專利名稱：一種經(jīng)切割后能產(chǎn)生多種有效成分的前體蛋白的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明屬于重組蛋白質(zhì)藥物領(lǐng)域。通過對(duì)前體蛋白的基因工程構(gòu)建，實(shí)現(xiàn)了高效表達(dá)；通過前體蛋白不同位點(diǎn)的氨基酸變化，以及控制凝血酶酶切工藝，可以得到成熟白細(xì)胞介素11的多種突變體，該方法具有表達(dá)量高，操作簡(jiǎn)便，成熟蛋白活性高的特點(diǎn)。
二.
背景技術(shù)：
本發(fā)明中的前體蛋白是白細(xì)胞介素11前體蛋白。白細(xì)胞介素11是在人體內(nèi)有多種功能的一類細(xì)胞因子，其主要功能是(1)使造血干細(xì)胞分化為巨核系細(xì)胞，使巨核細(xì)胞增殖并成熟，促進(jìn)血小板生成；(2)保護(hù)胃腸粘膜受損細(xì)胞；(3)促進(jìn)骨髓集落的形成；(4)促進(jìn)白細(xì)胞生成等。白細(xì)胞介素11的最主要功能是促進(jìn)血小板生成從而提高外周血血小板的數(shù)量。美國(guó)的Genetics Institute公司生產(chǎn)的重組人白細(xì)胞介素11(商品名neumega)已于1997年11月由FDA批準(zhǔn)上市，適應(yīng)癥為化療引起的腫瘤病人血小板減少癥。
由于天然的白細(xì)胞介素11含量非常微小，難以得到，并且白細(xì)胞介素11的分子量約為19kD，也難以進(jìn)行化學(xué)合成，所以基因工程表達(dá)的方法就成為了生產(chǎn)重組人白細(xì)胞介素11的主要方法。
實(shí)驗(yàn)證明，白細(xì)胞介素11單獨(dú)在大腸桿菌中表達(dá)對(duì)菌體的毒性較大，可造成工程菌的死亡。一種方法是采用包涵體表達(dá)的方法(見專利99125600.X)，但由于白細(xì)胞介素11所含疏水氨基酸較多，疏水氨基酸占總氨基酸數(shù)量的60％左右，所以包涵體變性后復(fù)性難度較大且收率較低。另一種方法是采用甲醇酵母直接表達(dá)重組人白細(xì)胞介素11(見專利99118279.0)，這種方法白細(xì)胞介素11直接表達(dá)到甲醇酵母培養(yǎng)基中，方便了下游的純化，但是由于其發(fā)酵的時(shí)間較長(zhǎng)(大于3天)，增加了時(shí)間及其他成本，并且表達(dá)后的白細(xì)胞介素11在發(fā)酵液中高溫停留的時(shí)間較長(zhǎng)也增加了一些不利的因素。
鑒于此，用表達(dá)前體蛋白的方法純化后，再進(jìn)行切割得到目的的重組白細(xì)胞介素11的方法更為可行。美國(guó)Genetics Institute公司生產(chǎn)的重組人白細(xì)胞介素11(商品名neumega)的方法是使用PTHUS質(zhì)粒，得到Thioredoxin融合蛋白，然后使用羥胺進(jìn)行切割，多步純化得到了目的蛋白(見US 5,760,189)。然而該種方法的融合蛋表達(dá)量?jī)H占總蛋白的約10％，另外，其純化步驟較為繁復(fù)，包括多步超濾和層析，本發(fā)明通過構(gòu)建另一種前體蛋白，采用了凝血酶進(jìn)行切割，而得到成熟白細(xì)胞介素11蛋白的多種突變體，具有高表達(dá)，高活性的特點(diǎn)，適用于臨床上血小板減少癥的治療。
三.

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的主要特點(diǎn)是構(gòu)建并表達(dá)了白細(xì)胞介素11的一種前體蛋白，采用的凝血酶進(jìn)行切割，得到高活性的成熟白細(xì)胞介素11重組蛋白突變體，更適于血小板減少癥的治療。
鑒于白細(xì)胞介素11直接表達(dá)有很多困難，本發(fā)明設(shè)計(jì)的前體蛋白的前10位氨基酸組成的肽(His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg)起到了分子伴侶的作用，減少了白細(xì)胞介素11對(duì)大腸桿菌細(xì)胞的毒性，并且在大腸桿菌胞質(zhì)中可以穩(wěn)定目的蛋白的結(jié)構(gòu)，從而使其表達(dá)量大大提高，達(dá)到總蛋白的35％以上。
前體蛋白采用大腸桿菌偏愛的密碼子，可采用如pET，pBV，pGEX等多種表達(dá)載體進(jìn)行表達(dá)，宿主菌可采用BL21，BL21(DE3)，JM109，DH5α等多種宿主菌進(jìn)行胞內(nèi)可溶性表達(dá)發(fā)酵。表達(dá)后的前體蛋白可以通過菌體機(jī)械破碎的方法釋放并用離心或超濾的方法進(jìn)行固液分離。然后前體蛋白通過常規(guī)的層析方法進(jìn)行純化，本發(fā)明采用樣品先分子篩脫鹽后陽(yáng)離子交換層析的方法，進(jìn)行純化可使前體蛋白的純度達(dá)到90％以上。
通過控制前體蛋白第15位X和第139位Y氨基酸的變化與純化后凝血酶的酶切條件，可以得到一系列白細(xì)胞介素11的突變體。具體方法如下當(dāng)X為Val時(shí)，Y為Asp時(shí)，凝血酶濃度為2U/mL，得到的人白細(xì)胞介素11是前體蛋白的第10位到第183位，此為白細(xì)胞介素11-NO1。
當(dāng)X為Ala時(shí)，而Y為Asp和Asn時(shí)，凝血酶的濃度為5U/mL，得到的人白細(xì)胞介素11是前體蛋白的第15位到第183位，此分別為白細(xì)胞介素11-NO2和NO3。
當(dāng)X為Ser時(shí)，而Y為Asp和Gln時(shí)，凝血酶的濃度為8U/mL，得到的人白細(xì)胞介素11是前體蛋白的第15位到第183位，此分別為白細(xì)胞介素11-NO4和NO5。
以上的前體蛋白經(jīng)過凝血酶切割后，進(jìn)行2步純化，分別使陽(yáng)離子交換層析和陰離子交換層析后，得到了純度大于95％的重組人白細(xì)胞介素11?？偸章蚀笥?0％。
得到的各種白細(xì)胞介素11突變體細(xì)胞活性采用MTT法，用B911細(xì)胞，應(yīng)用美國(guó)已上市的重組白細(xì)胞介素11(neumega)作為參照品進(jìn)行生物活性的測(cè)定，結(jié)果如下白細(xì)胞介素11種類比活性neumega 6.2×106U/mgNO1 5.3×106U/mgNO2 8.8×106U/mgNO3 8.6×106U/mgNO4 7.7×106U/mgNO5 7.4×106U/mg從結(jié)果可以看出，本發(fā)明的白細(xì)胞介素11-NO2-NO5與標(biāo)準(zhǔn)品比較活性都有了明顯的提高，由此這些白細(xì)胞介素11突變體在臨床治療血小板減少癥的情況下就有可能降低劑量，減少毒性，從而達(dá)到更好的治療效果。
四.
具體實(shí)施例方式
實(shí)例1用PCR方法，從人肝細(xì)胞文庫(kù)中擴(kuò)增出目的基因，合成引物時(shí)引入前10個(gè)氨基酸(His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg)并嵌入酶切位點(diǎn)，再用測(cè)序質(zhì)粒pBSK篩選出完整的目的基因片段備用，最后從重組pBSK質(zhì)粒中切下序列測(cè)定正確的目的基因片段，定向地嵌入表達(dá)質(zhì)粒pET21b中，得到重組質(zhì)粒pET-pro，經(jīng)過酶切、測(cè)序、鑒定后的重組質(zhì)粒pET-pro，用CaCl2法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21(DE3)中，該重組工程菌經(jīng)過表達(dá)，純化得到最終白細(xì)胞介素11蛋白突變體。
前體蛋白的氨基酸序列為His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Val-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu具體方法如下1.表達(dá)從轉(zhuǎn)化好的工程菌平面上挑取3個(gè)單菌落，接種到50mL LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉(zhuǎn)/分鐘，12小時(shí)后，把50mL菌液轉(zhuǎn)接入1升LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉(zhuǎn)/分鐘，3小時(shí)后，當(dāng)OD600約等于0.8時(shí)，加入IPTG使其終濃度為1mM，3小時(shí)后離心收集菌體。
2.裂菌收集的菌體按1∶5的比例加入裂菌緩沖液，20mM Tris，pH8，然后使用超聲波法進(jìn)行破菌，破菌后15000rpm/分鐘進(jìn)行離心20分鐘，收集上清。
3.純化a.凝膠過濾層析采用Sephadex G25 Medium介質(zhì)，平衡液采用20mM PB，pH7，收集蛋白峰。
b.陽(yáng)離子交換層析采用CM Sehparose Fast Flow層析介質(zhì)，平衡液為20mM PB，pH7，上樣并平衡后采用20mMPB，pH7，0.25M NaCl洗脫，收集蛋白洗脫峰。
c.酶切采用凝血酶，比例為樣品1mL2U，進(jìn)行酶切，時(shí)間為2小時(shí)，溫度為25度。
d.陽(yáng)離子交換層析酶切液用20mM PB，pH7緩沖液稀釋3倍，上CM Sehparose Fast Flow層析介質(zhì)，平衡液采用20mM PB，pH7，洗脫液采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脫，收集蛋白洗脫峰。
e.陰離子交換層析上一步層析得到的洗脫液用20mM PB，pH7稀釋3倍，上DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)，收集透過峰。即為白細(xì)胞介素11-NO1純品。
4.檢測(cè)得到的白細(xì)胞介素11-NO1通過SDS-PAGE純度檢測(cè)和反相HPLC檢測(cè)，純度大于95％。
5.活性檢測(cè)得到的白細(xì)胞介素11-NO1采用MTT法，應(yīng)用美國(guó)已上市的重組白細(xì)胞介素11(neumega)作為參照品，用B911細(xì)胞進(jìn)行生物活性的測(cè)定，結(jié)果neumega的比活性為6.2×106U/mg，白細(xì)胞介素11-NO1的比活性為5.3×106U/mg。
實(shí)例二采用PCR定點(diǎn)突變的方法，將實(shí)例一中的前體蛋白的第15位氨基酸突變?yōu)锳la，并從重組pBSK質(zhì)粒中切下序列測(cè)定正確的目的基因片段，定向地嵌入表達(dá)質(zhì)粒pBV中，得到重組質(zhì)粒pBV-pro，經(jīng)過酶切、測(cè)序、鑒定后的重組質(zhì)粒pBV-pro，用CaCl2法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌DH5α中，該重組工程菌經(jīng)過表達(dá)，純化得到最終白細(xì)胞介素11蛋白突變體。
前體蛋白的氨基酸序列為His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu具體方法如下1.表達(dá)從轉(zhuǎn)化好的工程菌平面上挑取3個(gè)單菌落，接種到50mL LB液體培養(yǎng)基中，30度，200轉(zhuǎn)/分鐘，12小時(shí)后，把50mL菌液轉(zhuǎn)接入1升LB液體培養(yǎng)基中，30度，200轉(zhuǎn)/分鐘，3小時(shí)后，當(dāng)OD600約等于0.8時(shí)，溫度升到42度，3小時(shí)后離心收集菌體。
2.裂菌收集的菌體按1∶5的比例加入裂菌緩沖液，20mM Tris，pH8，然后使用超聲波法進(jìn)行破菌，破菌后15000rpm/分鐘進(jìn)行離心20分鐘，收集上清。
3.純化a)凝膠過濾層析采用Sephadex G25 Medium介質(zhì)，平衡液采用20mM PB，pH7，收集蛋白峰。
b)陽(yáng)離子交換層析采用CM Sehparose Fast Flow層析介質(zhì)，平衡液為20mM PB，pH7，上樣并平衡后采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脫，收集蛋白洗脫峰。
c)酶切采用凝血酶，比例為樣品1mL∶5U，進(jìn)行酶切，時(shí)間為2小時(shí)，溫度為25度。
d)陽(yáng)離子交換層析酶切液用20mM PB，pH7緩沖液稀釋3倍，上CM Sehparose Fast Flow層析介質(zhì)，平衡液采用20mM PB，pH7，洗脫液采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脫，收集蛋白洗脫峰。
e)陰離子交換層析上一步層析得到的洗脫液用20mM PB，pH7稀釋3倍，上DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)，收集透過峰。即為白細(xì)胞介素11-NO2純品。
4.檢測(cè)得到的白細(xì)胞介素11-NO2通過SDS-PAGE純度檢測(cè)和反相HPLC檢測(cè)，純度大于95％。
5.活性檢測(cè)得到的白細(xì)胞介素11-NO2采用MTT法，應(yīng)用美國(guó)已上市的重組白細(xì)胞介素11(neumega)作為參照品，用B911細(xì)胞進(jìn)行生物活性的測(cè)定，結(jié)果白細(xì)胞介素11-NO2的比活性為8.8×106U/mg。
實(shí)例三采用PCR定點(diǎn)突變的方法，將實(shí)例二中的前體蛋白的第139位氨基酸改變?yōu)锳sn，從重組pBSK質(zhì)粒中切下序列測(cè)定正確的目的基因片段，定向地嵌入表達(dá)質(zhì)粒pKK中，得到重組質(zhì)粒pKK-pro，經(jīng)過酶切、測(cè)序、鑒定后的重組質(zhì)粒pKK-pro，用CaCl2法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21中，該重組工程菌經(jīng)過表達(dá)，純化得到最終白細(xì)胞介素11蛋白突變體。
前體蛋白的氨基酸序列為His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ala-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asn-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu具體方法如下1.表達(dá)從轉(zhuǎn)化好的工程菌平面上挑取3個(gè)單菌落，接種到50mL LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉(zhuǎn)/分鐘，12小時(shí)后，把50mL菌液轉(zhuǎn)接入1升LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉(zhuǎn)/分鐘，3小時(shí)后，當(dāng)OD600約等于0.8時(shí)，加入IPTG使其終濃度為1mM，3小時(shí)后離心收集菌體。
2.裂菌收集的菌體按1∶5的比例加入裂菌緩沖液，20mM Tris，pH8，然后使用超聲波法進(jìn)行破菌，破菌后15000rpm/分鐘進(jìn)行離心20分鐘，收集上清。
3.純化a)凝膠過濾層析采用Sephadex G25 Medium介質(zhì)，平衡液采用20mM PB，pH7，收集蛋白峰。
b)陽(yáng)離子交換層析采用CM Sehparose Fast Flow層析介質(zhì)，平衡液為20mM PB，pH7，上樣并平衡后采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脫，收集蛋白洗脫峰。
c)酶切采用凝血酶，比例為樣品1mL∶5U，進(jìn)行酶切，時(shí)間為2小時(shí)，溫度為25度。
d)陽(yáng)離子交換層析酶切液用20mM PB，pH7緩沖液稀釋3倍，上CM Sehparose Fast Flow層析介質(zhì)，平衡液采用20mM PB，pH7，洗脫液采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脫，收集蛋白洗脫峰。
e)陰離子交換層析上一步層析得到的洗脫液用20mM PB，pH7稀釋3倍，上DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)，收集透過峰。即為白細(xì)胞介素11-NO3純品。
4.檢測(cè)得到的白細(xì)胞介素11-NO3通過SDS-PAGE純度檢測(cè)和反相HPLC檢測(cè)，純度大于95％。
5.活性檢測(cè)得到的白細(xì)胞介素11-NO3采用MTT法，應(yīng)用美國(guó)已上市的重組白細(xì)胞介素11(neumega)作為參照品，用B911細(xì)胞進(jìn)行生物活性的測(cè)定，結(jié)果白細(xì)胞介素11-NO3的比活性為8.6×106U/mg。
實(shí)例四采用PCR定點(diǎn)突變的方法，將實(shí)例一中的前體蛋白的第15位氨基酸改變?yōu)镾er，從重組pBSK質(zhì)粒中切下序列測(cè)定正確的目的基因片段，定向地嵌入表達(dá)質(zhì)粒pET21b中，得到重組質(zhì)粒pET-pro，經(jīng)過酶切、測(cè)序、鑒定后的重組質(zhì)粒pET-pro，用CaCl2法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌BL21(DE3)中，該重組工程菌經(jīng)過表達(dá)，純化得到最終白細(xì)胞介素11蛋白突變體。
前體蛋白的氨基酸序列為His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ser-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Asp-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu具體方法如下1.表達(dá)從轉(zhuǎn)化好的工程菌平面上挑取3個(gè)單菌落，接種到50mL LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉(zhuǎn)/分鐘，12小時(shí)后，把50mL菌液轉(zhuǎn)接入1升LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉(zhuǎn)/分鐘，3小時(shí)后，當(dāng)OD600約等于0.8時(shí)，加入IPTG使其終濃度為1mM，3小時(shí)后離心收集菌體。
2.裂菌收集的菌體按1∶5的比例加入裂菌緩沖液，20mM Tris，pH8，然后使用超聲波法進(jìn)行破菌，破菌后15000rpm/分鐘進(jìn)行離心20分鐘，收集上清。
3.純化a)凝膠過濾層析采用Sephadex G25 Medium介質(zhì)，平衡液采用20mM PB，pH7，收集蛋白峰。
b)陽(yáng)離子交換層析采用CM Sehparose Fast Flow層析介質(zhì)，平衡液為20mM PB，pH7，上樣并平衡后采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脫，收集蛋白洗脫峰。
c)酶切采用凝血酶，比例為樣品1mL∶8U，進(jìn)行酶切，時(shí)間為2小時(shí)，溫度為25度。
d)陽(yáng)離子交換層析酶切液用20mM PB，pH7緩沖液稀釋3倍，上CM Sehparose Fast Flow層析介質(zhì)，平衡液采用20mM PB，pH7，洗脫液采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脫，收集蛋白洗脫峰。
e)陰離子交換層析上一步層析得到的洗脫液用20mM PB，pH7稀釋3倍，上DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)，收集透過峰。即為白細(xì)胞介素11-NO4純品。
4.檢測(cè)得到的白細(xì)胞介素11-NO4通過SDS-PAGE純度檢測(cè)和反相HPLC檢測(cè)，純度大于95％。
5.活性檢測(cè)得到的白細(xì)胞介素11-NO4采用MTT法，應(yīng)用美國(guó)已上市的重組白細(xì)胞介素11(neumega)作為參照品，用B911細(xì)胞進(jìn)行生物活性的測(cè)定，結(jié)果白細(xì)胞介素11-NO4的比活性為7.7×106U/mg。
實(shí)例五采用PCR定點(diǎn)突變的方法，將實(shí)例四中的前體蛋白的第139位氨基酸改變?yōu)镚ln，從重組pBSK質(zhì)粒中切下序列測(cè)定正確的目的基因片段，定向地嵌入表達(dá)質(zhì)粒pGEX中，得到重組質(zhì)粒pGEX-pro，經(jīng)過酶切、測(cè)序、鑒定后的重組質(zhì)粒pGEX-pro，用CaCl2法轉(zhuǎn)入表達(dá)菌JM105中，該重組工程菌經(jīng)過表達(dá)，純化得到最終白細(xì)胞介素11蛋白突變體。
前體蛋白的氨基酸序列為His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-Ser-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Me-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Gln-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu具體方法如下1.表達(dá)從轉(zhuǎn)化好的工程菌平面上挑取3個(gè)單菌落，接種到50mL LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉(zhuǎn)/分鐘，12小時(shí)后，把50mL菌液轉(zhuǎn)接入1升LB液體培養(yǎng)基中，37度，200轉(zhuǎn)/分鐘，3小時(shí)后，當(dāng)OD600約等于0.8時(shí)，加入IPTG使其終濃度為1mM，3小時(shí)后離心收集菌體。
2.裂菌收集的菌體按1∶5的比例加入裂菌緩沖液，20mM Tris，pH8，然后使用超聲波法進(jìn)行破菌，破菌后15000rpm/分鐘進(jìn)行離心20分鐘，收集上清。
3.純化a)凝膠過濾層析采用Sephadex G25 Medium介質(zhì)，平衡液采用20mM PB，pH7，收集蛋白峰。
b)陽(yáng)離子交換層析采用CM Sehparose Fast Flow層析介質(zhì)，平衡液為20mM PB，pH7，上樣并平衡后采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脫，收集蛋白洗脫峰。
c)酶切采用凝血酶，比例為樣品1mL∶8U，進(jìn)行酶切，時(shí)間為2小時(shí)，溫度為25度。
d)陽(yáng)離子交換層析酶切液用20mM PB，pH7緩沖液稀釋3倍，上CM Sehparose Fast Flow層析介質(zhì)，平衡液采用20mM PB，pH7，洗脫液采用20mM PB，pH7，0.25M NaCl洗脫，收集蛋白洗脫峰。
e)陰離子交換層析上一步層析得到的洗脫液用20mM PB，pH7稀釋3倍，上DEAE Sepharose Fast Flow層析介質(zhì)，收集透過峰。即為白細(xì)胞介素11-NO5純品。
4.檢測(cè)得到的白細(xì)胞介素11-NO5通過SDS-PAGE純度檢測(cè)和反相HPLC檢測(cè)，純度大于95％。
5.活性檢測(cè)得到的白細(xì)胞介素11-NO5采用MTT法，應(yīng)用美國(guó)已上市的重組白細(xì)胞介素11(neumega)作為參照品，用B911細(xì)胞進(jìn)行生物活性的測(cè)定，結(jié)果白細(xì)胞介素11-NO5的比活性為7.4×106U/mg。
權(quán)利要求
1.一種前體蛋白，其氨基酸序列為His-Pro-Pro-Lys-Ser-Aso-Leu-Val-Pro-Arg-Gly-Ser-Pro-Arg-X-Ser-Pro-Asp-Pro-Arg-Ala-Glu-Leu-Asp-Ser-Thr-Val-Leu-Leu-Thr-Arg-Ser-Leu-Leu-Ala-Asp-Thr-Arg-Gln-Leu-Ala-Ala-Gln-Leu-Arg-Asp-Lys-Phe-Pro-Ala-Asp-Gly-Asp-His-Asn-Leu-Asp-Ser-Leu-Pro-Thr-Leu-Ala-Met-Ser-Ala-Gly-Ala-Leu-Gly-Ala-Leu-Gln-Leu-Pro-Gly-Val-Leu-Thr-Arg-Leu-Arg-Ala-Asp-Leu-Leu-Ser-Tyr-Leu-Arg-His-Val-Gln-Trp-Leu-Arg-Arg-Ala-Gly-Gly-Ser-Ser-Leu-Lys-Thr-Leu-Glu-Pro-Glu-Leu-Gly-Thr-Leu-Gln-Ala-Arg-Leu-Asp-Arg-Leu-Leu-Arg-Arg-Leu-Gln-Leu-Leu-Met-Ser-Arg-Leu-Ala-Leu-Pro-Gln-Pro-Pro-Pro-Y-Pro-Pro-Ala-Pro-Pro-Leu-Ala-Pro-Pro-Ser-Ser-Ala-Try-Gly-Gly-Ile-Arg-Ala-Ala-His-Ala-Ile-Leu-Gly-Gly-Leu-His-Leu-Thr-Leu-Asp-Trp-Ala-Val-Arg-Gly-Leu-Leu-Leu-Leu-Lys-Thr-Arg-Leu
2.權(quán)利要求1中第15位的X代表氨基酸Val，Ala，Gly。
3.權(quán)利要求1中第139位的Y代表氨基酸Asp，Asn，Gln。
4.權(quán)利要求1中的前體蛋白以大腸桿菌或酵母為宿主菌用基因工程的方法進(jìn)行表達(dá)。
5.權(quán)利要求1中的前體蛋白可獨(dú)立表達(dá)、也可與其它肽段融合表達(dá)。
6.權(quán)利要求1中的前體蛋白通過凝血酶切割的工藝得到高活性的成熟蛋白。
全文摘要
本發(fā)明涉及一種經(jīng)切割后能產(chǎn)生多種有效成分的前體蛋白，本發(fā)明可以使該前體蛋自在大腸桿菌基因工程菌中得到穩(wěn)定高效的表達(dá)。經(jīng)過表達(dá)后的前體蛋白經(jīng)過切割加工后，得到了超高效生物活性的有效成分蛋白，可用于癌癥的輔助治療。
文檔編號(hào)C12N15/09GK1666995SQ20041000479
公開日2005年9月14日 申請(qǐng)日期2004年3月11日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月11日
發(fā)明者許日山 申請(qǐng)人:許日山