專利名稱：新漆酶的表達(dá)載體、表達(dá)微生物菌株、表達(dá)的漆酶蛋白及其應(yīng)用的制作方法
技術(shù)領(lǐng)域：
本發(fā)明涉及漆酶的表達(dá)載體、表達(dá)微生物菌株、表達(dá)的漆酶蛋白及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
制漿造紙工業(yè)是我國(guó)國(guó)民經(jīng)濟(jì)的重要支柱，但它帶來(lái)的環(huán)境污染也是極其嚴(yán)重的，特別是漂白廢水。隨著人們對(duì)環(huán)境保護(hù)問題的關(guān)注，如何減小制漿造紙業(yè)的污染成為熱門的研究方向。傳統(tǒng)的用氯漂白方式一直被認(rèn)為是紙漿漂白最經(jīng)濟(jì)又有效的漂白方法，但含氯漂劑在漂白過程中會(huì)產(chǎn)生二噁英。二噁英是一種強(qiáng)烈的致癌物質(zhì)，其中最毒的一種化合物的毒性高于氰化鉀1.7倍。為了減小紙漿漂白對(duì)環(huán)境的污染和人類健康的損害，國(guó)際上已經(jīng)展開了代替氯化漂白段的研究，紙漿的無(wú)元素氯漂白和全無(wú)氯漂白成為必然的趨勢(shì)，這給生物漂白技術(shù)的發(fā)展提供了很好的機(jī)遇。
生物漂白，即利用微生物或其分泌的酶處理紙漿，達(dá)到脫除木素或有利于脫木素，并改善紙漿的可漂性或提高紙漿的白度的過程。生物漂白的流程一般是安排在傳統(tǒng)流程的前面，從而節(jié)約化學(xué)漂劑的用量和減輕污染負(fù)荷。特別可以減少氯化段有效氯的用量，以減少二噁英的產(chǎn)生。但在有氧脫木素工序時(shí)，則可安排在氧脫木素之后以利于酶發(fā)揮更大的作用。
80年代初，西方工業(yè)國(guó)家工業(yè)污染控制戰(zhàn)略出現(xiàn)了重大變革，以污染預(yù)防取代了污染治理。1986年，芬蘭的Viikari等人首次報(bào)道了用木聚糖酶處理未漂KP漿可增進(jìn)其漂白性。這一報(bào)道激發(fā)了人們對(duì)這方面的研究興趣。3年后，即1989年，芬蘭率先進(jìn)行了木聚糖酶漂白KP漿的工業(yè)化試驗(yàn)，隨后芬蘭率先將生物預(yù)漂白技術(shù)引入制漿造紙工業(yè)中。用木聚糖酶對(duì)紙漿進(jìn)行預(yù)漂白，可以減少隨后的化學(xué)漂白用氯量30％～40％，廢液中有機(jī)氯化物與毒性物含量顯著減少。至今，用于生物預(yù)漂白的木聚糖酶已經(jīng)經(jīng)歷了三代的發(fā)展。從第一代酸性酶，第二代中性酶，到第三代堿性酶。目前，對(duì)第三代木聚糖酶的研究與應(yīng)用正進(jìn)入高峰期，采用基因工程與蛋白質(zhì)工程手段獲得性質(zhì)優(yōu)良的耐熱耐堿木聚糖酶已成為各相關(guān)實(shí)驗(yàn)室的研究熱點(diǎn)，期望不久的將來(lái)重組酶會(huì)更有效地應(yīng)用于漂白工藝中。目前，酶法助漂新工藝在歐洲和北美的30余家大型紙廠得到應(yīng)用，成為生物技術(shù)在造紙工業(yè)應(yīng)用最成功的一例。加拿大已有約10％的硫酸鹽法紙漿廠采用了該新工藝。加拿大的帝國(guó)化學(xué)工業(yè)有限公司于1992年6月6日申請(qǐng)了生物漂白法的專利。到1994年，在加拿大有75萬(wàn)噸漿采用了木聚糖酶漂白。丹麥諾和諾德公司和美國(guó)山道斯化學(xué)公司等多家酶制劑廠商，紛紛推出了專門用于紙漿處理的木聚糖酶和纖維素酶新產(chǎn)品?，F(xiàn)今世界上應(yīng)用木聚糖酶漂白的廠家已有數(shù)十家。
由于木聚糖酶處理工藝是通過降解除去紙漿表面再沉積的半纖維素等方式來(lái)幫助化學(xué)漂劑漂白的。木聚糖酶只能起到助漂的作用，不能真正替代化學(xué)漂劑。因此，生物預(yù)漂白并不能完全替代化學(xué)漂白，能減少污染卻不能最終消除污染，要從根本上消除有毒氯漂液的污染，需最終實(shí)現(xiàn)生物漂白，即完全采用生物手段除去紙漿中殘留的木質(zhì)素。
近年來(lái)，人們認(rèn)識(shí)到白腐菌有脫木素的作用。1989年～1990年，加拿大Paice.等人研究了白腐菌Trametes Versicolor對(duì)硫酸漿的漂白條件與效果，發(fā)現(xiàn)能使闊葉木硫酸漿的殘余木素出現(xiàn)較大的下降，漿的白度提高15％ISO，1997年王雙飛等人曾報(bào)導(dǎo)了用白腐菌HGX-03和白腐菌Phanerochate chrysosporium對(duì)蔗渣漿直接進(jìn)行漂白預(yù)處理。1998年Abdo reza等人用白腐菌Panerochate chrysospoeium漂白洋麻韌皮纖維蒽醌漿的研究，取得了比較好的效果。但微生物直接作用于紙漿的漂白周期長(zhǎng)，紙漿需要經(jīng)滅菌處理，操作煩瑣。而利用酶代替微生物漂白可減少生物處理時(shí)間，提高效率。
經(jīng)研究，在白腐菌中起到脫木素作用的為一種漆酶，但由于白腐菌生長(zhǎng)緩慢，產(chǎn)酶量少，反應(yīng)PH多在2～4之間，并且在污水中活性保持時(shí)間較短(僅數(shù)小時(shí))且不耐高溫，故使白腐菌漆酶的生物漂白應(yīng)用受到極大限制。
漆酶(對(duì)羥基苯酚氧化酶，EC1.10.3.2)是工業(yè)上有很高應(yīng)用價(jià)值的一類酶。漆酶這類蛋白質(zhì)屬于被稱作“銅藍(lán)蛋白”的家族，通常含有四個(gè)銅離子，位于標(biāo)為1型至3型的三個(gè)銅中心。漆酶通常以是否為分泌蛋白和可能含有的糖基化含量(10％至45％的分子量)來(lái)加以區(qū)別。對(duì)于它所氧化的芳香化合物，漆酶具有很廣的底物特異性。在這種氧化中產(chǎn)生的電子用于還原氧，產(chǎn)生水。特別的存在于白腐菌中的漆酶的功能是能夠降解木質(zhì)素，這也就是在紙張制造中使用漆酶進(jìn)行紙漿去木質(zhì)化而具有應(yīng)用價(jià)值的原由。
除了可以解聚像木質(zhì)素這樣的大分子化合物，漆酶還可以催化特別是芳香化合物的聚合。例如與植物中的漆酶相關(guān)的植物木質(zhì)素的生物合成。故漆酶可能的工業(yè)應(yīng)用通常也包括用于各種類型的聚合反應(yīng)，例如用于廢水處理。漆酶在有機(jī)化學(xué)合成中的應(yīng)用也是已知的，例如芳香族化合物的偶聯(lián)反應(yīng)和側(cè)鏈氧化。然而，對(duì)于這許多潛在的應(yīng)用，一個(gè)不利的方面是大多數(shù)已知漆酶是常溫型的，就是他們具有低溫最適性以及有限的熱穩(wěn)定性。
現(xiàn)有的漆酶產(chǎn)品多來(lái)源于白腐菌培養(yǎng)分泌物，其生產(chǎn)周期很長(zhǎng)(多為兩到三星期一批)加之產(chǎn)量又小，造成了漆酶的使用成本極其高昂。并且由于真菌多嗜酸，造成了真菌來(lái)源的漆酶只能在酸性條件下(多為PH2.0～4.0)發(fā)揮作用，在中性及堿性條件下基本無(wú)活性，這對(duì)多處于堿性條件下的造紙、印染廢水的處理多有不便。另外在較高溫度下(50～70℃)的穩(wěn)定性和在自然狀態(tài)下的活性保持時(shí)間(幾小時(shí)到幾天)也是漆酶應(yīng)用的一大瓶頸。
漆酶的工業(yè)應(yīng)用的一個(gè)前提條件是它們能夠以可接受的成本來(lái)制備，通常只有通過使用以重組技術(shù)制備的酶才能使之成為可能。有許多原核和真核的表達(dá)系統(tǒng)可用于蛋白質(zhì)的生產(chǎn)，原核表達(dá)系統(tǒng)的代表有大腸桿菌和枯草桿菌，而廣泛使用的真核表達(dá)系統(tǒng)是哺乳動(dòng)物細(xì)胞和昆蟲細(xì)胞的細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)，以及真核微生物如酵母和絲狀真菌。
美國(guó)國(guó)立衛(wèi)生研究院蛋白數(shù)據(jù)庫(kù)中現(xiàn)已公布437種各種來(lái)源的含漆酶活性蛋白質(zhì)，其基因庫(kù)中現(xiàn)已公布504條可能含有漆酶活性的基因。這些蛋白和基因絕大多數(shù)來(lái)源于真菌。
迄今為止國(guó)內(nèi)共申請(qǐng)并被批準(zhǔn)了31個(gè)與漆酶相關(guān)的專利，而其中只有一個(gè)專利(申請(qǐng)?zhí)枮?8805778.6，發(fā)明名稱為“DNA序列，這些DNA序列的表達(dá)，這些DNA序列所編碼的嗜熱漆酶，及其應(yīng)用”)使用了基因重組技術(shù)，此專利為聯(lián)邦德國(guó)慕尼黑電化學(xué)工業(yè)有限公司(國(guó)際)所擁有。該技術(shù)采用真核表達(dá)體系，其生產(chǎn)周期長(zhǎng)、菌體在發(fā)酵過程中容易受到污染，對(duì)培養(yǎng)設(shè)備的要求很高，另外該技術(shù)生產(chǎn)的真菌漆酶最適PH為2.5～3.0，其半衰期也短，因而應(yīng)用受到限制。

發(fā)明內(nèi)容
本發(fā)明的第一個(gè)目的在于針對(duì)現(xiàn)有重組漆酶及表達(dá)體系存在的上述缺點(diǎn)，提供一種表達(dá)的漆酶在成本、使用范圍、總酶活力等方面都較好的新漆酶的表達(dá)載體。
本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供適合本發(fā)明的新漆酶表達(dá)的微生物菌株。
本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供在成本、使用范圍、總酶活力等方面都較好的新的漆酶蛋白。
本發(fā)明的新漆酶的表達(dá)載體，包含有DNA序列SEQ ID NO.1的第85位直至且包括第1551位的序列，或者與該序列具有90％以上的同源性的序列。
編碼本發(fā)明新漆酶的漆酶基因?yàn)榘蠨NA序列SEQ ID NO.1的第85位直至且包括第1551位的序列或者與該序列具有90％以上的同源性的序列的基因。
所述DNA序列SEQ ID NO.1為YacK基因，如下所述atgcaacgtc gtgatttctt aaaatattcc gtcgcgctgg gtgtggcttc ggctttgccg 60ctgtggagcc gcgcagtatt tgcggcagaa cgcccaacgt taccgatccc tgatttgctc 120acgaccgatg cccgtaatcg cattcagtta actattggcg caggccagtc cacctttggc 180gggaaaactg caactacctg gggctataac ggcaatctgc tggggccggc ggtgaaatta 240cagcgcggca aagcggtaac ggttgatatc tacaaccaac tgacggaaga gacaacgttg 300cactggcacg ggctggaagt accgggtgaa gtcgacggcg gcccgcaggg aattattccg 360ccaggtggca agcgctcggt gacgttgaac gttgatcaac ctgccgctac ctgctggttc 400catccgcatc agcacggcaa aaccgggcga caggtggcga tggggctggc tgggctggtg 480gtgattgaag atgacgagat cctgaaatta atgctgccaa aacagtgggg tatcgatgat 540gttccggtga tcgttcagga taagaaattt agcgccgacg ggcagattga ttatcaactg 600gatgtgatga ccgccgccgt gggctggttt ggcgatacgt tgctgaccaa cggtgcaatc 660tacccgcaac acgctgcccc gcgtggttgg ctgcgcctgc gtttgctcaa tggctgtaat 720gcccgttcgc tcaatttcgc caccagcgac aatcgcccgc tgtatgtgat tgccagcgac 780ggtggtctgc tacctgaacc agtgaaggtg agcgaactgc cggtgctgat gggcgagcgt 840tttgaagtgc tggtggaggt taacgataac aaaccctttg acctggtgac gctgccggtc 900agccagatgg ggatggcgat tgcgccgttt gataagcctc atccggtaat gcggattcag 960ccgattgcta ttagtgcctc cggtgctttg ccagacacat taagtagcct gcctgcgtta 1020ccttcgctgg aagggctgac ggtacgcaag ctgcaactct ctatggaccc gatgctcgat 1080atgatgggga tgcagatgct aatggagaaa tatggcgatc aggcgatggc cgggatggat 1140cacagccaga tgatgggcca tatggggcac ggcaatatga atcatatgaa ccacggcggg 1200aagttcgatt tccaccatgc caacaaaatc aacggtcagg cgtttgatat gaacaagccg 1260atgtttgcgg cggcgaaagg gcaatacgaa cgttgggtta tctctggcgt gggcgacatg 1320atgctgcatc cgttccatat ccacggcacg cagttccgta tcttgtcaga aaatggcaaa 1380ccgccagcgg ctcatcgcgc gggctggaaa gataccgtta aggtagaagg taatgtcagc 1440gaagtgctgg tgaagtttaa tcacgatgca ccgaaagaac atgcttatat ggcgcactgc 1500catctgctgg agcatgaaga tacggggatg atgttagggt ttacggtata a 1551上述SEQ ID NO.1的第1位至第84位為編碼蛋白分泌所需的信號(hào)肽序列。此信號(hào)序列可以被任何其他的蛋白分泌的信號(hào)序列所替換。
SEQ ID NO.1的DNA序列即YacK基因可以通過例如克隆的方法從菌株E.coli TG-1中獲得。為此，以已知方法從E.coli TG-1中抽提全基因組質(zhì)粒，并根據(jù)YacK基因3’端和5’端序列設(shè)計(jì)DNA引物，經(jīng)PCR(多聚酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng))技術(shù)從E.coli TG-1基因組DNA獲得SEQID NO.1的DNA序列。
YacK基因可按照常規(guī)方法分離。
分離出的一個(gè)YacK基因，可以通過熟練技術(shù)人員所知的技術(shù)，例如定點(diǎn)誘變，在其序列的任何所需位置進(jìn)行修飾。因而，本發(fā)明的新漆酶的表達(dá)載體也涵蓋了包含有與DNA序列SEQ ID NO.1從第85位直至且包括第1551位的序列具有90％以上的同源性的DNA序列的表達(dá)載體。
利用熟知的方法將包含有DNA序列SEQ ID NO.1從第85位直至且包括第1551位的序列或者與其具有90％以上的同源性的DNA序列克隆至一個(gè)表達(dá)載體上，即構(gòu)建成本發(fā)明的表達(dá)載體。
本發(fā)明的表達(dá)載體可以是一個(gè)整合到宿主基因組中去并和宿主一起復(fù)制的DNA結(jié)構(gòu)，或者一個(gè)自主復(fù)制而不需要整合至宿主基因組中的DNA結(jié)構(gòu)，如質(zhì)粒、人工染色體，及類似的體外遺傳因子，在大腸桿菌中表達(dá)的載體優(yōu)選PET22m載體，PET22m由Pet22B+突變而來(lái)。
本發(fā)明的表達(dá)載體應(yīng)該優(yōu)選地含有下列遺傳因子一個(gè)啟動(dòng)本發(fā)明的漆酶基因在宿主中表達(dá)的啟動(dòng)子，和適合于宿主的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，該轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能性地連接于所述漆酶基因的3’端，并且在真核中還應(yīng)含有聚腺苷化的信號(hào)。
所述啟動(dòng)子優(yōu)選如一之一lac啟動(dòng)子、tac啟動(dòng)子、枯草桿菌蛋白酶啟動(dòng)子、GAL啟動(dòng)子、TAKA淀粉酶啟動(dòng)子、多角蛋白啟動(dòng)子、葡糖淀粉酶啟動(dòng)子、gapDH啟動(dòng)子和醇氧化酶啟動(dòng)子。用于在大腸桿菌中表達(dá)的是lac啟動(dòng)子和tac啟動(dòng)子，用于在枯草桿菌中表達(dá)的是枯草桿菌蛋白酶啟動(dòng)子，用于在啤酒糖酵母中表達(dá)的是GAL啟動(dòng)子，用于在黑曲霉中表達(dá)的是TAKA淀粉酶啟動(dòng)子，用于在桿狀病毒感染的昆蟲細(xì)胞中表達(dá)的是多角蛋白啟動(dòng)子，或者來(lái)自黑曲霉的葡糖淀粉酶啟動(dòng)子，或來(lái)自巴斯德畢赤酵母的醇氧化啟動(dòng)子。本發(fā)明的表達(dá)載體尤其優(yōu)選的啟動(dòng)子是來(lái)自大腸桿菌的lac啟動(dòng)子和tac啟動(dòng)子。
表達(dá)的漆酶蛋白質(zhì)應(yīng)優(yōu)選的被宿主分泌到培養(yǎng)基中，宿主的分泌通過N-端信號(hào)序列來(lái)介導(dǎo)，因此本發(fā)明的表達(dá)載體上還優(yōu)選地包含有一個(gè)N-端信號(hào)序列，它功能地連接于所述漆酶基因的5’端，它是天然存在于Yack基因中的信號(hào)序列，或者是一個(gè)異源信號(hào)序列，如來(lái)自Klebsiella oxytoca的α-環(huán)糊精葡糖轉(zhuǎn)移酶、來(lái)自啤酒酵母的α-因子、來(lái)自巴斯德畢赤酵母的酸性磷酸酶、來(lái)自黑曲霉的α-淀粉酶、來(lái)自黑曲霉或泡盛曲霉的葡糖淀粉酶。表達(dá)載體上的N-端信號(hào)序列優(yōu)選天然存在于Yack基因中的信號(hào)序列。
漆酶的分泌也可以通過融合蛋白的的表達(dá)而完成，其中一個(gè)分泌蛋白的基因或者該蛋白的一個(gè)分泌片段的基因在表達(dá)載體中有功能地與漆酶基因相連接。這方面尤為優(yōu)選的是，一種由來(lái)自黑曲霉的葡糖淀粉酶N-端片段和本發(fā)明的熱漆酶組成的融合蛋白的表達(dá)。
尤其合適的可用于本發(fā)明漆酶表達(dá)的信號(hào)序列是來(lái)自大腸桿菌本身的一段84bp的信號(hào)肽，它可幫助本發(fā)明的漆酶特異性地分泌到大腸桿菌周質(zhì)空間，以利于后續(xù)的分離純化。
本發(fā)明的表達(dá)載體還優(yōu)選地包含有一個(gè)選擇標(biāo)記的基因。該基因編碼的選擇標(biāo)記可以給宿主帶來(lái)一種抗生素抗性或者對(duì)宿主的一種缺陷有互補(bǔ)。優(yōu)選的選擇標(biāo)記的基因是可帶來(lái)如下抗性的基因氨芐青霉素、卡那霉素、氯霉素、四環(huán)素、潮霉素、zeocin或bialaphos。優(yōu)選的可對(duì)生長(zhǎng)缺陷互補(bǔ)的選擇標(biāo)記基因有amdS，pyrG，trpC，His4，niaD，argB，或者h(yuǎn)ygB。
尤其優(yōu)選的選擇標(biāo)記基因是氨芐青霉素抗性基因。
此外，選擇標(biāo)記基因可以在一個(gè)DNA分子上與漆酶基因一同存在，或者兩個(gè)基因分別存在于不同的DNA分子上。后一種情況下，宿主應(yīng)被兩種DNA分子一同共轉(zhuǎn)化。
本發(fā)明涉及的微生物菌株是包含有前述本發(fā)明的表達(dá)載體之一或者包含有DNA序列SEQ ID NO.1的第85位直至且包括第1551位的序列或者與該序列具有90％以上的同源性的序列的微生物菌株，為細(xì)菌，優(yōu)選大腸桿菌。
漆酶基因的表達(dá)載體可按照常規(guī)的方法轉(zhuǎn)化進(jìn)入宿主，如大腸桿菌E.coli BL21。
培養(yǎng)帶有漆酶基因的表達(dá)載體的宿主，從收獲的菌體中得到漆酶蛋白，如實(shí)施例采用滲透休克法可溶性的釋放出周質(zhì)空間中的漆酶蛋白，再經(jīng)過DEAE-Sepharose(Pharmacia)層析柱按照蛋白帶電性質(zhì)進(jìn)行弱陰離子交換以得到純度95％以上的漆酶蛋白。
本發(fā)明涉及的漆酶蛋白為包含有蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO2的蛋白質(zhì)，由包含有DNA序列SEQ ID NO.1的第85位直至且包括第1551位的序列或者與該序列具有90％以上的同源性的序列的漆酶基因所編碼，蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO2如下所述Met Gln Arg Arg Asp Phe Leu Lys Tyr Ser Val Ala Leu Gly Val Ala5 10 15Ser Ala Leu Pro Leu Trp Ser Arg Ala Val Phe Ala Ala Glu Arg Pro20 25 30Thr Leu Pro Ile Pro Asp Leu Leu Thr Thr Asp Ala Arg Asn Arg Ile35 40 45Gln Leu Thr Ile Gly Ala Gly Gln Ser Thr Phe Gly Gly Lys Thr Ala50 55 60Thr Thr Trp Gly Tyr Asn Gly Asn Leu Leu Gly Pro Ala Val Lys Leu65 70 75 80Gln Arg Gly Lys Ala Val Thr Val Asp Ile Tyr Asn Gln Leu Thr Glu85 90 95Glu Thr Thr Leu His Trp His Gly Leu Glu Val Pro Gly Glu Val Asp100 105 110Gly Gly Pro Gln Gly Ile Ile Pro Pro Gly Gly Lys Arg Ser Val Thr115 120 125Leu Asn Val Asp Gln Pro Ala Ala Thr Cys Trp Phe His Pro His Gln130 135 140His Gly Lys Thr Gly Arg Gln Val Ala Met Gly Leu Ala Gly Leu Val145 150 155 160Val Ile Glu Asp Asp Glu Ile Leu Lys Leu Met Leu Pro Lys Gln Trp165 170 175Gly Ile Asp Asp Val Pro Val Ile Val Gln Asp Lys Lys Phe Ser Ala180 185 190Asp Gly Gln Ile Asp Tyr Gln Leu Asp Val Met Thr Ala Ala Val Gly195 200 205Trp Phe Gly Asp Thr Leu Leu Thr Asn Gly Ala Ile Tyr Pro Gln His210 215 220Ala Ala Pro Arg Gly Trp Leu Arg Leu Arg Leu Leu Asn Gly Cys Asn225 230 235 240Ala Arg Ser Leu Asn Phe Ala Thr Ser Asp Asn Arg Pro Leu Tyr Val245 250 255Ile Ala Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Glu Pro Val Lys Val Ser Glu260 265 270Leu Pro Val Leu Met Gly Glu Arg Phe Glu Val Leu Val Glu Val Asn275 280 285Asp Asn Lys Pro Phe Asp Leu Val Thr Leu Pro Val Ser Gln Met Gly
290 295 300Met Ala Ile Ala Pro Phe Asp Lys Pro His Pro Val Met Arg Ile Gln305 310 315 320Pro Ile Ala Ile Ser Ala Ser Gly Ala Leu Pro Asp Thr Leu Ser Ser325 330 335Leu Pro Ala Leu Pro Ser Leu Glu Gly Leu Thr Val Arg Lys Leu Gln340 345 350Leu Ser Met Asp Pro Met Leu Asp Met Met Gly Met Gln Met Leu Met355 360 365Glu Lys Tyr Gly Asp Gln Ala Met Ala Gly Met Asp His Ser Gln Met370 375 380Met Gly His Met Gly His Gly Asn Met Asn His Met Asn His Gly Gly385 390 395 400Lys Phe Asp Phe His His Ala Asn Lys Ile Asn Gly Gln Ala Phe Asp405 410 415Met Asn Lys Pro Met Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln Tyr Glu Arg Trp420 425 430Val Ile Ser Gly Val Gly Asp Met Met Leu His Pro Phe His Ile His435 440 445Gly Thr Gln Phe Arg Ile Leu Ser Glu Asn Gly Lys Leu Leu Ala Ala450 455 460His Arg Ala Gly Trp Lys Asp Thr Val Lys Val Glu Gly Asn Val Ser465 470 475 480Glu Val Leu Val Lys Phe Asn His Asp Ala Pro Lys Glu His Ala Tyr485 490 495Met Ala His Cys His Leu Leu Glu His Glu Asp Thr Gly Met Met Leu500 505 510Gly Phe Thr Val516本發(fā)明的新漆酶蛋白適合于已知的所有的漆酶應(yīng)用。尤其適合于紙漿的去木質(zhì)化和高分子量聚集物的解聚以及印染污水中染料的分解。漆酶可進(jìn)一步用于廢紙的去墨漬，用于廢水處理中的芳香化合物的聚合，特別是紙漿漂白后含木質(zhì)素的廢水的芳香化合物的聚合，或者可廣泛應(yīng)用于受污染土壤的解毒。更進(jìn)一步的應(yīng)用涉及與前體組分及反應(yīng)使染料氧化以及使染料活化而形成顏料。在有機(jī)合成方面的應(yīng)用包括芳香化合物的偶聯(lián)反應(yīng)以及以及芳香側(cè)鏈的氧化，例如苯甲醇氧化形成相應(yīng)的醛類而防止進(jìn)一步氧化成羧酸。在上述的應(yīng)用當(dāng)中，漆酶可以單獨(dú)應(yīng)用于相關(guān)的反應(yīng)，也可以結(jié)合一種促進(jìn)反應(yīng)的介體如ABTS或N-羥基苯并三唑。
與現(xiàn)有的為數(shù)不多的重組漆酶相比，本發(fā)明的表達(dá)載體及微生物所表達(dá)的新漆酶在成本、使用范圍、生產(chǎn)安全性以及總酶活力等方面都有突出的優(yōu)點(diǎn)?，F(xiàn)與聯(lián)邦德國(guó)慕尼黑電化學(xué)工業(yè)有限公司(國(guó)際)所擁有的第98805778.6號(hào)專利涉及的重組漆酶比較如下1、第98805778.6號(hào)專利采用黑曲霉AB1.13(pyrG)、泡盛曲霉(ATCC11358)以及巴斯德畢赤酵母作為表達(dá)菌株進(jìn)行漆酶生產(chǎn)。這三個(gè)菌株都為真核表達(dá)體系，生長(zhǎng)速度較慢，其中曲霉的培養(yǎng)時(shí)間為60～100小時(shí)，酵母的培養(yǎng)時(shí)間為220小時(shí)，這就造成了生產(chǎn)周期長(zhǎng)、菌體在發(fā)酵過程中容易受到污染等問題，而且酵母表達(dá)時(shí)還須有培養(yǎng)溫度的較大改變(從28℃調(diào)至37℃)，這也對(duì)培養(yǎng)設(shè)備提出了很高的要求。而本發(fā)明的新漆酶使用細(xì)菌尤其是原核大腸桿菌進(jìn)行表達(dá)，生產(chǎn)周期短(6～7小時(shí))，菌體不易污染，生產(chǎn)過程中溫度等外界參數(shù)均不需調(diào)整，且所需營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)簡(jiǎn)單，僅傳統(tǒng)的LB培養(yǎng)基就可滿足其全部營(yíng)養(yǎng)需要，而真核表達(dá)體系的培養(yǎng)基必須添加各種微量元素及生物素作為輔料，成本較高，特別是巴斯德畢赤酵母的生產(chǎn)過程中要使用對(duì)人體有很強(qiáng)毒性的甲醇作為誘導(dǎo)劑，這又在安全防護(hù)上增加了成本。
2、在各種生化特性方面，本發(fā)明的新漆酶也有巨大的優(yōu)勢(shì)第98805778.6號(hào)專利的真菌漆酶最適PH為2.5～3.0，37℃半衰期僅為60～120分鐘，65℃半衰期為60分鐘；而本發(fā)明的新漆酶最適PH為4.0～5.0，較偏堿性，60℃半衰期超過12小時(shí)，70℃半衰期為3小時(shí)，在室溫下可保持活性超過24小時(shí)，這都使該酶具有更優(yōu)的應(yīng)用價(jià)值。
3、在產(chǎn)量方面每批曲霉可得粗酶0.5～2.5U/mL，雖然本發(fā)明采用大腸桿菌表達(dá)每批僅獲得0.15U/mL的純酶，但相同時(shí)間內(nèi)可得的平均產(chǎn)量為1.5～3U/mL，優(yōu)于曲霉；而每批酵母可得粗酶4U/mL，相同時(shí)間內(nèi)本發(fā)明所用大腸桿菌可得純酶4.5U/mL，與酵母表達(dá)量基本相當(dāng)。
在生產(chǎn)過程中本發(fā)明的新漆酶也存在不足，就是采用大腸桿菌表達(dá)的漆酶蛋白沒有分泌到培養(yǎng)基中，必須通過滲透休克法破碎細(xì)胞才能得到蛋白，這比真菌表達(dá)增加了一定的工作量和生產(chǎn)成本。


圖1是載體pMD18-T的克隆位點(diǎn)圖。
圖2是測(cè)序用引物位置圖。
圖3是DNA載體PET22b+的結(jié)構(gòu)圖。
圖4是DNA載體PET22m的結(jié)構(gòu)圖。
圖5是實(shí)施例所得新漆酶的活性與pH的相關(guān)性曲線圖。
圖6是實(shí)施例所得新漆酶的活性與外源添加銅離子濃度的相關(guān)性曲線圖。
圖7是不同金屬離子對(duì)實(shí)施例所得新漆酶活性的影響圖。
圖8是實(shí)施例所得新漆酶在60℃時(shí)的溫度穩(wěn)定性曲線圖。
圖9是實(shí)施例所得新漆酶在70℃時(shí)的溫度穩(wěn)定性曲線圖。
圖10是實(shí)施例所得新漆酶對(duì)靛藍(lán)類染料的脫色性能曲線圖。
具體實(shí)施例方式
以下的實(shí)施例用于進(jìn)一步解釋本發(fā)明。在實(shí)施例中對(duì)DNA或RNA的處理所使用的標(biāo)準(zhǔn)方法，例如用限制內(nèi)切酶，DNA聚合酶，反轉(zhuǎn)錄酶的處理等，以及標(biāo)準(zhǔn)的方法，例如細(xì)菌的轉(zhuǎn)化，Sounthern和Northern雜交分析，DNA測(cè)序，放射性標(biāo)記，掃描和PCR技術(shù)，除非另有說(shuō)明，均按照所用試劑盒的制造商推薦的方法進(jìn)行，如果沒有制造商的說(shuō)明，則按照本領(lǐng)域所熟知的標(biāo)準(zhǔn)教科書進(jìn)行。
實(shí)施例一一、從大腸桿菌E.coli TG-1基因組中分離得到Y(jié)acK基因。
使用E.coli TG-1菌株。E.coli TG-1的凍存菌體首先通過在LB瓊脂平板(0.5％酵母抽提物，1％蛋白胨，1％NaCl，1.5％的瓊脂，其余為蒸餾水)于37℃過夜活化，挑單菌落接種到500ml三角瓶中的100ml無(wú)菌LB培養(yǎng)基(0.5％酵母抽提物，1％蛋白胨，1％NaCl，其余為蒸餾水)。在37℃以220rpm搖動(dòng)培養(yǎng)過夜。將菌液12000rpm離心后，用TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0，其余為蒸餾水)將菌體懸浮起來(lái)，冰浴靜置10min，用酚∶氯仿∶異戊醇＝25∶24∶1抽提基因組DNA，去掉水相和沉淀后用足量乙醇使DNA沉淀，將沉淀徹底晾干后，用純水和TE緩沖液(10mM Tris-HCl，1mM EDTA，PH8.0)溶解，用Ep管分裝保存。
YacK基因通過以所設(shè)計(jì)的引物從E.coli TG-1基因組中PCR擴(kuò)增的方法制備，引物位置如圖2所示。這對(duì)引物序列如下A5’-gcatgcaacgtcgtgatttc-3’(SEQ ID NO.3)B5’-gcttataccgtaaaccctaa-3’(SEQ ID NO.4)PCR擴(kuò)增按照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。在100μl的PCR體系中使用2μl的E.coli TG-1基因組DNA，以及1.25U的Taq聚合酶，1.25mMMgCl2，0.2mM的各種dNTP和各100pmol的引物A和B，其余為純水。所需PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增的其他條件是94℃3分鐘，然后開始30個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增過程(94℃1分鐘，55℃1分鐘，68℃2分鐘)，最后68℃10分鐘。最后得到約1.5kb的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，用T4連接酶連入圖1所示的pMD18-T載體并轉(zhuǎn)化進(jìn)E.coli。從轉(zhuǎn)化的E.coli培養(yǎng)物中分離質(zhì)粒。通過基因測(cè)序確認(rèn)該克隆的DNA片段為漆酶基因的片段。
二、用于在大腸桿菌中表達(dá)的漆酶的重組質(zhì)粒的制備。
為了將已驗(yàn)證正確的YacK基因連入合適的表達(dá)載體中，我們?cè)O(shè)計(jì)了一對(duì)引物，在YacK基因的5’端和3’端分別加上兩個(gè)酶切位點(diǎn)EcoR I和Xho I，這對(duì)引物序列如下C5’-gacgaattcatgcaacgtcgtgatttc-3’(SEQ ID NO.5)D3’-gatctcgagttataccgtaaaccctaa-3’(SEQ ID NO.6)PCR擴(kuò)增按照本領(lǐng)域熟練技術(shù)人員熟知的方法進(jìn)行。在100μl的PCR體系中使用2μl的E.coli TG-1基因組DNA，以及1.25U的Taq聚合酶，1.25mMMgCl2，0.2mM的各種dNTP和各100pmol的引物A和B，其余為純水。所需PCR產(chǎn)物的特異性擴(kuò)增的其他條件是94℃3分鐘，然后開始35個(gè)循環(huán)的擴(kuò)增過程(94℃40秒，55℃50秒，71℃1分40秒)，最后71℃10分鐘。最后得到約1.5kb的PCR產(chǎn)物。PCR產(chǎn)物經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳純化，用限制酶EcoR I和Xho I酶切，克隆入EcoR I和Xho I酶切的PET22m載體。圖4所示的PET22m載體由圖3所示的PET22b+突變得到，它是將PET22m載體中的Nde I位點(diǎn)切除，在后邊添加了Klenow片段，并且用堿性磷酸酶去除了磷酸基團(tuán)。PET22m載體的使用避免了所表達(dá)的蛋白將以融合蛋白形式存在的可能性，使其保持更好的分泌性質(zhì)。
三、大腸桿菌的轉(zhuǎn)化。
轉(zhuǎn)化中使用了菌株大腸桿菌BL-21。大腸桿菌的轉(zhuǎn)化按照本領(lǐng)域的技術(shù)進(jìn)行。
感受態(tài)的細(xì)胞可以攝入外部溶液中的DNA，而常態(tài)的細(xì)胞卻不能，所以要轉(zhuǎn)化質(zhì)粒DNA進(jìn)入大腸桿菌必須首先制備感受態(tài)的大腸桿菌細(xì)胞。流程如下1、取1％(培養(yǎng)基體積的1％)大腸桿菌E.coli TG-1接種于含2mlLB培養(yǎng)基的試管中，37℃振蕩培養(yǎng)過夜；2、取0.1ml過夜培養(yǎng)物轉(zhuǎn)種于含10ml LB培養(yǎng)基的三角瓶中，37℃振蕩培養(yǎng)3小時(shí)至OD600＝0.3；3、然后把培養(yǎng)物倒入1.5ml離心管中，冰浴10min；4、在4℃下以4000rpm離心5min，去上清液；
5、把菌體懸浮于15ml冰冷的0.1M CaCl2溶液中，置冰上30min；6、然后再在4℃下以4000rpm離心10min，去上清液；7、將菌體懸浮于0.1ml CaCl2溶液中，冰浴放置4-12小時(shí)備用。
制備好感受態(tài)細(xì)胞后，接下來(lái)就是質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化入大腸桿菌細(xì)胞的過程。但要注意的是感受態(tài)細(xì)胞最好是新制備的，因?yàn)楸４嬉欢〞r(shí)間的感受態(tài)細(xì)胞會(huì)使轉(zhuǎn)化率降低；此外DNA的濃度也要注意，不能太高。流程如下1、取新制備的一管感受態(tài)細(xì)胞；2、取0.03ml感受態(tài)細(xì)胞和4ng質(zhì)粒DNA于Ep管中混勻，置冰浴30min；3、將上步Ep管置于42℃水浴中熱沖擊2分鐘，立即置于冰上1分鐘；4、在Ep管中加70ul LB培養(yǎng)基混勻，37℃培養(yǎng)30min；5、把菌液涂在含適當(dāng)濃度抗生素的LB平板上；6、37℃培養(yǎng)過夜，長(zhǎng)出的菌斑既為陽(yáng)性克隆。
對(duì)所得陽(yáng)性克隆分別用LB培養(yǎng)基(0.5％酵母抽提物，1％蛋白胨，1％NaCl，0.01％氨芐青霉素，其余為純水)過夜培養(yǎng)，取培養(yǎng)物按1％體積的比例(即1ml)接種到500ml三角瓶中的100ml無(wú)菌LB培養(yǎng)基(0.5％酵母抽提物，1％蛋白胨，1％NaCl，0.01％氨芐青霉素，其余為純水)中擴(kuò)大培養(yǎng)，OD600＝0.6時(shí)加入0.1％IPTG(異丙基-β-D-硫代半乳糖苷)進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，37℃、220rpm搖動(dòng)培養(yǎng)3小時(shí)后12000rpm離心菌體，加入裂解緩沖液(50mMTris-HCl pH8.0，100mMNaCl，0.1％PMSF，1％Triton X-100)超聲波破碎，對(duì)破碎物混合物測(cè)定是否對(duì)ABTS(2，2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)有活性，從而找到所需克隆。
通過在pH4.5，25℃條件下，于50mM醋酸-醋酸鈉緩沖液中加入10mMCuCl2與底物2mMABTS(2，2’-聯(lián)氮-雙(3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸)的反應(yīng)比色來(lái)確定漆酶活性。測(cè)量420nm處吸收的增長(zhǎng)。1U的漆酶活性定義為每分鐘轉(zhuǎn)化1μmol的ABTS底物。
四、新漆酶在大腸桿菌中的表達(dá)。
在搖瓶水平上對(duì)新漆酶在大腸桿菌中的表達(dá)進(jìn)行了研究。使用了下列LB培養(yǎng)基0.5％酵母抽提物，1％蛋白胨，1％NaCl，其余為純水。在表達(dá)實(shí)驗(yàn)中，從前步含有重組質(zhì)粒的單菌落過夜培養(yǎng)后的5ml菌液中取1ml擴(kuò)大到一個(gè)500ml的三角燒瓶?jī)?nèi)的100ml培養(yǎng)基，37℃下220rpm搖動(dòng)培養(yǎng)，OD600＝0.6時(shí)加入0.1％IPTG進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá)，誘導(dǎo)后每小時(shí)取樣，超生破碎后進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳，觀察分子量56000～57000附近的誘導(dǎo)條帶的產(chǎn)量變化。在3～5小時(shí)時(shí)間內(nèi)達(dá)到最大蛋白量。
目標(biāo)蛋白通過兩方面確定首先是聚丙烯酰氨凝膠電泳觀察其分子量在56000～57000范圍，其次是通過在pH4.5，25℃條件下，表達(dá)產(chǎn)物于50mM醋酸-醋酸鈉緩沖液中加入10mMCuCl2與2mMABTS的顯色反應(yīng)來(lái)確定是否存在漆酶活性。測(cè)量420nm處吸收的增長(zhǎng)，可知具體的酶活力大小。
五、新漆酶的分離純化。
如第四步中所述，通過培養(yǎng)轉(zhuǎn)化的大腸桿菌菌株獲得漆酶蛋白。含有漆酶的菌體經(jīng)12000rpm離心后，采用滲透休克破碎方法將周質(zhì)中的蛋白溶出，以使其保持在可溶狀態(tài)。滲透休克法的具體步驟如下將離心后的菌體以每100ml菌液加1ml緩沖液的比例在經(jīng)過冰浴冷卻后的1#緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8.0，5mMEDTA，20％蔗糖)中重懸，并在冰上保溫20min。將保溫后的懸浮液14000rpm離心，留取上清，將沉淀用2#緩沖液(20mM Tris-HCl，pH8.0，5mMEDTA)以同樣比例重懸，冰上保溫30min。將保溫后的懸浮液12000rpm離心，留取上清。將兩次上清混合并通過透析降低蔗糖含量，最后超濾濃縮至適當(dāng)體積。
濃縮后的漆酶在一個(gè)DEAE-Sepharose(Pharmacia)柱上進(jìn)行層析，柱子用50mMTris-HCl pH8.0(上樣緩沖液)平衡。在此條件下漆酶結(jié)合于DEAE-Sepharose。經(jīng)上樣緩沖液中0-0.5MNaCl線性梯度的洗脫，在0.15MNaCl濃度時(shí)回收獲得漆酶活性。將DEAE-Sepharose柱的漆酶收集組分進(jìn)行聚丙烯酰氨凝膠電泳后，選取純度較高的組分混合儲(chǔ)藏，混合液純度可達(dá)95％以上。
六、新漆酶的生物化學(xué)特性。
對(duì)第五步中所述的從大腸桿菌中制備的漆酶的最適pH和溫度穩(wěn)定性以及Cu2+濃度和不同金屬離子對(duì)漆酶活性的影響進(jìn)行了分析。同時(shí)還對(duì)該漆酶對(duì)靛藍(lán)類染料的脫色能力做了分析。在這些實(shí)驗(yàn)中漆酶的初始緩沖液為DEAE-Sepharose時(shí)的Tris-HCl pH8.0緩沖液。
A、最適pH通過適當(dāng)混合非緩沖的各類酸堿性鹽溶液來(lái)制備圖5所示的各種pH值的緩沖液。在25℃并存在10mMCuCl2條件下的各種pH中確定本實(shí)施例所得漆酶的漆酶活性。如圖5所示，本實(shí)施例所得漆酶具有的對(duì)于底物ABTS的最佳活性處于pH4.5附近。
B、金屬離子對(duì)重組漆酶活性的影響我們配制了如圖7所示的各種金屬鹽溶液并用它代替同等濃度的10m CuCl2作為酶活測(cè)定體系中的組分參與反應(yīng)，從而確定哪種金屬離子對(duì)酶活有促進(jìn)作用。如圖7表明，只有Cu2+對(duì)漆酶YacK的活性有促進(jìn)作用，其他金屬離子不能使漆酶顯示出對(duì)ABTS的活性。
C最適Cu2+濃度通過對(duì)5MCuCl2溶液的不同比例稀釋，我們使酶活測(cè)定系統(tǒng)中的Cu2+終濃度如圖6所示。如圖6所示，CuCl2溶液對(duì)漆酶具有的最佳催化濃度處于10mM附近范圍。
D、溫度穩(wěn)定性漆酶預(yù)先溫浴于60℃和70℃，pH8.0的50mMTris-HCl緩沖液中。經(jīng)過如圖8、圖9所示的時(shí)間后分別取出等份樣品，在25℃，pH4.5的緩沖液中確定漆酶活性。如圖8、圖9所示，該酶在60℃及pH4.5、不加銅條件下穩(wěn)定性在4個(gè)小時(shí)內(nèi)保持100％，加銅條件下半衰期為6個(gè)小時(shí)。該酶在70℃及pH4.5，不加銅條件下半衰期3個(gè)小時(shí)，加銅半衰期15分鐘。該酶的活性在60-70℃時(shí)仍有最高活性的90％。
E、對(duì)靛藍(lán)類染料的脫色能力如圖10所示，在圖10中所示的各種情況下研究了漆酶YacK對(duì)靛藍(lán)類染料的脫色作用，圖中結(jié)果表明在中性pH值條件下且無(wú)ABTS作為介體參與反應(yīng)時(shí)本實(shí)施例的漆酶仍然有很強(qiáng)的靛藍(lán)染料脫色能力。
序列表<110>深圳市構(gòu)思生物技術(shù)有限公司<120>新漆酶的表達(dá)載體、表達(dá)微生物菌株、表達(dá)的漆酶蛋白及其應(yīng)用<160>6<210>1<211>1551<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)<400>1atgcaacgtc gtgatttctt aaaatattcc gtcgcgctgg gtgtggcttc ggctttgccg 60ctgtggagcc gcgcagtatt tgcggcagaa cgcccaacgt taccgatccc tgatttgctc 120acgaccgatg cccgtaatcg cattcagtta actattggcg caggccagtc cacctttggc 180gggaaaactg caactacctg gggctataac ggcaatctgc tggggccggc ggtgaaatta 240cagcgcggca aagcggtaac ggttgatatc tacaaccaac tgacggaaga gacaacgttg 300cactggcacg ggctggaagt accgggtgaa gtcgacggcg gcccgcaggg aattattccg 360ccaggtggca agcgctcggt gacgttgaac gttgatcaac ctgccgctac ctgctggttc 400catccgcatc agcacggcaa aaccgggcga caggtggcga tggggctggc tgggctggtg 480gtgattgaag atgacgagat cctgaaatta atgctgccaa aacagtgggg tatcgatgat 540gttccggtga tcgttcagga taagaaattt agcgccgacg ggcagattga ttatcaactg 600gatgtgatga ccgccgccgt gggctggttt ggcgatacgt tgctgaccaa cggtgcaatc 660tacccgcaac acgctgcccc gcgtggttgg ctgcgcctgc gtttgctcaa tggctgtaat 720gcccgttcgc tcaatttcgc caccagcgac aatcgcccgc tgtatgtgat tgccagcgac 780ggtggtctgc tacctgaacc agtgaaggtg agcgaactgc cggtgctgat gggcgagcgt 840tttgaagtgc tggtggaggt taacgataac aaaccctttg acctggtgac gctgccggtc 900agccagatgg ggatggcgat tgcgccgttt gataagcctc atccggtaat gcggattcag 960ccgattgcta ttagtgcctc cggtgctttg ccagacacat taagtagcct gcctgcgtta 1020ccttcgctgg aagggctgac ggtacgcaag ctgcaactct ctatggaccc gatgctcgat 1080atgatgggga tgcagatgct aatggagaaa tatggcgatc aggcgatggc cgggatggat 1140cacagccaga tgatgggcca tatggggcac ggcaatatga atcatatgaa ccacggcggg 1200aagttcgatt tccaccatgc caacaaaatc aacggtcagg cgtttgatat gaacaagccg 1260atgtttgcgg cggcgaaagg gcaatacgaa cgttgggtta tctctggcgt gggcgacatg 1320atgctgcatc cgttccatat ccacggcacg cagttccgta tcttgtcaga aaatggcaaa 1380ccgccagcgg ctcatcgcgc gggctggaaa gataccgtta aggtagaagg taatgtcagc 1440gaagtgctgg tgaagtttaa tcacgatgca ccgaaagaac atgcttatat ggcgcactgc 1500catctgctgg agcatgaaga tacggggatg atgttagggt ttacggtata a1551<210>2<211>516<212>PRT<213>大腸桿菌(E.coli)<400>2Met Gln Arg Arg Asp Phe Leu Lys Tyr Ser Val Ala Leu Gly Val Ala
5 10 15Ser Ala Leu Pro Leu Trp Ser Arg Ala Val Phe Ala Ala Glu Arg Pro20 25 30Thr Leu Pro Ile Pro Asp Leu Leu Thr Thr Asp Ala Arg Asn Arg Ile35 40 45Gln Leu Thr Ile Gly Ala Gly Gln Ser Thr Phe Gly Gly Lys Thr Ala50 55 60Thr Thr Trp Gly Tyr Asn Gly Asn Leu Leu Gly Pro Ala Val Lys Leu65 70 75 80Gln Arg Gly Lys Ala Val Thr Val Asp Ile Tyr Asn Gln Leu Thr Glu85 90 95Glu Thr Thr Leu His Trp His Gly Leu Glu Val Pro Gly Glu Val Asp100 105 110Gly Gly Pro Gln Gly Ile Ile Pro Pro Gly Gly Lys Arg Ser Val Thr115 120 125Leu Asn Val Asp Gln Pro Ala Ala Thr Cys Trp Phe His Pro His Gln130 135 140His Gly Lys Thr Gly Arg Gln Val Ala Met Gly Leu Ala Gly Leu Val145 150 155 160Val Ile Glu Asp Asp Glu Ile Leu Lys Leu Met Leu Pro Lys Gln Trp165 170 175Gly Ile Asp Asp Val Pro Val Ile Val Gln Asp Lys Lys Phe Ser Ala180 185 190Asp Gly Gln Ile Asp Tyr Gln Leu Asp Val Met Thr Ala Ala Val Gly195 200 205Trp Phe Gly Asp Thr Leu Leu Thr Asn Gly Ala Ile Tyr Pro Gln His210 215 220Ala Ala Pro Arg Gly Trp Leu Arg Leu Arg Leu Leu Asn Gly Cys Asn225 230 235 240Ala Arg Ser Leu Asn Phe Ala Thr Ser Asp Asn Arg Pro Leu Tyr Val245 250 255Ile Ala Ser Asp Gly Gly Leu Leu Pro Glu Pro Val Lys Val Ser Glu260 265 270Leu Pro Val Leu Met Gly Glu Arg Phe Glu Val Leu Val Glu Val Asn275 280 285Asp Asn Lys Pro Phe Asp Leu Val Thr Leu Pro Val Ser Gln Met Gly290 295 300Met Ala Ile Ala Pro Phe Asp Lys Pro His Pro Val Met Arg Ile Gln305 310 315 320Pro Ile Ala Ile Ser Ala Ser Gly Ala Leu Pro Asp Thr Leu Ser Ser325 330 335Leu Pro Ala Leu Pro Ser Leu Glu Gly Leu Thr Val Arg Lys Leu Gln340 345 350Leu Ser Met Asp Pro Met Leu Asp Met Met Gly Met Gln Met Leu Met
355 360 365Glu Lys Tyr Gly Asp Gln Ala Met Ala Gly Met Asp His Ser Gln Met370 375 380Met Gly His Met Gly His Gly Asn Met Asn His Met Asn His Gly Gly385 390 395 400Lys Phe Asp Phe His His Ala Asn Lys Ile Asn Gly Gln Ala Phe Asp405 410 415Met Asn Lys Pro Met Phe Ala Ala Ala Lys Gly Gln Tyr Glu Arg Trp420 425 430Val Ile Ser Gly Val Gly Asp Met Met Leu His Pro Phe His Ile His435 440 445Gly Thr Gln Phe Arg Ile Leu Ser Glu Asn Gly Lys Leu Leu Ala Ala450 455 460His Arg Ala Gly Trp Lys Asp Thr Val Lys Val Glu Gly Asn Val Ser465 470 475 480Glu Val Leu Val Lys Phe Asn His Asp Ala Pro Lys Glu His Ala Tyr485 490 495Met Ala His Cys His Leu Leu Glu His Glu Asp Thr Gly Met Met Leu500 505 510Gly Phe Thr Val516<210>3<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)<400>3gcatgcaacg tcgtgatttc20<210>4<211>20<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)<400>4gcttataccg taaaccctaa20<210>5<211>27<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)<400>5gacgaattca tgcaacgtcg tgatttc27
<210>6<211>27<212>DNA<213>大腸桿菌(E.coli)<400>6gatctcgagt tataccgtaa accctaa2權(quán)利要求
1.一種新漆酶的表達(dá)載體，包含有DNA序列SEQ ID NO.1的第85位直至且包括第1551位的序列，或者與該序列具有90％以上的同源性的序列。
2.如權(quán)利要求1所述的表達(dá)載體，其特征在于選自一個(gè)整合到宿主基因組中去并和宿主一起復(fù)制的DNA結(jié)構(gòu)，或者一個(gè)自主復(fù)制而不需要整合至宿主基因組中的DNA結(jié)構(gòu)。
3.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于選用PET22m載體。
4.如權(quán)利要求2所述的表達(dá)載體，其特征在于其上還包含有一個(gè)啟動(dòng)權(quán)利要求1所述的漆酶基因在宿主中表達(dá)的啟動(dòng)子，和適合于宿主的轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)，該轉(zhuǎn)錄終止信號(hào)功能性地連接于所述漆酶基因的3’端。
5.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于.其上還包含有一個(gè)N-端信號(hào)序列，它功能地連接于所述漆酶基因的5’端。
6.如權(quán)利要求4所述的表達(dá)載體，其特征在于其上還包含有一個(gè)選擇標(biāo)記的基因。
7.包含有權(quán)利要求1至6所述的表達(dá)載體之一或者包含有DNA序列SEQ ID NO.1的第85位直至且包括第1551位的序列或者與該序列具有90％以上的同源性的序列的微生物菌株，為細(xì)菌。
8.如權(quán)利要求7所述的微生物菌株，為大腸桿菌。
9.包含有蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO.2的漆酶蛋白。
10.如權(quán)利要求9所述的漆酶蛋白在紙漿的去木質(zhì)化、高分子量聚合物的解聚、廢紙的去墨漬、廢水尤其是紙漿漂白后含木質(zhì)素的廢水中的芳香化合物的聚合、染料的氧化或者染料的活化以形成顏料、在有機(jī)合成中芳香化合物的偶聯(lián)反應(yīng)以及芳香側(cè)鏈的氧化作用中的應(yīng)用。
全文摘要
本發(fā)明為新漆酶的表達(dá)載體、表達(dá)微生物菌株、表達(dá)的漆酶蛋白及其應(yīng)用。本發(fā)明的表達(dá)載體包含有DNA序列SEQ ID NO.1的第85位直至且包括第1551位的序列，或者與該序列具有90％以上的同源性的序列。本發(fā)明的表達(dá)微生物菌株為包含有前述表達(dá)載體之一或者包含有DNA序列SEQ ID NO.1的第85位直至且包括第1551位的序列或者與該序列具有90％以上的同源性的序列的微生物菌株。本發(fā)明的漆酶蛋白為包含有蛋白質(zhì)序列SEQ ID NO.2的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的漆酶蛋白可適合于已知的所有的漆酶應(yīng)用，與現(xiàn)有的重組漆酶相比，本發(fā)明的新漆酶在成本、使用范圍、生產(chǎn)安全性以及總酶活力等方面都有突出的優(yōu)點(diǎn)。
文檔編號(hào)C12N1/21GK1560257SQ200410007200
公開日2005年1月5日 申請(qǐng)日期2004年3月4日 優(yōu)先權(quán)日2004年3月4日
發(fā)明者龔為民 申請(qǐng)人:深圳市構(gòu)思生物技術(shù)有限公司