汽滅菌，加入100ml 20％葡萄糖(過濾除菌)。
YPM10g酵母提取物，20g蛋白胨，加水至900ml。高壓蒸汽滅菌，加入100ml 20％麥芽糖糊精(過濾除菌)。
10×Basal鹽75g酵母氮堿，113g琥珀酸，68g NaOH，加水至1000ml，過濾除菌。
SC-URA100ml 10×Basal鹽，28ml無維生素的20％酪蛋白氨基酸，10ml1％色氨酸，加水至900ml。高壓蒸汽滅菌后，加入3.6ml 5％蘇氨酸和100ml 20％葡萄糖或20％半乳糖。
SC-瓊脂SC-URA，加入20g/l瓊脂。
AZCL木糖葡聚糖(Megazyme，Australia)在酵母中克隆表達(dá)按照本文中引作參考文獻(xiàn)的H.Dalboege等(H.Dalboege等，分子與普通遺傳學(xué)1994，243253-260；WO93/11249；WO94/14953)所述進(jìn)行酵母中的克隆表達(dá).總RNA的提取、cDNA合成、綠豆核酸酶處理、用T4 DNA聚合酶形成平末端以及構(gòu)建文庫等各個(gè)步驟均按照上述文獻(xiàn)進(jìn)行。
發(fā)酵Tiarosporella phaseolina(CBS編號(hào)446.97)以分離mRNA從平板上將Tiarosporella phaseolina(CBS編號(hào)446.97)生長(zhǎng)完全的菌絲體接種到含有100ml培養(yǎng)基B(參見培養(yǎng)基)的搖瓶中。培養(yǎng)液于26℃，200rpm培養(yǎng)7天，所得培養(yǎng)液經(jīng)miracloth過濾，將菌絲體冷凍在液氮中。
按照H.Dalboege等(分子與普通遺傳學(xué)1994，243253-260；WO93/11249；WO94/14953)所述從該培養(yǎng)物的菌絲體中分離mRNA。
總RNA的提取是用硫氰酸胍處理，再經(jīng)5.7M CsCl超速離心進(jìn)行的，按照WO94/14953描述的步驟經(jīng)Oligo(dT)-纖維素親和層析分離poly(A)+RNA。
cDNA合成用RNaseH方法(Gubler和Hoffman(1983)，基因25263-269，Sambrook等，(1989)分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，Cold Spring Harborlab.Cold Spring Harbor，NY)，從5mg poly(A)+RNA合成雙鏈cDNA。將poly(A)+RNA(在5μl DEPC處理過的水中含有5μg)在預(yù)先硅化過的無RNase的Eppendorph管中于70℃加熱8分鐘，在冰上驟冷，并與含有1mM dATP、dGTP、dTTP和0.5mM 5-甲基-dCTP(Pharmacia)、40單位人胎盤核糖核酸酶抑制劑(RNasin，Promega)、1.45μg Oligo(dT)18-NotI引物(Pharmacia)和1000單位SuperScript II RNaseH反轉(zhuǎn)錄酶(Bethesda ResearchLaboratories)的反轉(zhuǎn)錄酶緩沖液(50mM Tris-Cl(pH8.3)、75mMKCl、3mM MgCl2、10mM DTT，Bethesda Research Laboratories)合并至終體積50μl。將反應(yīng)混合物置于45℃保溫1小時(shí)合成第一鏈cDNA。合成完成后，按照廠商說明用MicroSpin S-400 HR(Pharmacia)離心柱凝膠過濾mRNAcDNA雜合混合物。
凝膠過濾后，將雜合物稀釋到含有200μl各種dNTP，60單位大腸桿菌DNA聚合酶I(Pharmacia)，5.25單位RNaseH(Promega)以及15單位大腸桿菌DNA連接酶(Boehringer Mannheim)的250μl第二鏈緩沖液(20mM Tris-Cl，pH7.4，90mM KCl，4.6mM MgCl2，10mM(NH4)2SO4，0.16mM bNAD+)中。將反應(yīng)管置于16℃保溫2小時(shí)，再在25℃保溫15分鐘，以合成第二鏈cDNA。加入EDTA至終濃度為20mM以終止反應(yīng)，隨后進(jìn)行酚/氯仿抽提。
綠豆核酸酶處理通過加入2體積96％EtOH，0.2體積10M NH4Ac，于-20℃沉淀雙鏈cDNA 12小時(shí)，再經(jīng)離心回收，在70％EtOH中洗滌，干燥并重懸于30μl含有25單位綠豆核酸酶(Pharmacia)的綠豆核酸酶緩沖液(30mM NaAc(pH4.6)、300mM NaCl、1mM ZnSO4、0.35mM DTT、2％甘油)中。反應(yīng)于30℃保溫30分鐘以剪切單鏈發(fā)夾DNA，隨后，加入70μl 10mM Tris-Cl(pH7.5)、1mM EDTA，進(jìn)行酚抽提，用2體積96％EtOH、0.1體積3M NaAc(pH5.2)在冰上放置30分鐘進(jìn)行沉淀。
用T4 DNA聚合酶形成平末端離心回收雙鏈cDNA，將反應(yīng)混合物置于16℃保溫1小時(shí)，使在30ml含有0.5mM各種dNTP和5單位T4 DNA聚合酶(New EnglandBiolabs)的T4 DNA聚合酶緩沖液(20mM Tris-乙酸鹽，pH7.9，10mMMgAc，50mM KAc，1mM DTT)中產(chǎn)生平末端。加入EDTA至終濃度20mM以終止反應(yīng)，隨后進(jìn)行酚/氯仿抽提，加入2體積96％EtOH、0.1體積3M NaAc(pH5.2)，在-20℃沉淀12小時(shí)。
銜接子連接，NotI消化和大小選擇填平反應(yīng)完成后，離心回收cDNA，在70％EtOH中洗滌，進(jìn)行干燥。將cDNA沉淀重懸于25μl含有2.5μg非回文性BstXI銜接子(Invitrogen)和30單位T4連接酶(Promega)的連接緩沖液(30mMTris-Cl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP)中，于16℃保溫12小時(shí)。65℃加熱20分鐘C終止反應(yīng)，然后置冰上冷卻5分鐘。通過加入20μl水，5μl 10×NotI限制酶緩沖液(New EnglandBiolabs)和50單位NotI(New England Biolabs)，隨后于37℃保溫2.5小時(shí)，從而用NotI限制酶消化連接好的cDNA。65℃加熱10分鐘終止反應(yīng)。通過在0.8％SeaPlaque GTG低熔點(diǎn)瓊脂糖凝膠(FMC)上于1×TBE中進(jìn)行凝膠電泳，對(duì)cDNA進(jìn)行大小分級(jí)分離，從而分離出未連接的銜接子和小cDNA。選擇出分子量0.7kb以上的cDNA，并按照廠商說明用β-瓊脂糖酶(New England Biolabs)從凝膠中將其釋放出來，通過加入2體積96％EtOH和0.1體積3M NaAc(pH5.2)在-20℃放置12小時(shí)使cDNA沉淀。
構(gòu)建文庫離心回收定向的經(jīng)大小選擇過的cDNA，在70％EtOH中洗，干燥后重懸于30μl 10mM Tris-Cl(pH7.5)，1mM EDTA中。經(jīng)過MicroSpin S-300 HR離心柱，按照廠商說明進(jìn)行凝膠過濾，從而對(duì)cDNA進(jìn)行脫鹽。在含有5μl雙鏈cDNA(反應(yīng)管#1和#2)、15單位T4連接酶以及30ng(管#1)、40ng(管#2)和40ng(管#3，載體背景對(duì)照)BstXI-NotI切割的pYES2.0載體的10μl連接緩沖液(30mM Tris-Cl，pH7.8，10mM MgCl2，10mM DTT，0.5mM ATP)中作三次檢測(cè)連接。于16℃保溫12小時(shí)進(jìn)行連接反應(yīng)，70℃加熱20分鐘，并向每個(gè)管加入10μl水。按照Sambrook等描述的方法(1989，分子克隆實(shí)驗(yàn)指南，Cold Spring Harbor Lab.，ColdSpring Harbor NY)，通過電穿孔將每種連接混合物1μl導(dǎo)40μl電感受態(tài)大腸桿菌DH10B細(xì)胞(Bethesda ResearchLaboratories)中。利用最適條件，在大腸桿菌中建立文庫，由各個(gè)群組成。將轉(zhuǎn)化的大腸桿菌鋪到瓊脂平板(LB+氨芐青霉素)上，密度為37℃溫育24小時(shí)后可形成15000-30000個(gè)菌落/板，這樣制得了各個(gè)群。向平板中加入20ml LB+氨芐青霉素，使細(xì)胞懸浮其中。將細(xì)胞懸液在一個(gè)50ml試管中于37℃振蕩1小時(shí)。按照廠商說明用QIAGEN質(zhì)粒試劑盒從細(xì)胞中分離質(zhì)粒DNA，保存在-20℃。
將來自每個(gè)群的1μl純化質(zhì)粒DNA樣品(100ng/ml)經(jīng)電穿孔(Becker和Guarante(1991)酶學(xué)方法194182-187)轉(zhuǎn)化釀酒酵母W3124，將轉(zhuǎn)化子鋪到含有2％葡萄糖的SC瓊脂平板上，并于30℃溫育。
鑒定陽性克隆通過尋找木糖葡聚糖酶陽性菌落間接篩選菌落的XET表達(dá)情況。
瓊脂平板生長(zhǎng)3-5天后，將其影印到一組含有0.1％AZCL木糖葡聚糖的SC-URA瓊脂(加有20％半乳糖)平板上。將這些平板于30℃培養(yǎng)3-7天。周圍有藍(lán)色圈的菌落確定為木糖葡聚糖酶陽性菌落。
將來自酶陽性菌落的細(xì)胞鋪到瓊脂平板上以分離出單菌落，挑選每個(gè)鑒定到的產(chǎn)木糖葡聚糖酶菌落的產(chǎn)酶單菌落。
檢測(cè)所有木糖葡聚糖酶陽性克隆的XET，發(fā)現(xiàn)都是陽性。
分離cDNA基因以在曲霉中表達(dá)將產(chǎn)XET的酵母菌落接種到50ml玻璃試管中的20ml YPD培養(yǎng)液中。試管于30℃振蕩兩天。于3000rpm離心10分鐘收獲細(xì)胞。
按照WO94/14953分離DNA，并將其溶于50ml水中。經(jīng)標(biāo)準(zhǔn)操作將DNA轉(zhuǎn)化到大腸桿菌中。用標(biāo)準(zhǔn)步驟從大腸桿菌中分離出質(zhì)粒DNA，并進(jìn)行限制酶分析。用限制酶BamHI和XbaI將cDNA插入片段切割下來，并連接到曲霉表達(dá)載體pHD414中，得到質(zhì)粒pA2XG80。
用Applied Biosystems ABI PRISMTM377 DNA測(cè)序儀，按照廠商說明，將經(jīng)Qiagen純化的pA2XG80(Qiagen，USA)質(zhì)粒DNA中的cDNA插入片段測(cè)序，測(cè)序中使用Taq脫氧末端循環(huán)測(cè)序試劑盒(Perkin Elmer，USA)和合成寡核苷酸引物。
轉(zhuǎn)化米曲霉或黑色曲霉如此處引作參考文獻(xiàn)的WO95/02043(16頁，21行-17頁，12行)所述制備原生質(zhì)體。
將100μl原生質(zhì)體懸液與10μl STC(1.2M山梨醇，10mMTris-HCl，pH＝7.5，10mM CaCl2)中的5-25μg適當(dāng)?shù)腄NA混合。將原生質(zhì)體與p3SR2(攜帶構(gòu)巢曲霉amdS基因的質(zhì)粒)(ToveChristensen等，生物/技術(shù)，1419-1422頁，6卷，1988年12月)混合?；旌弦褐檬覝刂?5分鐘。加入0.2ml 60％PEG4000(BDH29576)，10mM CaCl2和10mM Tris-HCl(pH＝7.5)，小心混勻(兩次)，最后加入0.85ml同一溶液，小心混勻?；旌弦褐檬覝?5分鐘，在2500g離心15分鐘，將沉淀重懸于2ml 1.2M山梨醇中。再沉淀一次后，將原生質(zhì)體鋪在含有1.0M蔗糖(pH＝7.0)、10mM乙酰胺(作為氮源)以及20mM CsCl的基本平板(Cove，Biochem.Biophys.Acta 113(1966)51-56)上，以抑制背景生長(zhǎng)。于37℃溫育4-7天后，挑出孢子，鋪平板以形成單菌落。重復(fù)該過程，將第二次重分離后得到的單菌落的孢子作為明確的轉(zhuǎn)化子保存起來。
檢測(cè)米曲霉轉(zhuǎn)化子將每株米曲霉轉(zhuǎn)化子接種在10ml YPM(參見下述)中進(jìn)行增殖。于30℃培養(yǎng)2-5天后，除去上清。
用前面描述的XET點(diǎn)印跡檢測(cè)方法鑒定XET活性。
下列序列(SEQ ID No3)是pYES2.0中的XG80(得自Tiarosporella phaseolina的XET)的cDNA插入片段，其中包括克隆所用的BamHI和NotI識(shí)別位點(diǎn)GGATCCGAATTCCAACTATCCTGCCCTCCTTTCAAGCGAACACCATGAAGTTCTCCTCGGCTCTGTTTCTGGCCGCTACGGCGGTCTTGGCTTCCGCCGCGCCGCTTGAGCGCCGCGCCGACTTTTGTGGTCAATGGGACAACGTGAAGAACGGACCTTACACTCTTTACAACAACCTGTGGGGAAAAGATGCTTCCGGAGCCTCCGGATCGCAATGCACCGGCGTCGATAGCTTCAGCAGCAACACCATCGCTTGGCACACATCCTGGTCCTGGTCCGGTGCTCAGTACAATGTCAAGTCTTACGCAAACGTGGTCGTCGACATCACCTCTAAGAAACTCAGCGCCATCAGCAGCATTAACAGCATCTGGCGCTGGGCTTACACGGGTAGCAACATTGTTGCCAATGTTGCCTACGATATCTTCACTTCATCCACTGTCGGTGGTAGCGAGGAATATGAAATCATGATATGGGTTGGTGCTCTCGGTGGTGCTGGTCCGATCTCATCTACCGGCTCCCCTATTGCCACCGTTTCCCTTGCAGGCTCCTCGTGGAAGCTCTACAAAGGGCCCAACGGGCAGATGACCGTGTTCAGCTTCGTCGCCGAGTCCAACGTGAACAACTTCAGCGGTGACCTTAACGCTTTCATCAAGTACCTCACCGGCAACCAGGGCCTTCCCGCCTCGCAATACATCAAGAGCATTGGCGCTGGCACTGAGCCGTTCACGGGTTCCAACGCCAAGCTGACCACTTCCTCCTACACTGTCAGCTTCAGATAACTGTGAAGCTTTATGCTGCCCTTATGCATCATCCTTGTACATAGTTATCACCAGGGGACTCTTGTAAATACGATTGCCTTATTAACCGCCTGCATCTGCTTTCACACAATGGCATTTACCAATCAACAGTGCGCCTCGAATCCGTAAAAGGTGGCTTAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAAATTCCTGCGGCCGC.
下列序列(SEQ ID No4)是XG80編碼區(qū)的氨基酸序列
MKFSSALFLAATAVLASAAPLERRADFCGQWDNVKNGPYTLYNNLWGKDASGASGSQCTGVDSFSSNTIAWHTSWSWSGAQYNVKSYANVVVDITSKKLSAISSINSIWRWAYTGSNIVANVAYDIFTSSTVGGSEEYEIMIWVGALGGAGPISSTGSPIATVSLAGSSWKLYKGPNGQMTVFSFVAESNVNNFSGDLNAFIKYLTGNQGLPASQYIKSIGAGTEPFTGSNAKLTTSSYTVSFR.
本發(fā)明還涉及包含SEQ ID NO4所示氨基酸序列的微生物XET酶，或與SEQ ID NO4氨基酸序列至少80％同源、優(yōu)選與至少85％同源、更優(yōu)選至少90％同源、還要更優(yōu)選至少95％同源、特別優(yōu)選至少98％同源的XET。
如果通過已知算法(例如Lipman和Pearson在科學(xué)227(1985，1435頁)中描述的那種算法)將多肽與親本XET的相應(yīng)氨基酸序列進(jìn)行比較后發(fā)現(xiàn)有X％相同，則認(rèn)為它們的同源性為X％。
Cl.XG80克隆于1998年2月24日保藏在DSMZ(保藏號(hào)DSM12032)。
序列表(1)一般資料(i)申請(qǐng)人(A)姓名Novo Nordisk A/S(B)街道Novo Alle(C)城市Bagsvaerd(E)國(guó)家丹麥(F)郵政編碼(ZIP)DK-2880(G)電話45 4444 8888(H)傳真45 4449 3256(ii)發(fā)明題目微生物木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(iii)序列數(shù)4(iv)計(jì)算機(jī)可讀形式(A)培養(yǎng)基類型軟盤(B)計(jì)算機(jī)IBM PC可兼容機(jī)(C)操作系統(tǒng)PC-DOS/MS-DOS(D)軟件PatentIn Release #1.0，Version #1.30(EPO)(2)SEQ ID NO1的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度27個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO1Ala Glu Phe Cys Gly Gln Trp Asp Thr Gln Thr Val Gly Asn Tyr Ile1 5 10 15
Val Tyr Asn Asn Leu Leu Gly Ala Gly Ser Ala20 25(2)SEQ ID NO2的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度24個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO2Xaa Asp Phe Cys Gly Gln Trp Asp Asn Val Lys Asn Gly Pro Tyr Thr1 5 10 15Leu Tyr Asn Asn Leu Gly Gly Lys20(2)SEQ ID NO3的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度975個(gè)堿基對(duì)(B)類型核酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型DNA(基因組)(xi)序列描述SEQ ID NO3GGATCCGAAT TCCAACTATC CTGCCCTCCT TTCAAGCGAA CACCATGAAG TTCTCCTCGG60CTCTGTTTCT GGCCGCTACG GCGGTCTTGG CTTCCGCCGC GCCGCTTGAG CGCCGCGCCG120ACTTTTGTGG TCAATGGGAC AACGTGAAGA ACGGACCTTA CACTCTTTAC AACAACCTGT180GGGGAAAAGA TGCTTCCGGA GCCTCCGGAT CGCAATGCAC CGGCGTCGAT AGCTTCAGCA240GCAACACCAT CGCTTGGCAC ACATCCTGGT CCTGGTCCGG TGCTCAGTAC AATGTCAAGT300CTTACGCAAA CGTGGTCGTC GACATCACCT CTAAGAAACT CAGCGCCATC AGCAGCATTA360ACAGCATCTG GCGCTGGGCT TACACGGGTA GCAACATTGT TGCCAATGTT GCCTACGATA420TCTTCACTTC ATCCACTGTC GGTGGTAGCG AGGAATATGA AATCATGATA TGGGTTGGTG480CTCTCGGTGG TGCTGGTCCG ATCTCATCTA CCGGCTCCCC TATTGCCACC GTTTCCCTTG540
CAGGCTCCTC GTGGAAGCTC TACAAAGGGC CCAACGGGCA GATGACCGTG TTCAGCTTCG600TCGCCGAGTC CAACGTGAAC AACTTCAGCG GTGACCTTAA CGCTTTCATC AAGTACCTCA660CCGGCAACCA GGGCCTTCCC GCCTCGCAAT ACATCAAGAG CATTGGCGCT GGCACTGAGC720CGTTCACGGG TTCCAACGCC AAGCTGACCA CTTCCTCCTA CACTGTCAGC TTCAGATAAC780TGTGAAGCTT TATGCTGCCC TTATGCATCA TCCTTGTACA TAGTTATCAC CAGGGGACTC840TTGTAAATAC GATTGCCTTA TTAACCGCCT GCATCTGCTT TCACACAATG GCATTTACCA900ATCAACAGTG CGCCTCGAAT CCGTAAAAGG TGGCTTAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA960AATTCCTGCG GCCGC 975(2)SEQ ID NO4的資料(i)序列特征(A)長(zhǎng)度244個(gè)氨基酸(B)類型氨基酸(C)鏈型單鏈(D)拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)線性(ii)分子類型肽(xi)序列描述SEQ ID NO4Met Lys Phe Ser Ser Ala Leu Phe Leu Ala Ala Thr Ala Val Leu Ala1 5 10 15Ser Ala Ala Pro Leu Glu Arg Arg Ala Asp Phe Cys Gly Gln Trp Asp20 25 30Asn Val Lys Asn Gly Pro Tyr Thr Leu Tyr Asn Asn Leu Trp Gly Lys35 40 45Asp Ala Ser Gly Ala Ser Gly Ser Gln Cys Thr Gly Val Asp Ser Phe50 55 60Ser Ser Asn Thr Ile Ala Trp His Thr Ser Trp Ser Trp Ser Gly Ala65 70 75 80Gln Tyr Asn Val Lys Ser Tyr Ala Asn Val Val Val Asp Ile Thr Ser85 90 95Lys Lys Leu Ser Ala Ile Ser Ser Ile Asn Ser Ile Trp Arg Trp Ala100 105 110Tyr Thr Gly Ser Asn Ile Val Ala Asn Val Ala Tyr Asp Ile Phe Thr115 120 125Ser Ser Thr Val Gly Gly Ser Glu Glu Tyr Glu Ile Met Ile Trp Val130 135 140Gly Ala Leu Gly Gly Ala Gly Pro Ile Ser Ser Thr Gly Ser Pro Ile145 150 155 160
Ala Thr Val Ser Leu Ala Gly Ser Ser Trp Lys Leu Tyr Lys Gly Pro165 170 175Asn Gly Gln Met Thr Val Phe Ser Phe Val Ala Glu Ser Asn Val Asn180 185 190Asn Phe Ser Gly Asp Leu Asn Ala Phe Ile Lys Tyr Leu Thr Gly Asn195 200 205Gln Gly Leu Pro Ala Ser Gln Tyr Ile Lys Ser Ile Gly Ala Gly Thr210 215 220Glu Pro Phe Thr Gly Ser Asn Ala Lys Leu Thr Thr Ser Ser Tyr Thr225 230 235 240Val Ser Phe Arg
權(quán)利要求
1.一種木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(XET)的生產(chǎn)方法，包括(a)在適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，有利于XET酶產(chǎn)生的條件下培養(yǎng)表達(dá)微生物XET的一種微生物，以及(b)隨后從培養(yǎng)基中回收XET酶。
2.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是真菌或細(xì)菌。
3.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述真菌是擔(dān)子菌，接合菌，子囊菌或有絲分裂孢子真菌。
4.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述真菌是革蓋菌目、裂褶菌目、韌革菌目或Xenasmatales目的擔(dān)子菌菌株。
5.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述真菌是選自屬于革蓋菌科、伏革菌科、裂褶菌科、韌革菌科和Tubulicrinaceae各科菌株的擔(dān)子菌。
6.根據(jù)權(quán)利要求4的方法，其中所述真菌是選自栓菌屬、伏革菌屬、裂褶菌屬、韌革菌屬(Stereum)或Tubulicrinis屬菌株的擔(dān)子菌。
7.根據(jù)權(quán)利要求6的方法，其中所述真菌是選自毛栓菌、玫瑰色伏革菌、裂褶菌屬之種、毛韌革菌和Tubulicrinis subulatus種菌株的擔(dān)子菌。
8.根據(jù)權(quán)利要求7的方法，其中所述真菌是裂褶菌屬之種，保藏號(hào)CBS443.97。
9.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述子囊菌是選自屬于腔菌綱、盤菌綱、核菌綱和不整囊菌綱的菌株。
10.根據(jù)權(quán)利要求9的方法，其中所述子囊菌選自屬于座囊菌目、斑痣盤菌目、盤菌目、錘舌菌目、炭角菌目、肉座菌目、海殼目、黑痣菌目、腐皮殼菌目和散囊菌目各目的菌株。
11.根據(jù)權(quán)利要求10的方法，其中所述子囊菌選自屬于小球腔菌科、葡萄座腔菌科、小穴殼菌科、球腔菌科、毛筒殼科、斑痣盤菌科、肉盤菌科、火絲菌科、核盤菌科、圓孔殼科、Hyponectriaceae、炭角菌科、黑腐皮殼科、黑盤孢科、肉座菌科、海殼科、黑痣菌科和發(fā)菌科各科的菌株。
12.根據(jù)權(quán)利要求11的方法，其中所述子囊菌選自屬于盾殼霉屬、莖點(diǎn)霉屬、二孢屬、Plowrightia、葉點(diǎn)霉屬、殼針孢屬、毛筒殼屬、鏈格孢屬、Embellisia、Tiarosporella、Galiella、珠頭霉屬，假黑盤菌屬、火絲菌屬、葡萄孢屬、外殼孢屬、盤多毛孢屬、多毛菌屬、Chaetapiospora、孔座殼屬、Nodulisporium、炭角菌屬、殼囊孢屬、座盤孢屬、擬莖點(diǎn)霉屬、棒盤孢屬、Seimatosporium、鐮孢屬、輪枝孢屬、周刺座霉屬、Lulworthia、刺盤孢屬、曲霉屬、散囊菌屬、正青霉屬、青霉屬、Petromyces和踝節(jié)菌屬各屬的菌株。
13.根據(jù)權(quán)利要求12的方法，其中所述子囊菌選自屬于棉色二孢、Plowrightia ribesia、葉點(diǎn)霉屬之種、殼針孢屬之種、Tubeufia amazonensis、鏈格孢屬之種、Embellisia hyacinthi、新莖點(diǎn)霉、熱帶莖點(diǎn)霉、盾殼霉屬之種、橄欖色盾殼霉、當(dāng)克盾殼霉、Tiarosporella sp.、Tiarosporella phaseolina、Galiellacelebica.、淡黑假黑盤菌、磚火絲菌、珠頭霉屬之種、灰色葡萄孢、外殼孢屬之種、盤多毛孢屬之種、多毛菌屬之種、點(diǎn)孔座殼、炭角菌屬之種、Nodulisporium sp.、腐皮鐮孢、輪枝孢屬之種、巴西周刺座霉、Chaetapiospora rhododendri、Lulworthiauniseptata、棘孢刺盤孢、Colletotrichum crassipes、殼囊孢屬各種、座盤孢屬之種、擬莖點(diǎn)霉屬之種、Phomopsis cirsii、栗棒盤孢、Seimatosporium 7ichenicola、塔木里氏曲霉、Eurotiumche valieri、爪哇正青霉、膠囊青霉、奧爾森氏青霉、嗜松青霉、婁格法爾特氏青霉、意大利青霉、疣孢青霉、變灰青霉、Petromycesalliaceus和黃色踝節(jié)菌各種的菌株。
14.根據(jù)權(quán)利要求13的方法，其中所述子囊菌選自屬于灰色葡萄孢保藏號(hào)CBS447.97、淡黑假黑盤菌保藏號(hào)CBS444.97、Tiarosporella phaseolina保藏號(hào)CBS446.97、盤多毛孢屬之種保藏號(hào)CBS445.97和Lulworthia uniseptata保藏號(hào)CBS442.97等種的菌株。
15.根據(jù)權(quán)利要求3的方法，其中所述接合菌選自屬于毛霉目的菌株。
16.根據(jù)權(quán)利要求15的方法，其中所述真菌是選自屬于絲枝霉科和毛霉科菌株的接合菌。
17.根據(jù)權(quán)利要求16的方法，其中所述真菌是選自屬于Dichotomocladium、放射毛霉屬、球托霉屬、Sporodiniella和毛霉屬各屬菌株的接合菌。
18.根據(jù)權(quán)利要求17的方法，其中所述真菌是選自屬于Dichotomocladium hesseltinei、雅致放射毛霉、卵形孢球托霉、米赫毛霉minor變種和Sporodiniella umbellata各種內(nèi)菌株的接合菌。
19.根據(jù)權(quán)利要求18的方法，其中所述真菌是卵形孢球托霉保藏號(hào)CBS448.97。
20.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述真菌是有絲分裂孢子真菌。
21.根據(jù)權(quán)利要求1的方法，其中所述微生物是Vialaeainsculpta。
22.根據(jù)權(quán)利要求2的方法，其中所述細(xì)菌是革蘭氏陽性細(xì)菌。
23.根據(jù)權(quán)利要求22的方法，其中所述革蘭氏陽性細(xì)菌是芽孢桿菌。
24.根據(jù)權(quán)利要求23的方法，其中所述革蘭氏陽性細(xì)菌是嗜堿芽孢桿菌保藏號(hào)DSM11404。
25.根據(jù)權(quán)利要求1到24中任何一項(xiàng)得到的XET制劑用于處理纖維素材料的用途。
26.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述處理能使纖維素材料具有改善的強(qiáng)度和/或提高的保形性能和/或更好的抗皺性能。
27.根據(jù)權(quán)利要求25的用途，其中所述纖維素材料是纖維素織物或紙和紙漿產(chǎn)品。
28.一種木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶制劑，它能通過培養(yǎng)表達(dá)微生物XET的一種微生物產(chǎn)生。
29.根據(jù)權(quán)利要求28的制劑，其中所述XET具有SEQ ID NO.1所示氨基酸序列，或者該XET具有與SEQ ID NO.1至少80％同源的氨基酸序列。
30.根據(jù)權(quán)利要求28的制劑，其中所述XET具有SEQ ID NO.2所示氨基酸序列，或者該XET具有與SEQ ID NO.2至少80％同源的氨基酸序列。
31.根據(jù)權(quán)利要求28的制劑，其中所述XET具有SEQ ID NO.4所示氨基酸序列，或者該XET具有與SEQ ID NO.4至少80％同源的氨基酸序列。
32.根據(jù)權(quán)利要求28的制劑，其中所述XET在pH3到11、尤其是pH 4到9有活性。
33.一種木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶(XET)的生產(chǎn)方法，包括(a)在適宜的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中，有利于XET酶產(chǎn)生的條件下，培養(yǎng)表達(dá)微生物XET的一種轉(zhuǎn)化宿主微生物，以及(b)隨后從營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基中回收XET酶。
全文摘要
通過篩選分析，發(fā)現(xiàn)了大批在系統(tǒng)發(fā)生上比較分散的微生物能產(chǎn)生XET活性。因此，本發(fā)明涉及一種能夠通過培養(yǎng)表達(dá)XET的一種微生物而生產(chǎn)的木糖葡聚糖內(nèi)切轉(zhuǎn)糖基酶制劑。
文檔編號(hào)C12R1/69GK1530442SQ20041000165
公開日2004年9月22日 申請(qǐng)日期1998年2月26日 優(yōu)先權(quán)日1997年2月26日
發(fā)明者R·I·尼爾森, R I 尼爾森 申請(qǐng)人:諾沃奇梅茲有限公司