專(zhuān)利名稱(chēng)：組織型纖溶酶原激活劑缺失/點(diǎn)突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)領(lǐng)域，其技術(shù)屬于細(xì)胞生物學(xué)與分子生物學(xué)的相關(guān)實(shí)驗(yàn)方法與技術(shù)，特別是一種組織型纖溶酶原激活劑缺失/點(diǎn)突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株。
背景技術(shù)：
心血管疾病引發(fā)的血栓并發(fā)癥嚴(yán)重威脅人類(lèi)的生命與健康，是導(dǎo)致死亡和病殘的主要疾病之一。全世界每年心血管病患者多達(dá)幾千萬(wàn)；我國(guó)血栓性疾病的發(fā)生人數(shù)近年來(lái)也明顯上升，每年高達(dá)300萬(wàn)，且治療后復(fù)發(fā)率較高。而由血栓造成的急性心肌梗塞(Acutemyocardial infarction，AMI)的死亡率可高達(dá)30％。對(duì)于許多AMI患者來(lái)說(shuō)，溶栓治療是提高存活率及保持左心室功能的首選方法。故疾病發(fā)作時(shí)，進(jìn)行及時(shí)有效的特效藥物治療以保證血液循環(huán)的正常暢通，對(duì)提高患者的生存率十分重要。
組織型纖溶酶原激活劑(tissue-type plasminogenactivator，t-PA)是目前臨床上所使用的第二代溶栓劑之一，它是血中纖溶系統(tǒng)中天然存在的生理性激活劑，能特異地激活纖溶酶原轉(zhuǎn)變?yōu)槔w溶酶，而后者能在血栓局部有效地溶解血栓中的纖維蛋白，使血管再通。但是，t-PA在血中的半衰期甚短(3～5分鐘)，使得在臨床治療中為維持其有效濃度而必須大劑量靜脈滴注，從而增加了引起系統(tǒng)性出血的危險(xiǎn)。除此之外，溶栓治療時(shí)，大量t-PA的使用也使其價(jià)格令人難以接受。因此設(shè)計(jì)并研制延長(zhǎng)半衰期，降低系統(tǒng)出血傾向，提高特異活性，簡(jiǎn)化給藥途徑，價(jià)格便宜的新型t-PA愈發(fā)重要?；诖?，人們努力開(kāi)發(fā)研制新型溶栓試劑。
作為第三代溶栓制劑之一的rPA(Reteplase，t-PA的V4～E175缺失突變體)早在1996年就已通過(guò)FDA的認(rèn)證。與野生型t-PA相比，其有許多的優(yōu)點(diǎn)，如半衰期相對(duì)延長(zhǎng)；對(duì)患者用藥時(shí)，可以采用推注而非滴注的方式等等。但對(duì)于rPA來(lái)說(shuō)，不僅其基因上仍然存在有t-PA的快速抑制劑PAI-1(plasminogen activator inhibitor -1)的作用位點(diǎn)，而且由于其為大腸桿菌的表達(dá)產(chǎn)物，需要進(jìn)行大量的純化與復(fù)性方面的工作，從而增加了生產(chǎn)成本，使其在國(guó)內(nèi)臨床上難以得到廣泛的應(yīng)用。
而對(duì)于真核細(xì)胞表達(dá)系統(tǒng)來(lái)說(shuō)，由于其不僅能夠正確剪接加工成熟的mRNA，提高產(chǎn)品正確構(gòu)型的幾率，且表達(dá)產(chǎn)物具有遺傳穩(wěn)定性和可重復(fù)性，可分泌到培養(yǎng)基中，提純工藝簡(jiǎn)單，成本也較低。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的目的是通過(guò)真核細(xì)胞表達(dá)方式提供一種組織型纖溶酶原激活劑缺失/點(diǎn)突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株本發(fā)明的目的按下述方案實(shí)現(xiàn)一種組織型纖溶酶原激活劑缺失/點(diǎn)突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，它是以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將所構(gòu)建成的t-PA的缺失/點(diǎn)突變體cDNA的真核表達(dá)載體pCSRK轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-，經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，首次獲得了其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株CHO-dhfr-pCSRK(保藏號(hào)CGMCC NO.1094)；上述t-PA的缺失/點(diǎn)突變體cDNA是在t-PA V4～E175缺失突變體cDNA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行了KHRR296～299AAAA點(diǎn)突變，以逃避PAI-1的抑制。
本發(fā)明對(duì)上述細(xì)胞株的生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定。其中，F(xiàn)APA檢測(cè)結(jié)果表明，表達(dá)產(chǎn)物具有良好的溶纖活性；80℃平板滅活實(shí)驗(yàn)表明，產(chǎn)物具有特異活性；Western blotting結(jié)果表明，產(chǎn)物具有特異抗原性；穩(wěn)定性試驗(yàn)表明，細(xì)胞株具有良好的穩(wěn)定性。實(shí)驗(yàn)中，還對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基CHO-S-SFM II與常規(guī)培養(yǎng)基DMEM培養(yǎng)條件下的細(xì)胞株特性進(jìn)行了比較，其中24h，48h，72h時(shí)，目的產(chǎn)物的表達(dá)量，前者均約為后者的2倍；SDS-PAGE顯示，前者僅有少量的蛋白質(zhì)條帶，而后者則存在大量的蛋白質(zhì)條帶。
具體實(shí)施例方式以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將所構(gòu)建成的t-PA的缺失/點(diǎn)突變體cDNA的真核表達(dá)載體pCSRK轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-，經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，首次獲得了其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株CHO-dhfr-pCSRK(保藏號(hào)CGMCC NO.1094)；上述t-PA的缺失/點(diǎn)突變體cDNA是在t-PA V4～E175缺失突變體cDNA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行了KHRR296～299AAAA點(diǎn)突變，以逃避PAI-1的抑制。
并對(duì)其生物學(xué)特性進(jìn)行了鑒定；實(shí)驗(yàn)中還首次對(duì)無(wú)血清培養(yǎng)基(serum free medium，SFM)在rPA突變體的生產(chǎn)應(yīng)用方面進(jìn)行了探索，從而進(jìn)一步證明了SFM對(duì)于生產(chǎn)藥用性蛋白質(zhì)的廣闊前景。本發(fā)明為臨床上開(kāi)發(fā)和應(yīng)用延長(zhǎng)半衰期，降低系統(tǒng)出血傾向，提高特異活性，簡(jiǎn)化給藥途徑和價(jià)格便宜的新型長(zhǎng)效t-PA奠定了良好的基礎(chǔ)。
權(quán)利要求
1.一種組織型纖溶酶原激活劑缺失/點(diǎn)突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，其特征在于它是以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將所構(gòu)建成的t-PA的缺失/點(diǎn)突變體cDNA的真核表達(dá)載體pCSRK轉(zhuǎn)染CHO-dhfr-，經(jīng)G418及DMEM的雙重選擇后，首次獲得了其穩(wěn)定表達(dá)細(xì)胞株CHO-dhfr-pCSRK(保藏號(hào)CGMCC NO.1094)。
2.如權(quán)利要求1所述的組織型纖溶酶原激活劑缺失/點(diǎn)突變體基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，其特征在于上述t-PA的缺失/點(diǎn)突變體cDNA是在t-PA V4～E175缺失突變體cDNA的基礎(chǔ)上，進(jìn)一步進(jìn)行了KHRR296～299AAAA點(diǎn)突變，以逃避PAI-1的抑制。
全文摘要
本發(fā)明是一種組織型纖溶酶原激活劑突變體rPA(K)基因轉(zhuǎn)染細(xì)胞株，它是以脂質(zhì)體介導(dǎo)法將所構(gòu)建成的含有t－PA cDNA的缺失/點(diǎn)突變體rPA(K)－rPA(KHRR296～299AAAA)基因(該突變體可逃避PAI－1的抑制)的真核表達(dá)載體pCSRK轉(zhuǎn)染CHO－dhfr
文檔編號(hào)C12N15/85GK1560239SQ20041000473
公開(kāi)日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月1日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月1日
發(fā)明者王玉炯, 李敏, 扈榮良, 羅惠霞 申請(qǐng)人:寧夏大學(xué)